ELISA PDF 1

martes, 3 de septiembre de 2019
ELISA
¿QUE ES ?: Inmunoabsorción ligado a enzimas.

técnica de inmunoensayo
La aparición de colorantes permite medir
indirectamente mediante espectrofotometría el
determinar si antígeno
un anticuerpo particular está
presente en la muestra de
sangre de un paciente.
Un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo
enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable,
como cambio de color
1) USOS :
Un anticuerpo primario que
• Infección o una enfermedad autoinmune
reconoce al antígeno y que a
• Falso positivo: El cuerpo de una persona que ha estado enferma y que ya
su vez es reconocido por un
se ha recuperado puede seguir produciendo anticuerpos.
anticuerpo secundario
• Falso negativo : personas que producen una baja cantidad de
anticuerpos, por lo que estos pueden pasar desapercibidos y no ser
medidos ej : INMUNODEFICIENCIA
• Falsos negativos: cuando se da inespecificidad entre antígeno-
Tiene número de variables, tales
anticuerpo.
como selección de reactivo,
• western blot :detecta la presencia de varios anticuerpos,
temperatura, medición de
volumen y tiempo, que si no se simultáneamente, frente a la misma infección en una muestra.considera
ajustan correctamente, puede positivo cuando aparecen al menos 5 bandas
afectar los pasos sucesivos y el
resultado de la prueba.
1
- ELISA , aplicación en todos
aquellos campos en los que se
precisaba la cuantificación de martes, 3 de septiembre de 2019
productos mediante anticuerpos:
diagnóstico clínico, detección
viral, clasificación de
Dispositivos empleados
en ELISA
Tubos de cristal
Microplacas de 96 pocillos de
plástico tratado
aumentar su capacidad de
adsorción (en su superficie) de
moléculas, y con fondos de
pocillo claros Los lectores ELISA son espectrofotometros
PERMITE : realizar medidas capaces de realizar lecturas seriadas de cada
de densidad optica uno de los pocillos de la placa ELISA.
-instrumentos específicos,
espectrofotómetros de Tiene filtros que solo permiten la lectura de una
lectura de placas yo pocas longitudes de onda; para determinar la
Lectores ELISA densidad óptica de los cromógenos
Fases de un ensayo ELISA

1)Conjugación del anticuerpo o del antígeno con una enzima:
( peroxidasa , fosfatasa alcalina ,) anticuerpo conjugado se emplea en ensayos directo e indirectos -
(SANDWICH) , anticuerpo-enzima o antígeno-enzima), solución coloreada y que pueda ser valorada
visualmente o cuantificada por medio de un espectrofotómetro , sino se completa el tiempo da un

FALSO NEGATIVO .
2
2) Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos:
Si se usa mucho antígeno, se pueden obtener falsos positivos. Por el contrario, si se usa poco antígeno,
esto dará lugar a una reacción falsa negativa.
3)Formación de una o más capas de inmunocomplejos:
En el caso del antígeno unido a la placa, se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno
marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti-
primario marcado (ELISA indirecto). 4) Revelado de la reacción enzimática
4) Revelado de la reacción enzimática:

lavado para eliminar todas las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos, se
añade el sustrato enzimático, se incuba durante un tiempo estandarizado por cada casa comercial,
en el cual se producirá una reacción enzimática, luego se frena esta reacción mediante el uso de
una solución stop y se lee la densidad óptica mediante espectrofotometría.
Tipos de ensayos ELISA

-ELISA directo: (ensayo ELISA simple de dos capas).
-ELISA indirecto: Las placas ELISA se preparan de la misma forma a la anterior.
-ELISA «sándwich»: (Ensayo de captura de antígeno y detección mediante

inmunocomplejos).
-ELISpot: es un método altamente sensible en la inmunología para enumerar las

células que producen una citoquina dada.
3
Quimioluminiscencia
Los tipos de ELISA que recurren a la quimioluminiscencia utilizan un
sustrato que genera luz, en lugar del sustrato cromógeno de las
reacciones ELISA ordinarias.
Oxidación del compuesto luminol por peróxido de hidrógeno y la

enzima peroxidasa de rábano (HRP), que producen luz.
La medición cuantitativa de la emisión de luz puede hacerse mediante el

uso de un luminómetro
La ventaja de las pruebas de quimioluminiscencia sobre las

cromógenas es la mejoría de la sensibilidad.
Marcadores enzimáticos más comúnmente utilizados
-HRPO (peroxidasa de rábano)
- AP (fosfatasa alcalina)
TMB ç
ABTS (peroxido de hidrogeno)
DAB (peroxido de hidrogeno)
CNP AEC
4
ASA
BCIP 1
NAPFB
PG IS
BETA G ONGP : ( cloruro de magnesio)
UREASA BP
Prueba ELISPOT
capaz de detectar cuantitativamente el número de células en una población productora de

anticuerpos específicos contra un antígeno determinado o un antígeno contra el que se
dispone de un anticuerpo específico.

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¿QUE ES ?: Inmunoabsorción ligado a enzimas.

PERMITE : realizar medidas capaces de realizar lecturas seriadas de cada

de densidad optica uno de los pocillos de la placa ELISA.

Fases de un ensayo ELISA

( peroxidasa , fosfatasa alcalina ,) anticuerpo conjugado se emplea en ensayos directo e indirectos -

(SANDWICH) , anticuerpo-enzima o antígeno-enzima), solución coloreada y que pueda ser valorada

visualmente o cuantificada por medio de un espectrofotómetro , sino se completa el tiempo da un

3)Formación de una o más capas de inmunocomplejos:

4) Revelado de la reacción enzimática:

Tipos de ensayos ELISA

-ELISA indirecto: Las placas ELISA se preparan de la misma forma a la anterior.

-ELISA «sándwich»: (Ensayo de captura de antígeno y detección mediante

-ELISpot: es un método altamente sensible en la inmunología para enumerar las

Oxidación del compuesto luminol por peróxido de hidrógeno y la

La medición cuantitativa de la emisión de luz puede hacerse mediante el

La ventaja de las pruebas de quimioluminiscencia sobre las

Marcadores enzimáticos más comúnmente utilizados

-HRPO (peroxidasa de rábano)

capaz de detectar cuantitativamente el número de células en una población productora de

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