Enriquecimiento de benzo [ a ] pireno en los aceites vegetales y determinación por HPLC-FL

S. Vázquez Troche una , MS GarcõÂa FalcoÂn b , S. GonzaÂlez Amigo una , MA Lage Yusty a, *,
J. Lozano Simal una

un Departamento de Química Analítica , Nutrición y Bromatología , Área de Nutrición y

Bromatología , Facultad de Farmacia , Uni 6 ersidad de Santiago de Compostela , E -
15706 Santiago de Compostela , España

b Nutrición y Bromatología Grupo , analítica y el Departamento de Química de los

Alimentos , Ciencias de los Alimentos y la Facultad de Tecnología ,

Campus de Ourense , Uni 6 ersidad de Vigo , E - 32004 Ourense , España

Recibido el 28 de septiembre de 1999; recibida en el año 2000 13 del encofrado de enero de

revisado; aceptó 17 de enero de el año 2000

Abstracto

Hemos desarrollado un método simple para la determinación del carcinógeno benzo [ a ]

pireno (BP) en los aceites vegetales. El método consiste en la extracción del aceite vegetal en
acetonitrilo, la concentración a sequedad en evaporador rotatorio y la redisolución del residuo
en hexano. El puri®cation del extracto de hexano fue sobre Sep-Pack de sílice Plus cartuchos, y
la determinación de la BP en el extracto aislado fue por HPLC-FL. Los límites de detección y
quanti®cation fueron 0,23 y 0,32 mg kg 1 de aceite de oliva, respectivamente. Recuperación
( \ 93%) y RSD ( B 4%) fueron satisfactorios. Cuando se aplica a 18 muestras de aceite, los
niveles de PA variaron de no detectado a 1,99 m g kg 1 . © 2000 Elsevier Science BV Todos los
derechos reservados.

Introducción

Hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) son un grupo de compuestos lipófilos altas que
han sido objeto de gran preocupación en los últimos años debido a su potencial tóxico. Benzo
[ un pireno] (BP), el más conocido de los HAP cancerígenos, se ha utilizado a menudo como un
indicador de la presencia de HAP en el agua y los alimentos. PAHs se forman principalmente
durante una combustión incompleta de or-materiales inorgá-. La contaminación del aire es la
principal fuente de HAP en las partes comestibles de plantas. Ciertos procesos tecnológicos y
procedimientos de cocción [1] también pueden causar niveles elevados de HAP en algunos
alimentos.

Numerosos investigadores [1 ± 15] han informado de la presencia de hidrocarburos aromáticos

policíclicos en aceites y grasas comestibles. Estos productos pueden estar contaminados por la
contaminación y del medio ambiente : medidas o de transformación antes del re®ning, porque
este proceso (desodorización, decoloración, tratamiento con carbón) en las condiciones
apropiadas, reduce el contenido de los HAP individuales a una m g kg 1nivel [1,9].

La alta producción y el consumo de petróleo en España, así como en otros países

mediterráneos, exigen un control de los HAP en este tipo de producto. Actualmente, sin
embargo, dicha legislación no existe con respecto a los niveles de PA en los aceites vegetales,
aunque la UE tiene la intención de establecer un máximo de 1 m g kg 1 en los alimentos [16].

Los principales problemas asociados con la de- terminación de los HAP en matrices complejas,
tales como aceites vegetales, son los niveles de analito bajo ( m g kg 1 ) y la diversidad de
posibles interferentes presentes.

El método más común para la extracción de PAHs de estas matrices, por lo general implica
poni®cation SA- de lípidos por KOH alcohólico [12,17 ± 21] seguido de ± líquidos de partición
líquido y puri®cation fase sólida.

Otros trabajadores [10,11,14,15] suprimen el paso saponi®cation ous la laboriosidad y

determinar los HAP en los aceites vegetales obtención de los analitos en ± líquidos partición
líquido entre sulfóxido de dimetilo (DMSO) o dimetilformamida (DMF) y un disolvente orgánico
(hexano, pentano, ciclohexano), seguido de limpieza en gel de sílice.

Kolarovic y Traitler (1982) [4] analizan los HAP diferentes, también en aceites vegetales
formando complejos con la cafeína en solución de ácido fórmico y la puri®ca- por
cromatografía en capa fina.

Métodos descritos son costosos y los tiempos de consumibles ING debido a varios los
procedimientos de limpieza utilizados con el fin de eliminar los coextractivas impurezas
sección ANTES ®nal el análisis. Por otra parte, el alto consumo de disolventes orgánicos
peligrosos y tóxicos (más de 300 ml) es otra desventaja de estos procedimientos.

En este trabajo se desarrolló un procedimiento relativamente recta hacia adelante que es más
rápido, usa menos disolvente y llega a límites más bajos que quanti®cation de- métodos
trazadas. El procedimiento consiste en ex- tracción del aceite vegetal (1 g) en acetonitrilo, la
concentración a sequedad en evaporador rotatorio y la redisolución del residuo en hexano. El
catión puri®- del extracto de hexano fue sobre Sep-Pack de sílice Plus cartuchos, y la
determinación de la BP en el extracto aislado fue por HPLC-FL.

El tiempo de análisis total de una muestra es aproximada- mente 100 min y la cantidad total de
disolventes usados es de aproximadamente 40 ml de ACN y 20 ml de hexano. La precisión del
método y la recuperación son

y el límite quanti®cation satisfactoria (0,32 m g kg 1 ) es considerablemente menor que el

1 m g kg 1 , el máximo que la UE tiene la intención de establecer.

2. Experimental

2 . 1 . Las muestras

Todos los aceites vegetales comerciales fueron adquiridos de supermercados de Santiago de

Compostela (noroeste de España).

2 . 2 . reactivos

Benzo [ a ] pireno estándar (BP) se adquirió de Aldrich, hexano residuo grado análisis fue de
Merck, acetonitrilo de calidad de rutina (ACN) para HPLC fue de Scharlau y DMSO para su
análisis era de Panreac. Cartuchos Sep Pak C18 Sílice Plus y Plus se adquirieron de Aguas (Mil-
lipore) y nitrógeno (SEO N-45) y helio (SEO N-50) eran de la Sociedad de EspanÄola OxõÂgeno.

2 . 3 . Preparación de las normas

Las soluciones madre que contienen 100 mg l 1 y 100 m g l 1 de BP se prepararon en hexano,

ACN y DMSO y se almacenaron a 4 ° C en ACKS volumétricas (con tapones de vidrio) envueltos
en papel de aluminio para evitar la posible degradación de la luz. La norma HAP fueron
preparados por luciones di- apropiadas de estas soluciones madre.

2 . 4 . Aparato

Para la sonicación, se utilizó un Selecta Modelo 300513 baño ultrasónico.

Por HPLC, un Spectra-Physics cromatógrafo líquido equipado con una bomba isocrática P100,
Teknokroma de fase inversa trazador Tr-C-160 C18 precolumna y la columna Hypersil PAH
(5 m de tamaño m par- tícu; 10 cm 4,6 mm ID), detector cencia un FL2000 ¯uores-, y un
integrador Datajet conectado a través de Labnet a un ganador de PC se ejecuta en Windows
(WOW) se utilizaron el software de procesamiento de datos. La circulación ter Wa- a través de
un baño de agua termostatizado

se utilizó para mantener la temperatura de la columna a 32 9 0,1 ° C.

Para con®rmation de BP, un Perkin-Elmer LS-50 espectrómetro equipado con una lámpara de
descarga de xenón, Monk-Gillieson se utilizaron monocromadores y cubetas de cuarzo de 1
cm, con tapones de Teon. Adquisición y tratamiento de los datos espectrales fue por el
software de Administrador de fluorescencia de datos (v. 2.5 y 3.5).

3. Procedimiento

3 . 1 . Extracción y limpia - hasta

Un gramo de aceite de oliva se pesó en un tubo de centrífuga con tapón de cierre y se extrajo
con tres porciones de 10 ml de ACN, agitando vigorosamente durante 3 min. Después de cada
extracción, la muestra se centrifugó a 2500 rpm durante 10 min para separar las capas, la
elaboración de la capa superior con la pipeta. los

extractos combinados ACN (30 ml) se concentraron hasta sequedad en el evaporador

rotatorio, y el residuo se redisolvió en 5 ml de hexano; que luego se hizo pasar sobre un
septiembre Pak Silica Plus cartucho de filmación y se eluyó con 10 ml de hexano a tasa de OW
de 1 ml min 1 (volumen ®nal 15 ml). El eluato hexano se evaporó a sequedad y el residuo se
volvió a disolver en 1 ml de ACN, que después se ®ltered a través de 0,5 m m de tamaño de
poro MFS- 25 ®lters de PTFE.

3 . 2 . procedimiento cromatográfico

Una parte alícuota (20 m l) de la solución de acetonitrilo se inyectó en el sistema HPLC y se

eluye con acetonitrilo-agua (85:15, v : v) a una constante OW-tasa de 0,5 ml min 1 . Para
cuantificar la BP, el detector se fijó en la longitud de onda de excitación de longitud de onda
296 nm y de emisión de 406 nm [22,23].
Higo. 1. HPLC-FL cromatogramas de muestra de aceite de oliva previamente disuelto en
hexano y después se extrajo con ACN (a); y la muestra de aceite de oliva se extrae
directamente con ACN (b).

tabla 1

Precisiones (% RSD) y recuperaciones (% R) obtenidos para seis muestras repetidas de `aceite

de oliva» sobrecargadas con 15 m g kg 1 de benzo [ a ] pireno, extraída durante 9 minutos por
agitación manual y de 45 minutos en baño de ultrasonidos.

método de Añadió una cantidad Cantidad medida ( m g % RSD R% Tiempo de extracción

extracción ( m g kg 1 ) kg 1 ) (min)

agitación 15 13.96 3.93 93 9

manual

Baño 15 12.15 9.91 81 45

ultrasónico
Tabla 2

Benzo [ a ] pireno de 18 muestras de aceite

número de muestras Muestra BP ( m g kg 1 )

1 aceite de oliva virgen 0,79

2 aceite de oliva virgen 0.34

3 Aceite de oliva 1.16

4 Aceite de oliva 0.48

5 Aceite de oliva 0.70

6 Aceite de oliva ND una

7 El aceite vegetal asociada con anchoas 0.35

8 El aceite vegetal asociada con anchoas 0.56

9 El aceite vegetal asociada con atún 0.44

10 El aceite vegetal asociada con atún 0.34

11 El aceite vegetal asociada con atún 0.38

12 El aceite vegetal asociada con Ank ®sh atún 0.52

13 El aceite vegetal asociada con caballa 1.87

ahumada

14 El aceite vegetal asociada con sardinas 1.99

ahumadas

15 El aceite vegetal asociada con sardinas 0.68

16 El aceite vegetal asociada con sardinas ND una

17 El aceite vegetal asociada con sardinas 0.42

18 El aceite vegetal asociada con sardinas 0.60

3 . 3 . Confirmación de los resultados

La identidad del analito se con®rmed por longitud de onda constante imetry spectro¯uor-
síncrona.

La solución de acetonitrilo, analizado por HPLC, se evaporó a sequedad bajo corriente de

nitrógeno y el residuo se volvió a disolver en 3 ml de hexano. La solución se desoxigenó
burbujeando nitrógeno a través de él en 50 ml min 1 para 2 min.

Se registró el extracto de hexano sin tratar y desoxigenada con nitrógeno, entre 200 y 500 nm
a una velocidad de barrido de 240 nm min 1 y con excitación y emisión hendiduras
anchos tanto ajustado a 5 nm. La excitación-emisión de longitud de onda diferencia fue de 20
nm.

Por último, la solución de hexano se evaporó a sequedad bajo corriente de nitrógeno y el

residuo se volvió a disolver en 3 ml de DMSO y luego, registra sin tratar y desoxigenada en las
mismas condiciones [24].

4. Resultados y discusión

4 . 1 . Extracción

Aunque DMSO o DMF son los disolventes más comunes utilizados para la extracción de líquido
± líquida de HAP de los aceites y grasas [2,3,7,10,11,14,15], elegimos ACN porque este
disolvente emulsiones producen menos que la otro y es también más fácil de eliminar en la
etapa subsiguiente.

Recuperaciones completas fueron obtenidos por partición de las muestras de aceite, Punta
con BP, entre hexano y ACN seguido de puri®cation con sílice, sin embargo muchas impurezas
estaban aún presentes en el cromatograma HPLC. Estas impurezas se eliminan cuando el
aceite vegetal se extrajo directamente con ACN, sin disolución previa de la muestra en hexano
(Fig. 1).

Dos procedimientos se compararon para la extracción del analito, es decir, baño de

ultrasonidos y agitación manual tradicional. El método ®rst se ha utilizado anteriormente para
la extracción de PAH de plantas, suelos, alimentos, sediments¼ [22,25 ± 29] pero podría ®nd
ninguna referencia a su uso para la extracción de los HAP de los aceites.

La Tabla 1 muestra los resultados comparativos de los estudios recuperaciones y los tiempos
de extracción obtenidos para muestras contaminadas de aceites vegetales (®rstly, se
con®rmed que los niveles de PA fueron inferiores al límite de detección). Estas muestras
cargadas se extrajeron con tres porciones de 10 ml de ACN tanto sonicación y agitación
manual. Cada valor de recuperación que se muestra es la media de 6 determinaciones. La
recuperación promedio obtenida por la técnica convencional fue del 93%, con una media de
RSD 3,93% y para la técnica de la sonica- fue del 81% con una RSD media de 9,91%. El tiempo
de extracción total de una muestra fue de 9 minutos con agitación manual, y
aproximadamente 45 minutos con el método ultrasónico.
Debido a que la recuperación fue mayor, RSD% era más pequeño y el tiempo de extracción fue
más corto usando

agitación manual, se eligió este método para el análisis de los aceites vegetales.

4 . 2 . Limpia - hasta

Con el fin de obtener un puro adecuado y se concentró el extracto dos adsorbentes, se

evaluaron septiembre Pak C18 y cartuchos de sílice.

4 . 2 . 1 . Cartucho C18

Los estudios previos de otros productos alimenticios en los que se utilizó cartucho Sep Pak
C18, indicaron que este adsorbente se ef®cient para limpiar arriba extractos
acuosos [22,23,30].

Por lo tanto, el ACN extracto (30 ml) mezclado con 60 ml de agua (ACN : proporción de agua de
1: 2) se pasó a través de un cartucho Sep Pak C 18 Plus que habían sido previamente activado
por el paso de 5 ml de ACN seguido de 10 ml de agua destilada. El eluato de acetonitrilo
acuosa se desechó y el BP retenida en el cartucho se eluyó con 5 ml de hexano [30]. Los
resultados obtenidos para muestras enriquecidas no fueron satisfactorios (% 46 de
recuperación). Las pérdidas se debieron a la presencia de trazas de aceite en el extracto de
ACN que eluyen de la BP menos Tena ciously llevó a cabo en el adsorbente.

4 . 2 . 2 . Cartucho de sílice

El extracto ACN se concentró a sequedad en evaporador rotatorio, y el residuo se resolvió

bución en 5 ml de hexano que se pasó sobre una Sep-Pak cartucho de sílice Plus (tamaño de
partícula 55 ± 105 m m), y el BP retenida se eluyó con 10 ml de hexano. Los resultados
obtenidos con este adsorbente para muestras enriquecidas fueron satisfactorios [22,23,30].

Antes de la HPLC, este eluato hexano (total de 15 ml de volumen) se concentró a sequedad

bajo corriente de nitrógeno, y el residuo se volvió a disolver en 1 ml de ACN.

4 . 3 . Cuantificación y la linealidad de la respuesta instrumental

La señal debido a la PA se identi®ed por comparación de cromatogramas de muestras con el

cromatograma del estándar BP. Quanti®cation fue por el método estándar externo.

La recta de calibración se construyó por medio ING regress- ( n 3) área del pico de
concentración estándar (0,5 ± 16 m g l 1 en ACN). La respuesta fue altamente lineal ( r 0,9999).
Higo. 2. HPLC-FL cromatogramas de 1 m g l 1 de benzo [ a ] pireno estándar; aceite vegetal
asociada con anchoas, la muestra 8; y el aceite vegetal asociada con sardinas ahumadas,
muestra 14.
Higo. 3. -longitud de onda constante fluorescencia sincrónica espectros ( Dl 20 nm) de 8 m g
l 1 de benzo [ a ] pireno en (1) hexano; (2) hexano desoxigenado; (3) DMSO; y (4) DMSO
desoxigenado.

4 . 4 . Los límites de detección y quanti®cation

Los límites de detección y quanti®cation para BP en el eluato de acetonitrilo son 0,23 y

0,32 m g l 1 , respectivamente (calculado, siguiendo directrices de la ACS [31]), lo que equivale
a 0,23 y 0,32 m g kg 1de aceite vegetal. Claramente, el límite de concentración último es
mucho menor que el 1 m g kg 1 , máxima que la UE tiene la intención de establecer [16].

4 . 5 . La precisión y la reco 6 ery

La precisión y la recuperación del método se determinó mediante la aplicación del

procedimiento para seis muestras cate replicables de `aceite de oliva '(muestra 6) enriquecida
con BP (1 y 15 m g kg 1 ). En primer lugar, se con®rmed que los niveles de PA en esta muestra
estaban por debajo del límite de detección. La precisión (% RSD) y recu-
Ery (% R) obtenidos para muestras adicionadas con 1 y 15 m g kg 1 de BP fueron 2,00%, 100% y
3,93%, 93%, respectivamente.

4 . 6 . Análisis de muestras

El procedimiento se aplicó a 18 muestras (Tabla 2): 2 aceites de oliva vírgenes (en los países de
la UE, `aceite de oliva virgen 'designa un aceite de oliva unre®ned y ONU tratado), 4 aceites de
oliva (en los países de la UE,` aceite de oliva 'designa una mezcla de aceites de oliva vírgenes y
re®ned, además de ser un término general), y 12 aceites vegetales enlatados asociados con
®sh pro- ductos (en España, `aceite vegetal» designa una mezcla de aceites vegetales re®ned,
excepto el aceite de oliva).

Los niveles de BP en `aceite de oliva virgen 'y' aceite de oliva 'fueron entre no detectado y
1,16 m g kg 1 . Estos valores están de acuerdo con la mayoría de los datos de la literatura para
aceites europeos [7,8,10,11,15] se encontraron valores similares de BP por tratados y no
tratados aceites, debido a que el proceso de re®ned eliminar el `luz ' HAP (2 ± 3 anillos),
mientras que el `pesado 'HAP (4 ± 5 anillos, por ejemplo, BP), permanecen en el aceite [9].

Para analizadas, las muestras 13 (aceite vegetal asociada con la caballa ahumada) los 12
`aceites vegetales 'y 14 (aceite vegetal asociada a cenar SAR ahumado) contenía los niveles
más altos de la PA (1,87 y 1,99 m g kg 1 , respectivamente) (fig. 2). Es posible que estos altos
niveles en el aceite pueden ser el resultado de la lixiviación de la lipófilo BP de los productos
®sh ahumados. Este comportamiento también se observó por Lawrence y Weber (1984) [32]
cuando analizaron los mejillones y ostras ahumadas en aceite vegetal.

Aunque, en general, los valores de PA fueron bajos, tres muestras (3, 13 y 14) mostraron un
nivel de PA por encima de 1 m g kg 1 , el máximo que la UE tiene la intención de establecer
para los alimentos.

4 . 7 . Con®rmation de la identidad

La identidad del analito BP fue con®rmed por longitud de onda constante tro¯uorimetry espec-
síncrona. Esta técnica se ha utilizado ampliamente para la determinación de BP en una
variedad de matrices [33 ± 39].

Los intervalos de longitud de onda entre emisiones y monocromador de excitación que

brindaban a la mejor

S . Vázquez Troche et al . : Talanta 51 (2000) 1069 ± 1076

Higo. 4. -longitud de onda constante espectros de fluorescencia sincrónica ( Dl 20 nm) de (1) la
muestra 3 en hexano; (2) de la muestra 3 en hexano desoxigenado; (3) de la muestra 3 en
DMSO; (4) la muestra 3 en DMSO desoxigenado.

señal para BP en DMSO y hexano, son 20 o 110 nm para los dos. Con Dl 20 nm, hubo menos
interferencias en el barrio de la excitación correspondiente de BP (384 nm de hexano y 389 nm
en DMSO), y por lo que este valor de Dl se utilizó para con®rmation.

Se observa que la sensibilidad de BP depende del disolvente utilizado (el límite de detección
más bajo y el límite quanti®cation se obtienen con DMSO y la más alta con hexano) y de los
effets de bloqueo del oxígeno. La magnitud de la desactivación también depende del
disolvente utilizado para disolver el analito (la desoxigenación de la solución de DMSO
aumentó fluorescencia BP en un factor promedio de 1,1, mientras que una más o menos de
ocho veces aumento era habitual después de la desoxigenación de la solución de hexano
correspondiente) (Fig. 3) [24].

Estas diferencias y el hecho de que la sorbance máximo ab- de BP se desplaza a 389 nm en

DMSO se utilizaron para con®rm la identidad del analito en los aceites de muestra (Fig. 4).
referencias

[1] K. Cejpek, J. HajslovaÂ, V. Kocourek, M. TomaniovaÂ, J. CmolõÂk, los hu

Alimentos. Contam. 15 (1998) 563 ± 574.

[2] JH Howard, RT Teague, RH blanca, BE Fry, J. Assoc.Apagado. Anal. Chem. 49 (3) (1966) 595 ±
611.

[3] G. Grimmer, H. Bohnke, J. Assoc. Apagado. Anal.Chem. 58 (1975) 725 ± 733.

[4] L. Kolarovic, H. Traitler, J. Chromatogr. 247 (1982) 263 ± 272.

[5] JF Lawrence, DF Weber, J. Agric. Food Chem. 32 (1984) 794 ± 797.

[6] JF Lawrence, Environ. Anal. Chem. 24 (1986) 113 ± 131.

[7] A. Hopia, H. Hyysalo, K. Wickstrom, J Assoc. Apagado.Anal. Chem. 63 (7) (1986) 889 ± 893.

[8] K. Speer, E. Steeg, P. Hortmann, TH Kuhn, A. Mon- Tang, J. alta Resolut. Chromatogr. 13 (2)
(1990) 104 ± 111.

[9] MJ Dennis, RC Massey, G. Cripps, I. Venn, N. Howarh, G. Lee, Comida servicios

adic. Contam. 8 (4) (1991) 517 ± 530.

[10] E. Menichini, A Bocca, F. Merli, D. Ianni, F. Monfre- Dini, los hu Alimentos. Contam. 8
(1991) 363 ± 369.

[11] E. Menichini, A. Domenico, L. Bonanni, E. Corradetti, L. Mazzanti, G. Zucchetti, J.

Chromatogr. 555 (1991) 363 ± 369.

[12] J. Balenovic, I. Petrovic, M. Perkovac, Euro Food Chem. 8 (1995) 275 ± 281.

[13] F. Van Stijn, MAT Kerkhoff, BGM Vandeginste, J. Chromatogr. Un 750 (1996) 263 ± 273.

[14] AM Pupin, MC Figuiredo Toledo, Food Addit. Tam ción. 13 (1996) 639 ± 646.

[15] AM Pupin, MC Figuiredo Toledo, Food Chem. 55 (1996) 185 ± 188.

[16] R. Derache, Toxicología y Seguridad de los Alimentos, Omega, Barcelona, 1990, págs. 295
± 317.

[17] H. Seto, T. Ohkubu, T. Kanoh, M. Koike, K. Nakamura, Y. Kawahara,

Arch. Reinar. Contamin. Toxicology. 24 (1993) 498 ± 503.

[18] J. Dujmov, P. Sucevic, M. Tonkovic, Toxicology.Reinar. Chem. 46 (1994) 73 ± 80.

[19] TL Shchekaturina, AL Khesina, OG Mironov, LG Krivosheeva, marzo Pollut. Toro. 30 (1)

(1995) 38 ± 40.

[20] E. PenÄa, JE Conde, FG Montelongo, Bull. Reinar.Contam. Toxicology. 57 (1996) 803 ± 810.
[21] T. Win, W. Luther, J. Jacob, HA Vaessen, A. Boenke, Fresenius J. Anal. Chem. 360 (1998)
640 ± 644.

[22] MS GarcõÂa FalcoÂn, MJ LoÂpez de Alda VillaizaÂn, S. GonzaÂlez Amigo, J. Simal Lozano,
MA Lage Yusty, J. Chromatogr. A 753 (1996) 207 ± 215.

[23] MS GarcõÂa FalcoÂn, MJ LoÂpez de Alda VillaizaÂn, S. GonzaÂlez Amigo, J. Simal Lozano,
MA Lage Yusty, los hu Alimentos. Contam. 13 (7) (1996) 863 ± 870.

[24] MS GarcõÂa FalcoÂn, S. GonzaÂlez Amigo, MA Lage Yusty, B. Laffon Lage, J. Simal Lozano,
Talanta 48 (1999) 377 ± 384.

[25] JT Coates, AW Elzerman, J. Assoc. Apagado. Anal.Chem. 69 (1986) 110 ± 114.

[26] L. Morselli, S. Zappoli, Sci. Environ Total. 73 (1988) 257 ± 266.

[27] U. Hechler, J. Fisher, S. Plagemann, Fresenius J. Anal.Chem. 351 (1995) 591 ± 592.

[28] E. Aamot, E. Steinnes, R. Schmid, Environ. Pollut. 92 (1996) 275 ± 280.

[29] JW Readman, I. Tolosa, en la ley, J. Bartocci, S. Aze- mard, T. Hamilton, LD Mee, A.

Wagener, M. Le Tissier, N. Dowing, ARG Precio, marzo Pollut. Toro. 32 (1996) 437 ± 443.

[30] MJ LoÂpez de Alda VillaizaÂn, MS GarcõÂa FalcoÂn, S. GonzaÂlez Amigo, MA Lage Yusty, J.
Simal Lozano, Talanta 43 (1996) 1405 ± 1412.

[31] Sociedad Americana de Química (Subcomité de Química Analítica Ambiental),

Anal. Chem. 52 (1980) 2241 ± 2248.

[32] JF Lawrence, DF Weber, J. Agric. Food Chem. 32 (1984) 794 ± 797.

[33] K. Tanaka, K. Sugawara, K. Masuda, Anal. Sci. 3 (1987) 89 ± 90.

[34] K. Tanaka, M. Saito, analista 113 (1988) 509 ± 510.

[35] Z. Zenhua, P. Wenyi, J. Environ. Sci. 1 (1989) 109 ± 115.

[36] R. Santana, F. Sosa, Talanta 39 (1992) 1611 ± 1617.

[37] MJ LoÂpez de Alda VillaizaÂn, MS GarcõÂa FalcoÂn, MA Lage Yusty, J. Simal Lozano, J.
Assoc. Apagado.Anal. Chem. 78 (1995) 402 ± 406.

[38] MJ LoÂpez de Alda VillaizaÂn, J. Simal Lozano, MA Lage Yusty, Talanta 42 (1995) 967 ±
970.

[39] B. Laffon Lage, MS GarcõÂa FalcoÂn, S. GonzaÂlez Amigo, MA Lage Yusty, J. Simal Lozano,
Alimentación adic. Contam. 14 (1997) 469 ± 470.