HSQC y HMQC
HSQC y HMQC
HSQC y HMQC
El desplazamiento químico describe la dependencia de los niveles de energía magnética del núcleo
atómico con el ambiente electrónico de la molécula. El núcleo de un átomo puede poseer un
momento magnético (espín nuclear), el que entrega diferentes niveles de energía
VENTAJAS
la HSQC tiene ciertas ventajas para registrar los espectros de moléculas grandes, como las
proteínas
SECUENCIA DE PULSOS
secuencia inept
SECUENCIA INEPT
El primer pulso de 90º aplicado a los 1 H sobre el eje x rota la magnetización hacia el eje y (los dos
vectores corresponden a la magnetización del protón unido a los 13C con espín alfa de color rojo y
13C con espín beta de color azul). Tras aplicar este pulso fuerte de 90° los niveles de energía igualan
los niveles poblacionales de las transiciones de protón |αα> → |βα> y |αβ> → |ββ>. Como
consecuencia, no existe magnetización sobre el eje z.
Los vectores sobre el eje y comenzarán a precesar durante el tiempo τ. Este tiempo se define como
el valor de 1/4J (si J = 125Hz, entonces τ es 2 ms), lo cual provoca una separación entre ambos
vectores de 90º (el ángulo formado entre dos vectores acoplados después de un tiempo dado, τ,
está dado por la ecuación Θ = 2πJτ). Posteriormente se aplica un pulso de 180º sobre el eje x que
invierte la orientación de los vectores prevaleciendo el sentido de su rotación, Figura 5.
Figura 5. Movimiento de precesión de los vectores correspondientes a la magnetización de
protones unidos a carbono con espín alfa, MH Cα , y de la magnetización de protones unido a
carbono con espín beta, MH Cβ . Durante el primer tiempo τ dentro de la secuencia de pulsos los
vectores presentes comienzan a precesar hasta alcanzar un ángulo de 90º definido por τ = 1/4J. El
pulso de 180º aplicado sobre protón invierte el sentido de las magnetizaciones, pero se sigue
conservando el sentido de los movimientos de rotación de cada vector.
Si se espera un tiempo τ nuevamente, estos dos vectores coincidirán nuevamente sobre el eje –y, a
esta coincidencia se le llama reenfoque de la magnetización. Sin embargo, se aplica un pulso de 180°
sobre el núcleo de carbono lo cual cambia la situación. Al aplicar un pulso de 180º sobre 13C se
invierten las poblaciones de 13C, el diagrama de niveles energéticos permite representar este
proceso. La inversión de estos niveles poblacionales implica que ahora la magnetización
correspondiente a los carbonos unidos a protones con espín alfa, MC Hα , pasa a ser la
magnetización de los carbonos unidos a protones con espín beta, MC Hβ . Esta representación en el
modelo vectorial es un cambio en la posición de los vectores MH Cα y MH Cβ que es como si
cambiara el sentido de giro de los vectores.
Figura 6. Efecto del pulso de 180º aplicado sobre 13C. El pulso invierte los niveles poblacionales de
los estados |αα> → |αβ> y |βα> → |ββ> y en el modelo vectorial esto se representa como un
cambio del vector MH Cα por MH Cβ y viceversa.
Estos componentes precesan libremente en el tiempo τ = 1/4J generando un ángulo de 180º entre
ambos vectores, de tal forma que cada vector se encuentra ahora alineado a lo largo del eje x. La
aplicación del pulso de 90º, pero ahora sobre el eje y rota los vectores en dirección del eje z,
quedando un vector en sentido positivo y otro en sentido negativo.
Figura 7. En el segundo tiempo de espera τ, las magnetizaciones se alinean sobre el eje x y el
siguiente pulso de 90º en 1 H sobre el eje y, coloca las magnetizaciones sobre el eje z. Es en este
paso donde se lleva acabo el fenómeno llamado transferencia de polarización.
El siguiente pulso de 90ºx sobre el núcleo de carbono rota nuevamente los vectores hacia los ejes
“y” y “-y” con ello se generan señales observables. El resultado final es un doblete con una señal en
sentido positivo y otra en sentido negativo.
Figura 10. El ultimo pulso de 90º en C-13 solamente hace que la señal se vuelva observable al
rotarla hacia el eje y. El resultado es un doblete con señales de signo contrario (señal en antifase)
de intensidades –6 y 10. El incremento en cada señal fue de –8 y +8 con respecto a la intensidad
original de ambas señales (+2, +2).
La magnetización del núcleo X evoluciona durante t1, mientras que el pulso de 180º del protón
reenfoca la evolución con el acoplamiento 1 H-X lo que hace que sólo haya evolución del
desplazamiento químico de X durante t1. Después del período de evolución variable t1 la
magnetización transversal de 13C es transferida de nuevo al protón vía un bloque retroINEPT, lo
que produce magnetización de protón en fase que puede ser detectada en presencia de un
desacoplamiento de carbono.
-Un período optimizado a 1/2 * 1JXH para permitir la evolución de las constantes de acoplamiento
heteronucleares. Se aplican pulsos simultáneos de 180º 1H y X en la mitad de este período para
reenfocar la evolución del cambio químico en 1H. -El resultado final es una magnetización en fase
1H que se puede detectar con un desacoplamiento X opcional.
OPERADORES PRODUCTO:
El primer bloque INEPT genera magnetización en antifase de X con respecto a 1H, IzSy,
como se indica en (1). Durante t1 hay una evolución con el desplazamiento químico de X.
El pulso de 180º de protón en el centro de t1 reenfoca la evolución con el acoplamiento 1JCH
y por simplicidad no aparece en la ecuación (2). El último pulso de 90º de X junto al de
protón transfiere la magnetización al protón en antifase, IySz, como en (3). Durante el
período posterior de reenfoque dicha magnetización se convierte en magnetización en fase
detectable (4)
SECUENCIA DE PULSOS:
4.1. Preparación.
El primer pulso de 90X∘ al protón crea una magnetización transversal del protón a lo largo del eje
−𝑦, mientras que la magnetización de la red de carbono permanece a lo largo del eje + 𝑧
(magnetización longitudinal) (Figura 2, esquema 2).
Para proporcionar una explicación vectorial coherente para el experimento, el estado de giro del
esquema 2 de la Figura 2 se representará por sus componentes vectoriales como en el esquema 2a
de la Figura 2. El esquema 2a de la figura 2 se puede interpretar de la siguiente manera: hay dos
componentes de la magnetización del carbono, a saber, 𝛼C y bC (representados en azul),
(aproximadamente) la mitad de 𝛼C está acoplada a los protones con espín 𝛼 (que es el estado de
espín 𝛼C𝛼H ), y la otra mitad está acoplada a protones con giro spin (estado 𝛼C𝛽H). Se puede realizar
un razonamiento similar para el carbono con espín. Aquí se adoptan otras simplificaciones de
esquemas para evitar el apiñamiento de figuras. El esquema 2a de la Figura 2 se transforma en el
esquema 2b de la Figura 2, al no representar los carbonos acoplados a los protones de giro.
Naturalmente, cualquier análisis posterior de la evolución del giro se refiere al 𝛼C𝛽H y 𝛽C𝛽H no
representados de la misma manera.
Justo después del pulso de 90x∘, los componentes de protones que se encuentran a lo largo de −𝑦,
se dividen de acuerdo con el acoplamiento con el socio carbono. Los protones acoplados a los
carbonos con giro 𝛽 se moverán hacia −𝑥, mientras que los acoplados a los carbones con giro 𝛼 se
moverán hacia + 𝑥 (Figura 2, esquema 2b). Se le permite al sistema evolucionar un tiempo de retardo
Δ igual a (21 𝐽CH) −1, donde 1 𝐽CH representa la constante de acoplamiento de un enlace entre un
carbono y el protón directamente unido a él. Después de este tiempo, los componentes de protones
están en direcciones opuestas. En este estado, se dice que los vectores son antifásicos entre sí
(Figura 2, esquema 3). El subsiguiente pulso a carbono de 90x carbon hace rotar los componentes
de carbono desde el eje ± 𝑧 a ± 𝑦 (Figura 2, esquema 4). El estado resultante de este pulso se conoce
como MQC, que es inobservable, y puede pensarse como una magnetización transversal simultánea
de ambos núcleos. El esquema 4 de la figura 2 es quizás la parte más inexacta de esta explicación
vectorial. El hecho es que MQC es indetectable, y el modelo vectorial no puede explicar tal
característica.
4.2. Evolución.
En este punto, los componentes de protones y carbono son antifásicos en los ejes 𝑥 y 𝑦,
respectivamente (Figura 2, esquema 4). Durante MQC, el acoplamiento heteronuclear no
evoluciona [37], que es otra característica que no puede ser contabilizada por el modelo vectorial
clásico. Por lo tanto, tanto las compensaciones de protones como las de carbono, junto con el
acoplamiento homonuclear (no mostrado en la Figura 2), son los observables evolucionados durante
𝑡1 (Figura 2, esquemas 4 a 7). El pulso de 180x∘ para protones en la mitad del período de evolución
sirve para reenfocar su desplazamiento.
4.3. Mezclando
El siguiente pulso de 90X∘ lleva los componentes de carbono al eje ± 𝑧, mientras que los vectores
de protones todavía forman un ángulo de 𝜋 radianes intermedios (Figura 2, esquema 8). Como
resultado, MQC se convierte en Coherencia de Quantum Único (SQC), lo que significa que ahora solo
un tipo de núcleo tiene coherencia transversal. Después de otro tiempo de retardo Δ igual a (21
𝐽CH) −1, los vectores de protones evolucionan bajo el acoplamiento heteronuclear hasta que ambos
componentes están en fase (Figura 2, esquema 9). Vale la pena señalar que los componentes de
carbono en el esquema 8 de la Figura 2 están invertidos con respecto a los representados en el
esquema 2b 'de la Figura 2; es decir, se ha producido una inversión de la población de carbono. Esto
implica que el protón que tiene inicialmente un carbono como compañero de acoplamiento tiene
ahora un carbono as como socio y viceversa. En consecuencia, ambas componentes de protones
finalmente se alinean a lo largo de −𝑦. Luego comienza el tiempo de detección.
OPERADORES PRODUCTO:
Sin embargo, ambas técnicas tienen sus pros y sus contras, tales como:
1. Un espectro HSQC proporciona una mejor resolución en la dimensión indirecta (13C y 15N) en
comparación con un espectro HMQC, y por lo tanto es más adecuado para espectros de
hacinamiento.
2. Las señales HSQC son singletes, mientras que los espectros HMQC usualmente dan múltiplets
debido a acoplamientos homonucleares (1 H – 1 H), lo que complica la interpretación de las regiones
agrupadas de los espectros HMQC. Por lo tanto, el experimento HSQC se prefiere a los experimentos
HMQC para biomoléculas grandes.
4. El experimento HSQC usa significativamente más pulsos que el experimento HMQC, y por lo tanto
es más sensible a las imperfecciones experimentales.
HSQC – Heteronuclear Single Quantum Correlation, provides the same information as HMQC, but
gives narrower resonances for 1 H-13C correlations. Also requires Xdecoupling and hence a large
number of steady state scans and is also more sensitive to pulse imperfections.