l. OBJETIVO.

 Analizar microbiológicamente una muestra.

 Aislar e identificar microorganismos (mohos y levaduras) presentes en muestras de alimentos.

ll. FUNDAMENTO.

Los hongos son organismos micro y macroscópicos pertenecientes al reino fungi; poseen un núcleo definido,
por lo que se consideran seres eucariontes, portadores de esporas, aclorofilicos, que por lo general se
reproducen sexual y asexualmente, y cuyas estructuras somáticas, ramificadas y filamentosas. En algunos
tipos de hongos, estas estructuras están rodeadas por paredes celulares que contienen quitina o celulosa, o
ambas sustancias, junto con otras moléculas orgánicas complejas. (Ciudad, 2012)

Dentro de este gran Reino, existen varios tipos de hongos, como lo son los mohos y las levaduras.

Los mohos son un tipo de hongos filamentosos, dotados de un micelio verdadero, microscópicos, y cuyo
crecimiento en los alimentos en condiciones de humedad o descomposición, y se reconocen fácilmente por
su aspecto aterciopelado o algodonoso; son de pequeño tamaño. Los mohos se reproducen asexualmente
en la mayoría de los casos y las estructuras sexuales sólo aparecen cuando las circunstancias son favorables
o se encuentran micelios de distinta polaridad. Sus filamentos que a su vez, constituyen el micelio reciben el
nombre de hifas. Las hifas pueden estar separadas en secciones generalmente multinucleadas por medio de
septos perforados, o bien carecer de éstos. La pared celular del micelio de los mohos semeja un extenso
sistema tubular por el que avanza el citoplasma para su dispersión y búsqueda de nutrientes. (Carrillo, 2007)

Las levaduras, por otro lado, son microorganismos unicelulares que miden de 1 a 9 µm de ancho y 2 a más
de 20 µm de longitud según la especie, nutrición, edad y otros factores. Las levaduras pertenecen a dos
clases de hongos: ascomicetos o basidiomicetos, aunque muchas de ellas se presentan comúnmente en la
forma imperfecta. (UNSA, 2007)

Las levaduras son organismos heterotróficos (solo pueden alimentarse de materia orgánica ya preformada)
Generalmente la reproducción es un proceso asexual, pero también se conoce un proceso de conjugación o
reproducción sexual. A consecuencia de esto, la levadura puede existir en estado haploide o diploide. La
reproducción de las levaduras se produce por gemación, esporulación o fisión. (Características, 2018)

Tanto los mohos como las levaduras están ampliamente distribuidos en la naturaleza y se pueden encontrar
formando parte de la flora normal de un alimento, o como agentes contaminantes y en los equipos sanitizados
inadecuadamente, provocando el deterioro fisicoquímico de éstos, debido a la utilización en su metabolismo
de los carbohidratos, ácidos orgánicos, proteínas y lípidos originando mal olor, alterando el sabor y el color
en la superficie de los productos contaminados. Además los mohos y levaduras pueden sintetizar metabolitos
tóxicos termoresistentes, capaces de soportar algunas sustancias químicas, así como la irradiación y
presentan capacidad para alterar sustratos desfavorables, permitiendo el crecimiento de bacterias
patógenas. (Salud, 1994)

Para su determinación, la NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-111-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS.

MÉTODO PARA LA CUENTA DE MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS, propone un método, el cual se
basa en inocular una cantidad conocida de muestra de prueba en un medio selectivo específico, acidificado
a un pH 3,5 e incubado a una temperatura de 25 ± 1°C, dando como resultado el crecimiento de colonias
características para este tipo de microorganismos.
 lll. Materiales y reactivos.

Materiales y reactivos.
2 Matraces de 150 mL (con 99 mL de 1 matraz Erlenmeyer de 250 mL
agua esterilizada)
2 Portaobjetos, cubreobjetos 5 Pipetas graduadas estériles de 1 mL con tapón
Aceite de inmersión de algodón
5 tubos 22 x 175 mm 5 Pipetas graduadas estériles de 10 mL con
1 licuadora tapón de algodón
1 probeta de 50 ml 1 Gradilla para tubos
1 vidrio de reloj 2 Mecheros Fisher
1
Espátula 1 Micropipeta de 1000 uL y 200 uL
10 Puntas azules y blancas
1 Microscopio óptico 5 Cajas de Petri
1 Contador de colonias 1 Incubadora
1 potenciometro
1 Baño maría

TABLA 1. Características fisicoquímicas de los reactivos.

REACTIVOS DESCRIPCIÓN
PEPTONA Polipéptidos formados durante
la degradación enzimática de proteínas. Son la
principal fuente de nitrógeno en el medio orgánico
para el cultivo de bacterias.
Contienen aminoácidos libres y cadenas cortas
de péptidos, y a veces carbohidratos. Es soluble en
agua e insoluble en etanol y éter.
NaCl Es un compuesto iónico formado por
un catión sodio (Na+) y un anión cloruro (Cl-), y,
como tal, puede sufrir las reacciones características
de cualquiera de estos dos iones. Como cualquier
otro cloruro iónicosoluble, precipita cloruros
insolubles cuando es agregado a una disolución de
una sal metálica apropiada
NaOH Un hidróxido cáustico usado en la industria
(principalmente como una base química) en la
fabricación de papel, tejidos, y detergentes.
Además, se utiliza en la industria petrolera en la
elaboración de lodos de perforación base agua. A
nivel doméstico, son reconocidas sus utilidades para
desbloquear tuberías de desagües de cocinas y
baños, entre otros.
La tinción de Azul de lactofenol se emplea para
observar hongos.
Es una tinción simple (un sólo colorante) y como tal
está basada en la afinidad del colorante por
 componentes de las células, en este caso por las
estructuras fúngicas.
El azul de lactofenol tiene tres características que lo
hacen especial para observar dichas estructuras en
los hongos del tipo moho obtenidos en los cultivos
por aislamiento.
 El fenol destruye la flora acompañante
(algunas veces en los cultivos, juntos a los
Solución colorante de lactofenol azul de algodón hongos pueden crecer colonias de bacterias)
 El ácido láctico conserva las estructuras
fúngicas al crear, por decirlo de algún modo,
una película que las protege provocado por
un cambio de gradiente osmótico entre el
interior y el exterior de dicha estructura.
 El azul de algodón tiene la capacidad de
adherirse a las hifas y conidios de los hongos
microscópicos
Ácido tartárico  Fórmula H2C4H4O
 Peso molecular: 150,1.
 Punto de fusión: 168 – 170 ºC.
 Punto de combustión: 1149,9 KJ/mol.
 Descripción: cristales incoloros o polvo
cristalino blanco de sabor fuertemente ácido,
inodoro y estable a la luz y al aire..
 Calor de disolución: -14.42 KJ/mol.
Agar papa dextrosa Medio común de cultivo microbiológico que se
preparan a partir de infusión de patata y dextrosa. El
agar de patata y dextrosa es el medio más utilizado
para el crecimiento de hongos y levaduras que
atacan a las plantas vivas o materia vegetal muerta
en descomposición. La base del medio es altamente
nutritiva y permite la esporulación y la producción de
pigmentos en algunos dermatofitos.

TABLA 2.Características de microorganismos aislados.

MICRORGANISMO CARACTERÍSTICAS AGAR

Hongo Es un género de hongo que, Agar papa dextrosa
generalmente, habita en el suelo
Fusarium Muchas de sus especies son
inofensivas pero en
determinadas ocasiones pueden
causar infecciones,
especialmente en pacientes
inmunodeprimidos. Su hábitat
principal es el suelo y suelen ser
organismos patógenos de varias
plantas, también forman parte de
las biocapas acuáticas y se
 encuentran en la microflora
normal de algunos productos
como el arroz, los frijoles, la soja,
etc.
Hongo Es un género de hongos que son Agar papa dextrosa
simbiontes de las plantas como
Colletotrichum (chirimoya endófitos o fitopatógenos .
Annona Cherimola Mill) Muchas de las especies de este
género son patógenos de
plantas, pero algunas especies
pueden tener una relación
mutualista con los hospederos.

lV. METODOLOGIA.

Homogeneizar la muestra con

Pesar 10.0 g de muestra la solución anterior en un De la suspensión, tomar 1.0
y pasarla a un matraz vaso de licuadora estéril o mL y transferirlo a un tubo de
Erlenmeyer que pasarla a una bolsa de ensayo que contenga 9.0 mL
contenga 90.0 mL de Stomacher y homogeneizar agua peptonada, agitar y
durante 10.0 seg en el caso de repetir esta operación tantas
una solución la licuadora a velocidad veces como diluciones sean
amortiguadora de mínima, ó 30.0 seg en el necesarias. Se debe utilizar
fosfatos de pH 7.2 ó Stomacher a una velocidad una pipeta estéril para cada
agua peptonada al 0.1%. normal. Esta es la dilución dilución.
primaria.

Realizar una tinción

Realizar una tinción de húmeda para mohos con
Gram para la colorante de lactofenol
Vertir las cajas y
azul de algodón, para un
observación examen microscópico y
colocarlas en la
microscópica de las incubadora a 25±1°C.
una posible identificación
levaduras obtenidas. de los mohos que se
hayan desarrollado.

Describir las
características
macroscópicas y
microscópicas
observadas, de los
mohos y/o levaduras
desarrollados a partir de
la muestra analizada.
V. RESULTADOS
Las diluciones seleccionadas fueron 1:10. Después del tiempo de incubación se observó el crecimiento en
las placas con medio agar papa dextros, la siguiente tabla muestra los resultados obtenidos:
Tabla 3. Resultados de la siembra del hongo “Colletotrichum” (chirimoya - Annona cherimola Mill) y
“Fusarium” (tortilla con hongo).

NÚMERO DE Dilución AGAR + RESULTADO

CAJA MICROORGANISMO (Observación en placa)
SEMBRADO
1 1:10 Agara papa dextrosa/
Hongo Fusarium

2 S/D Agar papa dextrosa /

Colletotrichum

3 S/D Agar papa dextrosa /

Colletotrichum
 Resultado
(Observación al
microscopio
tinción “Azul de
algodón” 40x)

Hongo “Colletotrichum” Hongo “Fusarium”

Vl. DISCUSIÓN DE RESULTADOS.

En base a la tabla número 3 en donde se muestran los resultados obtenidos de la siembra de dos diferentes
microorganismos en condiciones de esterilidad se infiere que las buenas prácticas de laboratorio fueron
correctamente aplicadas, ya que los medios analizados no tuvieron ningún tipo de contaminación y a su vez
se obtuvo el crecimiento esperado de ambos hongos, por consecuencia, también se muestran las
observaciones al microscopio.
De acuerdo al estudio de tesis realizado “Aislamiento e identificación de Fusarium spp. a partir de granos de
trigo. Relación entre ocurrencia de la especie y la incidencia de la enfermedad”. La clasificación morfológica
en el género Fusarium se basa en las características macro y microscópicas del cultivo. El tipo de micelio
aéreo, pigmentación y tasa de crecimiento de la colonia, así como la ausencia o presencia de esporodoquios,
esclerocios o estroma en diferentes medios son características básicas de identificación. El color que
desarrollan depende de la especie, y puede ser blanco, crema, rojo, purpura, etc. El micelio aéreo suele ser
abundante.
Las especies del género pueden producir tres tipos de esporas asexuales llamadas macroconidios,
microconidios y clamidosporas. El macroconidio es la espora principal en la caracterización. Su forma y
tamaño varían según la especie Los macroconidios pueden originarse a partir de estructuras especializadas.
El microconidio es un carácter taxonómico primario y se considera su presencia o ausencia. Si está presente
las características consideradas son forma, modo de formación, si están solos, en falsas cabezas, cabezas
o cadenas. Pueden formarse en el micelio aéreo a partir de mono o polifiálides pero no en esporodoquios.
Otros caracteres taxonómicos primarios son clamidosporas, conidióforos y mesoconidios.
A partir del aislamiento del hogo Fusarium obtenido de tortilla, se obtuvo una cada Petri inoculada con una
dilución 1:10, de acuerdo a la identificación por características morfológicas de las colonias en cultivo y
microscópicas. Las características de las colonias tenidas en cuenta en cultivos crecidos en medio de cultivo
fueron tasa de crecimiento, pigmentación y tipo de micelio aéreo. Obteniendo como resultado la tabla 1.4 La
caracterización microscópica llevada a cabo en el cultivo de mostro que el macroconidio observado era largo
y delgado y microconidio ausente.

Tabla 1.4 Características de las colonias de aislamientos de Fusarius spp. crecidos en medio de
cultivo

Hongo Tasa de crecimiento Pigmentación Micelio aéreo

Fusarium Rápido Reverso verdoso. Algodonoso abundante
Superficie blanca
Vll. CONCLUSIÓN
Se confirmó la presencia de hongos en los alimentos adquiridos de acuerdo a los diferentes criterios de
identificación de la especie La integración de los resultados morfológicos y moleculares nos permitieron
identificar las especies de Fusarium. Las buenas prácticas de laboratorio correctamente aplicadas fueron
útiles en la caracterización de las especies, necesariamente debieron acompañarse de las técnicas de
morfología en la utilización de los análisis.
Siguiendo la NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-111-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. MÉTODO PARA
LA CUENTA DE MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS, donde la cantidad conocida fue en una dilución
de 1:10 en agar papa dextrosa, incubado a una temperatura de 25 ± 1°C, se obtuvo como resultado el
crecimiento de colonias características para este tipo de microorganismos.

Bibliografía
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegón, M.Palao, B.Serrano y O.Velázquez. (2009). Facultad de Química, UNAM. Obtenido
de Facultad de Química, UNAM.: http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Tecnic-Basicas-Coliformes-en-
placa_6528.pdf

Características. (2018). Características. Obtenido de Características: https://www.caracteristicas.co/levadura/

Carrillo, B. (2007). UNSA. Obtenido de UNSA: http://www.unsa.edu.ar/biblio/repositorio/malim2007/3%20mohos.pdf

Ciudad, U. A. (Agosto de 2012). Universidad Autónoma de Ciudad. Obtenido de Universidad Autónoma de Ciudad:
http://www.uacj.mx/ICB/UEB/Documents/Hojas%20tecnicas/INTRODUCCION%20A%20LOS%20HONGOS.pdf

LAB, M. (2018). MCD LAB. Obtenido de MCD LAB:

http://www.mcdlab.net/Fichas%20Tecnicas/Agar%20Bilis%20y%20Rojo%20Violeta.pdf

Microali. (27 de Octubre de 2008). Micro de los alimentos. Obtenido de Micro de los alimentos:
http://mikroalimentos.blogspot.mx/2008/10/coliformes-totales-y-fecales.html

Salud, S. d. (1994). Secretaria de Salud . Obtenido de Secretaria de Salud :

http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/111ssa14.html

Salud., S. d. (1994). Secretaría de Salud. Obtenido de Secretaría de Salud.:

http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/113ssa14.html

UNSA. (2007). UNSA. Obtenido de UNSA: http://www.unsa.edu.ar/biblio/repositorio/malim2007/4%20levaduras.pdf

Vázquez, Sylvia; O´Neill, Selva; Legnani, Marcela. (Septiembre de 2013). Obtenido de

http://www.montevideo.gub.uy/sites/default/files/importancia_de_los_coliformes_en_los_alimentos.pdf