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    Actividad Vs Concentracion Enzimatica (1) Lab

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    Hernan Mauricio Rivera Escobar
    FACULTAD DE CIENCIAS. ESPECIALIALIZACIÓN EN BIOQUÍMICA CLÍNICA INTEGRANTES: MAURICIO RIVERA PRESENTADO A: Docente: JAIME CASAS ESTANDARIZACION DE UN METODO ESPECTROFOTOMETRICO DE ANALISIS POR PUNTO FINAL Y DETERMINACION CINETICA DE UN ANALITO. Objetivos: 1. OBJETIVO: Efectuar el seguimiento del ∆A con el tiempo para el sistema TGO – reactivo. ABSORBANCIA 0,994 0,993 0,991 0,99 0,988 0,987 0,987 0,986 0,985 0,984 0,982 0,981 0,979 0,978 0,978 0,976 0,975 TIEMPO 0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 1

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    FACULTAD DE CIENCIAS. ESPECIALIALIZACIÓN EN BIOQUÍMICA CLÍNICA INTEGRANTES: MAURICIO RIVERA PRESENTADO A: Docente: JAIME CASAS ESTANDARIZACION DE UN METODO ESPECTROFOTOMETRICO DE ANALISIS POR PUNTO FINAL Y DETERMINACION CINETICA DE UN ANALITO. Objetivos: 1. OBJETIVO: Efectuar el seguimiento del ∆A con el tiempo para el sistema TGO – reactivo. ABSORBANCIA 0,994 0,993 0,991 0,99 0,988 0,987 0,987 0,986 0,985 0,984 0,982 0,981 0,979 0,978 0,978 0,976 0,975 TIEMPO 0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 1

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    Actividad vs Concentracion Enzimatica[1]Lab

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    FACULTAD DE CIENCIAS. ESPECIALIALIZACIÓN EN BIOQUÍMICA CLÍNICA INTEGRANTES: MAURICIO RIVERA PRESENTADO A: Docente: JAIME CASAS ESTANDARIZACION DE UN METODO ESPECTROFOTOMETRICO DE ANALISIS POR PUNTO FINAL Y DETERMINACION CINETICA DE UN ANALITO. Objetivos: 1. OBJETIVO: Efectuar el seguimiento del ∆A con el tiempo para el sistema TGO – reactivo. ABSORBANCIA 0,994 0,993 0,991 0,99 0,988 0,987 0,987 0,986 0,985 0,984 0,982 0,981 0,979 0,978 0,978 0,976 0,975 TIEMPO 0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 1

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    FACULTAD DE CIENCIAS. ESPECIALIALIZACIÓN EN BIOQUÍMICA CLÍNICA INTEGRANTES: MAURICIO RIVERA PRESENTADO A: Docente: JAIME CASAS ESTANDARIZACION DE UN METODO ESPECTROFOTOMETRICO DE ANALISIS POR PUNTO FINAL Y DETERMINACION CINETICA DE UN ANALITO. Objetivos: 1. OBJETIVO: Efectuar el seguimiento del ∆A con el tiempo para el sistema TGO – reactivo. ABSORBANCIA 0,994 0,993 0,991 0,99 0,988 0,987 0,987 0,986 0,985 0,984 0,982 0,981 0,979 0,978 0,978 0,976 0,975 TIEMPO 0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 1

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    FACULTAD DE CIENCIAS.

    ESPECIALIALIZACIÓN EN BIOQUÍMICA CLÍNICA

    INTEGRANTES:
     MAURICIO RIVERA

    PRESENTADO A:
    Docente: JAIME CASAS

    ESTANDARIZACION DE UN METODO ESPECTROFOTOMETRICO DE ANALISIS


    POR PUNTO FINAL Y DETERMINACION CINETICA DE UN ANALITO.

    Objetivos:

    1. OBJETIVO: Efectuar el seguimiento del ∆A con el tiempo para el sistema TGO –


    reactivo.

    ABSORBANCIA TIEMPO ΔA DELTA DE TIEMPO


    0,994 0 -0,001 15
    0,993 15 -0,002 15
    0,991 30 -0,001 15
    0,99 45 -0,002 15
    0,988 60 -0,001 15
    0,987 75 0 15
    0,987 90 -0,001 15
    0,986 105 -0,001 15
    0,985 120 -0,001 15
    0,984 135 -0,002 15
    0,982 150 -0,001 15
    0,981 165 -0,002 15
    0,979 180 -0,001 15
    0,978 195 0 15
    0,978 210 -0,002 15
    0,976 225 -0,001 15
    0,975 240 -0,0011875 15

    TABLA 1. RELACION DE ABSORBANCIA Y TIEMPO DEL SISTEMA TGO

    1. Cálculo ∆A:
    • Para calcular el delta de la absorbancia es necesario establecer en la tabla de
    Excel la relación entre dos puntos de absorbancia. Es decir, absorbancia final
    menos la inicial. Como se explica a continuación:

    A1 = 0.994 A2 = 0.993

    ∆A = A1 – A2

    ∆A = 0.993 – 0.994

    ∆A = - 0.001

    EN LA TABLA 1, se relacionan las diferencias de las absorbancias (∆A), puesto que el


    cociente entre los ∆A y el tiempo permiten obtener la actividad enzimática del sistema.
    Sin embargo esta actividad está sujeta al recíproco del factor de dilución.

    2. OBJETIVO

    Determinar la actividad enzimática de la muestra del paciente por los métodos


    analítico y gráfico.

    2. Cálculo del factor de dilución:

    A = ε* . b. c m

    ∆A = ε . b. ∆c m

    ∆A / min = ε . b. ∆c m / min

    Despejando:

    ∆c m / min = ∆A / min
    ε.b

    La actividad enzimática está medida en unidades internacionales (U/L) y la


    relación entre esta magnitud y los ∆A se expresa a continuación:

    U/L = ∆A / min
    ε.b

    Donde: ε= 6.3 * 10 3 M-1 * cm-1†

    U/L = ∆A / min
    ε.b

    U/L = ∆A / min * 10 6 µmol * 1100 µL * 10 6 µL


    6300 M-1 * cm-1 * 1 cm 1 mol 10 6 µL 100 µL

    *
    ε tiene unidades M-1 * cm-1 y b como indica el espesor de la celda es medida en cm.

    †
    Este valor de ε se basa en las características de absorción del NADH2 o del NADPH a 340 nm.
    U/L = ∆A / min * 1746.03 (reciproco del factor de dilución)

    En la tabla 1 se relacionan el promedio de los ∆A y el valor absoluto de este


    promedio es 0.0011875. Reemplazando en la ecuación anterior tenemos:

    U/L = 0.0011875 / 15 s * 1746.03

    U/L = 0.138 RELACION POR SEGUNDO

    U/L = 0.138 * 60 = 8.28 RELACION POR MINUTO

    METODO GRÁFICO
    VALOR ABSOLUTO ∆A / TIEMPO FACTOR DE DILUCION ACTIVIDAD ENZIMATICA (U)

    7,91667E-05 1746,03 0,138227375

    METODO GRAFICO

    Dada la grafica, se puede establecer una relacion decreciente en el sistema TGO-


    reactivo cuya ecuacion es: y = -8E-05x + 0,993.

    La pendiente de la recta (-8E-05) establece la relacion del delta de la absorbancia con


    relacion al tiempo en segundos, aplicando la ecuacion que desde el metodo analitico
    se estableció se sustituye el valor y se debe multiplicar por 60 para transformar dicha
    actividad en minutos como lo establece la unidad internacional.
    U/L = ∆A / min * 1746.03

    U/L = -8E-05 * 60 (seg) * 1746.03

    U/L = 8.3

    3. OBJETIVO

    Verificar si el sistema glucosa – reactivo satisface las leyes de la fotometría.

    IDENTIFICA VOLUMEN VOLUMEN CONCENTRACIO ABSORBA %T 100-%T Reciproco


    CION DE INICAL FINAL (µL) N (mg/dl) NCIA del factor
    CADA TUBO (µL) de
    dilución

    B 0 1000 0 0 100 0 0

    P1 10 2010 0.497 0.099 79.61 20.39 2010/10 =


    201

    P2 14 2014 0.695 0.164 68.54 31.46 2014/14 =


    143.85

    P3 18 2018 0.891 0.231 58.74 41.26 2018/18 =


    112.11

    P4 11 1011 1.088 0.231 58.74 41.26 1011/11 =


    91.90

    P5 13 1013 1.283 0.273 53.33 46.67 1013/13 =


    77.92

    P6 15 1015 1.477 0.330 46.77 53.23 1015/15 =


    67.66

    MUESTRA 10 1010 0.087 81.84 18.16

    TABLA 2. RELACIÓN ENTRE LA CONCENTRACIÓN, ABSORBANCIA Y TRANSMITANCIA

    • Para calcular la concentración (mg/dl) es necesario multiplicar la concentración


    del patrón de glucosa -dado por el inserto- (100mg/dl) por el factor de dilución
    respectivo para cada tubo. Como se explica a continuación:

    P1= 100mg/dl*10 µL/2010= 0.497

    P2= 100mg/dl*14µL/2014= 0.695

    P3= 100mg/dl*18µL/2018= 0.891

    P4= 100mg/dl*11µL/1011= 1.088

    P5= 100mg/dl*13µL/1013= 1.283

    P6= 100mg/dl*15µL/1015= 1.477

    En la tabla 2 se relacionan las concentraciones.


    • Con el fin de saber la cantidad de energía que se transmitió a 340nm, se
    calcula % Transmitancia despejando la fórmula de absorbancia, como se
    explica a continuación:

    A= 2-log%T

    %T=10(2-A)

    P1 %T= 10(2-0.099) = 79.61

    P2 %T= 10 (2-0.164) = 68.54

    P3 %T= 10 (2-0.231) = 58.74

    P4 %T= 10 (2-0.231) = 58.74

    P5 %T= 10 (2-0.273) = 53.33

    P6 %T= 10 (2-0.330) = 46.77

    Muestra %T= 10 (2-0.087) = 81.84

    En la tabla 2 se relacionan todos los porcentajes de transmitancia.

    • Al realizar los cálculos de 100-%Transmitancia se obtiene:

    100-%T

    P1 100 - 79.61 = 20.39

    P2 100 - 68.54 = 31.46

    P3 100 - 58.74 = 41.26

    P4 100 - 58.74 = 41.26

    P5 100 – 53.33 = 46.67

    P6 100 – 46.77 = 53.23

    Muestra 100 – 81.84 = 18.16

    Los resultados se expresan en la tabla 2.

    CONCENTRACIÓN
    (mg/dl) ABSORBANCIA
    0
    0,497 0,099
    0,695 0,164
    0,891 0,231
    1,088 0,231
    1,283 0,273
    1,477 0,33
    ABSORBANCIA vs CONCENTRACIÓN

    0,35
    y = 0,216x + 0,0078

    ABSORBANCIA (nm)
    0,3
    R2 = 0,9534
    0,25
    0,2
    0,15
    0,1
    0,05
    0
    Serie1
    0 0,5 1 1,5 2
    Lineal (Serie1)
    CONCENTRACIÓN (m g/dL)

    Donde: A=0.0078; B = 0.216; r= 0.9534

    En esta gráfica se puede apreciar que la absorbancia es directamente proporcional a


    la concentración de los patrones elaborados, presentados en la tabla 2., además de
    observar un r alejado de 1, indicando que el ajuste no ha sido el esperado, pero igual
    se trabajó con ese valor.

    4. OBJETIVO

    Determinar el rango óptimo en concentración para el sistema glucosa-reactivo.

    Para establecer el rango optimo se hizo la gráfica en papel semi-logarítmico entre


    Absorbancia vs Concentración, se estableció la ecuación de la recta y el valor de r. Sin
    embargo la forma que reflejan los puntos en dicha gráfica no permiten establecer una
    curva sigmoidea y a partir de ella, una linealización. De forma gráfica se hicieron dos
    intentos con la finalidad de seleccionar la ecuación que más se adecuara al sistema
    glucosa – reactivo. Al final decidimos omitir los patrones P3 y P4 cuyos valores de
    absorbancia eran equivalentes.

    Para saber si se cumplió el objetivo propuesto, realizamos la comprobación con la


    curva de verificación, en la cual se omitieron dos puntos que presentaron absorbancias
    iguales (P3; P4) a pesar de que sus concentraciones eran diferentes, lo que hace
    pensar que se trata de un error técnico. (Ver gráficas anexas)

    El rango óptimo para el sistema glucosa reactivo es: 0.5 – 1.3mg/dl, cuya ecuación de
    la recta es: y= -31.49x + 93.17 siendo r=-0.99

    5. OBJETIVO

    Diseñar la curva de calibración para el sistema glucosa – reactivo


    La curva de calibración para el sistema glucosa – reactivo está dada por la ecuación:
    y=0.870x + 0.370 r= 1

    Para establecer la curva de calibración a partir del rango óptimo hallado en el objetivo
    No. 4 se tomaron dos valores que entraban dentro del rango óptimo, como se muestra
    en la siguiente tabla:

    Concentración
    (mg/dl) Absorbancia
    1,088 0,231
    1,283 0,273

    6. OBJETIVO

    Determinar la concentración de glucosa en el paciente y expresar el resultado en mg/dl


    en ppm.

    Al extrapolar el valor de Absorbancia de la muestra problema (0.087) en la curva de


    calibración, la concentración que se obtiene, no cae dentro del rango establecido en la
    curva de calibración.

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