FUNDACiÓN PARA LA INNOVACiÓN AGRARIA - FIA

MINISTERIO DE AGRICULTURA

INFORME TÉCNICO Y DE DIFUSiÓN

ANTECEDENTES ADICIONALES

"CURSO DE TÉCNICAS ESPECIALIZADAS DE CONSERVACiÓN

DE ORQuíDEAS y CONGRESO INTERNACIONAL DE
CONSERVACiÓN DE ORQuíDEAS"

CODIGO F01-1-BT-082

Fecha de presentación: 25 de Marzo de 2002.

 MANUAL DE TÉCNICAS DE
CONSERVACIÓN DE ORQuíDEAS

Curso Práctico - 1er Congreso Internacional de

Conservación de Orquídeas. Perth, Australia.
Septiembre, 2001
 MANUAL DE TÉCNICAS DE
CONSERVACiÓN DE ORQuíDEAS

PLANT SCIENCE, KINGS PARK & BOTANIC GARDEN.

Recopilado por Andrew Batty y Mark Brundett.

Traducido por Ximena Alvarez G, Ximena Calderón B., Mauricio Cisternas B.

y Enrique Matthei J.

Colaboradores:
Mark Brundett
K. Sivasithamparam
Margaret Ramsay
Siegy Krauss
Robyn Taylor
Aaron Hicks
Nura Abdul Karim
Nika Debeljak
Sofi Mursidawati
Bob Dixon
Colin Bower
Andrew Brown

Fotografías en cubierta . Arriba : ESEM de pelotón visible en LS de raíz de Prassophy/um fimbriata.

Abajo : Imagen de semilla de Ca/adenia arenico/a en microscopio SEM. Al centro : Plántula
simbiótica de The/ymitra magínií.

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TABLA DE CONTENIDOS

CAPíTULO l. INTRODUCCION 3

CAPíTULO 2. PREPARACIÓN DE SUSTRATOS 10

CAPílTUlO 3. TÉCNICAS GENETICAS PARA lA CONSERVACION DE ORQuíDEAS 11

CAPíTULO 4. TÉCNICA DE GERMINACIÓN DE SEMIllAS DE ORQuíDEA 18

CAPíTULO 5. AISLAMIENTO DE HONGOS DE ORQUíDEAS 29

CAPíTULO 6. CRIOPRESERVACIÓN DE SEMIllAS DE ORQuíDEA y HONGOS 31

CAPíTULO 7. TECNICAS DE MICROSCOPIA 34

CAPíTULO 8. PROPAGACIÓN 48

CAPíTULO 9. CRECIMIENTO DE ORQuíDEAS 51

CAPíTULO 10. CAPTURANDO HONGOS MICORRITICOS EN El SUElO 58

ANEXO 1. REFERENCIAS DE GERMINACIÓN SIMBiÓTICA DE SEMIllAS DE ORQuíDEAS. 62

ANEXO 2. CONSERVACIÓN DE ORQuíDEAS (IUCN) 63

ANEXO 3. PRESENTACIONES EN CHARLA DE DIFUSIÓN 71

Agradecimientos : Se han utilizado partes del libro de Brundett M., Bougher N., Dell B., Grove T.,
Malajczuk. 1996. Working with mycorrhizas in Forestry and Agriculture. Pirie Printers , Canberra.

2
CAPíTULO 1. INTRODUCCION

(Traducido por Enrique Matthei Jensen).

Las Orquídeas se encuentran en todos los continentes de la tierra a excepción de la Antárt ica.
La mayor diversidad de las orquídeas se encuentra en los trópicos con un gran número de
especies epiquitas . La típica abundancia y diversidad de las orquídeas disminuye al aumentar la
distancia que la separa del ecuador terrestre, así también al tornarse más templadas las
condiciones climáticas, las orquídeas terrestres son las que empiezan a dominar. (Jones 1993).

Al aumentar la diferenciación en las condiciones climáticas alejándose de los trópicos, con

variaciones estacionales de precipitaciones y temperatura , los ciclos de vida varían. Así por
ejemplo, la mayoría de las orquídeas terrestres del suroeste de Australia Occidental su período de
crecimiento se restringe a los meses de mayo a noviembre y se ven forzadas a sobrevivir la
sequedad del período estival entrando a un estado de dormancia o latencia.

Diversidad de las Orquídeas.

Las orquídeas son consideradas como el mayor grupo de plantas sobre la tierra, con 20.000 a
35.000 especies agrupadas en más de 750 géneros (Jones 1993). El hecho que abarcan
alrededor del 10 %de las plantas vasculares que florecen indica la gran capacidad de adaptación
en un amplio y variado ángulo de habitas. (Jones 1993).

Una de las razones que explican el alto grado de diversidad de las Orchidaceae puede ser
atribuida a los agentes polinizadores (Darwin 1862; Benzing 1987; y Dressler 1981) La gran
cantidad de diminutas semillas que contribuyen a su variabilidad genética y su alto grado de
dispersión que alcanzan, atravesando barreras ecológicas y geográficas , con ciclos de vida
relativamente rápidos, gran plasticidad tanto en la fragancia como en la arquitectura floral y
preadaptación al epifitismo, contribuyen a la gran diversidad encontrada en las orquídeas (Gentry
and Dodson , 1987; Burns-Balogh and Bernhardt, 1988).

Las flores de las orquídeas están entre las más evolucionadas, tienen gran diversidad en colores y
fragancias (Kaiser 1993; Senghas 1993) así como también rangos en tamaños vegetales , que van
desde plantas microscópicas como P/atyste/e and Bu/bophyllum a largas vainillas , hasta llegar a
plantas gigantes como la Grammatophyllum y Cirtopodium.

Biología de las Orquídeas.

Las orquídeas carecen de un sistema radicular primario y en su reemplazo tiene raíces adventicias
que emergen del tallo. Las raíces de las epífitas pueden durar un par de años y crecen
profusamente . Las raíces aéreas son a veces fotosintéticas , cilíndricas , en contacto con el aire o
lisas cuando se adhieren a un sustrato. Una característica distintiva de las orquídeas epífitas es su
velamen, que está hecho de células de paredes gruesas que forman una funda alrededor de la
raíz, capaz de absorber agua y nutrientes. Sin embargo, las raíces o rizomas de las orquídeas
terrestres , son más bien carnosas , pocas en número y adaptadas para crecer sólo en una
temporada , alrededor de seis meses. Algunas orquídeas terrestres , como las pertenecientes al
género Ca/adenia y Pterostylis tienen raíces muy reducidas o casi ausentes (Ramsay et al. 1986).
Las raíces de muchas orquídeas terrestres son órganos carnosos conocidas como rizomas,
almacenan alimentos y permanecen durante condiciones adversas, (Dixon, 1991). El rizoma
contiene un brote apical que al elongarse forma un nuevo tallo que también genera nuevas raíces.
Algunas especias de orquídeas terrestres producen más de un rizoma de reemplazo cada año,
formando verdaderas colonias (reproducción asexual) sin embargo, generalmente es sólo un
rizoma de reemplazo el que alcanza un desarrollo normal produciendo semillas (reproducción

3
sexual). Los tallos portaflores pueden ser muy variados, a veces restringidos o largos e
hinchados. Los tallos de las orquídeas terrestres son carnosos y suculentos (Hoffman y Brown
1992; Jones 1993) .

Las semillas de las orquídeas son diminutas y carecen generalmente de componentes

estructurales que se encuentran en otras semillas de angiospermas. Generalmente las semillas
miden 2 milímetros de largo por 1 de ancho (Arditti 1992; Arditti y Ghani 2000). La diferencia más
significativa está en la ausencia de células diferenciadas y la falta de reservas nutricionales, como
el endospermo. Hay una pequeña cantidad de Iípidos almacenados en su interior, la envoltura de
las semillas de las orquídeas es una cubierta lipolítica (Arditti 1979).

Las semillas de las orquídeas maduras poseen un embrión simple formado por células
parenquimáticas, que contienen cuerpos proteicos y lipídicos (Manning and van Staden 1987;
Rasmunsen 1990; Richardson et al., 1992) . Para mayores detalles de las estructuras de las
semillas consúltese la recopilación de Peterson et al. (1998). Una característica distintiva de las
semillas de las orquídeas es la ausencia de un tallo meristemático apical diferenciado o meristema
apical radicular, una vez maduro (Veyre 1974).

Micorrizas.

Las micorrizas (hongos radiculares) son una asociación simbiótica entre hongos específicos del
suelo y las plantas comprometidas en una transferencia de nutrientes (Brundrett (2001) para una
definición más completa). Las orquídeas poseen una asociación micorrítica, que es
morfológicamente diferente a otros tipos de micorrizas que involucra fisiológicamente a distintos
tipos de hongos terrestres. (Hadley 1982; Rasmussen 1995; Currah et. Al. 1997; Smith y Read
1997).

A principio del 1900, los investigadores tuvieron éxito en la germinación in vitro observando los
procesos de infestación de embriones y semillas (Bernard 1903; Burgeff 1909). Las opiniones
diferían en cuanto a la relación entre las orquídeas y las micorrizas basándose en las estructuras
observadas. Las micorrizas de las orquídeas se caracterizan por la presencia de densas espirales
en las células corticales en la raíz, vara y protocormos (Harley y Smith 19983; Masuhara y
Katsuya 1994) . Investigaciones histológicas recientes han reconocido dos tipos de micorrizas en
las orquídeas (i) tolypophagy, que se encuentra en la mayoría de las especies y (ii) ptyophagy,
encontradas en un reducido número de especies microscópicas (Le. Gastrodia). Esta fitofágea se
interpreta como una deformación o lisis (llamada también digestión) de las puntas de las hifas
intracelulares, donde el contenido de las células fúngicas es liberado (Burgeff 1959) pero esto
necesita ser confirmado, con investigaciones más acuciosas, utilizando el microscópico
electrónico. En la mayoría de estas asociaciones el endófito forma nítidos rollos, llamados
pelotones, en células infectadas antes que tenga lugar la mencionada lisis o digestión. Sucesivas
olas de formación de pelotones de digestión y reinfección han sido informadas (Burgeff 1959;
Smith y Read 1997) . La transferencia de meta bolitas a través de hongos hospedantes, más en
interfase que en digestión , se considera ahora como un modo primario de transferencia de
nutrientes en todo tipo de micorrizas, pero los flujos no han sido medidos en orquídeas (Smith y
Read 1997) . Este proceso se considera como un mecanismo general defensivo en respuesta a la
invasión del hongo y se considera como una regulación de los procesos metabólicos en asociación
con la planta (Brundrett 2001) .

Hay una variación considerable en la distribución de las micorrizas, ya sea en el tallo o rizoma de la
orquídea. La colonización de las micorrizas ha sido estudiada como esporádica en la mayoría de
las epífitas, pero en general, más diseminadas y consistentes en las orqu ídeas terrestres (Burgeff
1959; Rasmussen 1995). Diferentes géneros de orquídeas terrestres pueden tener patrones de
colonización distintos en sus raíces y tallos (Ramsay et al. 1996) . Estos patrones de infección
micorrítica en toda la planta (raíz, corola, tallo, rizoma , etc.) puede estar asociado a tipos de

4
hongos específicos (Ramsay et al. 1986). Los patrones de colonización de hongos micorríticos en
las plantas están determinados primariamente por las propiedades de las células hospederas, pero
los rasgos morfológicos pueden estar correlacionados por la presencia de ciertos hongos.
(Brundrett 2001).

Hongos de las Orquídeas.

Identidad y especificación.

Los hongos conocidos que forman micorrizas en las orquídeas, son los Basidiomycetes y la
mayoría pertenece al género Rhizoctonia (Sneh et al. 1991; Currah et al. 1997). Estas son
reconocidas por el rasgo general del micelio en cultivo, la presencia en la mayoría de las aisladas,
de pequeños segmentos abultados que asemejan a esporas y la formación de agregados
separados de hifas semejando un poco a una esclerótica poco desarrollada. (Hadley 1982).
Aisladas a veces, forman estados sexuales en cultivo, (un procedimiento difícil de repetir),
Pertenecen al género basidiomiceto Ceratobasidium, Ceratorhiza, Epulorhiza, Sebacina ,
Thanatephorus y Tulasnella (Warcup and Talbot 1967; 1971; Currah et al. 1997). Diversas
combinaciones de hongos pertenecientes a otros grupos también han sido alistados, pero muchos
de ellos no son beneficiosos. (Currah et al. 1997).

La interrogante de la especifidad en las Orchidaceae ha sido un punto de discusión por muchos

años. Knudson, pensaba que existían bajos niveles de especificidad en las epífitas tropicales .
Contrariamente Burgeff (1909; 1959) que trabajó con muchas orquídeas terrestres, concluyó que
existía una especificidad muy fuerte en las asociaciones entre orquídeas y hongos. Burgeff (1909)
distinguió siete categorías en la relación hongo/semilla, variando, entre totalmente incompatible,
hasta plena compatibilidad . Lo que ha probado ser adecuado para describir el rango completo de
interacción. Evidencias adicionales confirmadas hoy en día, afirman que estas hipótesis son
correctas. (Arditti 1992)... Cultivos y tests de simbiosis han demostrado que existen varias razas
con variaciones fisiológicas y morfológicas con respecto al espectro de cada especie o grupo
similar. Por ejemplo Harvais y Hadley (1967), aislaron 244 especies de Rhizoctonia, desde
Dactylorh iza purpurella y otras orquídeas del norte de Inglaterra. Estas pertenecían a 15 grupos
mayoritarios , pero la mayoría de los grupos fue difícil su obtención en más de un hábitat, con la
excepción de R. Perens que estaba más diseminada. Curtis (1939) argumentó que la distribución
ecológica del hongo está relacionado más con el hábitat circundante que con el hospedero .
Hadley (1967) demostró también que la Dactylorhiza purpurella era simbiótica con casi todas las
aisladas. Sin embargo, hay otras orquídeas como las del Goodyera repens , que generalmente está
infectada por un solo hongo (Ceratobasidium cornigerum) en su estado adulto (Hadley 1982).
Estas observaciones pueden explicar el porqué la G. repens se encuentra en áreas más
restringidas que la D. purpurella. Muchas otras orquídeas que han sido estudiadas parecen tener
asociaciones muy específicas con los hongos yen menor grado con el hábitat (eg. Warcup 1981;
Ramsay et al. 1987; Currah et al. 1997; Sen et al. 1999).

Smreciu (1989) demostró que semillas de Platanthera hyperborea germinadas y protocormos , se

desarrollaban tanto en un medio asimbiótico como en un medio Warcup 's, con muchos hongos
endófitos. Richardson (1992) encontró que la orquídea terrestre P. hyperborea germinaba tanto
con Rhizoctonia cerealis o Ceratorhiza goodyerae-repentis y sugirió, basado en evidencias de
(Smreciu 1989) y Masuhara y Katsuya (1989) que las orquídeas del género Plantanthera, puede
que no sean tan específicas a los hongos endófitos. Muchos tipos de hongos han demostrado
tener una relación específica asociados a los géneros de las orquídeas de Australia Occidental
(Ramsay et al. 1986; 1987). Por ejemplo, en cultivos estériles en agar dextrosa de papa, todas las
especies Caladenia examinadas, utilizaban un hongo mucoso, cremoso, de crecimiento lento,
mientras que la Pterostylis, requería un hongo de crecimiento rápido, velloso, espacios endófitos
blancos, para germinación de semillas in vitre y posterior crecimiento y desarrollo.

5
La especificidad de muchos hongos estudiados, se ha basado en tests de germinación bajo
condiciones estériles, presumiéndose que algunos hongos se van a asociar con plantas adultas
(eg. Warcup 1980; Ramsay et al, 1986). Sin embargo, estos estudios concluyen de la importancia
de la asociación micorrítica en la germinación, pero no son necesariamente tan importantes en la
sobrevivencia de la planta. Semillas de algunas orquídeas no van a germinar con micorrizas de
plantas adultas (Masuhara et al. 1993; Zelmer et al. 1997). Se ha descrito que la especificidad del
hongo hospedante, es generalmente menor al tiempo de germinación, que durante el desarrollo de
la siembra in vitro (Muir 1989). Esto decrece nuevamente en cuanto la planta alcanza la fase
fototrópica, cuando muchos hongos distantes pueden encontrarse como endófitos. (Warcup 1981;
Alexander y Hadley 1983). Sin embargo, esta asociación de la germinación de las semillas no
perdura para toda la vida, pero también hay muchos ejemplos donde hongos aislados de plantas
adultas, promueven una generación exitosa (Arditti (1992) por ejemplo). El establecimiento de
plantitas sanas con hojas y no solamente la ruptura de la cutícula, debe considerarse como criterio
para evaluar la compatibilidad del hongo hospedero (Peterson et al. 1998).

Por ejemplo, Warcup (1971 ; 1973) probó combinaciones factoriales en los hongos de germinac ión
para examinar el grado de especificidad de algunas orquídeas terrestres aisladas. Encontró que la
Diuris spp. contenía solamente Tu/asnella ca/ospora (Rhizoctonia repens) mientras que la
Caladenia spp. estaba asociada con Sebacina vermifera. Había también un alto grado de
especificidad fungosa entre la Diuris y Pterostylis. Ramsay el. Al. (1987) usando grupos de hifas
de anastomosis para categorizar asociaciones fúngicas con el género Pterostylis y demostrar que
la distribución de los tipos estaban enlazados al tipo de hábitat específico. Por ejemplo, el grupo
de anastomosis (AG) 8 sólo ha sido reporteado en hábitat calurosos y áridos y el (AG3 en sitios
semiáridos expuestos a hábitats rocosos) el AG4 solamente está asociado con Pterostylis, que
crece sólo en plantaciones de pinos introducidas. Contrariamente los grupos de hongos vicarios,
como el AG2, fueron aislados del grupo Pterostylis en una variada gama de hábitats. Especies
afines al Pterostylis han sido encontradas usando diferentes AG's.

Las orquídeas pueden vivir en simbiosis con diferentes tipos de asociaciones micorríticas, pero la
importancia relativa de estas ca-asociaciones todavía se desconoce. Esta doble asociación puede
minimizar la competencia para una fuente mixta de recursos, si diferentes tipos de hongos acceden
a diferentes tipos de recursos del suelo. En general, la diversidad de la asociación fúngica de las
orquídeas con una orquídea en particular parece ser mucho menor que para otros tipos de hongos
micorríticos. La mayor inferencia del alto grado de especificidad entre el hongo y el hospedero y la
baja diversidad fúngica en las orquídeas, se debe a la restricción de las orquídeas a ciertos
hábitats donde ocurre especificidad fúngica.

Distribución de sustratos.

La distribución especial de los hongos en las orquídeas es desconocida en gran medida. El

sustrato orgánico, que es el último recurso en la nutrición fúngica, está distribuido
desuniformemente en el suelo y las poblaciones de otros hongos micorríticos ocurren en discretos
bolsones de suelo (eg. Brundrett y Abbott 1995). Por eso es razonable presumir que la inoculación
de los hongos con las orquídeas es algo desigual. La competencia entre orquídeas hermanas
para alcanzar micelios, sucede en cultivos in vitro (Alexander y Hadley 1983; Rasmussen et al.
1989; Tsutsui y Tomita 1989). Algunas especies de orquídeas tienden a crecer asociadas mientras
otras lo hacen más diseminadas; sin embargo, esto depende en gran medida de una tendencia
diferencial a producir competencia intraespecífica, entre las poblaciones que pueden influenciar
también los patrones de distanciamiento...

Al comprender la distribución de los hongos micorríticos en el suelo u otros sustratos, es importante

para retornar orquídeas al campo y comprender su distribución. La rala distribución de las
orquídeas tal vez esté influenciada por la presencia o ausencia de hongos micorríticos específicos,
que son esenciales para su sobrevivencia. Una técnica de siembra enterrada en el suelo,

6
preconizada por Rasmussen . y Whigha.m. (1993) permite la distribución efectiva de orquídeas
endófitas para asentarlas in situ en su hábitat natural.

Los primeros trabajos hechos por Curtis (1939) y Harvai~ y ~adley (1967), sugieren que la
asociación fúngica de las orquídeas puede estar más diseminada en el suelo que en los
hospederos. Se han aislado en lugares donde no existían orquídea~ (~ar~up y .Talbot 1967).
Ceratobasidium cornigerum y Tu/asnella ea/ospora parecen tener una dl~tnbuclón ~n1~ers~I, lo que
ocurre también con otras especies. Perkins et al. (1995) observó que diferentes dIS.t~lbu~lo~es de
hongos micorríticos ocurrían en las raíces de Mierotis parviflora, a través de tres ~ltlOS Indicando
que otros factores, así como también la especificidad de los hosp~der~~ eran .Importantes en
determinar cual hongo era micorrítico con M parviflora en cualquier sitio partlc~lar. Factores
ambientales pueden variar considerablemente entre cada sitio. Igua~me~te la densl.dad de cada
hongo en el suelo puede variar temporalmente así como su espaclaml~nto . (~erklns y McGee
1995). Los estudios in situ de las micorrizas de las orquídeas se describen mas adelante en el
capítulo 4.

Dependencia micorrítica y nutrición.

Knudson's (1992) fue el primero en demostrar con sus experimentos que las semillas no tienen un
requerimiento absoluto por las micorrizas, al poder captar nutrientes directamente si se encuentran
a su alcance . Sin embargo, existen numerosas demostraciones de los beneficios que proveen a
las orquídeas las micorrizas, estableciéndose que la mayoría de las orquídeas terrestres tienen un
requerimiento obligado con ellas en hábitat naturales. (Arditti 1992; Rasmussen 1995; Peterson et
al. 1998). Otras evidencias han sido detectadas al observar la asimilación de compuestos
fosforados, utilizando isótopos radioactivos (Smith 1966; 1997; Alexander et al. 1984; Alexander
and Hadley 1985).

Mayores evidencias de la efectividad de las micorrizas en las orquídeas, se comprueba por la

existencia de muchas especies que sobreviven en suelos extremadamente pobres, con escaso
acceso a minerales o con pH extremos, muy altos o muy bajos, con pérdidas de horizontes y
contenido de humos (eg. Sheviak 1974).

La situación de las orquídeas epífitas es menos clara, ya que sus protocormos llegan a ser
fotosintéticos en un estado temprano y las plantas adultas tienen una colonización fúngica limitada
y esporádica , lo que puede indicar una dependencia micorrftica decreciente (Rasmussen 1995).
Un estudio reciente en la germinación de semillas epífitas ha demostrado que los hongos
micorríticos pueden llegar con la absorción de agua (Yoder et al. 2000).

Las micorrizas de las orquídeas difieren de las típicas asociaciones ECM o VAM, ya que los
hongos de las orquídeas pueden proveer una fuente de energía, así como también nutrientes
minerales a sus plantas hospederas (Rasmussen 1995). Estos compuestos carbonados ,
presumiblemente derivan del quiebre de sustancias orgánicas en los sustratos circundantes. La
transferencia 14 C de los hongos de las orquídeas hacia la planta hospedera, ha sido demostrado
(Alexander y Hadley 1985), pero la última fuente de este carbono no ha sido determinada. El
carbono radioactivo ha sido rastreado de los hongos a la semilla, pero no de la semilla a los
hongos. La planta tal vez supla vitaminas o aminoácidos esenciales a los hongos en ciertos casos
(Leake 1994). Sin embargo, no hay ninguna evidencia real que los hongos reciban beneficios
sustanciales de las asociaciones con las orquídeas y a menudo crecen sin ninguna presencia de
orquídeas .

Las asociaciones micorríticas donde los hongos parecen no recibir ningún beneficio de la planta se
llaman epiparásitas, micro-heterotróficas, asociaciones engañosas, o asociaciones explotativas
(Leake 1994; Taylor y Bruns 1999; Brundrett 2001). Este es el reverso en la mayoría de las
relaciones entre plantas superiores y hongos. En este enunciado estas asociaciones se catalogan
como asociaciones explotativas de las micorrizas, reflejando la naturaleza de esta relación desde

7
el punto de vista de los hongos. Entre las Orchidaceae se encuentran especies con diferentes
grados de dependencia con las micorrizas, abarcando desde las autotróficas plenas,
presumiblemente con asociaciones micorríticas mutualistas, hasta las heterotróficas totales, con
asociaciones engañosas. Sin embargo, la naturaleza de esas asociaciones micorríticas en muchas
de estas plantas, no han sido investigadas y su dependencia nutricional del hongo ha sido
presumido, al faltar otras explicaciones.

Poco se sabe al respecto de otros roles ecológicos de los hongos asociados a las orquídeas
verdes, y alguno de estos hongos tienen un impacto adverso sobre otras plantas. Por ejemplo, las
orquídeas epífitas a veces parecen tener determinados efectos sobre los árboles (Ruinen 1953;
Johansson 1977), pero esto puede ser el resultado de la correlación entre la abundancia de
epífitas y la declinación del árbol, más que otros factores. Hay algunos casos en que las
Rhizoctonia aisladas de las orquídeas han sido identificadas como patógenas en las raíces de
otras plantas (Warcup 1985; Zelmer et al, 1996) sin embargo, la mayoría de las orquídeas tienen
una acentuada asociación específica con Rhizoctonia , que no se ha sabido que sean patógenas
para otras plantas (Warcup 1981; Ramsay et al. 1987; Muir 1989; Currah et al. 1997; Sen et al.
1999). Actualmente la información es insuficiente para poder afirmar con seguridad si las
orquídeas autotróficas normalmente están asociadas con hongos del suelo inespecíficos u hongos
micorríticos específicos. Este conocimiento es esencial para nosotros para desarrollar un
conocimiento de la biología y ecología de estas hermosas y fascinantes plantas.

Germinación de semillas de orquídeas.

Esta sección focalizada en las orquídeas terrestres, así como epífitas típicas se propagan por
medios asimbióticos. Tal como se ha venido discutiendo, hay una estricta evidencia del rol vital que
los medios asimbióticos en las orquídeas. Esto contrasta con las orquídeas epífitas donde los
hongos micorríticos tienen una menor importancia después de la germinación de la semilla.

Las diminutas semillas de las orquídeas tienen muy pocas reservas nutricionales almacenadas
para su germinación (Arditti y Ghani 2000). Estas reservas limitadas y la germinación subterránea
en la mayoría de las especies terrestres, hacen pensar que en general los hongos micorríticos son
normalmente esenciales en la germinación de las semillas. Estudios comparativos en la
efectividad de las asociaciones simbióticas y asimbióticas en la germinación. ha demostrado
convincentemente que la germinación simbiótica ha sido más rápida y efectiva que la germinación
asimbiótica (ver Person et al. 1998). En algunas orquídeas terrestres una germinación exitosa era
sólo posible con una asociación simbiótica (Hadley 1982). Muir (1989) abarcando un gran rango
de hongos aislados por su capacidad para promover la germinación de las especies europeas de
orquídeas. Ophrys, Dactylorrhiza y Serapias . Encontró que algunas especies eran compatibles
con algunos hongos aislados de un mismo género. En algunos casos hongos diferentes eran
responsables del crecimiento de plantas maduras más que en la germinación de semillas. Hay
poca información disponible de la germinación in situ de la semilla de orquídea (Masuhara y
Katsuya 1994; Zelmer y Currah 1997; Rasmussen y Whigham 1993; Currah et al. 1997).

8
Conservación de orquídeas.

La fenomenal diversidad de las orquídeas y varios procesos amenazantes han derivado en que
muchas especies de orquídeas se encuentren en vías de extinción.

Cuadro 1 1 Pautas de conservación de orquídea de rango universal (IUCN 1996).

Amenaza Causa
Destrucción de hábitat, modificación y fragmentación Tala de bosques
Agricultura y plantaciones
Hábitat alterados
Desarrollo urbano
Minería
Recolección de hábitat natural Explotación agrícola
Coleccionistas amateur
Orquídeas comestibles

La alteración o destrucción de un hábitat pone en riesgo a cada especie en diferentes grados de

acuerdo a su distribución geográfica, hábitat específico y grado de contaminación. La rareza de
una especie puede determinarse basándose en este criterio (Rabinowitz et al. 1986). Las especies
raras de orquídeas están intrínsecamente más expuestas a la extinción que aquellas más comunes
al sobrevivir catástrofes naturales (incendios, inundaciones o severas e inusuales variaciones
climáticas).

Al comprender mejor la biología de las especies nos ayudará a ser más eficientes en nuestros
esfuerzos conservacionistas . Muchas de las especies amenazadas en Australia Occidental
requieren de una asistencia inmediata si queremos preservarlas. El trasplante de especies al
campo para completar poblaciones es una alternativa válida para los dueños del suelo. (ANPC,
1997). Estudios cuidadosos de la historia de la vida de las plantas, proporciona una información
invaluable para el futuro manejo poblacional de la flora amenazada en Australia Occidental.

Las orquídeas están bien estudiadas desde el punto de vista taxonómico, pero se sabe
relativamente poco acerca de su biología e importantes métodos de manejo para trasplantarlas .
Distinto a otras plantas, las orquídeas también son únicas en su especificidad de los agentes
polinizantes. Requieren de una tecnología sofisticada para propagarlas en gran escala. Estos
métodos incluyen (i) Colección de semillas y hongos simbiontes que sean efectivos en la
germinación (ii) Desarrollo de métodos efectivos de propagación para las especies amenazadas
(iii) Trasplante de orquídeas a sitios seguros.

Las asociaciones simbióticas se consideran esenciales en el género Orchidaceae. Sin embargo,

tenemos conocimientos limitados de la ecología de las orquídeas, su asociación simbiótica y la
interrelación entre ellos. La mayoría de los conocimientos actuales de los hongos de las orquídeas
y su interrelación con la planta hospedera, se basan en estudios in vitre usando hongos aislados
de plantas maduras. Sin embargo, en los últimos años investigaciones han demostrado la habilidad
de revelar algunos misterios de las micorrizas de las orquídeas bajo condiciones K.

Todavía existe una gran cantidad de investigación que será necesario llevar a cabo en el mundo
para revelar los secretos restantes de la biología de las orquídeas y la biología de los hongos
asociados.

Técnicas presentadas en este manual, serán utilizadas para empezar este curso.

9
CAPíTULO 2. PREPARACIÓN DE SUSTRATOS

(Traducido por Enrique Matthei Jensen).

Hay un gran número de sustratos rutinarios usados en la propagación de orquídeas por sustratos
de protocolos asimbióticos. Una lista exhaustiva es presentada por Rasmussen (1995) y Hicks
(2000). Los sustratos comunes para tratar con la germinación simbiótica de las orquídeas
terrestres en Australia se detallan a continuación. Estos son los principales sustratos usados en
este trabajo.

Asimbiótico.

Anotaciones en la formulación de sustrato . Hay algunas fórmulas de sustratos que se pueden

conseguir en el comercio. Todos son (o deberían ser) el producto de una experimentación para
obtener rend imientos óptimos. Algunas fórmulas son conocidas y otras están patentadas y no
publicadas. Este es un sustrato madre se usa para la germinación de semillas, y un sustrato de
transplante que se usa para hacer crecer los protocormos hasta un tamaño donde puedan ser
trasplantadas exitosamente.

Un sustrato utilizado preferentemente es el P-6668 vendido por la Sigma-Aldrich Chemical

Company, también se vende como P668 (Phyto Tech Labs). Es barato, confiable, de fácil alcance
y su fórmula está publicada. Una desventaja primaria es que es muy fuerte para muchas especies
y debe ser empleado diluido. Es muy flexible y puede ser utilizado combinándolo con plátano. Una
fórmula comercial es el P-1056 (Sigma-Aldr ich) es P.668 más 30 grs. de una mezcla de polvo de
plátano al 50 % con malta dextrina. Es fácil de comprar el P-6668/P y agregarle 50 grs. de
alimento para bebés de pulpa de plátano para hacer un medio conveniente de transplante. Si se
usa plátanos crudos, las frutas deben ser lo más madura posible . Debe estar congelada para
obtener un puré antes de deshacerlo.

De la misma manera el P6668/P668 puede ser usado para reemplazar el sustrato madre
agregando pulpa de plátano y otros "aditivos complejos" puede ser usado de la misma manera.
Este sustrato puede demandar la adición de plátanos, piña, leche de coco, todos los cuales
contienen altos niveles de azúcar reducida entre otras cosas. Esto contrasta con el sustrato madre
que contiene sólo sacarosa, un disacárido (que probablemente se desdobla convirtiéndose en
glucosa y fructosa durante el proceso de autoclave en una solución ácida mediana. La fructosa se
encuentra virtualmente pura en la miel.

Para algunas especies terrestres que toleran el frío, aditivos especiales como sabia de abedul,
cubos de papas y otros componentes complejos han sido mostrados para benefic iar la germinación
o desarrollo de plantas de semillas. Es importante mantener bajo estricta observación el desarrollo
de cultivo . Si los protocormos de la placa madre se tornan verdees o de otro color deben ser
trasladados lo más rápido posible a un medio fresco de transplante antes mueran. Además si los
transplantes de protocormos o plantitas de semillas no están prosperando bien en un medio
determinado, no tarde en removerlos a un nuevo medio para ver si mejora su crecimiento.

Esta información ha sido proporcionada por la Orchid Seedbank Project, Chandler, Arizona, USA y
puede ser reproducida sin problemas sin alterar su fórmula .

10
CAPílTULO 3. TÉCNICAS GENETICAS PARA LA CONSERVACION DE ORQuíDEAS.

(Traducido por Enrique Matthei Jensen).

Actualmente , existe un desconcertante número de técnicas disponibles para el análisis de variación

de las poblaciones a nivel individual. Estas notas entregan una breve introducción para algunas de
éstas. Un listado de referencias con información más detallada se adjunta. La atención
preferencial se da al PCR multi-Iocus DNA finger print (huella digital) AFLP que es una técnica
preferencial usada en el Kings Park para resultados prácticos en conservación, restauración y
cultivo de plantas nativas. Algunos de los marcadores empleados incluyen Allozymes , RFLP,
RAPDs, DAF, AFLP, SCAHs, SAMPL, microsatélites (SSRs), Minisatélites como también
secuenciadores de DNA.

Este arsenal de marcadores puede ser reducido a algunas categorías principales :

Marcadores codominantes - los dos alelos en un organismo diploides es visualizado por un

sistema de marcador genético tal como se detectan los genotipos homo y heterocigotos. Los
ejemplos incluyen allozymes RFLPs y microsatélites. A nivel de fenotipos , el gen producido por
ambos alelos es detectado , produciendo dos bandas en el gen en un locus (sitio) dado.

Marcadores dominantes. Sólo un alelo en un organismo diploide es visualizado por un sistema

genético de marcadores , tan sólo dos genotipos son detectados, cualquiera de los dos ya sea,
presencia de banda o su ausencia. A nivel de fenotipos el gen producto de un solo alelo (ya sea
en forma homocigoto u heterocigoto). Los ejemplos incluyen RAPDs and AFLP.

De esto se puede hacer una distinción entre las técnicas basadas entre el PCR y no PCR. Las
técnicas no-PCR incluyen a los allozymes y los RFLP. Las PCR incluyen RAPD, AFLP Y
microsatélites.

PCR (reacción de polímeros en cadena)

Utiliza la mezcla de la enzima polimerasa del DNA con una reacción compleja haciendo millones
de copia de DNA de una sola copia, permitiendo la visualización del gel electroforético.
Comprende 4 pasos:

1. Desnaturalizar. La mezcla de reacción se calienta hasta 94 0 C para separar las dobles

estrías de DNA transplantándolas a moléculas de estrías simples.

2. Recogimiento. Temperaturas menores de 40-70 0 C que permiten a las moléculas cortas

de DNA llamadas "primers" o primarias (8 a 20 pares bases de largo) para reconocer "sus
estrías complementarias ".

3. Extensión. Al aumentar la temperatura hasta 72 o C para permitir el acoplamiento de

estrías simples de DNA comenzando en el primer complejo templado . La polimerasa del
DNA es el catalizador para esta extensión.

4. Repite los pasos 1-3 de 20 a 50 ciclos para amplificar las regiones del DNA flanqueadas
exponencialmente por los primers.

El uso de estabilizadores de temperatura en la polimerasa del DNA que sobrevive la larga

exposición de altas temperaturas requeridas por el PCR, y el desarrollo de termociclos capaz de
ciclar las temperaturas rápidamente y con precisión, han facilitado la automatización de este
proceso y revolucionando el análisis de variación genética a nivel de poblaciones .

Las principales técnicas genéticas para conservación incluyen:

11
Allozyrnes. Son formas alternadas de enzimas codificadas por diferentes alelas en el mismo
locus (sitio). Estas allozymes se preparan homogeneizando tejidos para producir una solución
proteica por la electroforesis, a través de un gel (almidón o acetato de celulosa). Productos
enzimáticos específicos son visualizados por el uso de una tinción facilitando la reacción
enzimática. Por ejemplo, el alcohol de dehidrogenasa es transformado en aldehido, que se
combina con un tinte para visualizar las bandas. Los alelas de diferentes tamaños tienen diferente
movilidad.

RFLP son (restricción, fragmentada, largo, polimorfismo) El polimorfismo en sitios específicos en la

secuencia del DNA revelado por cortes del DNA con enzimas restringidas, electroforesis, haciendo
pasar este producto por una membrana que es después probada con DNA radioactiva, permitiendo
visualizar bandas de distintos tamaños.

RAPDs (Ampliación aleatoria, polimorfismo DNA). El polimorfismo obtenido por ampliación de

fragmentos del DNA por PCR usando "arbitrariamente" primers. Los primers son típicamente diez
bases de largo y sirven para ampliar hacia adelante o hace atrás. Los fragmentos de DNA, por
electroforesis en un gel de agarosa, es visualizado con el uso de bromuro de etidio y de una fuente
de luz ultravioleta.

Microsatélite. (Repetidores de secuencias simples SSRs). Repetición en tandem de arreglos de

nucleótidos muy cortos (1-6 largo de base) ego (CA) 17 o (AAG) 12. Los primers específicos
amplían estos sitios por PCR, con visualización por electroforesis en gel de agarosa o gel de
acrilanida, usando un secuenciador fluorescente automático.

AFLP (Polimorfismo ampliado fragmentado largo) Una poderosa técnica de huella digital basada
en el nuevo PCR multilocus de DNA con gran capacidad de reproducción y gran aplicación. El
número de pasos a seguir incluyen - restricción del DNA con restricción de enzimas tal como
EcoRI y la MSN.; ligación de los adaptadores al final de estos fragmentos; una preselección PCR,
usando un primers EcoRI y un primer Msel, cada uno con una base de extensión detrás del sitio
del adaptador. Una ampliación selectiva de PCR, usando EcoRI y Msel primers con 2.3 o 4 base
de extensión detrás del sitio del adaptador - el EcoRI es un primers fluorescente que permite la
electroforesis y la visualización en un secuenciador automático de DNA. Demarcación de huellas
digitales usando un software específico como el GeneScan y el Genotyper. Fragmentos
individuales son clasificados con precisión por la inclusión de un estándar interno de una amplitud
de onda diferente (color) para más detalles consulte más adelante.

Variaciones genéticas generadas por todas estas técnicas son visualizadas por alguna forma de
electroforesis. La electroforesis es la migración de partículas a través de un medio gel bajo la
influencia de la corriente eléctrica. Proteínas o fragmentos de DNA de diferentes tamaños migran a
través de gel a diferentes lugares. La visualización de estos productos es a través del uso de
colorantes como el bromuro de etidium, o por el uso de tinciones fluorescentes de DNA al usar un
secuenciador automático.

Recopilación y análisis de datos.

Como se ha mencionado, los marcadores codominantes como los allozymes y los microsatélites
nos permiten distinguir los heterocigotos y los homocigotos en un locus aislado (sitio). Los
heterocigotos producen dos bandas por la electroforesis por un gel, uno por cada alelo. Los
homocigotos producirán una banda única si ambos alelas son idénticos. Frecuentemente estas
bandas homocigotos van a doblar la intensidad de la banda de los heterocigotos. Por consiguiente
con una población en un sitio único, estamos en condiciones de determinar el número de alelas, la
frecuencia de cada alelo, la heterocigosidad observada, la heterocigosidad esperada, basada en el
equilibrio de Hardy- Weinberg y como las poblaciones se diferencian en su frecuencia de alelas.

12
En sitios múltiples, podemos calcular el porcentaje de sitios polimórficos y el porcentaje de alelos
por sitio. Podemos calcular igualmente la proporción de la variación total con jerarquías sobre o
entre las poblaciones. Esta estructura de la variación genética puede ser usada bajo ciertas
presunciones para inferir en los niveles históricos de la corriente de genes. Esto incluye la
variación en el uso de microsatélites para la caracterización de las poblaciones, análisis de
paternidad y relaciones individuales.

Para marcadores dominantes como el RAPOs y AFLP, los heterocigotos no se pueden distinguir
corrientemente de un heterocigoto por consiguiente estos geles se ordenan típicamente de
acuerdo a la presencia o ausencia de fragmentos en un tamaño particular. La estadística de
poblaciones que deriva de estos datos incluye el porcentaje de marcadores que son polimórficos
por población. Estimaciones de la heterocigosidad esperada puede hacerse bajo ciertas
presunciones. Sin embargo, la desventaja de dominancia es sobrellevada especialmente con la
AFLP, por la generación por un número bastante elevado de marcadores por individuo. Como
consecuencia solamente las huellas digitales DNA pueden generar distinciones genéticas
individuales. Por consiguiente, los marcadores AFLP a menudo permiten una asignación sin
ambigüedades de la paternidad en poblaciones naturales. La presencia /ausencia de la matriz de
datos puede ser convertido en una de estimación de la distancia genética entre individuos usando
medidores de distancia como la distancia euclidiana, la que puede ser analizada a través de un
análisis cerrado, o mejor aún por una técnica de ordenamiento como una escala multidimensional.
Este "mapa genético" resume la distancia entre todos los individuos analizados. Por ejemplo
nosotros estamos usando este tipo de análisis para delinear la proveniencia genética de especies
amenazadas para ser restaurada. La presencia/ausencia de la matriz de datos también puede ser
usada para las particiones de análisis de variación por ejemplo usando AMOVA (análisis de
variación molecular), que es análoga a la convencional ANOVA, y que se encuentra en el
programa Arlequín, o en Genalex (ver los programas computacionales a continuación).

NOTAS TECNICAS

1.- EXTRACCION DE DNA

Tal vez el paso más crítico para el análisis molecular y particularmente AFLP es la extracción
limpia de la molécula pesada DNA. He aquí algunas técnicas extractivas del DNA que usamos en
el laboratorio del Kings Park.

1.a) DNAZOL ®

El DNAzol es el procedimiento de mayor uso debido a su rapidez, efectividad y bajo costo. A

trabajado bien para nosotros en un amplio rango de taxa . Es una nueva técnica , basada en una
solución Iysign detergente de guanidina que permite la precipitación selectiva del DNA de un
Iisado de células.

DNAZOL obtenido del Invitrogen (formalmente tecnologías vivas).

Muela tejido de plantas (100mg) en nitrógeno líquido usando un mortero y atacador (micro
atacador y Eppendorf)

Agregue 300 ul DNAZOL y mezcle bien.

13
 Agregue 1-2 Enjuague e incube por 1.5 horas a 25 oC.

Agregue 300 ul de cloroformo y mezcle vigorosamente. Bata o centrifugue a 13.500

revoluciones por minuto durante 10 minutos, traspasando el contenido a un tubo nuevo.

Agregue 225 ul de etanol al 100% frío. Mezcle por inversión y déjelo reposar por 5 minutos.

Centrifugue a 10.000 rpm por 4 minutos .

Elimina el sobrenadante . Lave el pellet con 300 ul de DNAzol (1 volumen de DNAzol y 0.75
volumen de etanol al 100 %. Deje reposar por 5 minutos.

Centrifugue a 10.000 rpm por 4 minutos.

Vierta el sobrenadante y vuelva a avar los pellets con etanol 70 % (2 veces) .

Elimine el sobrenadante y seque los pellets Disuelva en 70 ul TE (o en agua) .

1.b) PROCEDIMIENTO DE EXTRACCiÓN CTBA (Vea la referencia Doyle al final)

Muela el material de hojas en nitrógeno líquido hasta obtener polvo.

Agregue 500 ul extracto buffer CTAB. Incube a 65 oC por 15-20 minutos.

Centrifugue a 11.500 rpm durante por 10 minutos. Deje decantar el sobrenadante y agregue
200ul de acetato de potasio 5M (pH 4,8) . Mezcle suavemente y deje reposar en el congelador
por 10 minutos .

Deshiele y centrifugue a 11.500 rpm durante 10 minutos a 4 oC.

Elimine sobrenadante cuidando el volumen y después agregue cantidades iguales de

cloroformo a la muestra .Mezcle bien y deje en el batidor por 10 a 60 minutos.

Centrifugue a 8.000 rpm por 10 minutos, transfiriendo la parte superior a un nuevo tubo. Repita
el paso 5 si esta turbio .

Agregue 330 ul de isopropanol y mezcle con cuidado para que precipite el DNA . Haga reposar
en congelador por 5 a 30 minutos.

Centrifugue a 3.000 rpm por 15 minutos y recoja el DNA (cuidado : los pellets no estarán
sólidos).

Para separar el DNA de los polisacáridos, disuelva el pellet en estado viscoso en 100 ul DI
agua y después agregue 400 ul de NaCI 2,5M.

Precipite el DNA agregando 1 mi de etanol 95% frío.

Centrifugue a 6.000 rpm por 10 minutos, descartando el sobrenadante.

Lave los pellets con 1 mi de de etanol 70% (para remover sales), deje que decante el líquido.

Seque y suspenda nuevamente el DNA en 100 ul 0,1 TE.

14
 RNAse con 1-2 ul de enzima a 37 "C por 60 minutos.

1.c) Jobes el al. (199S-ver referencias) procedimiento de extracción.

Una alternativa excelente para un proceso CTAB para remover eficientemente los polifenoles,
polisacáridos y RNA. Se basa en el uso del PVP para ligar compuestos polifenólicos a una alta
concentración molecular de cloruro de sodio para inhibir la coparticipación de polizacaridos y NDA ,
Y un método mejorado para remover RNA por precipitación selectiva de cloruro de litio. Sin
embargo , toma mucho tiempo para que el procedimiento DNAzol o QIAGEN DNeasy, y requiere el
uso de algunos reactivos repugnantes (fenol, cloroformo , cloruro de litio).

1.d) QIAGEN DNeasy .

Hemos usado el Qiagen Dneasy Kit (cat #69104) con resultados generales muy buenos. Tiene la
característica de ser muy rápido y no necesita cloroformo o fenol. Sin embargo, esta opción es más
cara alrededor de 5 dólares por muestra. Al compararlas la extracción DNAzol cuesta alrededor de
1,5 dólares por muestra.

2. PROTOCOLO AFLP .

Utiliza como reactivo central disponible del Invitrogen (anteriormente Life Technologies) cat #
10482-016.

Ver también : PE Applied Biosystems. 1996. AFLP(TM) Plant Mapping Protocol. Part Number
402083, Revision B. PE Applied Biosystems , Foster City, California .

2.1 DIGESTiÓN RESTRICTIVA DEL GENOMA DNA.

Agregue lo siguiente a un tubo eppendort de 1,5 mi creando una mezcla master.

o SX reacción Buffer 2.5 ul

o EcoRI/Msel 1 ul.

Mezcla Master alícuota, agregue después a 200 -500 ng de muestra DNA (hasta un volumen
máximo de 9 ul- complete la diferencia con agua) dando un total de 12,5 ul.

Mezcle con cuidado y brevemente revuelva. Incube a 37 "C por 2 horas .

Incube la muestra hasta 70 "C por 15 minutos. Coloque los tubos en hielo.

2.2 Ligason de adaptadpres.

Agregue a la muestra descrita arriba

Solución de Iigason de adaptadores 12 ul.

T4 DNA ligason 0.5 ul.

15
 Mezcle con cuidado y revuelva brevemente . Incube a 20 grados por 2 horas o/nite.

Ejecute la dilución 1:1O de la mezcla de ligación como sigue :

Tome 5 ul de mezcla de reacción y traspaselas a un nuevo tubo. Agregue 45 ul 0.1 TE buffer

mezcle bien .

Etiquete tubos.

2.3 REACCION PRE-SELECTIVA PCR .

Agregue lo siguiente a 1.5ml eppendorf como mezcla maestra

Pre-amp primer Mix I (del invitrogen cat # 10792-018 10ul
10 x PCR buffer ( no MgCI) . 1,25 ul
1.5 Mm MgCI 0,8 ul
Taq (0.3 Unidades) 0,06 ul.

Agregue 12.1 ul de mezcla maestra en cada PCR well.

Agregue 1.25 de DNA diluida del paso 2 .

Agregue PCR : 20 ciclos de 94 oC durante 30 segundos, 56 oC durante 60 segundos , 72 oC

durante 60 segundos .

Logre una dilución de 1:50 tomando 3 ul del producto preseleccionado PCR y agregue un
nuevo tubo conteniendo 147 ul de 0.1 TE.

Etiquete los tubos (3C).

2.4 REACCION SELECTIVA PCR.

Agregue lo siguiente a 1.5 mi eppendorf como muestra matriz pre-reacción .

10 x PCR Buffer (no MgCI) 1ul
1.5mM MgCI 0.6 ul
Tac (0.25 Units) 0.05ul
Agua 3.10ul

Tome una alícuota de 4.75 ul en cada PCR well.

Primex mix.

m-primer 2.25u l
e-primer (Labeled) 0.25 ul

Agregue 2.5 ul del primer mix concentración ( final 15 ng m-primer y 7.5 ng e-primer) a cada
PCR conteniendo la mezcla master. Note que incluimos esta sigla dNTPS en la m-primer para
obtener una concentración final de 0.2 mM para cada una.

+2.5 ul de su "3C" templada de DNA.

16
PCR SELECTIVO .

Un touchdown PCR comenzando con un ciclo 94 "C durante 30 segundos, 70 "C durante 2 minutos
y de 72 "C por 12 minutos. En ciclo subsecuentes la temperatura se reduce en pasos de a 1°C
hasta 61°C, seguido por 23 ciclos a 61 "C .Un paso único de 60 oC por 30 minutos, sigue antes
de mantener a 4 oC.

2.5 Electroforesis en un ABI Prism 377 Automated Seguencer

Formamide Master Mix.

361anes 48lanes.
Formamide 30 ul 40 ul.
ROX 500 8 ul 12ul
DYE 14 ul 20ul

Agregue 1.3 ul en cada tubo , y después agregue 2.5 ul de cada producto PCR seleccionado .

Mezcle y centrifugue , 90 grados de un baño María por 2 minutos después hielo. Cargue 2 ul
(36 lanes) o 1.5 ul (48 lanes) a gel. Remueva la combinación de papel después de comenzar a
girar.

La electroforesis se produce usando 5 % de gel de acrilamida usando un prisma ABI 377

secuenciador automático.

17
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C ha pte r J - 17
CAPíTULO 4. TÉCNICA DE GERMINACiÓN DE SEMillAS DE ORQUíDEA

(Traducido por Ximena Calderón Baltierra, Laboratorio de Cultivo de Tejidos, Universidad de

Talca).

SEMillAS

Las semillas son el material que generalmente se prefiere propagar para maximizar la diversidad
genética de plantas que se producen. Como la principal forma de dispersión de semillas de
orquídeas es por el viento, cada cápsula tiene miles de semillas. Las semillas terrestres tienen
fama de ser difíciles de germinar. En cierto grado esto es cierto, pero ellas no forman grupos
homogéneos con respecto a los requerimientos para germinar y para el desarrollo de las plántulas,
y, aunque se han resuelto algunos problemas hay todavía mucho por descubrir.

Cuando se propaga a partir de semilla hay que considerar factores como la calidad de la semilla.
Esto puede aparecer muy obvio, pero se ha gastado mucho dinero y esfuerzos en proyectos donde
se han usado complicadas técnicas sin éxito, debido a la pobre calidad de las semillas.

POLINIZACiÓN

Las poblaciones pequeñas pueden tener problemas para atraer polinizadores y puede haber
mecanismos de incompatibilidad que pueden prevenir la producción de semillas. Si se colecta de
poblaciones polinizadas en forma natural, se puede usar una pauta de la proporción colectada
(colectando varias plantas, tomando no más del 10%, no colectar cuando no hay muchos
individuos siguiendo las pautas que se usan normalmente).
Si la producción de semillas es baja, entonces es mejor la polinización manual, mantener una
colección de plantas ex situ donde no halla polinizadores o no tengan acceso a ellas. También la
polinización cruzada puede ser ventajosa y se aconsejan para estudios de conservación genética .
En muchos casos es aconsejable probar la eficacia del polen mediante la técnica de la gota
pendiente descrita por Light y MacConnaill (1996).

COLECTA

Los científicos frecuentemente cuentan con Botánicos de campo, conservadores , etc., para
colectar cápsulas. Es importante dar instrucciones claras. Esto puede incluir pautas de cuando
colectar las cápsulas, tiempo promedio para que maduren las cápsulas, tipo de contenedor,
empacamiento . Se debe enfatizar en el no uso de bolsas plásticas o contenedores que retengan la
humedad, por lo que será difícil remover las semillas por cuestiones de estática. Las semillas no se
deben poner en el refrigerador. Una vez recibidas hay que registrar: donador, procedencia, fecha
de cosecha, condiciones de la semilla) y en lo posible poner un ejemplar en el herbario.

18
COLECTA DE SEMILLAS DE ORQUIDEA PARA LA PROPAGACION

1. Como pauta, la cantidad de semillas que se colecte no debe ser mayor que el 10% de las
semillas disponibles en un día de colecta. Donde hay pocos individuos no se debe colectar.

2. El momento adecuado para colectar emillas es cuando la cápsula está comenzando a ponerse
café, antes que la cápsula se parta. En este estado las semillas están completamente
desarrolladas , pero se corre el riesgo de contaminación por esporas de hongos y bacterias.

3. Por lo general las cápsulas maduran a destiempo en la misma inflorescencia, por lo que se
recomienda colectar las cápsulas individuales y dejar que las inmaduras terminen su proceso
en forma natural.

4. Colectar preferentemente en viales de vidrio poniendo pocas cápsulas por frasco. Tapar con
algodón y envolver en papel.

5. Es muy difícil recuperar las semillas que se han colectado en envases plásticos. No las deje
en el refrigerador. Debe identificarse las cápsulas con la siguiente información: especie ,
localidad, fecha de polinización, fecha de colecta, colector.

HACER LÁMINAS (PARA PORTAOBJETOS) DE SEMILLAS GERMINADAS

Es adecuado preparar muestras para microscopio de las semillas que se germinen. Si la recepción
de las semillas es desconocida , el color, forma y tamaño pueden ayudar a distinguir los géneros.

Muchas las semillas pueden parecer normal pero no tener embrión. El hacer una preparación para
observar en portaobjetos es útil para registrar esto y pede indicar que la semilla no ha sido
sembrada mal. Indicaciones (figura 4.1):

Llene un vaso precipitado con agua caliente

Ponga un vial que contiene glicerol en el agua, deje hasta que hierva.
Sobreponga el portaobjeto en la boca del vaso precipitado y agregue una gota de glicerol en
el centro del portaobjeto.
Deje caer una pequeña cantidad de semillas de orquídea de semillas y agite con aguja.
Ponga un cubreobjeto circular y luego selle con pintura de uñas incolora.
Observe al microscopio.

Se puede agregar los colorantes Alcian blue o Azul de Coomasico al glicerol pero no es esencial.
La tinción se usó originalmente para teñir polen. Los embriones de semilla generalmente se
observan sin teñir.

19
Figura 4.1. Preparación para observar en portaobjetos.

con una gota

Frasco que contiene

glicerol

Agua caliente

¿SEMILLAS MADURAS O INMADURAS?

La ventaja de colectar semillas madura es que se puede almacenar y germinar mas tarde, pero la
inmadura no. La semilla madura ideal es aquella se que se obtiene de cápsulas a punto de abrir.
En este estado las semillas están totalmente maduras y se evita correr el riesgo de contaminación
con hongos y bacterias que es tan frecuente con este material.

Técnicas de germinación de semillas inmaduras

Las cápsulas verdes generalmente son difíciles de hacer germinar. La desventaja de usar semillas
de cápsulas inmaduras es el riesgo que lleven virus. Si las cápsulas se colectan muy temprano
ocurrirá la maduración en una pocas semanas.

Técnicas de germ inación para semillas maduras

Se pueden dividir en dos grupos: semillas en contacto y no en contacto con el esterilizante .

Las semillas en contacto directo con la solución de lavado deben ser expuestas a bajas
concentraciones del mismo y por tiempos cortos. La tensión superficial las hace flotar por lo que se

20
recomienda usar agentes surfactantes, infiltración al vacío y agitadores. La transferencia debe
hacerse en campana de flujo laminar para mantener la asepsia.

GERMINACION A PARTIR DE CAPSULAS VERDES

• Corte la cápsula con bisturí estéril. Cambie de bisturí entre una y otra cápsula para evitar la
infección viral. Las cápsulas colectadas se pueden almacenar pero es preferible usarlas de
inmediato (figura 4.2).

• Cuidadosamente elimine cualquier resto de partes secas de la flor que queden adheridos.

• Cepille las cápsulas con cepillo de dientes suave con detergente .

• Empape las cápsulas en cloro 1% por 10 minutos.

• En una campana de flujo póngalas en placas Petri.

• Empape unos segundos en alcohol 100%

• Flamee y deje que se enfríe. Repita.

• Corte longitudinalmente la cápsula para cortar en dos mitades.

• Sacuda las semillas sobre el medio de cultivo hasta que todas las semillas se hallan sacado .

• Repita la operación con las otras semillas.

21
Figura 4.2. Germinación de semillas con cápsula verde.

Corte los restos de la Cápsula disectada:

lt'
oro Esterilice la
ápsula y córtela
ongitudinalmente. ...... la mayoría de las
semillas están en el
centro.

Sostenga la cápsula al
revés sobre el disco con el
medio . Golpee levemente
las pinzas con el escalpelo
para liberar las semillas.

GERMINACION DE SEMILLAS INMADURAS

Una de las diferencias entre la esterilización de semillas de epifitas y de terrestres es que con las
primeras es más fácil y sencilla la esterilización superficial. Las terrestres pueden requerir más
tiempo y métodos más complejos de esterilización superficial.

NaOCI y CaOCI son los agentes más usados para esterilizar semillas de orquídeas. Se preparan
soluciones Standard.

Una alternativa para romper la test es utilizar previamente H2S04 0,5-2% por 5-15 minutos antes
del cloro, pero este tiempo y concentración se debe ajustar para cada especie.

METODO DEL PAQUETE

La mayor ventaja de utilizar un método de contacto indirecto como el uso de paquetes de papel
filtro (Mitchell, 1989) es su fácil manipulación. También es una técnica útil cuando se cuenta con
pequeñas cantidades de semilla disponible que no pueden ser desperdiciadas.

Se deben utilizar concentraciones más altas de esterilizante junto con un surfactante para que el
esterilizante penetre el papel filtro. No es apropiado para inmersiones prolongadas debido a que el

22
papel filtro de puede desintegrar. Las semillas no están en contacto di~ecto con el. ~gente
esterilizante y es adecuado cuando no se dispone de muchas semillas. Es Imp?rtante utilizar un
grado de papel filtro que soporte el empapado (por ej., Whatman 54, Hardened) (figura 4.2).

• Ponga una pequeña cantidad de semillas en el centro del papel filtro (A) (45 mm x 45 mm o un
círculo de 42,5 mm de diámetro).
• Pliegue el papel filtro para formar un paquete pequeño con el papel (8 y C).

• Prepara una espátula para insertar las semillas (O). Abra levemente el paquete e inserte las
semillas.
• Cierre con una grapa o corchete (E). Las semillas deben estar ubicadas al extremo opuesto del
corchete.
• No inserte una cantidad muy grande de semillas en un paquete porque el esterilizante puede
que no sea capaz de penetrar. Es mejor hacer varios paquetes.

• Sumerja los paquetes en agua destilada con pinzas, estrujando para eliminar el aire.

• Transfiera los paquetes al vaso precipitado, y cierre la tapa de la solución esterilizante,

apretando los paquetes para eliminar el aire restante que puede hacer flotar los paquetes. No
ponga más de 5 paquetes por beacker, es preferible usar varios recipientes.
• Ponga el vaso precipitado en un agitador magnético (el corchete actúa como barra de
agitación) y deje 10-15 minutos de acuerdo al tratamiento. Alternativamente, utilice una botella
pequeña que contenga 1 o 2 paquetes y agite suavemente con la mano con la solución de
esterilización .
• Traslade el vaso precipitado a un área esterilizada! flujo, retire los paquetes del esterilizante
ayudándose con pinzas y sumérjalas en agua destilada esterilizada (en tubo separados o en
botellas con tapa rosca). Agite por 5 mino
• Repita el enjuague por 2 veces más.
• Saque los paquetes del agua y exprima para quitar el exceso de agua.
• Corte los paquetes en el extremo del corchete y abra con pinzas (F).
• Sosteniendo el papel filtro con las semillas hacia abajo, pose levemente el papel contra el
medio - las semillas deberían quedar adheridas a la superficie . Si las semillas estuvieran
pegadas al papel filtro, frotar suavemente el filtro con las pinzas ayudará a que se desprendan.
Con práctica, las semillas pueden ser sembradas en forma muy uniforme.

23
Figura 4.2. Método de siembra del paquete.

! .:k¿.:..:..
.~ ."
( Y"
.. ,- '
o.' :
" . '

:' ".:
;'

B. c.

~J Inserte la
1:

espátula con
las semillas D. E.

METODO DE LA JERINGA

En este método, todas las etapas de esterilización y enjuague ocurren el la misma jeringa, es
posible llevar a acabo el procedimiento en un espacio abierto, requiriendo sólo de un ambiente
limpio (cabina o trabajar sobre vapor) para la etapa final de siembra . Se puede hacer sobre el
mesón si éste esta bien limpio (figura 4.3).

• Utilice una jeringa de vidrio de 10 o 20 mi y un vaso precipitado pequeño para soporte.

• Ponga una pequeña cantidad de algodón en la base de la jeringa que actúe como tapón (A).
(requiere estar suficientemente compactada para actuar como filtro durante las etapas de
esterilización y enjuague , pero a la vez suelto para permitir la descarga de semillas en la etapa
de siembra) cubrir con papel filtro.
• Agregue con una espátula las semillas(A) .
• Ponga el émbolo y agregue una solución de NaOel 1% ó 2% (B).
• Golpee levemente la jeringa para eliminar las burbujas de aire y dispersar las semillas, invierta
la jeringa y quite presión suficiente para eliminar el aire.
• Agite por 10 minutos llevando la jeringa posición invertida y luego volver.
• Fuerce la salida del esterilizante empujando el émbolo hasta la base.
• Para enjuagar las semillas succione agua estéril, agite levemente y empuje fuera el agua. Lave
con agua estéril varias veces.
• Repita el proceso por 2 a 3 veces.

24
• Saque el tapón de algodón (golpeando la jeringa o empujando con la punta de una aguja
esterilizada) , llene con 1-2 mi de agua estéril.

• Disperse las semillas en la solución y luego ponga las semillas en el medio. El exceso de agua
puede ser extraída succionando nuevamente con la jeringa.

• En forma alternativa, las semillas pueden ser sembradas por medio de eliminar el algodón con
pinzas y golpeando sobe la superficie del medio, también golpeando el extremo del émbolo.

Figura 4.3. Método de siembra de la jeringa.

I 4

Semillas lJ
t ,fo,
",' .; I
1

1 J ~ " emillas

Algodón
A. B. c. o. E.

METODO DE ESTERILlZACION DIRECTA EN UN TUBO

Este método se puede usar en combinación con el test de Trifeniltetrazolium de viabilidad para
obtener una comparación directa de la viabilidad y tasa de germinación (siempre que las semillas
hayan sido esterilizadas por el mismo tratamiento).

• Ponga una pequeña cantidad de semillas en un tubo de ensayo

• Agregue el agente esterilizante con un agente humectante (para ayudar al contacto de las
semillas y al decante).
• Cierre bien.
• Agite el tubo por 5-15 mino De modo que las semillas logren un buen contacto con el
esterilizante.
• Para esterilizaciones más prolongadas, especialmente para el caso se las semillas de
orquídeas terrestres, un equipamiento con un rotador de sangre puede permitir una agitación
intensa y constante.
• 1-2 minutos previos a término de la esterilización, detenga la agitación para que las semillas
sedimenten.
o

25
• Las semillas sedimentarán en la base del tubo o formarán un anillo en el extremo superior del
tubo.
• Retire la solución esterilizante sobre las semillas con una pipeta (las pipetas de plástico
desechables son útiles).
• Retirar toda la solución no es tan crítico debido a que con los sucesivos enjuagues se irá
diluyendo.
• Utilizando otra pipeta estéril, agregue agua destilada estéril, selle y agite.
• Permita que la semilla sedimente y elimine el agua con una pipeta . Repita el enjuague.
• En el enjuague final, retenga 1 mi de agua, agite con poco para suspender las semillas y luego
rápidamente eche el contenido en un disco de Petri o frasco (o use una pipeta para succionar y
luego dispersar).
• Disperse las semillas en un disco con una espátula (el exceso de agua puede ser eliminado
con una pipeta).

Figura 4.5 . Método de esterilización directa en tubo.

A. Pasos de la esterilización

Semillas
decantadas
en anillo en
un tubo de

Agregue las sem iIIas Agite y luego Elimine el esterilizante de

y el esterilizante. permita que las modo cuidadoso con una
Selle con un tapón. semillas pipeta sin tocar las
decanten. semillas.

26
:-
,
. ..-----
B. Pasos del eniu aqu

. :r". v

, ..
.,~.
v
Ji]
11

En 1 ml.del.último.enjuague
Agregue agua " Deje que las semillas decanten, ag ite y sus penda
I
1
est.erilizada y
agite .
... --.. . -.-..-.------
y luego extraiga el agua con una
I pipeta. Repita los pasos de
I enjuag ue.
nuevamente las semillas.
Luego vierta sobre un disco.
_···__·__ ·_·__·········_··· .w_
j
'---.. ...1

27
Figura 4.5. Panorama de la propagación simbiótica de las orquídeas terrestres.

Fase Procedimiento Diagrama

Recolección de semillas La recolección de semillas desde
plantas del campo es un paso
importante para la producción de
plántulas en el laboratorio.

Esterilización de semillas Es necesario eliminar cualquier

bacteria u hongo de la semilla en
forma previa a ponerla en un medio de
germinación. Esto se hace por medio
del lavado de la semilla en una
solución de cloro suave.

Siembra de semillas Una vez que la semilla está estéril se

enjuaga en agua estéril para remover
los restos de cloro y de reparte
uniformemente sobre el papel filtro y
se disponen en discos de
germinación.

Inoculación con hongos Antes que la semilla germine , ésta

necesitará ser inoculada con el hongo
ayudador correcto , aislado desde
plantas de la misma especie que la
semilla. El hongo crece a través del
disco de germinación infectando las
semillas estimulando la germinación
de la semilla .

Germinación de la semilla Después de un período de hasta 8

semanas , la semilla germinada habrá
desarrollado hojas y necesitará ser
trasladada a otras condiciones de
crecimiento.

Crecim iento La trasloca ción de las plantas de

semillas al suelo es una de las áreas
de mayor concentración de los
recursos de Westem Power Rescue
Orchid Programo Los resultados
iniciales son promisorios.

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Orchids. Physiol Plant.66:435-442 .
CAPíTULO 5. AISLAMIENTO DE HONGOS DE ORQuíDEAS

(Traducido por Ximena Calderón Baltierra, Laboratorio de Cultivo de Tejidos, Universidad de

Talca).

En las orquídeas terrestres solo las partes subterráneas están infectadas con el hongo apropiado.
Típicamente los collares del tallo o raíces contienen pelotones de hongos. Después de colectar el
material en el campo , la tierra se remueve por repetidos lavados con agua de la llave. Hay dos
métodos para obtener los pelotones estériles para iniciar cultivos estériles de los hongos.

A. Esterilización supeñicial
Los tejidos se esterilizan superficialmente con cloro 0,5% por 5-10 mino Los colares de raíz se
lavan dos veces en agua estéril. Se remueve la epidermis bajo el microscopio y los pelotones se
extraen de las células corticales, se cortan y ponen en medio de aislamiento de hongos (FIM)

B. Lavado de los pelotones

Este método no usa agentes químicos para esterilizar. Los contaminantes se lavan con agua
agitando vigorosamente. Los pelotones se extraen balo el microscopio cortando la epidermis y
dejando el tejido cortical libre. Con una pipeta pasteur con punta muy fina se succiona los
pelotones y se depositan gotas sobre placa Petri para generar una dilución. Los pelotones
individuales se plaquean sobre medio FIM. Este método es muy usado en el Kings Park.

C. Purificación del aislado

Las placas con medio FIM se almacenan en oscuridad a temperatura ambiente. Se requiere
monitorear los pelotones periódicamente hasta observar las hifas creciendo desde los
pelotones. Las hifas de crecimiento rápido están listas a los 2-3 días. Para hongos que crecen
lento son 7-10 días.
La contaminación con bacterias se puede evitar con antibióticos tales como estreptomicina
sulfato .

D. Almacenamiento del cultivo

Para periodos cortos las placas se pueden almacenar en FIM, PDA u otros. Sin embargo
subcultivos repetidos del aislado pueden reducir su capacidad para germinar semillas.
Los hongos se pueden almacenar a largo plazo en nitrógeno líquido.

29
Figura 5.1. Panorama del aislamiento de hongos.
Fase Procedimiento
Recolección de La recolección del material de plantas
plantas que contiene los hongos es diferente
dependiendo del hábito de las especies
objetivo. El tejido infectado es
típicamente parecido dentro de la misma
especie.

Lavando el material Para remover los contaminantes de la

superficie se enjuaga el material bajo
agua de la llave para r3emover el suelo.
EL enjuague con agua esterilizada o
utilizando un agente esterilizante
reducirá aún más los contaminantes. Los
pelotones se extraen en una cámara de
flujo laminar.

Enjuagando los Después que los pelotones han sido

pelotones disectados desde las células son
enjuagados en agua estéril
aproximadamente 6 veces. Los
pelotones pueden ser transferidos por el
agua de enjuague utilizando una pipeta
fina.

Plantando los Los pelotones individuales pueden ser

pelotones transferidos luego a FIM y ser incubados
a 18°a22°C.

Subcultivando los Luego de 2 a 10 días es posible

~
aislados observar hifas creciendo desde los
pelotones . Al subcultiva r en esta etapa
se obtienen aislados puros.

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Los hongos aislados se pueden

mantener en PDA, agar avena o FIM. Se
debe monitorear regularmente para
evitar infestación con arañita del polvo
(dust mite) .

30
CAPíTULO 6. CRIOPRESERVACIÓN DE SEMillAS DE ORQuíDEA y HONGOS

(Traducido por Ximena Calderón Baltierra, Laboratorio de Cultivo de Tejidos , Universidad de

Talca).

Se presenta un método utilizado corrientemente en el Kings Park para criopreservar orquídeas

terrestres y hongos asociados. Es recomendable que para las pruebas de nuevos taxa se realice
previamente una prueba de almacenamiento de lotes de semillas enteras en nitrógeno líquido
(figura 6.1).

Figura 6.1. Esquema general de la criopreservación.

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storage dewer.
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Cryo vials

Fungi
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Seed coll ection and
preparation for long- Purification of
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F u nga l
e xt rac t i o n

31
Debido al escaso contenido de agua de ambos el método de criopreservación es muy simple.
Consiste en sumergir directamente las semillas y los hongos en nitrógeno líquido sin recurrir al uso
de agentes crioprotectores. Para reanudar el crecimiento después de un almacenamiento
indefinido se pasan las muestras por un baño maría de 4° C y luego se ponen en sus respectivos
medios de cultivo.

Criopreservación de hongos micorrizas.

1. Seleccione los cultivos que están en crecimiento en medio de % PDA (Potato Dextrose Agar).
2. Prepare y esterilice recipiente de almacenaje.
3. Ubique var ios bloques (cinco) de 3 mm3 de inóculo en cada recipiente de cripreservación .
4. Asegure las tapas fuertemente.
5. Sumerja en nitrógeno líquido.
6. Complete los registros e incorpore los datos a las bases de datos

Para sacar del nitrógeno líquido:

1. Saque los recipientes desde el almacenaje y rápidamente descongélelos en un baño de agua a
40° C por 2-3 minutos (figura 5.2).
2. Saque bloques de agar y traspáselos a medio de aislación de hongos.
3. Mon itoree los cult ivos para signos de crecimiento o contaminación

Figura 5.2. Descongelamiento de dos recipientes que contiene hongo micorrizas en baño de agua
a 40° C.

32
Ctiooresetvecion de semillas de orquídeas.

1. Recolecte las semillas y elimine cualquier resto de cápsula o de planta.

2. Seque la semilla en sílica gel por 24 horas.
3. Ponga las semillas en un recipiente de criopreservación de 2 mI.
4. Ponga etiqueta a cada recipiente con un código apropiado .
5. Sumerja en nitrógeno líquido.

Para sacar del nitrógeno líquido:

1. Descongele rápido las semillas en baño de agua a 40° C.
2. Siembre las semillas con métodos disponibles .

33
CAPiTULO 7. TECNICAS DE MICROSCOPIA.

(Traducido por Ximena Alvarez Gerding, Biotecnología Agropecuaria S.A.)

7.1. Uso y cuidado del microscopio.

Este cap ítulo contiene información sobre métodos comúnmente utilizado para tomar muestras a las
raíces y para examinar las asociaciones micorríticas. Una breve introducción en el uso del
microscopio es explicada a continuación.

1. Los microscop ios deben permanecer en áreas separadas de los lugares donde se preparan las
muestras para minimizar la exposición a polvo y líquidos. Es recomendable contar con
plataformas plásticas transparentes para proteger la base del microscopio de las muestras
líquidas. Todas las partes del microcopio deben quedar protegidas del polvo y ser limpiadas
cuidadosamente cuando se ensucian .
2. Se debe tener especial cuidado al examinar preparaciones líquidas para evitar el contacto con
los objetivos (lentes). Se debe utilizar aceite de inmersión con sumo cuidado para evitar el
daño a los objetivos. Los lentes objetivos se pueden dañar fácilmente por medio de abrasión .
3. El condensador del microscopio se debe ser ajustado cuidadosamente para que el tipo de
iluminación sea uniforme y suficiente mente brillante (iluminación Kohler). Eleve el
condensador hasta que la imagen del iris del diafragma este en foco, centre la imagen y abra el
iris más allá del campo visual del objetivo.

Figura 7.1. Microscopio : A. Microscopio de disección ; B. Microscopio compuesto.

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7.2. Limpieza y tinción de las micorrizas de las raíces.

Las asociaciones micorríticas no son visibles cuando se observan las raíces frescas debido a que
las estructuras internas son oscurecidas por los pigmentos naturales y las células las contienen su
interior. El proceso de limpieza utiliza una solución KOH caliente para remover el contenido de las
células y los pigmentos de la pared celular. Las estructuras fungosas se revelar por medio del uso
de tinturas que se unen a las hifas de los hongos cono el Trypan blue o el Chlorazol Black E en
lactoglycerol (Philips and Hayman, 1970; Brundett et al., 1984).

Medidas de precaución.
1. Para limpiar las raíces se utiliza una solución al 10% w/v KOH. Se debe tener especial
cuidado de evitar el contacto con la piel ya que es un compuesto químico cáustico. Se debe
utilizar guantes, anteojos, etc.
2. Las tinciones Chlorazol black E y Trypan blue son sospechosas de ser carcinogénicas, tal
como lo son otros pigmentos biológicos (Coombres and Haveland Smith, 1982). Utilizar
guantes para proteger las manos cuando se utilicen estas soluciones y tener precaución de
evitar respirar polvo o que ingrese a los ojos cuando se esté manipulando la tinción en polvo.
3. los preservantes basados en formalina son dañinos para la salud. La preservación de las
muestran de plantas con un 50% de etanol funciona tan bien y es mucho más segura.
4. Remitirse a la información de las tablas de seguridad de los químicos que utilice.

35
Equipamiento y reactivos requeridos.
• Etanol al 50% (v/v) para preservar raíces.
• KOH al 10% (w/v hidróxido de potasio) disuelto en agua. Esta solución genera una reacción
exotérmica- utilice envases resistentes.
• Chlorazol black E (CSE) al 0.03% w/v en lactoglicerol (1:1:1 = ácido láctico: glicerol : agua).
Disolver el CSE en agua antes de agregar volúmenes iguales del ácido láctico y glicerol.
• Trypan blue al 0,05% w/v en lactoglicerol (1:1:1 = ácido láctico: glicerol: agua).
• Solución de glicerol al 50% en agua (v/v) para desteñir y almacenar las raíces teñidas.
• Ácido láctico para consumo humano y glicerol son adecuados y pueden comprarse a granel.
• Se puede utilizar autoclave (121° C), baño de agua u horno (60-90° C) para calentar las
muestras de raíces para la limpieza y la tinción.
• Material de vidrio resistente la autoclave y tubos para alojar las muestras.
• Malla fina de nylon (+100Dm mesh) para evitar la pérdida de raíces al cambiar de una solución
a otra.
• Pinzas finas y agujas de disección para transferir las raíces.
• Jarros de plástico con tapas herméticas para almacenar las muestras teñidas en glicerol 50%.
• Platos de plásticos transparentes con inscripciones de parrillas de líneas par medir la
colonización .
• pantalla fina (100mm) con malla de nylon para transferir las raíces desde las soluciones.
• Pinzas finas y sondas para manipular las raíces.
• Diapositivas para microscopio, trozos largos de cubreobjetos y PVLG moutant (ver más
adelante).
• Envases de plástico con tapas de cierre hermético para almacenar muestras.
• Microscopio de disección con transmisión de luz, se recomienda un panel transparente de
plástico sobre la base del microscopio para proveer de una plataforma estable y para proteger
del derrame de líquidos.
• Microscopio compuesto con un lente reticulado.

A. Material de procesamiento.

Los procesos de limpieza y tinción requieren de muestras de raíces que han sido lavadas y se
encuentran libres de suelo.

1. Las muestras de raíces de 1-2 g o más pequeñas se sumergen en una solución de KOH al
10%, tendiendo la precaución de evitar el contacto con el material corrosivo. Es imperativo
que los volúmenes de KOH o la solución de tinción sean suficientes para la cantidad de
material de raíces a ser procesado y que las raíces no estén todas agrupadas y apretadas
juntas. Es mejor cortar las raíces en segmentos de 2-4 cm de largo antes de limpiarlas o
subdividir los grandes volúmenes de raíces.

2. El uso del autoclave utilizando ciclos líquidos de 15-20 min a 121° C es eficiente para
limpiar/despejar la mayoría de la raíces. Las muestras que contengan raíces viejas, raíces
con altos compuestos fenólicos o raíces colectadas del campo normalmente requieren de
períodos más prolongados (25-60 min). Las muestras debe estar en contenedores
resistentes al autoclave y estar rellenos a menos de 1/3 de su capacidad, de otro modo
pueden derramar en el autoclave. Contenedores amplios se trabaja mejor que en tubos
altos y angostos.

36
3. Las raíces también pueden ser limpiadas al calentar KOH en un baño maría a 60-90° C.
Puede que se requieran períodos más largos (desde 5 horas hasta varios días).

4. Las muestras limpias son dispuestas en tubos fino y enjuagadas con agua antes de ser
transferidas a la solución de tinción.

5. Las muestras limpias son teñidas con CBE y Trypan blue en un solución de lactoglicerol
(Brundett et al., 1984; Bevege, 1968; Philips and Hayman, 1970).

6. Las muestras son teñidas por medio del calentamiento por varias horas a 90° C o al
dejarlas en la solución por varios días. La solución de tinción puede ser reutilizadas varias
veces si es filtrada a través de una cheesecloth plegada o una malla de nylon de 50 Dm
mesh después de cada uso (para remover los fragmentos de raíces). Cuando la solución
se torna muy translucida es que está demasiado débil para seguir utilizándola.

7. Un tratamiento de blanqueado (bleaching) con peróxido de hidrógeno alcalino (0.5%

NH40H Y 0.5% H202 v/ven agua) remueve efectivamente el exceso de pigmento
(Bevege, 1968; Kormanik and McGraw, 1982).

8. Las muestras deben ser desteñidas con glicerol al 50% (para CBE) o lactoglicerol (para
Trypan blue) por varios días previo a la observación , para permitir que el exceso de tintura
drene desde las raíces.

9. Las raíces teñidas con CBE pueden ser almacenadas en glicerol al 50%, pero la tinción del
Trypan blue es menos permanente, a no ser que las muestras sean guardadas en
lactiglicerol o en la solución de tinción.

10. Los portaobjetos semi-permanentes de las raíces teñidas puede hacerse con PVLG
moutant (ver más adelante).

11. El microscopio de Interferencia -contraste aumenta sustancialmente el contraste entre las

estructuras fúngicas teñidas al tomar fotografías.

12. Los procesos de tinción que miden la actividad de la succinato deshidrogenasa puede ser
utilizada para confirmar las hifas de los hongos micorríticos las cuales son enumeradas son
metabólicamente activos (Schaffer et al., 1993; Tisserant et al., 1993).

13. Las modificaciones al estándar de limpieza y procedimientos han sido propuestos por
razones de seguridad. Grace and Stribey (1991) sugieren sugieren que el metil blue o
anilina azul, pueden ser utilizados como reemplazos menos tóxicos por CBE o Trypan blue.
Como sea, no existe suficiente evidencia para confirmar que esos pigmentos son no-
tóxicos, por lo que deben ser manipulados cuidadosamente. Una concentración menor de
KOH (2.5%) puede ser utilizada para disminuir el riesgo de daños (Koske & Gemma ,
1989).

14. Se puede utilizar el pigmento ácido fucsínico en combinación con un microscopio de

fluorescencia para teñir las estructuras fungosas de las raíces (Meryweather & Fitter,
1991).
PVLG mountant (Koske & Tessier , 1983)
Polivinil alcohol 8.33 g
Agua destilada 50 mi
Ácido láctico 50 mi
Glicerina 5 mi

37
 - 24-32 centripose viscosidad del polivinil alcohol es disuelta en agua por medio del
calentamiento (900 C) durante toda la noche

B. Evaluando la colonización por el hongo micorrítico.

El método más frecuente para medir la colonización de las raíces y los hongos es el método de la
intersección de líneas de la parrilla (Newman, 1966; Giovannetti & Mosse, 1980).
1. Las muestras dispersas aleatoriamente en una placa de Petri de 9 cm de diámetro con parrilla
de líneas (ver figura 7.2). la muestra dispersa es escaneada a través de las líneas de las
parrilla utilizando un microscopio de disección para cuantificar los segmentos de material
vegetal que se designan como colonizado o no-micorrizado.

2. Los segmentos asignados como micorrizados son seleccionados al azar también deberían ser
montados en porta objetos y ser observados en el microscopio compuesto.

Figura 7.2. El método de intersección de parrilla (gridlíne intersection method).

THE GRIDLlNE INTERSECTION METHOO

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roollength col onlsed

38
7.3. Seccionando el material vegetal fresco.
Las observaciones del material vegetal fresco revelan la pigmentación natural, o refringencia se las
secciones de raíces a se obtienen aún más detalles por medio de la inducción-UV de
autoinfluorescencia de los segmentos semi-finos. Este procedimiento funciona mejor con raíces
frescas (túrgidas), pero también es posible obtener buenos resultados con raíces preservadas en
alcohol.

Equipamiento .
• Hojas de afeitar de dos filos.
• Material para sostener el material vegetal durante los cortes:
• Pedazos cuadrados de Parafilm TM y tapas de discos Petri.
• Trozos de plumavit o corteza.
• Agujas de disección , pinzas pequeñas o cepillo para pintar para manipular las secciones.
• Tinciones, secciones, portaobjetos, cubreobjetos , etc.

1. Las secciones cruzadas que quedan inmovilizadas por el Parafilm pueden ser realizadas
utilizando una hoja de afeitar afilada (Frohlichm 1984). Los mejores resultados se han obtenido
cuando se utiliza una hoja se sumerge repetidamente en un grupo de raíces para producir una
serie de segmentos (ver más adelante). Muchos segmentos de grosor variable se generarán
en corto tiempo, como es imposible regular el grosor de las secciones.

2. Estas secciones delgadas y uniformes son seleccionadas por medio de una pinza fina o pipeta
mientras se observan las secciones flotando en agua bajo un microscopio de disección. Las
secciones seleccionadas pueden ser dispuestas en recipientes o ser transferidas entre
soluciones mediante una pipeta.

3. Se pueden obtener resultados similares por medio del uso de trozos de plumavit (styrofoam) ,
corteza u otro material similar que inmovilice las raíces durante el proceso de corte.

4. Las secciones cortadas a mano pueden ser limpiadas en la misma manera que las raíces
enteras (ver detalle anterior), pero requiere una exposición al KOH caliente más corta. Se
disponen las secciones en un recipiente de vidrio pequeño utilizando una pipeta de boca ancha
y se lavan con KOH al 10% durante 4-12 horas al 60-90° e.

5. Las secciones son teñidas con Trypan blue o eSE por medio del calentamiento a 60° e
durante 2-3 horas, o dejándolas en la tinción por un día. Luego las secciones son enjuagadas
con agua después de los pasos de lavado de la tinción, utilizando una pipeta para transferir las
soluciones .

6. Las secciones teñidas pueden se montadas en portaobjetos en 50% de glicerina o en un agua

semi-permanente basada en un medio como PVLAG (sección 7.2).

39
Fi ura 7.3. Corte del material fresco .

HAND SECTIONING FRESH MATERIAL

Use 1/2 01 a ..,,"

shllrp ., ,---_/ '
razor _"l .¡..,...¡. \ ..
1. Immoblllze sample between parafilm layers
bl ade ., /
2. Cut across
tissue In rapld,
contlnuous
motions

7.4. Tinción histoquímica.

Sólo unos pocos de los muchos métodos son presentados aquí. Mayores antecedentes están
disponibles en las referencias de microtécnicas botánicas estándar e histológicas como los de
O'Brien & McCully (1981) y Brundett et al. (1994).

A. Tinción vital.

Las secciones cortadas a mano pueden ser dispuestas en un recipiente que contenga una malla
mesh en su base (Brundett et al., 1988), el cual puede ser utilizado para los siguientes
procedimientos de tinción.

La tinción vital fluorescein diactetate puede ser utilizada para indicar la presencia de hifas y
esporas vivas bajo la luz ultravioleta con un microscopio de fluorescencia (Schubert et al., 1987;
Hamel et al., 1990). El material el dispuesto en una solución de agua al 50 ug/ml (w/v) o buffer
(hecho por medio de la disolución de 5 mg de FDA en 1 mi de acetona).

B. Tinción nuclear.
Tinción de fluorescencia del núcleo y septos.

Soluciones de tinción
Prepare una solución stock por medio se la adición de 10 mg de Hoescht Dye a 25 mi de agua
destilada y caliente baño maría a 37° C hasta disolver. Almacene a 4° C.

Las soluciones buffer al pH correcto (7,8) se prepara con 0,1M de KH2P04 y 0,1M de NaOH y al
pH 10,5 con O,025M de H3B03 y O,1M de NaOH.

40
Los tintes se prepara agregando 0,6 mi de la solución stock de tinción a 50 mi de las soluciones
buffer.

Preparación del portaobjeto

Sumergir los portaobjetos de vidrio en PDA (Potato Dextrosa Agar) y dispóngalos en una barra e
vidrio en un disco Petri de 90 mm que contenga papel filtro esterilizado humedecido con agua
destilada estéril.

Ubique cubo 1 mm de agar que contenga micelio en el centro del portaobjeto. Incube los discos de
Petri en oscuridad hasta que el diámetro de la colonia alcance los 15-20 mm aproximadamente.

Figura 7.4. Portaobjetos con colonias de micorrizas.

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Tinción en el portaobjetos.
Después de la incubación, los portaobjetos se disponen en la corriente de una cámara de flujo
laminar hasta que la superficie del agar se seque. A cada lado de la colonia se le agrega una gota
de la solución de tinción al pH correcto y se cubre con cubreobjetos sobre las gotitas.

Los portaobjetos se observan bajo un microscopio de fluorescencia, donde se puede observar los
núcleos y las septas teñidas.

Otro método de tinción.

La tinción nuclear florescente DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, 5 mg/ml p/v en agua o buffer)
tiñe efectivamente el núcleo del hongo micorrítico (Cooke et al, 1987; Balestrini et al., 1992).

C. Tinción de viabilidad de semillas.

La tintura química más comúnmente utilizada para determinar la viabilidad de las semillas de
orquídeas es el triphenyltetrazolium cnionae (TIC) o f1uorescein diacetate. Estos tests son
particularmente útiles si se está permanentemente almacenando y sembrando semillas a través de
los años. Por ejemplo, el porcentaje de embriones teñidos (utilizando el test TIC) en semillas de
Liparis almacenadas por 5 años baja de 70% a 30%, con la consecuente disminución en la tasa
germinación. Otra ventaja radica en su uso en semillas que no han germinado para determinar si el
problema es de la semilla, o, si su viabilidad es alta, se deben considerar nuevas técnicas de
germinación.

El procedimiento de tinción mediante TIC , desarrollado por Lakon (1949) es uno de los
experimentos bioquímicos más ampliamente utilizados para evaluar la viabilidad de las semillas.
Comparado con los ensayos de germinación directos, esta prueba tiene la ventaja de ser rápida y
de ser apropiada para condiciones de control. Este ha sido utilizado exitosamente en orquídeas
epifíticas tropicales (Singh, 1981) Y Van Waes Debergh (1986) adaptó este ensayo a varias

41
orquídeas terrestres de Europa occidental. Ensayos realizados por Lauzer et al. (1994) en
Cypripedium indican que la germinación de las semillas maduras fue significativamente inferior que
el porcentaje de embriones teñidos con TIC . De cualquier modo, en nuestra experiencia, la tinción
con TIC puede arrojar una estimación gruesa de la germinación y es una guía útil, especialmente
en las semillas almacenadas por largo tiempo, y para saber si la semilla está mal sembrada.

Las cubiertas de la semillas de climas templados requieren un pre-tratamiento con una solución de
CaOCI (ver más adelante en esterilizantes) para ser teñidas con el TTC . Es necesaria una
inmersión en agua esterilizada por 24 horas después del pre-tratamiento con hipoclorito para
remover el hipoclorito que puede entorpecer la reducción del TTC en embriones viables.

Preparación de la solución de CaOCI

Para una solución al 5% peso por volumen .
En una cámara de vapor, vistiendo una máscara de protección, guantes y protección para los ojos,
pese 5 g de hipoclorito de calcio en polvo en un vaso precipitado pequeña de plástico. Aún en el
cámara de vapor, agregue un poco de 100 mi de agua al polvo y mezcle todo utilizando un mortero
(el CaOCI es difícil de disolver).

Revuelva en el resto del agua y con 1 mi de Tween-BO (1% v/v). Revolver enérgicamente durante
10 minutos, luego filtrar. Utilizar la solución filtrada inmediatamente.

Preparación de la solución de TTC.

En 100 mi de agua destilada, disolver 1 g de 2,3 ,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC). Ajuste el pH

a 7 con NaOH 0,1M. Almacene en oscuridad a 20 + 2° C (o en frasco de vidrio color caramelo
envuelto en foie a temperatura ambien te). El TTC es tóxico.

Test de viabilidad.

1. Pre-tratar las semillas con CaOCI al 5% p/v + 1% de Tween 80 (v/v). La duración de esta
inmersión debe ser determinada para cada especie (figura 7.5).

2. Empapar en agua esterilizada durante 24 horas.

3. Aplicar el test de TTC .

• En un tubo de ensayo de pyrex con tapa rosca, ponga una pequeña cant idad de semilla en
10 mi de una solución de CaOCI. Batir suavemente por un período apropiado (12-18 horas
en Cyprop edium , 45-60 minutos en Spiranthes, 3-8 horas para la mayoría de los géneros).

• Probablemente las semillas se depositarán en la base a medida que el aire de la testa sea
reemplazada por líquido .

• Con una pipeta extraiga la soluc ión de blanqueado (cloro) y reemplácela por agua
esterilizada. Cambie el agua ala menos dos veces y luego deje las semillas en agua por un
mínimo de 24 horas.

• Con una pipeta extra iga el agua y reemplácela por 10 mi de solución de TIC al 1%.
Disponga los tubos en oscuridad a 30° C por 24 horas (en Kew se utiliza un baño de agua
cubierto, pero se puede utilizar una incubadora).

42
• Con una pipeta extraiga la solución de TTC y lave las semillas 3 veces durante 5 minutos
cada una con agua destilada esterilizada.

• Opcionalmente, se puede aplicar una solución de verde de malaquita al 0,001 % durante 5

minutos, especialmente útil donde la testa está muy blanqueada.

• Mediante una pipeta extraiga la mayor parte del agua luego vacíe las semillas en un círculo
de papel filtro dividido en 4 partes iguales.

• Enjuague el resto de las emillas con una pequeña cantidad de agua y disperse las semillas
en forma pareja sobre la superficie.

• Utilizando un microscopio, registre lo siguiente:

• número total de semillas

• número total de semillas que tienen embrión
• número de embriones teñidos de rojo

• Calcule el % de viabilidad: [N° embriones teñidos rojos/ N° total semillas]* 100.

• Determinar la media y la desviación estándar de 4 repeticiones.

• Marcar el papel filtro con líneas como grilla y el uso de un contador ayudará facilitando el
registro.

43
Figura 7.5. Test de viabilidad de tetrazolium.

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) ::'

10 mi Remueva el Agregue Elimine el Agregue el

CaOCI5% CaOCI agua agua tetrazolium y
por 1-18 hr destilada mantenga por
esterilizada 24 hr a 300 C en
oscuridad

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...----- - - -
..------ -
~-
- - ..;;
..~-.-:~
[

~~
Lave las semillas por 3-5 minutos en Registre el número de
agua destilada estéril. embriones coloreados (de
Reserve 1 mi del último enjuague, rojo)
agite para suspender las semillas, y
vierta sobre un papel filtro marcado
con líneas.

44
7.5 Microscopia avanzada.

a. SEM
Preparación del material para el punto crítico de deshidratación y SEM.

1. Fijación y filtración al vacío.

a) Corte el tejido en fresco (cubo no > 2 cm) en gluteraldehyde al 2,5-5% en un buffer de pH 7.0
de fosfato 0,05M.

b) Traslade los especimenes dentro de frascos que contengan el fijador y tarjeta de identificación
(escrita con lápiz).

e) Filtre al vacío por 3-5 minutos y déjelas en fijador por 24 horas o más si es necesario .

2. Deshidratación

a) Reemplace el fijador en el frasco por un buffer por 30 minutos. Enseguida reemplace el buffer
con un buffer fresco por otros 30 minutos.

b) Reemplace el buffer con acetona al 50% por 24 horas o más.

e) Reemplace el acetona 50% con acetona al 75% por 24 horas o más.

d) Reemplace el acetona 75% con acetona al 90% por 24 horas o más.

e) Reemplace el acetona 90% con acetona al 95% por 24 horas o más.

f) Reemplace el acetona 95% con acetona al 100% por 24 horas o más.

g) Reemplace el acetona 100% con acetona fresca al 100% por 24 horas o más.

Se puede dejar el espécimen en este estado para almacenaje hasta que se esté listo para realizar
la tinción de punto crítico, pero se debe tener cuidado de que el acetona no se seque .

3. Secado de punto crítico y examen SEM.

a) Los especimenes debe sufrir un secado de punto crítico previo a ser montada con cinta de
carbón y cubiertas con coberturas Au + C.

b) Los especimenes cubiertos de observan con el Microscopio Philips 505 Scanning Microscope.

45
b. Programa de procesamiento/imbibición para GMA
Preparación del material para imbibición en GMA.
Protocolo Duración
Procedimiento
Fixative 1, a Agregar pequeñas trozos de material al fixative 1 hora a 1
semana
Lavado buffer 2 2 veces 15 min
Methoxyethanol 2 veces 12 hr
Etanol 2 veces 12 hr
Propan-1-ol 2 veces 12 hr
Butan-1-ol 2 veces 12 hr
GMA
a 1 vez 24 hr
GMA
a Transferir a bandeja de aluminio 24 hr
Calentar a 60° C para Transferir a macetas en horno, remover aire, agregar 24 hr
curar Argon
Nota:
1. Fijador : 2,5% gluteraldehyde (pH 6-7) en O,025M buffer fosfato .
2. Buffer fosfato : O.05M NaHPO.·2H2 0 (MW 156.01)/O,05M NaHPO. (MW 141.96)
3. Filtración al vacío .

La solución de glutaraldehido (fixative) se torna ácida con períodos prolongados sin remoción . Si el
pH baja más allá de 3 y el líquido se colorea (color miel) se debe descartar.

Para aumentar el nivel de pH del 25% del glutaraldehido stock, combinar con pequeñas cantidades
de carbón activado y filtrar. Pueden ser necesarias varias aplicaciones de carbón .

Notas de resina GMA

• GMA purificado (resina)

• Caboxax 2000/PEG200 (p/asticiser)

• Benzoyl peroxido (catalizador)

Mezcle los ingredientes todos juntos después de seguir las notas (i) y (ii).

Revuelva 1-2 hr a temperatura ambiente, no calentar. Polimerice a 60° C bajo condiciones

anaeróbicas.

Notas :

(i) El GMA debe estar lo más cercano posible al pH 7. Desde la botella viene a pH 3. Para
ajustar el pH, mezcle con carbón activado (4 g por 100 mi) y revuelva durante 1-2 hr.
Filtre a través de un filtro Whatman N°.1. Mientras más ácido esté el GMA , más resina
tomará cualquier catión de tintura (Le., To/uidine b/ue).

46
(ii) Benzoyl proxide es una sustancia explosiva cuando está seca, por lo tanto , es
almacenada en frío con un 25% de agua. Pese la cantidad requerida más un 25%
adicional para compensar el peso del agua. ¡NO LO SEQUE!

47
CAPíTULO 8. PROPAGACiÓN.

(Traducido por Ximena Alvarez Gerding , Biotecnología Agropecuaria S.A.)

Germinación de semillas

Los protocolos de germinación simbiótica utilizando hongos aislados desde taxa hospederos que
son conocidos por su efectividad en los ensayos, son utilizados para producir protocormos
apropiados para la transferencia a suelo/terreno (figura 8.1). Los platos de germinación deben ser
iniciados tres meses antes de la llegada de la época de crecimiento de modo que las plántulas
estén listas para su transferencia al invernadero durante los meses fríos del año y para coordinar el
crecimiento de la plántula con las fases de crecimiento natural.

Fi ura 8.1 Procedimiento de estableci iento de las or uídeas terrestres en suelo .

A Papel filtro

B
DMA 0.25%

Arena blanca de sílica esterilizada

e
Sustrato pasteurizado

A: Germinación simbiótica con el hongo aislado aprop iado. B: Capas de arena/agar. C: plántulas
simbióticas transferida a sustrato esterilizado en invernadero.

48
Contenedores de crecimiento
Para transferir los germinantes desde los platos de germinación simbiótica:. se utilizan
contenedores desechables de policarbonatro (60 mm de alto x 100 mm d.e dlametr~). Los
protocormos, con un hoja, en los estados 3 y 4 (Ramsay et al., 1986) son transferidos a medios con
capas de arena/agar como se aprecia en la figura 8.1b. A cada contenedor se le agregan
aproximadamente 60' mi de agar .avena (Oat Meal Agar-OMA) ~I O ,25o/~ (Clements and Ellyard,
1979) y se les aprieta la tapa previo a ser autoclavados por 20 mm a 121 C. Una ve~ que el OMA
0
se ha solidificado, una capa de 10 mm doblemente esterilizada (20 min a 121 C; dejar descansar
por 24 hr, y luego 20 min a 1210 C otra vez). Sobre el OMA se pone una capa de arena blanca de
sílica bajo condiciones estériles.

Se debe permitir que la humedad del OMA se traspa~e a la ar~~a antes del trasplante. .~a
ventilación de los recipientes se permite a través de un disco con millporos sobre una perforación
0
de 6 mm en la tapa. Los contenedores con las plántulas son incubados a 22 C en régimen de
fotoperíodo de 16 / 8 luz / oscuridad .

Inoculación de los contenedores.

Plántulas simbióticas son las que proveen del inóculo del hongo a los contenedores.

Traslocación al suelo .

Luego de incubar las plántulas por 3 meses, los contenedores con las plántulas pueden ser
trasladados a un invernadero por una semana antes de remover la tapa. Para un endurecimiento,
las plántulas se mantienen por 5 días más (sin tapa) antes de ser transferidas al suelo. Las
plántulas se plantan en bandejas de plástico para almácigos con contenedores de 35 x 30 x 50 mm
(figura 8.1c) y se cubren con una cúpula plástico transparente (Yates R cubierta húmeda) con una
ventilación variable provista por 6 perforac ión de 2 cm de diámetro. Las cubiertas se pueden
remover pasados 10 días manteniendo las vent ilaciones cerradas por los 3 primeros días . Las
plántulas deben ser monitoreadas para las plagas comunes de invernadero como larvas de mosca
(ver capítulo 9.3 para medidas de control).

La mezcla de suelo así como los almácigos deben ser sincronizados con las condiciones naturales
imperantes afuera del invernadero y permitir que se seque durante la estación seca. El desarrollo
de tubérculos puede lograrse en esta etapa. El riego se comienza con la primera lluvia de la
temporada. La sobrev ivencia de los tubérculos se confirma con la emergencia de la primera hoja.

Siembra de semilla in situ.

La semilla se siembra en sitios inoculados después de la llegada se la estación y la aparición de

las condiciones frías . Para apoyar la siembra de la semilla, ésta puede ser minuciosamente
mezclada con 80 g de arena de sílica blanca y dispersarla en forma pareja en la superficie del
suelo . El mulch se mantiene húmedo por medio del riego con agua de lluvia. Estos métodos
también pueden ser aplicados en el invernadero o en sitios de arbustos silvestres. Aunque las
plántulas desarrollaron y produjeron tubérculos, la mayoría de las plántulas fallaron en su
capacidad de sobrev ivir a las condiciones del verano seco. La investigación en relación al riego
artificial puede mejorar las tasas de establecimiento de las plántulas.

49
Establecimiento de las plántulas.

Las semillas que germinaron son transferidas a contenedores de crecimiento en el laboratorio

antes de ser trasladadas al invernadero como se describió anteriormente (figura 8.1). Las plántulas
simbióticas en contenedores son trasladadas 24 semanas después de a siembra y el
endurecimiento bajo condiciones de sombra afuera del invernadero por una semana antes de
transferirlos en sitios al campo. La plantación debe ser después de llegada la temporada (de
lluvias). Si es necesario, las plántulas se riegan con agua de lluvia.

Trasplante a través de transferencia de tubérculos.

Los tubérculos juveniles dormantes se de orquídeas terrestres producidos siguiendo la

metodología descrita con anterioridad, pueden se plantados en terreno una vez que la estación fría
haya comenzado. Se colocan tres cubos de 3 mm de medio de cultivo OMA que ha sido colonizado
por el hongo apropiado, ubicándolos en pequeños orificios (1-2 cm de profundidad) adyacentes a
los tubérculos traslocados para que actúen como fuente de inoculo. La perturbación del terreno es
mínima ya que en cada sitio, los tubérculos son introducidos utilizando una herramienta pequeña
cilíndrica del tamaño aproximado del tubérculo.

50
CAPíTULO 9. CRECIMIENTO DE ORQuíDEAS.

(Traducido por Ximena Alvarez Gerding , Biotecnología Agropecuaria S.A.)

9.1. El invernadero.
Los experimentos en orquídeas realizados en invernaderos permiten estudiar bajo condiciones
más controladas que las que se puede tener en un vivero en el campo, la fisiología vegetal,
nutrición mineral, asociaciones micorrícicas, y la respuesta de las plantas a factores del medio
ambiente . A continuación se lista el equipamiento básico para los experimentos en un invernadero
(cuadro 9.1).

Cuadro 9.1. Requisitos para experimentos en invernadero.

Condiciones de crecimiento
• Niveles de luz y ventilación deben ser adecuados
• Equipos de calor o enfriamiento pueden ser necesarios
• Rejas altas para prevenir contaminación
• El agua debe drenar fácil y rápidamente
• Es esencial un ambiente de trabajo limpio y sin polvo

Equipamiento
• Macetas limpias y estériles
• Mezcla de sustrato apropiada
• Sistema para pasteurizar o fumigar la mezclas de sustratos para
remover los organismos dañinos
• Fertilizantes apropiados
• Agua pura, no contaminada
• Medidas de control de plagas si es necesario

Sustratos de crecimiento.

Se requieren muestras de suelo de sitios específicos o mezclas adecuadas para macetas . Los
microorganismos indeseables deben ser removidos por medio de pasteurización con vapor (2 min
a 70° C en días consecutivos), o por otros métodos discutidos más adelante.

Riego de plantas.

Las plantas grandes pueden requerir de riego todos los días para limitar las diferencias de
suministro de agua entre tratamientos .

Nutrientes.

Es esencial que los fertilizantes sean aplicados en forma precisa y uniforme a las plantas. Se
encuentran disponibles en el mercado mezclas específicas para orquídeas .

51
Condiciones ambientales.

Se debe monitorear el ambiente par asegurar que la luz y la temperatura sean favorables .para el
crecimiento de las plantas. Estas condiciones deben ser informadas al momento d~ ~ubllcar los
resultados. Al estandarizar las condiciones de crecimiento se aumenta la precisi ón de los
experimentos .

Evaluando de plantas y la cosecha de los experimentos.

La duración óptima de un experimento va a depender de la tasa de crecimiento de las plantas y de

los niveles de nutrición del suelo. La medición de la altura puede ser utilizado para evaluar la
tendencia de crecimiento y así determinar cuando terminar el experimento. Una vez que el
experimento haya terminado, las plantas pueden ser cosechadas por medio del corte de la
canopia, la cual es pesada en una balanza para determinar la materia fresca, y después es secada
para determinar la materia seca y por medio del lavado de las raíces para que queden libres de
restos de suelo.

9.2. El vivero

En los viveros de producción de orquídeas es posible encontrar una gran variedad de prácticas de
cultivo. Aquí se describen los requerimientos de las orquídeas terrestres de Western Australia, sin
embargo, los principios y temas básicos también son aplicables a las orquídeas epifíticas. Los
temas claves para el manejo de las plantas en los viveros incluyen higiene del vivero, la elección y
preparación de las mezclas de sustratos para las macetas y el uso de fertilizantes. La composición ,
pH, humedad y temperatura del medio de enraizamiento , prácticas de fumigación y pasteurización,
y el uso de biocidas y fungicidas pueden ser manejadas para proveer de las condiciones que sean
óptimas para la producción de plantas.

A. Componentes de las mezclas de sustratos para macetas.

Ningún ingrediente por sí sólo puede proveer de todas las características requeridas para el
crecimiento efectivo de las plántulas, por lo que los viveros generalmente combinan varios
sustratos que se describen más adelante, para confeccionar una mezcla de sustrato . Estos
ingredientes pueden ser mezclados con suelo o arena, pero usualmente son combinados para
confeccionar sustratos "sin suelo".

Turba

La turba el componente mayoritario de muchos mezclas de sustrato proveyendo de una plataforma

orgánica para el crecimiento de las raíces. Existen muchas variaciones de formulaciones de turba
utilizadas por los administradores de viveros a estas incluyen tipo locales, fibra de coco, etc. Sin
embargo, la turba tradicional derivada del sphagnum moss posee las mejores características
físicas y químicas con bajos contenido de nutrientes y pH. Para su uso en contendedores,
normalmente se utiliza un 50% de turba con otros componentes como vermiculita y perlita.

52
Arena o agregados

Estos se utilizan principalmente para ayudar al drenaje y. agregar peso a la mezcla y para reducir
el encogimiento en las mezclas secad durante la dorman era.

Vermicu/ita y perlita

Estos componentes relativamente baratos y fácilmente d.isponibles son agent~~ de volumen ~ue
retienen humedad al tiempo que aseguran un buen drenaje de la mezcla. También ayu?an a evitar
que el med io de crecimiento se compacte. Ambos son livianos y de pH ~eut.ro. La perlita caree de
capacidad buffer y es nutricionalmente inerte, mientras que la vermiculita posee una mayor
capacidad buffer y puede proveer de Mg y K para el crecimiento d? las plántulas (Goh & ~a~nes,
1977) . Estos componentes rara vez se utilizan para nuestras orqu ídeas terrestres. El crecimiento
de algas puede ser un problema con estos ingredientes.

Corteza compostada

Los mejores componentes son la corteza de Allocasurina, ramillas y ac ículas de pino. La corteza
de pino rara vez se usa.

Productos de madera compostados

Las astillas y aserrín de madera fina son utilizadas como un sustituto natural de la turba si ésta se
encuentra limitada o prohibitivamente cara . Algunos tipos de madera pueden ser tóxicos para el
crecimiento de las raíces, por lo que es esencial realizar test prelim inares de estos productos en
forma previa a su utilización. Es preferible utilizar productos de la madera envejecidos y leach (Le.
compostados) . El ingrediente principal usado en Western Australia es aserrín de Jarrah (Eucaliptos
margenada) el cual es barato y está fácilmente disponible.

Compost

El compost se elabora combinando material vegetal como paja , productos de madera, residuos de
plantas y desechos de animales en una pila, y manteniéndolos en un estado húmedo, que permita
una descomposición microbiana parcial (Ho itink, 1980; Hardy & Sivasithamparam, 1989). El
producto final es un suelo que parece humus con un contenido alto de nitrógeno con una relación
C:N baja , productos de la madera relativamente crudos. El compost tiene una alta capacidad de
retención de agua , es liviano y se mezcla bien con arena, suelo, perlita y vermiculita (Liegal &
Venator, 1987) . Se ha descubierto de las mezclas para macetas basadas en corteza de eucaliptos
compostada suprimen patógenos como Phytophtora spp. (Hoitnik, 1980 ; Hardy &
Sivasithamparam, 1991) . Los principales materiales comportados para las orquídeas terrestres
son el aserrín de Jarrah, corteza/ramillas de Allocasuarina y ac ículas de pino. No se utilizan
desechos an imales.

Mezclas

53
Se ha utilizado un número de mezclas por un período prolongado de tiempo, sin embargo , estas
usualmente se basan en ingredientes orgánicos provistos por ecosistemas naturales los que no
son sustentables. Se han probado otros materiales orgánicos e inorgánicos (Nika). Generalmente,
las mezclas deben ser abiertas, con buen drenaje y contener materia orgánica beneficiosa para el
hongo. En el cuadro 9.2 se entregan algunas mezclas que han sido utilizadas de manera exitosa
en orquídeas terrestres de Western Australia.

Cuadro 9.2 . Mezclas de sustrato para orquídeas terrestres de Western Australia .

Mezclas Proporciones
Mezcla 1
Arena gruesa 4.5 partes
Loam 4.0 partes
Turba 1.5 partes
Mezcla 2
Arena gruesa 4.0 partes
Loam rico 2.0 partes
Astillas de madera 2.0 partes
Hojas de litre comportadas 2.0 partes
Mezcla 3
Arena gruesa 2.5 partes
Arena plana de la costa 5.0 partes
Loam 1.0 partes
Turba 1.5 partes

B. Esterilización de las mezclas.

Las mezclas que contienen en una mayor proporción turba, perlita y vermiculita usualmente no
requieren esterilización (pasteurización) mientras que las mezclas con aserrín, corteza , humus
crudo o suelo deben ser esterilizadas (pasteurizadas) para reducir la amenaza potencial de
patógenos y otros microorganismos que podrían limitar el crecimiento del hongo micorrítico en las
raíces y eliminar las semillas de malezas. Es Mejor esterilizar (pasteurizar) las mezclas de cuando
están tibias y húmedas. La turba, sin embargo, puede ser tratada al vapor cuando está casi seca.
El tratam iento de vapor, cuando se lleva a cabo a 70° C por 30 minutos, es preferible porque es no
tóxica y esteriliza parcialmente las mezclas, eliminando los microorganismos perjudicia les y las
semillas de malezas, mientras que los microbios saprófitos benéficos se mantienen vivos (Baker &
Roistacher, 1957). Es importante que se mantenga la mayoría los microorganismos saprófitos. Una
meta adicional en los viveros con micorrizas es erradicar las cepas de hongos menos eficientes,
como la The/ephora spp ., la cual reduce el éxito de los programas controlados de inoculación.
Existe una amplia variedad de equipamiento para realizar la pasteurización con vapor, pero éstos
pueden resultar de muy alto costo para los viveros de tamaño pequeño.

Temperaturas por sobre los 70° e pueden ser desventajosas en las mezclas que contienen algún
tipo de suelo ácido debido a que estos pueden liberan cantidades tóxicas de Mn causando una
deficiencia de Fe en plantas en contenedores (Sonneveld, 1979).

Una alternativa más barata al uso del vapor es utilizar la pasteurización solar donde la mezcla
húmeda es cubierta con una hoja de polietileno transparente y expuesta al sol directo por un
período de tiempo . La temperatura por debajo de la hoja de polietileno puede superar los 60° C
durante los meses de verano , pudiendo ser aún mayor en los trópicos .

Los resultados de exposiciones repetidas o continuadas a solarización a temperaturas subletales

que matarán igual a la mayoría de las plagas, semillas de malezas y patógenos , o los debilitarán
de modo que no puedan sobrevivir (Stapleton et al., 1985; Porter & Merriman, 1985). Este método

54
es recomendable para períodos en que la temperatura del aire es alta para así obtener
temperaturas que logren controlar la mayoría de las plagas de las raíces.

La esterilización química con fumigantes puede ser simple y efectiva, pero se deben seguir las
precauciones indicadas en la lata y consejos de la agencia de control local de plagas. El bromuro
de metilo es el fumigante más ampliamente utilizado, proveyendo una esterilización efectiva de los
suelos. En Western Australia sólo operadores con licencia están autorizados para aplicar
fumigantes.

Advertencia: Los esterilizantes químicos son materiales altamente riesgosos. Es esencial un

cuidado extremo en la manipulación y aplicación de estos químicos y se deben seguir
estrictamente las instrucciones indicadas en la etiqueta.

Figura 9.3. Mezclas para macetas. A. Combinación de ingredientes para confeccionar una mezcla
de sustrato con valores apropiados de pH, nivel nutricional, drenaje y capacidad de retención de
humedad.

Sieve and mi x

55
B. Métodos de pasteurización. (1) Con vapor, (2) Fumigación química, y (3) Solarización.

9.3. Control de plagas y enfermedades.

Las plántulas de orquídeas normalmente crecen en macetas en los viveros. El manejo de las
plagas y enfermedades es simplificado al hacer crecer las plantas en contenedores ubicados lejos
del suelo, y que, por lo tanto, no son expuestos a plagas y patógenos del suelo y estarán bien
aireados. La producción intensiva de plantas en los viveros crea la oportunidad para que plagas y
enfermedades florezcan si no son monitoreadas. Estas son exacerbadas bajo condiciones de mala
higiene o donde las plantas están estresadas debido al mal manejo (Le. sobre o sub riego, mezclas
de sustratos inapropiadas , etc.). Los viveros requieren de estrategias de control de plagas y
enfermedades efectivas que consideren la interacción entre el agente causal , la micorriza en el
contenedor y los factores ambientales (control integrado de plagas). En viveros , los productos
químicos son ampliamente utilizados para el control de enfermedades fungosas (fungicidas) ,
plagas de insectos (insecticidas) y nemátodos (nematicidas) . Adicionalmen te, algunos viveros
utilizan herbicidas para el control de las malezas. Ningún producto químico debería ser utilizado sin
un procedimiento adecuado y correcto de entrenamiento .

En el vivero de Kings Park & Botanic Garden es un vivero acreditado y como tal, se adhiere a las
condiciones requeridas bajo el Nursery /ndustry Accreditation Scheme Australia (N/ASA) .

56
Sin embargo , para propósitos de investigación solamente una pequeña superficie está reservada
para éste propósito donde es necesario utilizar materiales, suelo especial , de ecosistemas
naturales que no pueden ser pasteurizados o fumigados .

La mayor plaga de orquídeas en el vivero de Kings Park y su control se describen a continuación:

larvas de mosca (que comen las raíces de las plántulas y protocormos) Mesurol 750
R
(methiocarb) o VectoBac GAS (Bacilus thuringensis subsp. israelensis) .
Caracoles y babosas también son controladas con Mesurol 750 o varios tipos de cebos .

57
CAPíTULO 10. CAPTURANDO HONGOS MICORRITICOS EN El SUELO.

Un inóculo potencial es definido como la energía para el crecimiento de un organismo en la

superficie del hospedero, y el consecuente número de propágalos de ese organismo y su estado
nutricional (Garret, 1956). Comprender la distribución de los hongos micorrizas en el suelo y otros
sustratos es importante para intentar retornar las orquídeas al campo y también para comprender
la distribución de las orquídeas mismas . La distribución de las orquídeas en parches o
manchones, puede estar influida por la presencia o ausencia de un hongo micorriza específico
esencial par la sobrevivencia de la orquídea. La dispersión de las orquídeas puede ser una función
de la distribución de las micorrizas, la distribución de las semillas y las condiciones apropiadas para
la germinación de las semillas de orquídeas y del establecimiento de las plantas de orquídeas.
Estudios de germinación in situ en los sitios en el campo han demostrado que se puede obtener
una buena germinación.

A. Método de captura (cebo) del marco de diapositiva.

Una técnica de entierro de semillas desarrollada por Rasmunssen and Whigham (1993) permite
una efectiva distribución de los endófitos de orquídeas en hábitats naturales in situ. Un estudio
similar en Western Australia, la formación de tubérculos desde protocormos confirmó la presencia
del hongo, en semillas que fueron dejadas en el suelo a través de toda la temporada de
crecimiento (Batty et al., 2001) . En este estudio, el mayor éxito de germinación fue encontrado en
las semillas de orquídeas ubicadas próximas a plantas adultas de la misma especie.

Fi ura 10.1. Método de ca tura del marco de dia ositiva.

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Nylon Mesh

El método consiste en ubicar las semillas de orquídeas junto con arena de sílica estéril entre dos
trozos de malla de nylon y dispuestas en marcos de diapositivas, como se aprecia en la figura 10.1.
La cantidad de semilla a utilizar en cada captura dependerá de la cantidad de semilla disponible.
Para laxa raros se pueden utilizar menos semillas. Para ayudar a localizar los cebos de semillas en
el campo,. ~e puede unir un cordel de nylon al marco con un pegamento u otro pegamento de
secado rápido. Los marcos se pueden dejar listos con antelación y almacenados (por pocas
semanas) a temperatura ambiente hasta que se requieran .

58
B. Cebo de cubo de suelo intacto.
Este método se encuentra actualmente en desarrollo en nuestro laboratorio y solamente se entrega
una breve introducción aquí. Las semillas se adhieren a un trozo cuadrado de papel filtro de
membrana húmedo (ver figura 10.2) Y ubicadas en o los dos costados de un portaobjeto y es
cubierta por una mala de nylon plegada. Dos o más laxa de orquídeas pueden ser plantas cebo en
el mismo centro o núcleo por medio de ubicar las semillas en lados opuestos del portaobjetos o en
cuadrados separados de papel filtro. El portaobjetos de vidrio con semillas es insertado en una
grieta cortada en suelo (utilice solo una presión suave al insertar el portaobjetos de vidrio, de lo
contrario puede quebrarse y cortar tu mano). Nosotros hemos utilizado esta técnica para comparar
la germinación obtenida en el suelo bajo diferentes laxa de orquídeas.

Figura 10.2. Método de cebo de cubo de suelo intacto.

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59
C. Germinación de semillas sobre el suelo.
Esta técnica permite la observación no destructiva de la germinación de semillas utilizando
muestras de suelo colectado en el campo o mezclas de sustratos inoculadas con hongos
específicos. Esta es una modificación del método desarrollado para observar la germinación de las
esporas de hongos en contacto con la solución del suelo (Brundett & Juniper, 1995).

Materiales: Germinación de semillas sobre filtro de membrana.

• cuadrados de filtro de membrana de nitrocelulosa (0.45 um).
• discos o placas de Petri cuadradas (10 x 10 cm)
• trozos de malla de nylon de 11 x 11 cm (50 um),
• suelo arenoso pasteurizado (steamed)

1. El suelo es cernido y luego se riega con aproximadamente 2 veces la capacidad de campo con
agua desionizada y empacada en una placa que Petri cuadrada de 100 mm (aproximadamente
100 g de suelo / placa). Luego se cubre con una capa de malla de nylon (con poros de 50 Dm
de tamaño) .

2. Se cortan trozos cuadrados de 1 cm x 1 cm de filtro de membrana y se disponen sobre la malla

(ver figura 10.3)1. Tanto la malla como el papel filtro se pueden esterilizar con etanol al 70% y
enjuagarlas con agua destilada después. Normalmente no es necesario esterilizar las semillas
superficialmente.

3. Las placas de Petri se sellan y son incubadas en oscuridad a una temperatura apropiada. Cada
semana las placas se observan en el microscopio de disección con iluminación de fibra óptica
para observar el número de semillas en los diferentes estados de germinación.

4. Las semillas en los diferentes estados de germinación pueden montarse en portaobjetos para
hacer observaciones anatómicas .

60
Figura 10.3. Método de genninación de semillas de orquídeas en filtro de membrana cuadriculado.

Surface view of
protocorm
with hyphae

61
ANEXO 1. REFERENCIAS DE GERMINACiÓN SIMBiÓTICA DE SEMILLAS DE ORQuíDEAS.

62
 Appendix

Symbiotic Orchid Seed Germination References

1. Tan , T.K ., et al., Infection of Spathoglottis plicata (Orchidaceae) seeds by mycorrhizal fungus.
Plant Cell Reports , 1998. 18( 1-2): p. 14-19.
Spathoglottis plicata seeds were encapsulated in 4-mm-diameter capsu les of alginate-chitosan or
alginate-gelatin and infected with the mycorrh izal fungus Rhizocton ia AM9. Th e encapsu lated seeds were
placed directly on Rhizoctonia culture . About 66% of the seeds encapsulated in sucrose-free chitosan-
alginate established a symbiot ic relationship with the myco rrhizal fungus after co-culturing for 2 weeks .
Tr.é .,ighest percentage of infect ion observ ed was about 84%. Addition of S I 'CroSE I)r ur.inq gelatin-
aiqinate for encapsulation reduced the percentage of infection by about halt. The qrowui of Rhizoctonia
AM9 in sucrose-free alginate, chitosan and gelatin was found to be rninimal . Th e advantages of
germinating orch id seeds , encapsulated in sucrose-free polymers, through mycorrhizal infection is
discuss ed.

2. Zelmer Carla , D., L. Cuthbertson, and S. Currah Randy, Fungi associated with terrestria l orchid
mycorrhizas. seeds and protocorms. Mycoscience , 1996.37(4): p. 439-448 .
The identity and ecological role of fungi in the mycorrhizal roots of 25 species of mature terrestrial orchids
and in 17 species of field incubated orchid seedlings were examined . Isolates of symbiotic fungi from
mature orchid mycorrhizas were basidiomycetes primarily in the genera Ceratorhiza , Epulorhiza and
Moniliopsis; a few unidentified taxa with clamped hyphae were also recovered . More than one taxon of
peloton-fo rming fungus was often observed in the c1eared and stained mycorrhizas . Although Ceratorh iza
and Epulorhiza strains were isolated from the developing protocorms , pelotons of c1amped hyphae were
often present in the c1eared protocorms of several orchid species . These basid iomycetes are difficult to
isolate and may be symbionts of ectotroph ic plants . The higher proportion of endophytes bearing clamp
connections in deve loping seeds than in the mycorrhizas is attributed to differences in the nutritional
requirements of the fully mycotrophic protocorms and partially autotroph ic plants. Most isolates of
Ceratorh iza differed enzymat ically from Epulorhiza in producing polyphenol oxidases. Dual cultures with
thirteen orchid isolates and five non-orch id hosts showed that some taxa can form harmless associations
with non-orchid hosts. lt is suggested that most terrestri al orchid mycorrh izas are relatively non-specific
and that the mycob ionts can be saprophytes, paras ites or mycorrhizal associates of other plants .

3. Van Der Kinderen , G., Observations on in situ germination of Epipact is helleborine (L.) Crantz.
Lindleyana, 1995.10(4): p. 223-23 1.
Germination of Epipactis helleborin e was studi ed under natural conditions, using a new technique 01
controlled soil incubation in situ. The influence 01 temperature , incubation depth and seed viability was
examined in relat ion to the germination process. A long imbibition periodostarting 3 months alter seed
dispe rsal, was obse rved. Its durat ion was equal regardless of the depth at which seeds were incubated.
The proportion 01 seeds involved in the process was higher than suggested by bioch emical viability
testing, which proved to be unrel iable. Differentiation 01 embryos to protocorm s started almost one year
after seed dispersal. A cold period preced ed this stage of development and may have broken seed
dormancy, but differentiation was observed only alter lungal inlec tion. Alter this, a marked depth-
dependent dilferen ce in rate 01 developmen t was observed.

4. Ouay, L., A. McComb Jen, and W. Dixon Kingsley, Methods for ex vitro germination of Australian
terrestrialorchids. Hortscience, 1995. 30(7): p. 1445-1446.
Seeds 01 two Australi an terrestrial orchid species (Caladenia latilol ia R.B r. and Diuris magnifica D. Jones)
were germinated in a potting mix 01 Allocasuarina Iraseriana (Miq.) L. Johnson leal mulch and perlite
(1:1). The polling mix was irradi ated (7 Gy Ior 14 hours), steam pasteurized (?OC lor 30 minutes) or
 nontreated and inoculated with the appropriate mycorrhizal lungus lor each speci es, a sterile red lungu s
(SRF), or both. Protocorm lormation and green shoots were evident at 8 and 10 weeks , respecti~~ ly, alter
seed sow ing. The highest mean numbe r 01 seedlings was 84 lar C. latilo lia and 234 lor D. rnaqnitica per
. 270-ml container in pasteurized potting mix inoculated with mycorrhizal lungí and SRF . Shoots were
longest alter 20 weeks (28 mm Ior C. latilolia and 52 mm lor D. magnilica, respectively) in pasteurized
potting mix inoculated with mycorrh izal lung i only. Germination was absent in control treatments without
mycorrh izal lungi ; with SRF only; or in nonsterile potting mix with mycorrh izal lungi , SRF , or both .

5. Oddie, R.L.A. , K.W. Dixon , and J.A. McComb, Influence of substrate on asymbiotic and symbiotic
in vitro germination and seedling grawth of two Australian terrestrial orchids. Lindleyana, 1994. 9(3): p.
183-189.
Aqar, Gs lrite. Agro soke, ultral ine perlite and Allocasuarina leal mulch were tested as in vitre substrates
tor the germ ination and grow1h 01 two Australian terrest rial orchids, Elythran thera bruno nis and Diuris
longilolia. When cultured asymb iotically, seeds 01 both species showed more germ inatio n and grow1h on
medium gelled with Gelrite than on medium gelled with agar. Elythranthera seeds cultured on ultral ine
perlite gave a similar level 01 grow1h and germination as on Gelrite but, lor Diuris seedlings ultral ine
.perlite was superior to Gelrite . Agrosoke and Allocasuarina leal mulch supported no germination in either
species . Symbiotic germ ination 01 both species was more rapid than asymb iotic germ ination .
Elythranthera seeds cultured symbiotically on Gelr ite showed more grow1h than those on agar or ultral ine
perlite. A higher strength 01 Gelrite and a lower strength 01 agar promoted more germ ination and grow1h
01 symb iotic D. longilo lia seedlings . E. brunon is produced tubers alte r 20 weeks grow1h, with more tubers
being produced on Gelrite than on aga r or ultral ine perlite.

6. Johnson Stephen, R., Symb iotic seed germination in relation to potential naturalization ability of
Bletilla Striata (Orchidaceae). Lindleyana, 1994 . 9(2): p. 99-101.
Orchid species may var¡ in their specilicity for symb ionts . Species with less restricted lungal relationsh ips
and wide range 01 possible pollinators may possess the abil ity to naturalize outside their native habitats .
Unster ilized seeds 01 Bletilla striata we re collected lrom garden grown plants in 1988. Unsteril ized seeds
were placed onto a non ste rile comme rcially ava ilable potting soil and enclosed in plastic chambers to
maintain high relative humidity. Five chambers were inoc ulated with leal mold lrom the rhizosphere 01
Cypripedium acau le and anothe r l ive we re not. Seed germination was greater than 60%, morta lity was
less than 20% in the C. acau le leal mold treatment and in the treatmen t lacking C. acaule leal mold, seed
germination was 34% with a 45% mort ality 01 seedlings. Seedlings developed lrom protocorms in less
than 1 month . This suggests that Bletilla striata is not highly specili c in response to lun gal symb ionts and
may therelore possess some natu ralization ability.

7. Wang, H. and J.-T . Xu, A cytochemical study of acid phosp hatase in the mycorrhizal cells of
Gastrodia elata seedling. Acta Botanica Sinica, 1993. 35(10): p. 772-778.
A cytochemical study has been made to examine the activity 01 acid beta-g lycerophosphatase in the
mycorrhizal cells 01 the seedl ing 01 Gastrodia elata BI. using thin secti oning technique in which section s
were embedded in glycol mathacr¡late (GMA). Al ter the seedli ng was invad ed by the hyphae 01 Mycena
osmundicola Lang e, two dill erent kinds 0 1 inlected cells were lorm ed in its root cortex: the outer 1-2 cell
layers namely the hypha e-containing cells (or host cells) contained many coil ed hyph ae pelotons : the
inner com paratively large cell layer or lung us-digesting cells contained a lew straight hypha e. Localization
01 acid phosphatase in hyph ae-cont ain ing cells showed that only a lew senes cent hyphae retained the
enzyme activity and the plant cells did not release hydrolytic enzyme . So it is considered lhat the hyphal
Iysis in hyphae-containing cell may be due to autolysis. In contrast, highe r acid phosphatase aclivi ty was
visuali zed in many vesicles and small vacuo les 01 the lungus-digesting cells . When a hypha entered a
lungus-digesting cell through a hyphae-conlaining cell, a numb er 01 enzyme granul es (i.e. enzyrne-
containing vesicles) gath ered around it. Later on the enzyme granules expanded grad ually and becam e
smal l enzyme vacuoles 01 1.6-2.0 rnu-rn in diarneter. Still laler the small enzyme vacuoles lused with
each other to lorm a large vacuo le in whic h a part 01 an invading hypha was enclosed and gradually
diges ted by hydrolytic enzymes. Finally, the digesting vacuole changed into a residual body containing
some metabolic waste. The above results suggest that fungus-digesting cells can actively release
hydrolytic enzymes by Iysosomal vesicles to digest the invading hyphae, but such function is not present
in the hyphae-containing cells, the role of which may be attributed to attracting and controlling the
invad ing hyphae.

8. Beyrle, H.F. and S.E . Smith, Excessive carban prevents greening ot leaves in mycarrhizal
seedlings ot the terrestrial archid Orchis maria. Lindleyana, 1993 .8(2): p. 97-99.
Symb iotic germination of seeds of the terrestrial orchid Orchis morio L. on liquid oatmeal med ium resulted
in rapid development of protocorms and the formation of roots and leaves within six weeks. In daylight,
the leaves developed chlorophyll and became green. With the addition of starch or sucrose (1%) plantlets
developed longer roots, but light-induced chlorophyll synthesis was inhibited . Orchid mycorrhiza is
discussed as a mechanism of heterotrophic carbon assirnilat ion with tbe exploitation of the carbohydrate
pool of the mycorrhizal fungus by the orchid as the main feat ure.

9. Malmgren, S., Large-scale asymbiatic propagatian by seed ot Anacamptis, Ophrys, Orchis and
ather European archids with entire tubers. Svensk Botanisk Tidskrift, 1993. 87(4): p. 221-234.
It is now poss ible to propagate a large number of temperate terrestrial orchids on several different
growing media with asymbiotic methods. However, several species of Ophrys, Orchis , Anacamptis, and
similar orchids with entire tubers, as well as species of Cypripedium , seem to be very sensitive to
inorganic nitrogen, especially nitrate, in the medium. However, a simple medium , where an amino-acid
solution is the sole nitrogen source, has been used with great success. This solution, as well as the
vitamin source, are standardized solutions used normally as pharmaceutical substances in hosp ital
med ical care oMost terrestrial orchids seem to be possible to propagate on a large scale on this medium,
or very small variations of it (amino acids 0.4-1 g; saccarose 10-20 g/1 OOOg). Concerning germination a
combined treatment with H-2S0-4 and NaCIO is described. Several species, which are otherwise
problematic, germinate very well with this method, even from mature seeds. Mycorrhiza symbiosis is not
necessary for survival after transfer into the soil. Survival is just a question of plant size and experienced
plantlet nursing .

10. Webe r, T. and J. Bach Thomas , Partial purificatian and characterizatian af membrane-assaciated
3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A Iyase from radish seedlings. Zietschrift fuer Naturtorsch ung
Sect ion C Journal of Biosciences , 1993. 48(5-6) : p. 444 -450.

We solubilized from radish membranes and purified by 154-fold 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA Iyase

(HMGL, EC 4.1.3.4) catalyzing the conversion of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-(HMG -)CoA into acetyl-CoA
and acetoacetate. The apparent molecular mass under non-denaturating conditions is 70 kDa . The
enzy me has a broad pH optimum around 8.0 and its act ivat ion energy as determ ined from the linear par!
of an Ar rhen ius plot is 137.1 kJ/mol. The K-m with respect to (S)-HMG-CoA is 40 rnu-M. Th e enzyme is
extremely unstable and rapidly loses act ivity even when kept on ice . but retains som e activity over
seve ral weeks when sto red at -80 degree C.

11. Masuhara, G.K.K., Fungal Coil Formation of Rhizoctonia-Repens in Seedlings of Galeola -

Septentrianalis Orchidaceae . Botanical Magazine To kyo , 1076 . 104(1076): p. 275- 281 .
Protop cor ms or protocorms with roots of an achlorophyllous orchid Galeola septentrionalis we re
inoc ulated with iso lates of Rhizoctonia repen s, R. solani, and Rhizoctonia spp. Th e seedling s were
infec ted with eight of twelve isolates of R. repens oFungal coils were formed in the cell s, wh ich was
suggestive of a symb iotic association . Th e oth er iso lates caused soft rot or no infection lo Ihe prolocorms
or the prolocorms wilh a rool.

12. Uetaka, Y.K.K.O.A., Penetration and Peloton Formation By Binucleate Rhizoctania Ag-C On
Symb iatic Germinatian ot Spiranthes-Sinensis Seeds. Reports of the Tottori My colo gical lnstitute. 1990.
28: p. 307-3 16 .
Penetration time , site, and procedure, and peloton format ion 01 binucleate Rhizocton ia AG-C during the
symbiotic germination of Spiranthes sinensis (Orchidaceae) were observed using a light and a scanning
electron microscopes. The fungus invaded from the side oppos ite to the meristem 01embryo with single
hyphae. The embryo initiated germination just after the funga l invasion, emerged from the testa, and
became a protocorm. Hypae pennetrated subepidermal and inner cortical parenchymal cells and lorm ed
pelotons , but did not penetrate meristematic cells . Pelotons in subep idermal parenchymal cells were
stained strongly with salran in, and were not digested, whereas pelotons in the inner cortical parenchymal
cells were stained weakly with salranin, and were finally digested . Secondary infection occured to the
cells containing digested pelotons. Emergence of hyphae from the epidermis and hairs of protocorms was
observed.

13. Smreciu, E.A.C.R.S., Symb iotic Germination ot Seeds ot Terrestrial Orchids of North America
and Europe. Lindleyana, 1989.4(1): p. 6-15.
Symbiotic and asymbiotic germination of seeds 01 north temperature terrestrial orchids (10 North
American species: Amerorchis rotundifolia, Calypso bulbosa , Coeloglossum viride , Corallorhiza maculata,
C. trifida , Cypripedium calceolus , Goodyera repens, Platanthera hyperborea , P. obtusata, and P.
orbiculata and 10 European species: Dactylorhiza maculata, D. sambucina, Epipact is palustris , E.
purpurata, Gymnaden ia conopsea, G. odorat issima, Neott ia nidus-avis , Nigritella nigra, and Orch is morio)
were tested on a synthetic medium and on a cellu lose medium inoculated with one of six rhizocton ia
strains isolated Irom orchid mycorrhizae and various pathog enic sources. Some deve lopment, ranging
Irom embryo swelling to shoot development, was observed for 17 orchids. Embryos of Corallorhiza
maculata, C. trifida, and Epipactis purpurata failed to deve lop further. Ceratobasidium cereale stimulated
germina tion of 11 orchids but tended to function as a pathogen. Rhizocton ia anaticula and Sistotrema sp.
stimulated germination of several orchid species. Sistotrema formed pelotons in protocorm cells similar to
those lound in mature orchid mycorrhizae. Thanatephorus pennatus, Ceratobasium obscurum , and
Rhizoctonia anaticula were not effective in promoting seed germination or protocorm development in
most of the orchids.

14. Manning, J.C.V.S.J., The Development and Mobiliza tion of Seed Reserves in Sorne African
Orchids. Australian Journal of Botany, 1987.35(3): p. 343-353.
The development, linal appearance and digestion of seed reserves in a number 01 genera 01 the
Orchidaceae (tribe Orchideae) has been studied comprehensively, using ultrast ructural and histochemical
techniques complemented by gas chromatographic analysis of Iree sugars . Mature seeds of Disa,
Disperis and Huttonaea contain substantial reserves 01 lipid and protein in the embryo. The protoderm al
cells 01 Disperis also contain protein-carbohydrate bodies. Free sugars are present but starch occurs only
in immature seeds. Glyoxysom es are absent and lipolysis does not occu r in seeds incubated without an
external source 01 sucrose , and although a litlle starch is formed it is apparently synthesised lrom
endogenous sucrose reserves. In the presence 01 exogenous sucrose, howeve r, proteins are hydrolysed
and glyoxysomes appear . Substantial quantities 01starch are lorm ed in such seeds. From these
observations it is apparent that orchid seeds are unable to utilise endogenous reserves 01 lipid unless
simple sugars are supplied to the medium but can utilise the free suga rs present in the embryo. Resultant
conclusions on the role 01 mycorrhizae in the germina tion of orchid seeds are discuss ed.

15. Tsutsui, K.T.M., Symb iotic Germination of Spiranth es-Sinensis Associated With Sorne Orchid
Endophytes . Journal of the Faculty 01 Agricultur e Hokkaido University, 1986. 62(4): p. 440-452.
With 7 Rhizoctonia isolates obtained lrom 4 orchid species out of 10, symbiotic capability to Spiranthe s
sinensis seeds was tested on oat medium. A binucleate Rhizoctonia AG-C isolate obtained Irom
Gymnad enia camtschatica was the most effective symbiont to this orchid and germinated seeds grew
large enought to transplant within 3 months after seeding . Two binucleate Rhizoctonia iso/ates , possibly
Rhizoctonia repens, obtained from Spiranthes sine nsis per se were symbiotic to this orchid but fat less
effective. And there was a considerable difference between the two in their effectiveness. The effect of
culture media on the symbiosis was considerably large but it could not change the essentia/ nature of the
symbiosis. For this orchid the medium containing mineral salts, 1% cellulose. 0.1% sucrose and 0.02-
0.05% yeast extract was better than the oat medium for symbiotic culture . The additi.on of mycelial
powder or culture filtrate of the compatible fungus to non-symbiotic culture did not ~tlmulate the . .
germination or protocorm growth . Although Spiranthes sinensis was found to qerrninate non-symbl.otlcally
on a wide range of media irrespective of Iight conditions , the protocorm growth was very slow and It
required more than 16 months from seeding to attain sufficient grow1h for transplanting.

16. Markovina, A.L. and PA McGee , Comparison of symbiatic and asymbiatic seed germinatian and
plantlet develapment in Sarcachilus (Vandeae; Orchidaceae). Lindleyana . [ print], 2000. 15(2) : p. 68-72 .
In vitro symbiotic and asymbiotic seed germination and plantlets development of Sarcochilus species and
hybrids were compared. Of four fungi isolated from pelotons from Sarcochilus olivaceus Lindl. and S.
falcatus R.Br. , three germinated a similar proportion of seeds following inoculation on a commercial
asymbiotic medium. The fourth isolate overgrew the seed. One fungus , tentatively identified as
Ceratorhiza sp. , stimulated growth to the extent that some seedlings were large enough for ex vitro
growth 13 weeks after germination. Mycorrhiza formation in the root-like organs of one-year-old
asymbiotically germ inated plant/ets of a hybrid of Sarcochilus resulted in faster grow1h rates than of
asymbiotic plantlets growing on a commercial medium. Again, one fungus stimulated growth of leaves
. and roots significantly more than the others. We suggest that symbiotic techniques have a role in
commercial production of plants.

17. Wood Christopher, B., W. Pritchard Hugh , and P. Miller Angela, Simultaneaus preservatian of
archid seed and its fungal symbiont using encapsulatian-dehydratian is dependent on maisture cantent
and starage temperature. Cryo Letters , 2000. 21 (2): p. 125-136.
Seeds of Dactylorhiza fuchsii (common spotted orchid) and Anacamptis morio (green-winged orchid)
were encapsulated in alginate beads with hyphae of the basidomycete fungus Ceratobasidium
cornigerum. Pre-treatment of beads for 18 h with sucrose at an optimum concentration of 0.75 M
decreased the desiccation rate in a flow of sterile air (c. 23 degreeC, 30% RH) and increased seed and
fungal survival after up to 16 h drying. Pre-treated and 16-h dried beads were transferred to cryo-vials
and subsequently stored at a range of low temperatures for up to 30 d. Neither embryo growth of both
orchids nor fungal development was detrimentally affected by 1 d storage at -196 degreeC when the
beads were pre-dried to c. 20% moisture content. Encapsulated D. fuchs ii seed and compatible fungus
had Itoreq 5% and Itoreq 45% viability when beads of the same moisture content were stored for 1 d at -
20degreeC and -70degreeC respectively. In contrast, viability of the seed and the fungus remained
unchanged during 30 days storage at -196degreeC but was progressively lost at 16degreeC over the
same interval. The results indicate opportunities for the use of simultaneous cryopreservation as a
conservation tool for diverse taxa.

18. McKendrick, S.L., et al., Symbiotic germinatian and devetopment ot myca-heterotrophic plants in
nature: ontogeny ot Carallarrhiza trifida and charact erizatian ot its mycarrhizat fungi. New Phytologist,
2000. 145(3): p. 523-537 .
The processes of symb iotic germination and seedling development were analysed in the myco-
heterotrophic orch id C. trífida. seeds of which were buried in 'packets' either adjacent to or at vary ing
distances from adult plants in defined communities of ectamycorrhizal tree species. Germination occurred
within eight months of burial under Betula-Alnus and within seven months under Salix repensoIt was
always associ ated with penetration of the suspensor by a c1amp-forming myco rrhizal fungus . Four distinct
developm ental stages were defined and the rates of trans ition through these stag es were plotted . There
was no evidence of a relationship between extent of germination or rate of development and the
presence of natura lly distributed plants of C. trifida at the spatial scale of 1 m. The best germination and
the most rapid rate of development of C. trifida seedlings occurred in a Salix repens community located at
a cons iderable distance from any extant C. trifida popul ation. Determ ination of internal transcribed space r
(ITS) RFLPs and 01 gene sequen ces of the fungí involved in symbioti c germin ation and growth of C.
trifida, revealed them to belong exclusively to the Thelephora -Tomentell a complex of the
Thelephoraceae . These fungi are known also to be ectomycorrhizal associates of trees . It is hypothes ized
that the rate of growth 01 the C. trifida seedlings is determined by the ability 01 the lungal symbionts to
transfer carbon lrom their ectomycorrhizal co-associates

19. Takahashi, K., 1. Ogiwara, and N. Hakoda , Seed germination of Habenaria (Pecteilis) radiata
(Orchidaceae: Orchideae) in vitro. Lindleyana, 2000 . 15(1): p. 59-63.
Characteristics of seed germination in Habenaria (Pecteilis) radiata in vitro were studied with respect to
effects of seed age, culture media, Iight conditions, and mycorrhizal fungal isolates. The germination
percentage of seeds maintained under 10-15 deg C, 30-50% humidity conditions for seven months was
unaffected by Iight conditions, culture media , and fungal isolates , and the seeds had a high germination
percentage 28 days after sowing. Seeds sown in October immediately after harvesting had a lower
germination percentage than those sown in May 01 the following year, and germinat ion percentage lor
these also varied with Iight conditions, culture media , and funaal isolate. For seeds sown in Octob er,
those cultivated on Hyponex medium had a higher germinatioll percentage than those cultivated on
oatmeal medium , and those in lighted cond itions had the higher germination percentage. Additionally , the
existence 01 a fungal isolate (isolate 9240; Ceratobasidium sp.) that does not promote early growth but
does assist in germination was recognized

20. Umata, H., Germination and growth of Erythrorchis ochobiensis (Orchidaceae) accelerated by
monokaryons and dikaryons of Lenzites betulinus and Trametes hirsuta. Mycoscience, 1999.40(4): p.
367-371 .
Four sib-monokaryons and two reconstituted dikaryons 01 L. betulinus and T. hirsuta [Coriolus hirsutus],
accelerated the seed germination 01 E. ochobiensis, an achlorophyllous orchid . AII isolates 01 L. betulinus
and 3 isolates of C. hirsutus induced the development of plants from germinated seeds. Although three
monokaryotic isolates of C. hirsutus failed to induce the development of plants, the reconstituted
dikaryons induced the development

21. Zettler, L.W., J.C. Burkhead , and J.A. Marshall, Use of a mycorrhizal fungus from Epidendrum
conopseum to germinate seed of Encyclia tampensis in vitro. Lindleyana, 1999. 14(2): p. 102-105.
In vitro symbiotic seed germination and early development of the Florida butterfly orchid, Encyclia
tampens is, is described. Seeds of E. tampens is, a commercially exploited epiphytic species, were
inoculated with a mycorrhizal fungus origi nally isolated from another epiphyt ic orchid, Epidendrum
conopseum. Seeds inoculated with the fungus germinated (99.6%) within 21 days , whereas seeds
incubated in the absence 01 the fungus failed to germ inate. About 2% of the seedlings initiated leaves
alter 13 weeks 01 incubation. Evidence tor the orch id-lungal symbiosis consisted 01 the observation 01
coils 01 lungal hyphae (pelotons) in cortical cells 01 leal-bearing seedlings

22. Sarma , C.M. and K. Satinder , Application of Rhizoctonia solani for establishment of in vitro raised
Arundin a graminifolia (O. Don) Hochr. seedlings under natural conditions. Journal 01 lhe Orchid Sociely 01
India, 1998.12(1): p. 77-78.
The establishment 01 plantlets 01 A. gramin ilolia in terms 01 survival rate and growlh in differenl growing
media was studied. Planl survival and growth were besl in a medium composed 01 charcoaí, bricks, sand,
leal mould and cow dung (1 :1:1:1 :1). Treatm ent with Rhizoctonia solani enhanced percentage survival

23. Fan, L., S. Guo, and J. Xu, Interaction betw een protocorms of Gastrodia elata (Orchidaceae) and
Mycena dendrobii in symbiotic germ ination. Mycosystema, 1999. 18(2): p. 2 19-225.
Symbiotic germination tests between seeds 01 G. elata and M. dendrobii demon strated that M. dendrobii
stimulated seed germination. Many seeds germinated and formed protocorms which were colonized by
lungal hyphae. The hyphae were comm only distribut ed in stipecell, subepiderm al parenchyma cells
(SEP) and inner cortical parenchyma cells (lCP) , and were separated lrom protocorm cell cytoplasma by
electron-Iucent materials and the protocorm cell plasma membrane. The hyphae lorm ed pelotons in SEP,
but in ICP they were digested and Iysed. Protocorm cells conta ining degenerated hyphae were frequently
recolonized by hyphae, and hyphal digestion and the reinfection of protocorm ce lls occu rred repeatedly
throughout the protocorm growth

24. Tomita, M. and S. Konno, A preliminary report on the symbiotic germ ination of nine Japanese
terrestrial orchids. Journal of the Japanese Society for Hort icultural Science, 1998 . 67(5 ): p. 696-698.
To deve lop an effect ive propagation method , a symbiotic culture (using 20 funga l stra ins) was attempted
in 9 spec ies of Japanese ter restr ial orchids. In al! orch id species tested, seeds germinated in symb iotic
culture with Rhizoctonia isolates; no seeds germinated in symb iotic culture with non-Rhizoctonia isolates .
Seeds of Goodyera biflora varo macrantha, G. foliosa varo laevis and G. hachijonesis varo matsumurana,
when inoc ulated binucleate Rhizoctonia stra ins, germ inated and exhibited virtually the same nc
[tetrazolium test] results as ernbryos. Those in a symb iotic culture with binucleate Rhizocton ia grew well
compared with seeds on a non-symorotic cu lture. The 6 other orchid species exhibited lower germ ination
rates and reduced nc test resu lts. There were numerous effective fungal strains with 5 orch id species
with the except ion of Cypripedium macranthos varo speciosum , which deve loped a symbiotic relationship
with only one of the fungal isolates tested. The binucleate Rhizoctonia fungal group were su itable for
promoting symb iotic germ ination and growth of Aorchis cyclochila, Dactylorhiza aristata and Gymnadenia
camtschatica; Amitostigma kinoshitae and Ponerorchis graminifolia varo graminifolia responded better to
R. repens

25. Zettler, L.W . and C.J. Hofer, Propagation of the little club-spur orchid (Platanthera clavel/ata) by
symbiotic seed germ ination and its ecological implications. Environmental & Experimental Botany, 1998.
39(3 ): p. 189-195.
Propag ation of the auto-pollinated terrestrial orch id, P. c1avellata, using symb iotic seed germination is
described. Seeds from 3 popu lations in the southern Appa lachians (Tennessee, South Caro lina and
Georg ia, USA) were inoculated with mycorrhizal fung i (Epulorhiza spp .) in vitro. Seed germ inat ion and
protocorm (seedling) developmental stages were evaluated up to 1 year after sow ing. Seeds from
Tennessee and South Carolina had significantly higher percentage germ ination (76.4 and 81 .5%,
respectively) than seeds from Georg ia (16 .2%) . More advanced seedlings suitable for transfer to the soil
were obtained from the Georgia seed 101. A single funga l isolate (E. inqui lina) originally obta ined from
roots of P. c1avellata , promoted adv anced seed ling development; 3 other isolates from obtained from P.
ciliaris, P. crista ta and P. integrilabia wer e ineffect ive . The ecological role of this orchid with its associated
fungi is disc ussed with respect to the other coh abiting Platanthera species

26. Umata, H., In vitro germination ot Erythrorch is ochobiensis (Orchidaceae) in the presence of
Lyophyl/um shimeji, an ectomycorrh izal fungus. Mycoscience , 1997.38(3): p. 355-357.
In vitro germ ination of a myco-heterotroph ic orchid, E. ochob iensis, was teste d in the presence of
ectomyco rrhizal fungi, L. shimeji and Tricholo ma fulvocastaneum. L. shimeji stimula ted the ge rmination
alter incubation for 1.5 months. Although most germinated seeds did not grow furth er after 3 rnonths,
several seeds developed into small protocorms but showed amorphous profiles. Fungal mycelia were
obse rved in the germinat ed seeds and protocorms, but peloto ns were not detected. Since lh e seeds did
not germinale axenically, it is sugges ted that the fungu s has the ability to slimulate germinalion

27. Zelmer, C.D., L. Cuthb ertson , and R.S . Cu rrah, Fungi associated with terrestrial orchid
mycorrhizas, see ds and protocorms. Mycoscience. 1996.37(4): p. 439 -448.
The identity and ecological role of fungi in lhe mycorrhizal roots of 25 species of malure lerrestrial orchids
and in 17 species of field incubated orchid seedlings were examin ed. lsolates of symb iotic fungi from
mature orchid mycorrhizas were basidiomyceles pri marily in the genera Ceratorhiza. Epulorhiza and
Monili opsis; a few uniden tified la xa with clamped hypha e were also recovered. More lhan 1 taxon of
pelot on-formi ng fungus was often observed in lhe cleared and stained myco rrhizas. Although Cera torhiza
and Epulorhiza strains were isolaled from the developing protocorms, pelot ons of c1a mped hyphae were
often present in lhe cleared protoco rms of sev era l orchid species. These basidiom ycetes were difficull lo
isolate and may be symbionts of ectotrophic plants. The higher proportion of endoph.ytes beari.n.g clamp
connections in developing seeds than in the mycorrhizas is attributed to differences In the nutritional
requirements of the fully mycotrophic protocorms and partially autotrophic plants. Most isolates of
Ceratorhiza differed enzymatically from Epulorhiza in producing polyphenol oxidases. Dual cultures with
13 orchid isolates and 5 non-orchid hosts showed that some taxa can form harmless associations with
non-orchid hosts. It is suggested that most terrestrial orchid mycorrhizas are relatively non-specific and
that the mycobionts can be saprophytes, parasites or mycorrhizal associates of other plants

28. Umata, H., Seed germination of Galeola altissima, an achlorophyllous orchid, with
aphyllophorales fungí. Mycoscience, 1995 .36(3): p. 369-372.
Seed germination tests on G. altissima were carried out with 5 aphyllophorales fungi: Erythromyces
crocicreas, Ganoderma australe, Loweporus tephroporus , Microporus affinus and Phellinus sp. AII 5
species were effective for seed germination of the orchid. E. crocicreas, which has hitherto been
regarded as the only endomycorrhizal fungus of the orchid, was confirmed to be effective for further
development of the orchid

29. Rasmussen , H.N., Germination biology and mycotrophy of terrestrial orchids. Studies of north
tempera te species 1986-1993. SP Rapport Statens Planteavlsforsog, 1995(31).
Results of in vitro and field studies and a literature survey on the germination and growth of orchids in
association with mycorrhizas are discussed

30. Rasmussen , H.N., Terrestrialorchids. From seed to mycotrophic plant. Cambr idge University
Press, Cambridge, UK, 1995 . 332: p. 50.
Terrestrial orchid biology is surveyed, from seed dispersal to the established plant, including the role of
mycorrhizas, using observations from field and in vitro experiments. There are chapters on seed
properties, development, survival and germination, mycorrhizas and mycorrhizal funqi, underground
organs, abiotic factors in growth and development, Iife history and phenology, and propagation . The final
chapter reviews the life history, endophytes, role of mycorrhizas and propagation of 36 genera and their
species. There is a Iist of references and appendices of media and names and synonyms. The boak is
intended for both physiologists and those involved in orchid horticulture

31. Kinderen , G.v.d., Observations on in situ germination of Epipactis helleborine (L.) Crantz.
Lindleyana , 1995 .10(4): p. 223-231.
Germination of E. helleborine seeds was studied under natural conditions, using a new technique of
controlled soil incubation in situ. The influence of temperature , incubation depth and seed viability was
examined in relation to the germination process. A long imbibition period, starting 3 months after seed
dispersal , was observed . Its duration was equal regardless 01 the depth at which seeds were incubated .
The proport ion 01 seeds which proved to be viable in the soil incubation test was higher than suggested
by biochem ical viability testing , which proved to be unreliable. Differentiation of embryos to protocorms
started almost one year after seed dispersa!. A cold period preceded this stage of development and may
have broken seed dormancy , but differentiation was observ ed only alter mycorrhi zal inlection . Alter this, a
marked depth-dependent difference in rate 01 development was observed

32. Uetake, Y., A. Ogoshi, and N. Ishizaka, Cytochemicallocalization of malate synthase actívity in
the symbiotic germination of Spiranthes sinensis (Orchidaceae) seeds. Transactions of the Mycological
Society 01 Japan, 1993.34(1): p. 63-70.
Activity 01 malate synthase was demonstrated in microbodies (glyoxysomes) in asymbiotic seeds 4, 10,
15 and 25 d alter sowing on oat powder agar, and in symbiotic seeds at 4 d alter sowing and inoculation
with binucleate Rhizoctonia AG-C on the same medium . In symbiotic culture, the reaclion producls in
microbod ies lessened in the embryo alt er 5 d and were absent Irom or present in limited amounts in lhe
protocorms at 10 d and in young seedlings 15 d after sowing and inoculation. Lipid bodies were degraded
slowly in asymbiotic seeds, but rapidly in infected cells of symbiotic seeds. These results suggest that
fungal invasion caused changes in the metabolism of Iipid reserves in the orchid embryo cells

33. Zettler, L.W., F.V. Barrington, and T.M. Mclnnis, Jr., Developmental morphology of Spíranthes
odorata seedlings in symbíotic culture . Lindleyana, 1995.10(3): p. 211-216.
Symbiotic seed germination and developmental morphology of S. odorata protocorms (seedlings) were
investigated using 2 orchid endophytes isolated from the North American terrestrial orchids S. odorata
and Platanthera ciliaris. Seeds germinated during the second week of incubation in both symbiotic and
asymb iotic culture ; however, seedling development in the absence of a fungus was arrested after 35
days. Fungal -infected seedlings produced leaf primord ia in darkness, but further leaf (shoot) development
occurred only after exposure to white light. Seedlings infected with the P. ciliaris endophyte continueci to
develop, leading to the soil-establishment of 5.6% of the originally-sown embryos, 299 days follow;' :9
fungal inoculation. Seedlings that initiated the format ion of leaf primordia represented the most critical
stage in the early development of this species, with Iight and fungi both playing key roles. Although this
species is routinely propagated asexually through vegetative cloning, the continued implementation of
. symbiotic techniques for this and other temperate terrestrial orchids is advocated here, at least until the
reproductive potential of native orchids is fully understood

34. Rasmussen, H.N. and D.F. Whigham , Seed ecology of dust seeds ln situ: a new study techníque
and its application ln terrestrial orchíds. American Journal of Botany , 1993.80(12): p. 1374-1378.
A method is described by which seeds of terrestrial orchids are sown and retrieved in the field under
almost natural conditions. For the first time it is possible to conduct a quantitative study of orchid
germination in situ and observe seasonal growth and mortality of seedlings. The technique has also
enabled the relation between the site where the seeds are sown, the availability of an appropriate fungus
to infect the seeds, and seedling establishment in the soil to be investigated. Five local species were
studied . Corallorrhiza odontorhiza, Goodyera pubescens and Galearis spectabilis all began to germinate
in May-June, after 23-30 weeks in the soil. These species differed in their dependency on infection at
germination time , but none of the seedlings developed beyond the point of ruptur ing the testa except
when infected . Seeds of Liparis liliifolia and Tipu laria discolor did not germinate within the first 12 months
of the experiment. The implications and potential uses of this field sowing technique for further studies
and for other kinds of minute seeds are discussed

35. Zettler, L.W. and T.M. Mclnnis, Jr. , Light enhancement of symb íotic seed germinatíon and
development of an endangered terrestríal orchid (Platanthera íntegrílabia). Plant Science , 1994. 102(2) :
p. 133-138.
Seeds of the endangered orchid P. integrilabia were exposed to 1 of 3 light treatments: 7 days initial
darkness followed by 16 h Iightlday, 16 h lightlday for 7 days followed by darkness, and 16 h lightlday
throughout. Alternatively, a continuous dark treatment in symbiotic and asymbiotic culture was provided.
Seeds exposed to a photoperiod of 16 h/day or an initial 7 days of darkn ess followed by 16 h Iightlday
were largely inhibited from germinating . Seeds exposed to 16 h lightlday during the first 7 days after
fungal inoculat ions followed by darkness had a significantly higher percentage germin ation (44 %) than
the other treatments , includ ing inocul ated seeds in continuous darkness (20.3%). Seedling (protocorm)
developm ent (Le., formation of leaf primordi a) was also enhanced by initiallight compared with seedlings
under cont inuous darkness. lt is speculated that light exposure followed by darkness occurs naturally,
starting with the shedding of seeds from capsules to their imme rsion in a subst rate where germination
occurs . The beneficial effects of light in this study argues in support of light usag e to stimulat e
germination and seedling development of temperate terrestrial orchids

36. Wilkinson , K.G., et al., Effect of ¡AA on symbiotic germination of an Australian orchid and its
production by orchid-associated bacteria. Plant & Soil, 1994 . 159(2) : p. 29 1-295 .
Seven isolates of orchid-associated bacteria (OAB) belonging to 5 species were tested for their effect on
mycorrhiza-ass isted germination of the terrestrial orchid Pterostylis vittata . Growth regulator sta~dards
were also tested to evaluate their potential roles in the germination and development of the orchid.
Strains of Pseudomonas putida, Xanthomonas maltophilia and Bacillus cereus promoted symbiotic
germination , whereas certain strains of P. putida and an Arthrobacter species reduced it. Symbiotic
germination was enhanced by IAA, inhibited by GA<sub(3» and suppressed by kinetin . Each species of
OAB produced IAA, although the conditions of growth affected the production 01 the auxin . IAA was not
produced by the mycorrhizal lungus from P. vittata under the test conditions. Enhancement of symbiot ic
germination development may have resulted either from the production of IAA by the OAB and/or by the
induction 01 endogenous growth regulators in the orchid by the metabolites of the bacterium and/or
mycorrhizal fungus

37. Zettler, L.W. and T.M. Mclnnis, Jr ., Symbiotic seed germination and development ) f Soirsntnes
cernua and Goodyera pubescens (Orch idaceae: Spiran thoidea e). Lindleyana, 1993. 8(3) : p. 155-162.
The symbiotic germination and subsequent development of seeds of 2 North American terrestrial orch ids
was studied using a combination of 3 seed storage temperatures (6, 22 or -7 deg C) and 30rchid
. mycorrhizal endophytes isolated from Platanthera ciliaris, P. integrilabia and S. cernua . Germination
percentages were not significantly enhanced by fungus inoculation. Seeds germinated in all treatments
including those in asymb iotic culture (non-inoculated) . Seed germination percentages of G. pubescen s
increased in direct proportion to increas ing seed storage temperatures. The opposite was true for S.
cernua seeds, which when chilled remained viable in storage for at least 9 months . Development of G.
pubescens was arrested following the appearance of the first true leaves after incubation in vitro under a
16-h photoperiod . Three of 196 S. cernua seedlings in soil flowered 787 days after germination. AII but 3
of the 196 seedlings were derived from chilled seeds inoculated with a P. ciliaris endophyte. A mortality
rate of 4.1% for seedlings established in soil was recorded 704 days following germination. The
inoculat ion of chilled S. cernua seeds with a P. ciliaris endophyte appears to be a feasible means of
cultivating this species

38. Ozkoc , 1. and M. Dalci, The effect of some fungi upon germination and development of Orchis
laxiflora Lam . (Orchidaceae) seeds on two different media. Doga Turk Biyoloji Dergisi , 1993. 17(1): p. 23-
28.
Eleven mycorrhizal funga l isolates from various countries were compared in 2 oat-based media. Seed
germin ation and seedling deve lopment in both media were best with the foreign isolates No. 624 and F
418, follow ed by F 397. Two Turk ish isolates were found to be ineffective

39. Guo, S.X. and J.T. Xu, Studies on the changes of cell ultrastructure in the cou rse of seed
germination of Bletilla striata under fungus infection conditions. Acta Botan ica Sinica, 1990. 32(8 ): p. 594-
598.
The effect of fungal [mycorrhizal] inlection on ultrastructural changes occurring during germination of B.
striata seeds obs erved by EM, is reported

40. Richardson, K.A., R.L. Peterson, and R.S. Currah, Seed reserves and early sym biotic p rotocorm
development ot Platanth era hyperborea (Orch idaceae). Canadi an Journ al of Bot any . 1992. 70(2): p. 291-
300.
Seeds of this North American terrestrial orchid consist of a thin testa and a simple embryo without a
cotyledon. Studies showed that epide rmal and parenchyma cells of the embryo contained lipid and
protein as storage reserves. Many 01 the protein bodies had globoid crystal s identilied by their P,
Ca -cs up tz-) ». Mg<sup (2+» . and K<sup(+» conten!. Germin ation occurred with either Rhizoctonia
cerealis or Cera torhiza goodyerae-repe ntis as the lung al symbiont on Warcup 's medium. The lu ngus
entered through dead suspensor cells and triggered protocorm developm ent and concom itant utilization
01 lipid and protein reserves. Fungal hyphae lormed pelotons with proto corm cells initially. and these went
through stages of vacuolation and collapse. Some hyphae sto red sma ll numb ers 01 polypho sph ate
bodies . Clumps of degenerated hyphae were usually encased within material that stained positive with
aniline blue , presumably callose

41. Rasmussen , H.N., Seed dormancy patterns in Epipactis palustris (Orchidaceae) : requirements for
germination and establishment of mycorrhiza. Physiologia Plantarum , 1992.86(1): p. 161-167 .
Some terrestrial orchid species, including E. palustris, are considered extremely difficult to germinate and
cultivate in vitro . Observations of orchids germinating in nature are very few, and the timing and
requirements for seedling establishment are unknown for most species. Seeds of E. palustris were
incubated in vitro with an unidentified fungal strain isolated from plants in the field , but germination was
poor unless several other conditions were also met. These cond itions were scarification of the testa in
Ca(OCI)<sub(2» , an initial incubation for several weeks at 20 deg C, and a subsequent cold stratification
[o r 8-12 weeks at 4-8 deg . With these pretreatments, germination responses exce r-ded 50% after
incubatiun for 4 weeks at 20 deg . Healthy protocorms with normal organ development were only
produced by symbiotic culture following this lengthy seed preparation . The findings suggest that under
natural conditions the seeds need some after-ripening and the testa needs to be partially decomposed
before germination. The requirement for chilling suggests that germination of seeds in situ occurs in
spring

42. Masuhara, G., K. Katsuya , and K. Yamaguchi , Potential for symbiosis of Rhizoctonia solani and
binucleate Rhizoctonia with seed of Spiranthes sinensis varo amoena in vitro. Mycological Research,
1993. 97(6) : p. 746-752.
Rhizoctonia isolates obtained from non-orchid sources were tested for symbiotic ability with seeds of S.
sinensis varo amoena in vitro . AII or some isolates of R. solani anastomosis group (AG)-1, AG-2-1, AG-2-
2, AG-3 , AG-4 , AG-5 , AG-6 , AG-7 , AG-8 and AG-BI induced symbiotic germination of the orch id seeds . In
binucleate Rhizoctonia anastomosis groups, also all or some isolates of AG-A, AG-Ba , AG-Bb, AG-B,
AG-C, AG-O, AG-E , AG-F , AG-G , AG-H , AG-I , AG-K, AG-L , AG-M, AG-O , AG-P and AG-O, induced the
symb iotic germination. However, no germination occurred when the seeds were inoculated with Sebacina
verm ifera (R. globularis) and Waitea circinata (R. zeae and R. oryzae) in vitro

43. Yamashita, T. and K. Nishikawa, Oevelopment and anatomy of the fungus-free, cultivated
seedling and of underground organs of Habenaria radiata (Orchidaceae). Beitrage zur Biologie der
Pflanzen , 1991.66(3): p. 351-370.
Seeds of Habenaria radiata [Pecteilis radiata] were germinated in sterilized nutrient medium and the
seedlings were cultivated for 1 year in the same med ium. Protocorms, shoot axes, adventitious roots and
tuberous roots of the seedlings were invest igated morphologically and anatomically. The tuberous root is
initiated just below the shoot apex of the main axis, and the broadened proximal part of the tuberous root
primord ium envelopes the shoot apex . The apical part of the tuberous root primordium dissolves the
surround ing stem cortex tissue and makes a hole throu gh the stem epidermis. Finally the tuberous root,
together with the enclosed shoot apex of the ma in axis, moves out of the plant body through the hole
made in the stem epidermis. Thus , the seedlings grow monopodially, desp ite their pecul iar appearance.
Comparison with tuberous roots of adult, flower ing plants in Ophrydeae is discussed

44. Rasmussen, H. and F.N. Rasmu ssen , Climatic and seasonal regulation of seed plant
establishment in Oactyl orhiza majalis inferred from symbiotic expe riments in vitro. Lindleyan a, 1991. 6(4):
p.221-227.
Seeds of O. majalis (coll ected from a popul ation in North Zea land. Oenm ark) were germinated in vitro
wilh a compa tible fungus, Tulasn ella calospora. Germ inalion itselt was almost completely inhibited in long
and short day photoperiods and at a very low light intensity, but initial illumination (part icularly with red
light) raised the eventual germinalion percentage. These responses would tend to enhance germination
in ope n vege la tion but below ground , where ther e are chances 01 immediate symbiotic inl ection and Iittle
risk of desiccat ion . Germination in vitro was highest at about 20 deg C with Iittle diurnal fluctuat ion. Above
25 deg , seeds remained imbibed but did not germinate and reject ed fungal infection. Symbi otic seedlings
 grew well at fairly low temperatures and responded to chilling (5 deg for 15 weeks) by ?evel~ping an
aerial shoot and later a tuberoid . These findings suggest that the seeds normally germlnate In autumn
when saprophytic nutrition of the mycelium is optimal. The requirement of a cold season Ior further
. seedling differentiation may be restrictive for the distribution of this species

45. Anderson, A.B., Symbiolic and asymbiotic germination and growth of Spiranlhes
magnicamporum (Orchidaceae). Lindleyana, 1991. 6(4): p. 183-186.
Seeds of S. magnicamporum, a species which is becoming increasingly rare in Canada and which has
commercial potential, were germinated in vitro on (1) water agar, (2) modified Knudson's medium, or (3)
oat medium containing the fungal symbiont Epulorhiza repens isolated from a naturally occurring plant of
the same species . Symbiotic germination in medium (3) was variable, the fungus parasitizing many of the
embryos and developing protocorms, but surviving seedlings grew well. Forty plants were potted at 4
months and kept at 10 deg C in 8-h days until they were 8 n ionths old, when they were planted in a
raised bed of calcareous sand in June. AII survived to 23 months, when most of them flowered . With
medium (2), containing 250 mg calcium nitrate, Burgeff's phosphate buffer, 5% potato extract but no
potassium chloride, the germination was 45% with good development until 2 months when signs of N
.deficiency became evident; this was corrected by increasing the level of calcium nitrate to 1 g/litre. After
potting at 4 months, only 2 of the 40 seedlings survived to 23 months. With medium (1) germination was
excellent (99%) but there was no development beyond the protocorm stage. However, when protocorms
were transferred to medium (3) and became infected with the fungus development was satisfactory ; all 40
seedlings survived and most ñowered in the following Sep

46. Arditti, J., el al., The contrlbutkm of orchid mycorrhizal fungi lo seed germination: a speculative
review. Lindleyana, 1990. 5(4): p. 249-255.
Topics discussed in this review include physiology of orchid seeds, contributions by the fungus, orchid-
fungus specificity and nucleic acid metabolism

47. Rasmussen, H.N., B. Johansen, and T.F. Andersen, Symbiotic in vltro culture of immalure
embryos and seeds from Listera ovala. Lindleyana, 1991. 6(3): p. 134-139.
Immature embryos as well as seeds of L. ovata were successfully inoculated with a symbiotic fungus
(Epulorhiza sp.). Symbiotic protocorms developed from embryos in all stages, whereas asymbiotic culture
of embryos only succeeded if the capsules were almost mature . Germination percentage in mature seeds
was higher in symbiotic than asymbiotic culture, and symbiotic protocorms developed faster. Inoculation
of immature embryos could be a generally applicable method to propagate 'hard-to-germinate' orchid
species and to test compatibility of fungi

48. Rasmussen, H.N., Ce" differentiation and mycorrhizal intection in Dactylorhiza majalis (Rchb. f.)
Hunt & Summerh . (Orchidaceae) during germinatian in vitre. New Phytologist, 1990. 116(1): p. 137-147.
Seeds of D. majalis were sown in vitro with a compatible fungus (Epulorhiza sp.). Germination, and
establishment of mycorrhiza, took c. 14 d in vitro. From day 9 the protein reserves in the embryo were
hydrolysed, the protein vacuoles coalesced and starch accumulated in plastids . Certain epidermal cells
developed nuclei about 8 times orginal volume and produced rhizoids which emerged from day 11 . The
mycorrhiza was established after infection through the rhizoids: hyphae formed pelotons in central cells
with enlarged nuclei (16-64 times original volume) . Intracellular hyphae developed close contacts with the
hypertrophied host nuclei. Collapsed pelotons were observed in cells from day 12, one day after infection.
Meristematic activity in the uninfected chalazal end 01 the seedling began on day 12. On day 28 the first
vascular tissue started to develop and on day 35 the beginning of a leafy shoot could be detected

49. Rasmuss en, H., B. Johansen, and T.F. Andersen, Oensity -dependent interactians between
seedlings ot Oactylarhiza majalis (Orchidac eae) in symbiotic in vitre culture . Physiologia Plantarum, 1989.
77(3): p. 473-478 .
 In vitro growth 01 the heterotrophic seedlings 01 D. majalis with a symbiotic lungus (Rhizoctonia sp.) was
densíty-dependent, even at densities that are not high enough to exploit the growth medium fully.
Competition was two-sided; increasing density among seedlings did not increase síze inequalíty between
. them. The slowly growing and smaller seedlings are normally more Iikely to die than the bigger ones, but
mortality was not increased by higher density within the studied range (2-128 seedlings/dish). Growth
depression by neighbouring seedlings was independent of their physical distance but varied wíth the total
number 01 seedlings sharing the same culture dish and the same mycelium . Therefore, if the growth-
promoting effects of dilferent fungí or treatments are to be compared in luture work, the density 01
planting in the culture dishes should be comparable

50. Xu, J.T. and S.X. Guo, Fungus associated with nutritian ot seed germinatian ot Gastrodia elata -
Mycena osmundicoie Lange. Acta Mycologica Sínica, 1989. 8(3): p. 221-226.
M. osmundicola was isolated and identilied írorn the protocorms 01 qerrninate., seeos 01 G. elata orchids
lor the lirst time in China. Seeds inlected by str. 01 of M. osmundicola could germinate. Band numbers
and mobility 01 esterase isoenzymes of str. 01 were shown to be the same by PAGE

51. Tsutsui, K. and M. Tomita, Suitability ot several carbahydrates as the carban sources tor
symbiotic seedling growth of two orchid species. Lindleyana, 1990. 5(2): p. 134-139.
The suitability 01 mono-, di- and polysaccharides in symbiotic cultures was investigated with three orchid-
lungus combinations: Spiranthes sinensis with binucleate Rhizoctonia isolate No. 706, S. sinensis with R.
repens isolate No. 624, and Liparis nervosa with isolate No. 624. The orchid seeds were sown on
inoculated oat-agar medium. Cellulose and inulin were good carbon sources íor all combinations. In
general, mono- and disaccharides were inferior to these polysaccharides. This may be due to their early
depletion in the media as a result 01 rapid uptake and utilization by the lungi. Pectin was also a good
carbon source ter S. sinensis when associated with isolate No. 706, but it was harmlul to the orchid when
associated with isolate No. 624. Mannitol was utilized very slowly by the fungí and was a good carbon
source for symbiotic seedlings 01 S. sinensis but not so for those 01 L. nervosa. Galactose and
galacturonic acid were detrimental to the orchids but were as suitable for the lungi as other soluble
sugars. Galactose was as appropriate as other soluble sugars as a carbon source provided that orchids
did not come into direct into contact with it

52. Rasmussen, H., T.F . Anderson, and B. Johansen, Temperature sensitivity of in vitre germinatian
and seedling development of Oactylorhiza majalis (Orchidaceae) with and without a mycarrhizal fungus.
Plant, Cell & Environment, 1990. 13(2): p. 171-177.
In vitro germination and development 01 D. majalis seeds in the presence 01 a Rhizocton ia strain was very
temperature dependen!. There was a marked decline in germinalion percentage at temperatures more
than 23-25 deg C. Seeds that germinated at higher temperatures exhibited only slight or no mycorrhizal
development and developed lew or no rhizoids compared with seedlings raísed at optimal or lower
temperatures. When 6-week-o ld seedlings were grown tor an additional 4 weeks at temperatures ranging
Irom 10 deg to 28 deg the rate 01 increase of seedling length was highest at 23-24.5 deg ,. When grown
at 26 deg , seedlings had smaller starch reserves than those grown at lower temperatures and increased
in length as much as those kept at 13 deg . At 23-24.5 deg , seedlings grew to a larger size before shoot
initiation than those kept at higher or lower temperatures. At 23-24.5 deg seed germination in the
presence of Rhizocton ia was about double that in the absence of the lungus, and seedling length
increased at 45% per week in the presence 01 the lungus compared with 30% in its absence

53. Tsutsui , K. and M. Tomita , Effect of plant density on the growth ot seedlings ot Spiranthes
sinensis Ames and Liparis nervosa Lindl. in symbiotic culture. Journ al 01 the Japanese Society Ior
Horticultural Science, 1989.57(4): p. 668-673.
Seeds 0 1 each species were cultured with Rhizoctonia isolates on a medium containing a decoction 0 1 25
9 oats/litre and 1% agar, and the seedlings were transplant ed to Iresh medium at densities ranging lrom 1
to 10 per 60 mi medium. At high densities , the weights 01 individual seedlings alter 10-16 weeks were
proportional to the volume of medium per plant. At densities more than 1 planV60 mi for S. sinensis and
more than 2 plants/60 mi for L. nervosa , the rate of FW increase decreased with increasing seedling
density. Mycelium DW per culture flask also decreased with increasing seedlings density. The density
effect was thought to be the result of competition for nutrients in the medium, rather than competit ion for
space between the aerial parts

54. Mitchell, R.B., Growing hardy orchids trom seeds at Kew. Plantsman, 1989. 11 (3): p. 152-169.
The symbiotic and asymbiotic techniques used at the Royal Botanic Gardens for raising hardy terrestrial
orchids are described. Details are given of the isolation and storage of mycorrhizal fungi; seed collection,
sterilization, sowing and germination media ; transferring and growing-on protocorms; natural growth
cycles of seedlings ; weaning seedl ings in the greenhouse; and establish ing seedlings outdoors

55. Wilkinson , K.G., K.W. Dixon, and K. Sivasithamparam , Interaction ot soil bacteria, mycorrhizal
tutiqt and orchid seed in re/ation to germination ot Australian orchids. New Phytologist, 1989. 112(3) : p.
429-435 .
Endotrophic bacter ia were isolated from the mycorrhizal tissues of 12 of 13 species of Western Australian
terrestrial orchids tested. The bacteria were placed into 8 groups based on UV light fluorescence, Gram
staining and colony characteristics. The most commonly isolated bacteria from 9 of the 12 orchid species
sampled were strs within the Pseudomonas fluorescens-putida group . The abundance of bacteria
followed a seasonal pattern that differed between orchid genera especially on the basis of the
morphology of fungus infected tissue. There was little evidence of specificity of bacterial groups to orchid
taxa or part of the plant infected by the fungus. Symbiotic germ ination of Pterostylis vittata seed in
association with 7 bacterial isolates showed a signif icant promotion of germination and seedling
development with 3 bacterial strs. The influence of a fourth str. was no different to the control while the
remaining 3 strs significantly suppressed seedling development

56. Masuhara , G. and K. Katsuya, Effects ot mycorrhiza/ (ungi on seed germination and early growth
oi three Japanese terrestria/ orchids. Scientia Horticulturae, 1989.37(4): p. 331-337.
EHects of mycorrhizal fungi on germination and the early growth stage of Spiranthes sinensis var.
amoena , Ponerorc his gram inifolia [Gymnadenia sp.] and Bletilla striata were investigated in vitro. Fungi
isolated from protocorms or roots of 2 wild and 4 cultivated orchids were used in the germination test with
mature seeds of the 3 species on oatmeal agar. Promotion of germination and stimulation of protocorm
growth were observed in S. sinensis varo amoena and protocorm growth was also observ ed in P.
graminifolia. However, the symbiotic method was not effective for protocorm growth in B. striata
ANEXO 2. CONSERVACiÓN DE ORQuíDEAS (IUCN).

(basado en Orchid Conservation News.1999 (2) 8-10)

Traducido por Mauricio Cisternas Báez, Escuela de Agronomía , Universidad Católica de

Valparaíso .

Diversidad

Las Orchidaceae están entre las familias de plantas con flores más grandes del globo. Los últimos
reportes estiman alrededor de 20.000 especies. No solo son importantes en número, sino también
en la complejidad, mecanismos de polinización , colores y fragancia de sus flores. Las orquídeas
crecen en todos los ecosistemas terrestres , a excepción de los polos y desiertos extremadamente
secos, encontrándose la mayor diversidad en los trópicos. Estas plantas crecen en diferentes tipos
de hábitat, siendo la mayoría especies con crecimiento epifíticas.

Muchos factores confunden el número exacto de especies dentro de esta familia, en algunos casos
por el extensivo rango geográfico, tendiendo a tener diferentes nombres para cada región o país, y
también por su importancia florística , las orquídeas son redundantemente descritas por los
cultivadores , siendo común las sinonímias en este grupo de plantas. Además, la falta de botánicos
dedicados a trabajar en revisiones taxonómicas ha contribuido a limitar las estimaciones reales del
número de especies de orquídeas .

Las orchidaceae han evolucionado rápidamente hacia un polinizador que en muchos casos es
específico. La gran cantidad de semillas que favorecen la expresión de la variabilidad genética, alta
tasa de dispersión a través de barreras ecológicas y geográficas , ciclo de vida relativamente
rápido, alta plasticidad en arquitectura floral y la adaptación a diferentes hábitat, han gatillado la
gran diversidad en esta familia.

Distribución

La diversidad de orquideas se encuentra mayormente en los trópicos que en cualquier otro tipo de
ecosistema, reconociéndose alrededor de 36 géneros, y comprendiendo un total de 10849
especies, siendo los géneros PIeurothallis, Epidendrum, Bulbophyllum y Dendrobium los más
numerosos del Neotrópico. Las orquídeas epífitas de las zonas del África tropical y Australia-Asia
están pobremente representadas en este hemisferio.

Un reciente estudio de las especies de orquídeas del nuevo mundo, ha permitido estudiar la
distribución de estas dentro del hemisferio. Se reconocen 10967 especies, principalmente en el sur
de América Central y noroeste de América del Sur. Países como Ecuador (3270 sp.) y Colombia
(2899 sp.) tienen la mayor diversidad de orquídeas, y Costa rica y El Salvador tienen el mayor
2
número de especies por Km , cabe destacar que Chile posee el menor número de especies por
2
Km .

Varios factores parecen influir en la distribución de las orquídeas . Así se propone que la diversidad
de orquídeas epífitas incrementa a lo largo de una gradiente latitudinal y de humedad. Según este
análisis las zonas neotropicales con mayores precipitaciones anuales presentan mayor número de
especies (Costa rica 4000 mm), y la mayor diversidad de especies aparece entre los 1000-2000
m.s.n.m de altitud.

63
El endemismo local es poco citado en publicaciones sobre flora orquideológica o monografías,
principalmente debido a la concentración de las investigaciones sobre ender:nismo q~e han ~ido
dirigidas a pocos lugares, impidiendo conocer la situación actual. Se necesita compilar una lista
global de especies de orqu ídeas para hacer una valoración realista del grado de endemismo , y lo
más importante, identificar áreas/pa íses que han recibido poca atención de parte de los
investigadores.

Conocimiento actual de las Orquídeas

El conocimiento actual ha evolucionado rápidamente en el campo de la orquideología en los

últimos diez años. Con el estudio del DNA, a través de marcadores moleculares y junto con
estudios anatómicos y caracteres morfológicos , han logrado grandes avances en el área de la
filogenética . Sin embargo, se necesitan estudios sobre sistemática de especies y géneros
complejos que ayuden a comprender la clasificac ión de muchas especies problemáticas, de las
cuales se sabe muy poco (Ej.: Chloreinae). Además se requiere mayor conocimiento sobre
ecología de orquídeas, especialmente en aquellas áreas de alta diversidad y endemismo local.
Para ello, es necesario reunir esfuerzos para proteger algunas de estas áreas, aminorando
aquellas amenazas que ponen en peligro la estabilidad de estas especies y su complejo equilibrio
con el ecosistema .

Amenazas para la conservación

Muchas especies de orquídeas están consideradas en alto riesgo de extinción como un resultado ,
directa o indirectamente, por dos tipos de actividades humanas:

Alteración del hábitat o destrucción derivada del cambio en el uso del entorno natural, y la
extracción de plantas nativas para su posterior tráfico. Sin embargo , no todas las taxas están
igualmente amenazadas por estos factores. De otra manera, la colección de plantas para tráfico ,
afecta mayoritariamente a aquellas taxas que presentan flores vistosas , o proveen de algún
producto comestible (e.g. salep, vainilla) . Sin embargo, la pérdida del hábitat, es la principal
amenaza para la mayoría de las orquídeas .

El grado en el cual estos factores pueden afectar a cada especie de orquídea, varían según la
distribución geográfica , especificidad de hábitat y tamaño de las poblaciones. Además estos
criterios proveen de una base para la estimación relativa de la rareza para las orquídeas y otras
plantas. Siendo estas las plantas más propensas a la extinción, debido principalmente a su
estrecha distribución geográfica , hábitat muy reducidos , éstas se ven afectadas drásticamente por
la actividad humana.

La destrucción , modificación y fragmentación del hábitat, son consideradas las principales

amenazas para la biodiversidad , especialmente en los trópicos, donde es alta la diversidad de
orquídeas y los programas de conservacíón no están dentro de las prioridades de la naciones . En
los últimos años la creciente tasa de deforestación, ya sea modificación o destrucción completa de
los bosques y la irrecuperable modificación que sufre el paisaje, han mermado notablemente las
poblaciones de orquídeas , principalmente para satisfacer el incremento de las poblaciones a través
del desarrollo urbanístico .

Desafortunadamente no todas las especies logran adaptarse a nuevo hábitat. Muchas de ellas
sucumben al cambio climático , así las pocas especies que logran colonizar un nuevo hábitat están
constantemente en peligro por presión de origen antropogénico .

64
Las actividades forestales y agrícolas han tenido gran influencia en la sobrevivencia de las
orquídeas. Las actividades de explotación y madereo frecuentemente implica modificaciones en la
intensidad lumínica, humedad, y otros factores microclimáticos que afectan la sobrevivencia de
especies epífitas, aunque también se altera la ecología del suelo y con ello la relación micorríticas
de las especies terrestres. La introducción de especies arbóreas exóticas para plantaciones
comerciales , tales como Pinus sp y Eucaliptus sp, causan una evidente pérdida de biodiversidad.
Comúnmente estas especies son altamente invasoras y alelopáticas desplazando a la flora nativa.
La agricultura con la remoción de la cubierta vegetal y el establecimiento de plantaciones de café,
cítricos y otras especies arbóreas, han afectado gran parte de la carga de orquídeas epífitas en la
regiones tropicales. Además, la rápida pérdida de los nutrientes de los suelo tropicales llevan
constantemente a la abertura de nuevos terrenos selváticos para ser usados en la agricultura.

También en las zonas templadas las actividades agrícolas como cultivos de papas y trigo pueden
causar la total extirpación de individuos en praderas colonizadas por orquídeas .

La fragmentación del hábitat (cualquier efecto de origen antrópico o natural que provoque la
separación o transformación del área de distribución de las poblaciones), reduce los tamaños de
las poblaciones , afectando la dispersión y flujo génico entre las subpoblaciones restantes ,
exponiendo a las orquídeas a condiciones marginales , esto también produce efectos indirectos al
reducir o eliminar la tasa de polinizadores .

La actividad Humana es quizás la mayor amenaza a las poblaciones de orquídeas en áreas

densamente pobladas (e.g. Europa Central), aunque también representa un problema en países en
desarrollados donde hay poco o simplemente no existe control del crecimiento urbanístico. Los
grandes proyectos de desarrollo vial han afectado negativamente las poblaciones de orquídeas, no
solo por alteración del hábitat, sino también, por los procesos de construcción de estos mismos.

La exagerada colección de plantas desde poblaciones silvestres para tráfico internacional ,

hortícolas y coleccionistas aficionados, son una de la mayores causas de declinación de muchas
orquídeas vistosas , llegando a límites de la extinción de algunas taxas. Especies del género
Paphiopedilum y Phragmipedium han sido sobre colectadas, y gran parte de las poblaciones han
desaparec ido, incluyendo aquellas ubicadas en áreas protegidas. La situación critica de esta
especies llevo a su total inclusión en el apéndice I de CITES. También las orquídeas son a veces
colectadas por propósitos alimenticios (e.g. Vanilla, Aa) disminuyendo sus poblaciones.

Estrategias de Conservación

Muchas especies de orquídeas han sido sujeta al tráfico internacional desde principios del siglo 18,
cuando recién despierta el interés por estas plantas. Hoy en día, sin embargo el tráfico de
especímenes colectados en la naturaleza ha ido en aumento hasta llegar a la extinción de algunas
especies , por lo que ha sido urgente proteger estas plantas.

En 1973 se desarrolla la Convención para el Trafico Internacional de Especies en Peligro de la

Flora y Fauna Silvestre (CITES). Desde que CITES entra en vigencia, la familia completa de las
Orchidaceae esta incluida en sus apéndices, debido a que es difícil distinguir la categoría de las
especies (amenazadas o no).

7 especies y 2 géneros están incluidas en el apéndice 1, todas las otras especies están incluidas en
el apéndice 11. (todos los híbridos de orquídeas están cubiertos por CITES).

Sin embargo , las orquídeas no han recibido adecuada atención por el tráfico de plantas de la
convención CITES, por lo que se ha creado la OSG (Grupo de Especialistas de Orquídeas)
relacionado a CITES, e involucra varios aspectos a considerar en la convención , tales como:

65
-Análisis de las listas de orchidaceae que están en el apéndice I

-La conservación de especies de orquídeas amenazadas por.el tráfico internacional

-Lista de chequeo de orquídeas

-Implementación de la regulación CITES para el trafico en propagación artificial de especies de

orquídeas y sus híbridos.

-Estimulación de propagación artificial

-Educación y servicio de información sobre conservación (e.g. jardines botánicos), trafico (criaderos
de plantas y asociaciones de trafico de plantas), y coleccionistas (asociaciones de orquídeas
nacionales e internacionales)

Conservación in situ

La estrategia de conservación in-situ, es el aspecto más importante en la conservación de

orquídeas, que permite mantener una población dentro de una comunidad ecológica, conservando
su hábitat original. Las poblaciones de orquídeas pueden ser manejadas efectivamente dentro de
pequeñas áreas, basándose en varios aspectos ecológicos que incluye una evaluación de la
diversidad local y detalles observados por especialistas. Así el manejo de las orquídeas en áreas
protegidas o privadas será altamente importante, si la biodiversidad está adecuadamente
conservada .

A pesar que las orquídeas son el grupo de plantas más populares, existe muy poco conocimiento
sobre su ecología. La falta de información y de investigadores en esta área limita las acciones
rápidas y oportunas para estabilizar la declinación de las poblaciones.

En general las orquídeas tienen una corta expectativa de vida, debido a sus nichos ecológicos , que
son flujos sucesionales y porque están sujeto a numerosos eventos catastróficos, que limitan su
expectativa de vida.

Además por su gran inversión en reproducción, grandes inflorescencia, flores atractivas y grandes
cantidades de pequeñas semillas, les permite a las orquídeas colonizar nuevos hábitat temporales .
Así muchas especies de la zonas temperadas presentan estrategias de sobrevivencia, cuando sus
ambientes ideales son transitorios, adaptándose a un nuevo hábitat.

Desde el punto de vista ecológico, las orquídeas son generalmente consideradas plantas
adaptadas a condiciones de stress y disturbios, permitiendo a muchas orquídeas comportarse
como malezas, desarrollándose en áreas dramáticamente alteradas, donde su protección
inmediata es imposible.

Dentro de las consideraciones de manejo, el diseño de las reserva, manejo de polinizadores , uso
de áreas privadas, restauración y monitoreo son los principales componentes para una efectiva
conservación in-situ.

66
Conservación ex situ

Las orquídeas a diferencia de otras plantas son extremadamente fecundas, una cápsula produce
miles de semillas, cuya germinación en condiciones naturales es muy baja, restringiendo el
desarrollo de estas plantas a pequeñas áreas, haciéndolas altamente vulnerable y excelentes
candidatas para la conservación ex situ.

La conservación ex situ, permite mantener muestras representativas de la diversidad genética de

las especies y sus poblaciones, fuera de sus hábitat originales.

Para fines de conservación ex situ, se deben extraer algunas plantas del medio natural,
preferentemente de aquellos hábitat que están destruidos y que no tienen opción de regeneración.
Un rescate oportuno de muchas orquídeas permitirá que este material sirva de base para la
propagación artificial, ayudando a perpetuar a muchas especies.

El rol de los jardines botánicos, es muy importante al mantener colecciones vivas de plantas,
además viveros y coleccionistas aficionados, contribuyen significativamente al coleccionar material
genético (polen, semillas, material vegetativo, etc.) que pueden compartir entre ellos, manteniendo
diversificado un gran pool genético.

Uno de los objetivos más importante en la conservación ex situ, es disponer rápidamente de

plantas nuevas y raras reproducidas artificialmente para los viveros y jardines botánicos, así
aquellas especies más deseables, en peligro y que generalmente son especies nativas, son
protegidas de su exterminación al contar con grandes cantidades de plantas que satisfacen las
necesidad del mercado.

Para preservar la diversidad de orquídeas, se requieren de estudios florísticos y biogeográficos,

antes de determinar las estrategias de conservación a seguir, focalizando en mantener las
orquídeas in situ más que ex situ, ya que con esta última estrategia solo permite preservar el pool
genético de algunos individuos dentro de la especie, pero no del taxón, no preservando el potencial
evolutivo a largo plazo de la especie.

En la actualidad, la protección, manejo y restauración de hábitat naturales es el mejor y más barato

método de preservación de diversidad biológica y de estabilidad de ecosistemas globales.

Necesidades de investigación para la conservación de orquídeas.

Se requiere más estudios florísticos y monografías, especialmente en aquellos géneros o

áreas donde no exista información disponible.

Reconocimiento de áreas de alta diversidad y endemismo, basada en información precisa.

Reconocimiento de hábitat y especies las cuales se encuentran en situación critica de

conservación, basados en trabajos de campo.

Colección de información sobre la historia natural y ecología de las especies de orquídeas

investigadas.

Investigación demográfica sobre orquídeas, estableciendo modelos para el manejo de

otras especies.

Efectos demográficos y genéticos de la fragmentación del hábitat.

Clases de manejos necesarios para realzar la preservación de la diversidad de orquídeas

en sistemas agrícolas.

67
Educación

Una serie de instituciones y organizaciones pueden jugar un importante rol en promover la

educación y reglamentación para la preservación de las orquídeas.

Los jardines botánicos, las áreas protegidas y reservas naturales son una de las mejores vías para
diseminar y promover la información a una gran cantidad de personas sobre educación ambiental ,
relacionados a la familia orchidaceae, a través de exposiciones y programas que visualicen la
diversidad orquideológica , hábitat y los diferentes peligros que amenazan la sobrevivencia de las
orquídeas.

La sociedades orquideológicas cumplen un importante papel en reforzar las prácticas y

comportamiento éticos, permitiendo el intercambio de información con comunidades locales,
capacitándolas en el uso de los recursos naturales, diseminando programas sobre cultivo y
propagación de especies raras a viveros y coleccionistas aficionados.

Las autoridades deben mantener contacto oportuno con individuos y sociedades organizadas
dentro de su jurisd icción, de manera que estén al tanto de la legislación que pudiera afectar a las
orquídeas y su conservación .

Las organizaciones no gubernamentales (ONG) deben trabajar con otros grupos conservacionistas
y autoridades, para educarse los unos a los otros respecto de las peculiaridades de las orquídeas y
sus requerimientos . Es importante que formulen puntos de vistas consistentes, explicando el
razonamiento que les da apoyo y trabajando para un consenso mutuo.

El Grupo de Especialista en Orquídeas (OSG) debe ayudar al comité de plantas de CITES en sus
evaluación de los apéndices, estimulando la investigación sobre comercio y estado de
conservación, y compartiendo información.

68
Orquídeas Chilenas

Las orquídeas Chilenas comprenden los géneros Aa, Bipinnula. Brachysteles. Chloraea,
Codonorchis, Gavilea y Habenaria, con un total de 51 especies, de las cuales 24 son endémicas
(47%), siendo todas las especies terrestres, eventualmente epífitas y litófitas.

Se distribuyen desde la latitud 18° y 22° S, hasta Tierra del Fuego 55° S. Sus rangos de hábitat van
desde bosques prístinos hasta orillas de carreteras , incluyendo praderas de pastoreo, bordes de
bosques y eventualmente pantano.

A pesar que las Orchidaceae han sido extensamente estudiadas en otras partes del mundo, en
Chile es uno de los últimos grupos de plantas con flores estudiados . A la fecha no existe legislación
nacional para proteger nuestras orquídeas .

Amenazas de las orquídeas chilenas

-Destrucción del hábitat causado por urbanización, como por ejemplo la construcción de caminos o
desarrollo de centros recreacionales en biotopos costeros.

-La variabilidad genética y sobrevivenc ia de varias especies representada en áreas protegidas no

esta garantizada (e.g. Ganado vacuno en área protegidas)

-Muchas orquídeas crecen a orillas de caminos y lugares accesibles a visitantes que colectan flores
y ocasionalmente plantas completas.

-Introducción de animales exóticos para propósitos de caza, devoran las raíces, destruyendo
poblaciones completas .

-Consumo de rizomas (e.g. Aa es consumida por lo lugareños en la I región)

-Marcada tendenc ia como maleza y son comúnmente encontradas en bordes de caminos y en

hábitat de sucesión temprana. Desafortunadamente estas áreas son dramáticamente intervenidas
y su protección inmediata es imposible.

-Presencia de malezas invasivas como Ulex europeus y Teline monspessulana reducen

dramáticamente la vegetación nativa, incluyendo a las orquídeas.

-Indiscriminado uso de herbicida en plantaciones forestales han mermado fuertemente las

poblaciones , especialmente en la zona centro-sur (e.g. Chloraea crispa en plantaciones de Pinus
sp. en la localidad de Yumbel.

-Indiscriminado uso de pesticidas en la actividad silvoagropecuaria han diminuido las poblacionales

de los polinizadores , que en muchos casos son específicos , lo que asociado a una baja
polinización efectiva y baja cuaja de frutos, hacen dramático el descenso del éxito reproductivo en
poblaciones aisladas.

-Tala forestal y trabajos asociados (poda, madereo , raleo, etc.)

-Apertura de terrenos para la actividad agrícola y forestal, transformando el paisaje y con ello la
vegetación nativa, afectando la sobrevivencia de las orquídeas .

-Incendios forestales afectan gravemente los ecosistemas y con ello a las poblaciones de
orquídeas

69
Necesidades de conservación

Efectivo establecimiento de estrategias de conservación para las orquídeas chilenas .

Objetivo a corto plazo:

-Urgente estudio taxonómico de los géneros de orquídeas chilenos .

-Actualización el inventario de orquídeas chilenas

-Determinación de la distribución actual, períodos de floración y abundancia de las especies.

-Determinación de áreas de alta diversidad y endemismo.

-Identificación de especies amenazadas y aplicación de las categorías de la "lista roja" de la IUCN.

-Identificación de amenazas a la sobrevivencia de las especies de orquídeas y sus hábitat.

-Desarrollo e implementación de estrategias para controlar estas amenazas.

Objetivos a largo plazo:

-Recopilar información sobre sistemática , sistemas reproductivos y ecología de poblaciones. Esta

información es crucial para desarrollar efectivas estrategias de conservación in situ y ex situ.

-Programas educacionales focalizados en conservación de orquídeas chilenas promovidas por

diferentes instituciones de investigación y jardines botánicos.

70
ANEXO 3. PRESENTACIONES EN CHARLA DE DIFUSiÓN.

YUMBEL, 06 DE DICIEMBRE DE 2001.

71
 PROYECTO ORQUIDEAS
NATIVAS CHILENAS
(Género Chloraea)
CHARLA Y DIA DE CAMPO

/~
[ Enrique Matthei J. I BTA
GOBI ERNO DE CHIL E
~/
FUNDACiÓN rARA LA
INNOVACiÓN AGRARIA

Yumbel, Jueves 06 de Diciembre de 2001

CONTENIDOS

1. Introducción Proyecto de Innovación FIA

11. Estado Actual Proyecto de Innovación FIA

111. Difusión Programa de Formación FIA

1
l. Introducción Proyecto
de Innovación FIA

1.1 Origen del proyecto

2
3
1.2 Presentación

• IIEvaluación y multiplicación de especies

orquídea nativa chilena (género Chloraea) para
establecer las bases de un cultivo comercial en la
octava región de Chile" FIA C98-1-A-022
• Duración: 48 meses
• Inicio: Diciembre de 1998
• Unidades:
- Terreno: Los Rios de Yahuilo (Yumbel) y UCV (Quillota)
- Laboratorio: UTA (Talca) y N. Garrido (Concepción).
- Gestión técnica y financiera : BTA (Santiago)

1.3 Equipo de trabajo

• Enrique Matthei J., Coordinador G

• Gabriela Verdugo R., Directora t.

• Ximena Calderón B., Micropropa

• Norberto Garrido G., Micorrizas

• Michael Bourke, Recolección y man

• Ximena Alvarez G., Biotecno/ogia

técnica y financiera

4
 11. Estado Actual Proyecto
de Innovación FIA

Ximena Alvarez G., Ing. Agr. ~

Biotecnología Agropecuaria S.A. STA
~

Objetivo General

Incrementar el
conocimiento general y
evaluar las especies de
orquídea nativa chilena
(género Chloraea) y
optimizar su período
vegetativo y reproductivo
para fines comerciales en
la VIII región de Chile.

1
Objetivos Específicos

1. Generar los conocimientos

botánicos y fisiológicos
(género Chloraea)
2. Evaluar y mejorar la
eficiencia de los
mecanismos de
reproducción y el período
vegetativo
3. Evaluar técnicas de
micropropagación

Objetivos Específicos

4. Desarrollar un procedimiento de poscosecha

5. Evaluar técnica y económicamente los
resultados del proyecto
6. Transferir la información generada

2
 Metodología
Obj. 1. Generar los conocimientos botánicos
y fisiológicos (género Chloraea
r------L----------,
~ ~. 1_ .. , . _ ... '0u . ....l·'."",'"

-Recuperación bibliográfica
del género Chloraea

-Estudio de hábitat natural

-Recolección de material de
diversas poblaciones

-Identificación de
características relevantes

Obj. 2. Evaluar y mejorar la eficiencia de los

mecanismos de reproducción y el
período vegetativo

-Mecanismos de 1í

-Evaluación de ge

-Épocas de ñoreci

-Ensayos de culti

-Cruzsmientos dir,

3
 Obj. 3. Evaluar técnicas de micropropagación

-Evaluación de germinación
in vitro
-Micropropagación
vegetativa

-Aislamiento, identificación
e inoculación con
micorrizas

4
 Obj. 4. Desarrollar un procedimiento de
poscosecha

-Duración inflorescencia

-Evolución bajo condiciones

de simuladas de
exportación

-senescencte en flores
individuales

Obj. 5. Evaluar técnica y económicamente los

resultados del proyecto

5
 Obj. 6. Transferir la información generada

-Reuniones equipo técnico

-Dies de campo

-chenes técnicas
-Manual de producción
 Resultados a la fecha
• Base de datos agroclimática y edáfica
• Evaluación de los mecanismos de
reproducción y desarrollo: semillas y
rizomas
• Evaluación de técnicas de
micropropagación: vegetativa y
germinación in vitro
• Análisis de poscosecha y características
relevantes

Proyecciones de líneas de investigación

• Desarrollo de líneas madres / variedades

• Manejo de fertilización orgánica
• Inoculación de semillas y plantas con
micorrizas
• Trasplante a terreno

7
Ensayos agronómicos descripción y
evaluación del comportamiento de eh/orea
crispa como flor de corte

Proyecto FIA- Enrique Matthei

Investigadores:
Gabriela Verdugo, Alejandra Uribe, Angélica Rendich ,
Maritza Troncoso y Mauricio Cisternas

Desarrollo de la especie

1
Tipos de llores

2
Floración
Se desconoce el periodo juvenil
En general las plantas florecen
cada dos temporadas

3
Evaluaciones de calidad de la
Ilor
• Tiempo transcurrido entre aparición del primer
botón Vapenura del mismo 1días

• Tiempo entre apenura del primer Vúltimo botón

28a35días

• Tiempo entre apenura del primer botón V

senescencia del mismo 49 días

Floración
• Número promedio de flores por vara 12
rango6a18
• Promedio de flores abienas simultáneas 11
rango de 6a15

4
Crecimiento de varas florales

Duración de la flor después de

conada
• Vida de florero vara completa 28 días
• Vida de florero de una flor separada dela
vara 28 días

• Temperatura ambiente

5
 Tiempos de desarrollo de la Ilor
individualluera de la planta
• Botón verde ablanco globoso 16.3 días
• Botón blanco plano ablanco globoso 1días
• Botón blanco globoso aflor abiena 1días

lJ
¡.;,;
r- ~t •
~
~
Temperatura ambiente

Estado del rizoma posdloración

• En rizomas no florales se obtuvo una
ganancia de peso promedio de 45.52 %con
respecto al peso inicial del rizoma

• En rizomas florales se obtuvo una pérdida

de peso de 25.81 %con respecto al peso
inicial de los rizomas

6
Problemas presentados
• BOlrvtis vPhoma

zamientos

7
Continuara .

8
11. Difusión Programa de
Formación
Introducción
• "Curso de Técnicas Especializadas de
Conservación de Orquídeas y Congreso
Internacional de Conservación de
Orquídeas"
• Cofinanciado por Programa de Formación de
FIA
• Institución: Kings Park and Botanic Garden
• Lugar: Perth, Australia
• Duración: 10 días

9
Objetivo General

Aprender técnicas
especializadas en
manejo y conservación
de orquídeas terrestres
para potenciar el
desarrollo futuro a
escala comercial de las
orquídeas nativas
chilenas Chloraea.

Objetivos Específicos
1. Mejorar el conocimiento en técnicas de
conservación de Orquídeas Terrestres
(OTj .
2. Aumentar conocimientos de germinación,
polinización y multiplicación de OTo
3. Establecer contactos con especialistas,
investigadores y productores del rubro.
4. Difundir aspectos técnicos-prácticos y
teóricos obtenidos en las actividades.

10