2017

“Año del Buen Servicio al Ciudadano”

CURSO : Laboratorio de Microbiología.

PROFESORA : Villena Chavez, Gretty Katherina.
INTEGRANTES :
 Calizaya Alvarez, Diego.
 Enciso Cámac, Marco.
 Justil Olivares, Samuel.
 Roncal Romero, David.

CICLO : 2017-I

[0]
 ÍNDICE

I. INTRODUCCIÓN. .................................................................................................. 2
II. OBJETIVO. ........................................................................................................... 2
III. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA. .................................................................. 3
Ejercicio N°1. Actividad enzimática extracelular de bacterias. ................................... 3
IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES. ..................................................................... 6
Muestra Número 1: Agara caseína. ........................................................................... 6
Muestra Número 2: Agar almidón. ............................................................................. 7
Muestra Número 3: Agar gelatina. ............................................................................. 8
Muestra Número 4: Agar grasa. ................................................................................ 9
V. CONCLUSIÓN..................................................................................................... 10
VII. BIBLIOGRAFÍA. .............................................................................................. 11

[1]
I. INTRODUCCIÓN.

En los hábitats naturales, la proteólisis es un proceso importante que produce

aminoácidos utilizables como fuente de energía o como subunidades para la
biosíntesis . Muchos géneros de distintos grupo de bacterias son capaces de
producir enzimas proteolíticos, generalmente exoenzimas, que difunden al medio
medio exterior . Esta es la causa de que frecuentemente se encuentran altas
concentración de aminoácidos en los medio que se desarrollan las bacterias. (Páres,
2002)

En los microorganismos, la mayoría de los carbohidratos de que se disponen se

encuentra en la forma de polisacáridos. Un ejemplo común de esto compuestos es
el almidón. Un organismo puede hidrolizar almidón sólo si produce la enzima
amilasa. Como no todos los microorganismos producen esto, la hidrolisis de amilasa
puede servir para la identificación de microorganismos desconocidos.

II. OBJETIVO.

 Determinar la actividad enzimática en 4 medios de cultivo: agar almidón, agar

gelatina, agra caseína y agar grasa con las bacterias Escherichia coli,
Staphylococcus aureus, Bacillus cereus.

[2]
III. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA.
Ejercicio N°1. Actividad enzimática extracelular de bacterias.

Caja Petri con agar Grasa

Fuente: Propia.

Caja Petri con agar Gelatina

Fuente: Propia.

Caja Petri con agar Caseína

Fuente: Propia.

Caja Petri con agar Almidón

Fuente: Propia.

[3]
 Lugol

Fuente: http://www.lensforvision.com/

Ácido acético

Fuente: http://www.lensforvision/acetico.com/

Sulfato de cobre II

Fuente: http://3.bp.blogspot.com/ tinciones.JPG

Plumón indeleble
Mechero
Muestras (E. coli, S. aureus y B. cereus)
Regla (cm)

[4]
Procedimiento.

2 3

1 4
Tomar la caja Petri
que contiene al
Retirar con el asa medio y hacer la
estría con delicadesa
de Kohl muestra de
por la línea de guía
la bacteria, dibujada
siempre cerca del anteriormente,
mechero por evitando romper el
seguridad. agar. Repetir para Luego de dejar un día a
En las placas que
contienen el agar cada bacteria y cada 37°C, proceder con la
dividir en cuatro caja Petri reacción reveladora,
secciones: Un que consiste en echar
control y las otros 3 en exceso la sustancia
para las bacterias a para revelado y
estudiar. Dibujar la observar la formación
línea por donde irán del halo. Medir el
la estrías menor diámetro con
una regla.

[5]
 IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES.
Muestra Número 1: Agara caseína.

Reacción de revelado
Sustancia para
Medio de cultivo Sustrato Enzima a evaluar Halo de Zona no
revelado
hidrólisis hidrolizada
Agar caseína Ácido acético al
caseína proteasa transparente opaco
(leche) 5%

Bacterias involucradas: Bacillus cereus,

Staphylococcus aureus y Escherichia coli.
Presencia de halo de hidrólisis: Bacillus cereus
Medida del diámetro menor: 2 cm
Incidentes: Contaminación de toda la muestra.

En la leche, la caseína es la proteína más abundante, siendo la misma la que le proporciona las
características externas a la leche. La caseína se encuentra suspendida coloidalmente en esta.
Aquellas bacterias que pueden aprovechar metabólicamente esta proteína, las cuales son varias,
necesitan de la caseasa, una exoenzima hidrolizante. En otras palabras, la caseasa es una
proteasa que rompe el enlace peptídico CO-NH introduciendo agua a la molécula, liberando
pequeñas cadenas de aminoácidos llamados péptidos, los cuáles luego serían disminuidos a
aminoácidos libres para ser utilizados por las células. Esta peptonización produce un
aclaramiento en aquellas zonas de proliferación de bacterias con caseasa en el momento de la
reacción de revelado. (Swamy, 2008).
En cuanto a las bacterias que son capaces de producir proteasas extracelulares encontramos a
bacterias patogénicas como el Staphylococcus y Streptococcus, bacterias acuáticas como las
Pseudomonas y bacterias de suelo como los Bacillus y Clostridium. (Swamy, 2008). En nuestro
caso, nosotros hemos experimentado con dos bacterias que pertenecen a dos géneros
mencionados por este autor, sin embargo, por omisión, no podíamos descartar a Escherichia
coli. Por eso buscamos registros de actividad enzimática de este tipo relacionada a E. coli,
encontrando que según Haddadi et al, esta bacteria produce numerosos tipos de proteasas
entre las cuales está la caseasa.
En nuestros cultivos tuvimos una mala experiencia debido a las fallas en la inoculación, donde
se rompió el agar para la estría del Staphylococcus aureus y el Escherichia coli llegó a invadir
otras secciones del medio. Esto explicaría por qué solo Bacillus cereus llegó a formar un halo
regular mas no las otras dos bacterias.

[6]
 Muestra Número 2: Agar almidón.

Reacción de revelado
Sustancia para
Medio de cultivo Sustrato Enzima a evaluar Halo de Zona no
revelado
hidrólisis hidrolizada
Agar almidón almidón amilasa lugol transparente azul oscuro

Técnica de cultivo: Estriado sobre la superficie de agar

Luego de la incubación

Aquí se evaluó la actividad enzimática con tres bacterias:

Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Bacillus cereus
Luego de la incubación, y después de cubrir la superficie de la placa con solución de lugol, se
obtuvo los siguientes resultados:
 El halo de hidrólisis era transparente en el cuadrante que correspondía a la bacteria
Bacillus cereus, los demás cuadrantes y el cuadrante control estaban de color oscuro,
lo que correspondía con zonas no hidrolizadas.
 El diámetro del halo de hidrólisis fue de 1 cm.

La molécula del almidón es muy compleja y para su asimilación por las bacterias, estas deben
descomponerla (hidrolizarla) en sustancias más simples y fácilmente asimilables. Un gran
número de bacterias son capaces de elaborar una enzima amilasa que hidroliza el almidón con
formación de maltosa. La maltosa puede ingresar a la célula para ser utilizada. La enzima amilasa
es también una enzima extracelular, por lo tanto la demostración de la hidrólisis del almidón
puede hacerse tanto en medio líquido como en medio sólido.
El almidón reacciona químicamente con iodo para producir un color azul oscuro cuando las
moléculas de Iodo se insertan en los huecos de la molécula espiralada del almidón. Este
resultado es debido a que la molécula absorbe más luz visible excepto el azul, y si el almidón se
rompe en maltosa y glucosa, no se desarrolla ningún color debido a que desaparece la espiral y

[7]
no quedan los huecos para que entre el lodo, esta ausencia de color es asociada con la hidrólisis
de almidón. (Bailey; Scott, 2007)
La producción de amilasa es útil para diferenciar especies de Bacillus, de Streptococcus y de
Lactobacillus. De igual forma, se aplica a esquemas de diferenciación de algunas bacterias
aerobias y anaerobias como Actinomyces, Bacteroides, Clostridium y fusobacterium. (Rodríguez
et al., 2012)
Todos los miembros del grupo de Bacillus cereus producen leciticinasa en agar yema de huevo
e hidrolizan la caseína, el almidón y la gelatina. (Koneman, 2008)
Entonces con lo expuesto lineas arriba, concluímos que la evaluación de bacterias en el agar
almidon fue satisfactorio, comprobándose que solo la bacteria Bacillus cereus fue capaz de
hidrolizar el almidón.

Muestra Número 3: Agar gelatina.

Reacción de revelado
Sustancia para
Medio de cultivo Sustrato Enzima a evaluar Halo de Zona no
revelado
hidrólisis hidrolizada
Agar gelatina colágeno proteasa Ácido acético transparente opaco

Técnica de cultivo: Estriado sobre la superficie de agar

Luego de la incubación

Aquí se evaluó la actividad enzimática con tres bacterias:

Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Bacillus cereus
Luego de la incubación, y después de cubrir la superficie de la placa con solución de ácido
acético, se obtuvo los siguientes resultados:
 El halo de hidrólisis era transparente en el cuadrante que correspondía a la bacteria
Bacillus cereus, los demás cuadrantes y el cuadrante control estaban de opaco, lo que
correspondía con zonas no hidrolizadas.

 El diámetro del halo de hidrólisis fue de 1.3 cm

[8]
 Las proteasas naturales son más activas frente a las proteínas desnaturalizadas que frente a
alas nativas . Muchas proteasas bacterianas han sido cristalizadas . En el medio extracelular
también se encuentran peptidasas que hidrolizan los fragmento oligopeptídicos resultantes
de la acción de las proteasas . Tambien se ha purificado una serie de peptidasas bacterianas
.(Páres, 2002)

La proteasas se puede localizar en los bacillus intracelular como extracelularmente. En los

bacillus cereus se encuentra intracelularmente que aparentemente hidrolizan pequeños
péptidos tomados del medio exterior.(Páres ,2002)

Muestra Número 4: Agar grasa.

Reacción de revelado
Sustancia para
Medio de cultivo Sustrato Enzima a evaluar Halo de Zona no
revelado
hidrólisis hidrolizada
Agar grasa
triglicéridos Lipasa CuSO4 Turquesa Sin cambio
(mantequilla)

Técnica de cultivo: Estriado sobre la superficie de agar

Luego de la incubación

Aquí se evaluó la actividad enzimática con tres bacterias:

Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Bacillus cereus
Luego de la incubación, y después de cubrir la superficie de la placa con solución de CuSO4, se
obtuvo los siguientes resultados:
 El halo de hidrólisis era de color verde azulado en el cuadrante que correspondía a la
bacteria Staphylococcus aureus, los demás cuadrantes y el cuadrante control estaban
iguales al agar, lo que correspondía con zonas no hidrolizadas.
 El diámetro del halo de hidrólisis fue de 1.5 cm

[9]
FUNDAMENTO
El método se basa en inocular una cantidad conocida de muestra, en un medio de cultivo
selectivo específico que contiene triglicéridos, aprovechando la capacidad de este grupo
microbiano de alteración, de utilizar como nutrientes a los ácidos grasos mediante la lipólisis
enzimática. Al medio de cultivo se le añade un colorante, CuSO4, y al difundir la enzimas en el
medio de cultivo sólido, disminuye el pH debido a la acumulación de los ácidos grasos libres, y
su color se vuelve visualmente más brillante e intenso en aquellas zonas en donde se encuentran
los ácidos grasos libres.
A los microorganismos que hidrolizan grasas y aceites se les conoce como microorganismos
lipolíticos. Las lipasas se definen como aquellas enzimas capaces de hidrolizar los enlaces ester
de los ácidos carboxílicos de sustratos insolubles. Y en contraste, las enzimas que hidrolizan los
enlaces esteres de substratos solubles en agua se conocen como esterasas. El rol biológico de
las lipasas consiste en iniciar el metabolismo de las grasas y aceites reduciéndolos a ácidos
grasos libres realmente metabolizables y glicerol. Los triglicéridos no se absorben intactos
dentro de la célula, así que la hidrólisis inicial ocurre extracelularmente. Por esta razón, las
lipasas microbianas generalmente son excretadas por la célula, y se encuentran como enzimas
extracelulares. En algunos casos, la acción lipolítica provoca cambios indeseables, teniendo por
consecuencia el rechazo y disposición final de los alimentos. Mediante la utilización de medios
de cultivo especiales en placa, los microorganismos que producen lipasas pueden enumerase.
Tal enumeración no se realiza con fines rutinarios, sino cuando se presenta algún problema. La
determinación del número de microorganismos lipolíticos presentes en una muestra de
alimentos, puede proporcionar información al fabricante de si el problema relacionado con los
lípidos es microbiano o de origen no microbiano.
En nuestro caso se visualizó la presencia de degradación de los lípidos en la bacteria
Staphilococcus aureus, en la bacteria Bacillus cereus no se pudo presenciar el halo de la hidrolisis
ya que la enzima se fue hacia el fondo de la placa, en la bacteria Eschirichia coli no se presenció
halo de hidrolisis en los zonas sembradas.

V. CONCLUSIÓN.

- Se logró determinar la actividad enzimática en 4 medios de cultivo: agar

almidón, agar gelatina, agra caseína y agar grasa con las bacterias Escherichia
coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus.

VI. RECOMENDACIONES.

- Usar en todo momento mascarilla, bata, guantes y gorro.

- Lavar las manos con agua y jabón antes de realizar las actividades programadas,
antes de salir del laboratorio y siempre después de manejar materiales que se
sabe o se sospecha que pueden estar contaminados.
- Tener un adecuado uso de los materiales y sobre todo cuando se hace el cultivo
en las placas petri, evitando la contaminación con el ambiente, cogiendo con
una sola mano la placa petri y con la otra el estilete o asa de kôlle.

[10]
VII. BIBLIOGRAFÍA.

 (2007). En Bailey, & Scott, Diagnóstico Microbiológico (págs. 690-691). Madrid:

Editorial Médica Panamericana S.A.

 (2008). En E. Koneman, Diagnóstico Microbiológico (págs. 743-744). Buenos Aires:

Editorial Médica Panamerica.

 (2012). En E. Rodríguez Caballini, M. Gamboa Coronado, & F. Hernández Chavarría,

Bacteriología General (págs. 194-195). Costa Rica: Editorial Universidad de Costa Rica.

 (2008). En P.M. Swamy. Laboratory Manual on Biotechnology (pag 251). Nueva Delhi:
Rastogi Publications.
 (2005). En Haddadi, K; Moussaoui, F; Hebia, I; Laurent, F; Le Roux, Y. E. coli proteolytic
activity in milk and casein breakdown. Nancy: École Nationale Supérieure d'
Agronomie.
 Bioquimica de los micoorganismos , Ramón Páres, 2002 , Barcelona,España , pag 242.
 Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. American Public
Health Association; 4 ed. (April 15, 2001)
 Aislamiento de microorganismos con mayor actividad lipolítica del queso cotija. Tesis
para obtener título de Q. A. presentado por Verónica García Saturnino. UNAM, Fac. De
Química no. 2006.
 Diagnóstico Microbiológico. Texto y Atlas color. Koneman, Elmer, W. Editorial Médica
Panamericana. 1983.

[11]
[12]