UNIVERSIDAD RAFAEL LANDIVAR

FACULTAD DE INGENIERIA

"CINETICA DE LA FERMENTACION ALCOHOLICA

DE JUGO DI, ' .CAA POR LA Saccharomyces
L48Q.

ERWII

ENJERO QUIMfCO

BILcyj

GUATEMALA, JUNIO DE 1985

1 LR'O r

1 F
DF, L LIOTECA
 CONSEJO DE LA FACULTAD DE INGENIERIA

DECANO Ing. Carlos Vela Schippers

VICE-DECANO Ing. Pierre Castillo Contoux
SECRETARIO Ing. Fernando Ceballos Chacn
DIRECTOR INGENIERIA
QUIMICA INDUSTRIAL Ing. Ricardo Garca Martnez
DIRECTOR INGENIERIA
MECANICA INDUSTRIAL Ing. Jorge Mario Rodas Figueroa
DIRECTOR INGENIERIA
CIVIL ADMINISTRATIVA Ing. Pierre Castillo Contoux
DIRECTOR INGENIERA
INDUSTRIAL Ing. Jorge Nadalini Lemus
COORDINADOR
CARRERAS CORTAS Ing. Alejandro Basterrechea
REPRESENTANTES DE
CATEDRATICOS Ing. Hctor Lemus Ortega
Ing. Jorge Matzdorf
REPRESENTANTE
ESTUDIANTIL Br. Leonel Pinot

TRIBUNAL QUE PRACTICO EL EXAMEN

PRIVADO DE TESIS

Ing. Ricardo Garca Martnez

Ing. Jos Francisco Calzada M.
Ing. Julio Chvez Montfar

ASESOR DE TESIS
Dra. Sheryl Schneider de Cabrera
Ing. Carlos RoIz Asturias
 INSTITUTO CENTROAMERICANO DE
JJ INVESTIGACION Y TECNOLOGIA INDUSTRIAL
(ICAITI)
CRNTRAL AMERICAN RESARCH INSTITUIR FOR INOUSTRY
COSTA RICA
A,W. L. R.f.. 4.47. Zo.. 10 1552
L SALVADOR
GUATEMALA GUATEMALA, C. A.
reo
HONDURASTEL EF0JOS IC65l
NICARAGUA 37a6d

Seores
-1
Miembros del Consejo
Facultad de Ingeniera
Universidad Rafael Landvar
Ciudad

L
Su referencia Fecha de su carta Nuestra referencia Fecha
1A51/1/01 10 mayo 1985

Asunto: Trabajo de tesis

Seores Miembros del Consejo:

Por este medio comunicamos a ustedes que hemos asesorado el trabajo de

tesis: CINETICA DE LA FERMENTACION ALCOHOLICA DE JUGO DE CAA POR LA CEPA
Saccharomyces cerevisiae L-180 A DOS TEMPERATURAS, desarrollado por el estu-
diante Erwin A. Cordero Gonzlez para optar al ttulo de Ingenierio Qumico
Industrial.

En nuestra calidad de asesores, procedimos a supervisar el trabajo de

revisin bibliogrfica, la realizacin prctica y la elaboracin del Informe
Final de Tesis que resume lo efectuado por el seor Cordero Gonzlez y llegamos
a la conclusin de que dicho trabajo es una fuente de informacin til e impor-
tante para trabajos posteriores relacionados con el campo investigativo.

Es por tanto, nuestra opinin que dicho Informe de Tesis sea aprobado,
procedindose posteriormente a su impresin y divulgacin.

En espera de que ustedes queden igualmente satisfechos con el presente

trabajo, quedo

Muy atentamente,

S de Cabrera Carlos Roz"\

Jefe, Seccin de Microbiologa
Divisin de Investigacin Aplicada
_'I
Jefe, Divisi6 de Investigacin Aplicada
)

C)tICI tas nro tOA LIS Df 1. ICA111IPI.

C4:C,WO de I.,J.,..td::. 1.. fl.o&N.;6, Sok..,,.o de C6'o, de A.o&. N:cro le Ce.00 * Se
110 IddAoI,.; 551 I:.j._*, ATAD; J;.o.oe.,. CADIN
st. lego. AM Ir; C,:, PiCA AP. Ib, 5114 SALVADOR EJ 5&.OlA A b.40JME'.'A!A AP <. I5S'jrtCjAL;A.t,.d,,,. AP 115t T.Tf.NAJi';a

Miembro de lo Comisi6n Panamericana de Normas Tcnicas, COPANT

E URL1 VISTA HERMOSA fl ZONAS APARTADO Pc.r.i. .Rc.
TELS.: 6.2,5, AL 66
$12651 AL 25 - $62755 AL 65
CANtE: UNILANO.
FACULTAD DE INGENIERIA

Reg. No. I-329,.85

26 de Junio de 1985

Seor
Erwin Cordero Gonzlez
Presente

Estimado seor Cordero:

A continuaci6n me permito transcribir a usted el punto Segundo del Acta

No.12-84 de la sesi6n celebrada por el Consejo de la Facultad de Ingeniera
el da 20 deJuniode]. corriente ao, el cual literalmente dice:

SEGUNDO: "Con base al informe rendido por la terna examinadora del Examen
Privado de Tesis del estudiante Erwin Cordero Gonzlez, se autoriza la impre-.
s j n del trabajo titulado "CINETICA DE LA FERNENTACION ALCOHOLICA DE JUGO DE
CAA POR LA CEPA SACCHAROMy CES CEREVISIAE L-180 A DOS TEMPERATURAS".

Atentamente,

CL C.
Ing. Fernando Ceballos Chac6n
SECRETARIO
FACULTAD DE INGENIERIA

FCCH/oc
cc.Arch.(1)
 DEDICO ESTA TESIS

A DIOS

A MIS PADRES: Jos Augusto Cordero Ovalle

Aurora Stelia Gonzlez de Cordero

A MI HERMANA: Wilma Stelia

A MIS ABUELITOS: Leopoldo Baldomero Gonzlez

Victorina Cruz de Gonzlez
Q.E.P.D.

A MI FAMILIA

A MIS AMIGOS Y COMPAEROS DE ESTUDIOS

 RECONOCIMIENTO

Deseo expresar mi reconocimiento a mis Asesores Dra.

Sheryl S. de Cabrera e ng. Carlos Roiz, quienes con su experien
ca y conocimientos contribuyeron a alcanzar los objetivos
de este trabajo.

A las Autoridades y al Personal del Instituto Centroame-

ricano de Investigacin y Tecnologa Industrial, ICAITI, bor
la ayuda y facilidades que me dieron durante la realizacin
del presente trabajo.

A la Licenciada Mara del Carmen S. de Arriola, por

su colaboracin e inters en el desarrollo de este trabajo.
 INDICE

Pgina
1. Resumen .................................................................1
II. Introduccin ............................................................3
III. Antecedentes ...........................................................5
IV. Justificaciones ........................................................ 15
V. Objetivos .................................................................17
VI. Hiptesis ..................................................................19
VIL Aspectos Metodolgicos ............................................21
VIII.Resultados ...............................................................33
IX. Discusin de Resultados ..........................................41
X. Conclusiones ............................................................47
XI. Recomendaciones ..................................................... 49
XII. Referencias ..............................................................51
XIII.Anexos .....................................................................59
 1. RESUMEN

El objetivo principal de este trabajo es estudiar

el comportamiento cintico de la cepa Saccharomyces cere-
visiae L-180 a dos temperaturas (35 y 37 0C), utilizando para
ello dos modelos cinticos previamente establecidos, as
como tambin determinar los rendimientos de etanol y biomasa
en un medio de concentracin inicial de sustrato del 10%
utilizando tasas de dilucin de 0.072, 0.100, 0.150, 0.200,
0.300 y 0.400 h 1 , a dichas temperaturas.

Las ecuaciones cinticas obtenidas son una sencilla

generalizacin de la ecuacin de Monod, una que toma en
cuenta el efecto inhibitorio por etanol y que est dada
por:

r = k (1 CR/CR-). [C A CC/(C L C M)] (b)

Y la otra ecuacin que relaciona la concentracin

del alcohol con el tiempo de residencia en el reactor y
que est dada por:
CR_ CRO
k' T' =
CR C RO[ R/C]..Cco)(1 _CR/CR*)

Para la determinacin de las constantes cinticas,

la ecuacin anterior toma la forma siguiente:

Iog T= Iog k'-- n Iog C R*/(C * . -CA)

Los valores promedio encontrados para las constantes

cinticas de la 'ecuacin "b" son:

Para 35
k = 0.245 h' 1 , C M = 2.939 gIl, C R* = 133.55 gIl.

Para 37C:
k=0.186h 1 , C M = 1.538g/I,C * = 128.55 g/.

Los valores promedio encontrados para los constantes

cinticas de la ecuacin "i" son:

1
Para 350C:
k' = 0.510 h,n = 5.095 y CR* = 133.55 gIl.
Para 37C:
k' = 0.353 h 1 , n = 4.671 y CR* = 128.55 gIl.
Para 39 oc
k' = 0.321 h, n = 2.824 y CR* = 89.13 g/l.

Los aspectos importantes encontrados con relacin al

cultivo continuo son: Para aumentos en la temperatura se
presenta en general una disminucin en el recuento total,
concentracin de etanol, viabilidad, sustrato consumido
y peso seco, mientras que para aumentos en la tasa de
dilucin se presenta una disminucin en la concentracin
de etanol, sustrato consumido y rendimiento de etanol.
Para los dems parmetros analizados un aumento o disminu-
cin en sus valores depende de la combinacin que se haga
entre temperatura y tasa de dilucin.
 II. INTRODUCCION

La fermentacin de azcares con levadura, el proceso

qumico sinttico ms antiguo empleado por el hombre, sigue
siendo de enorme importancia para la preparacin de alcohol
etlico y ciertos otros alcoholes (37).

Los azcares provienen de varias fuentes, principalmen-

te de las melazas de la caa de azcar o del almidn que
se obtiene de varios granos. En el presente trabajo se
utiliza el jugo de caa o guarapo clarificado.

La fermentacin se puede realizar por medio de sistemas

por tandas o continuos. Este ltimo permite instalaciones
de plantas mucho ms pequeas y un costo ms bajo en el
producto producido.

Para los paises poco o no productores de petrleo

representa una alternativa econmica, mediante la cual
se pueden producir combustibles a partir de productos
renovables (18, 49).

Este trabajo pretende estudiar la cepa Saccharomyces

cerevisiae (L-180) en dos aspectos diferentes, tales como:
la produccin de etanol empleando diferentes tasas d
dilucin (0.072, 0.100, 0.150, 0.200, 0.300 y 0.400h')
y su comportamiento cintico a dos temperaturas.

3
 III, ANTECEDENTES

Para la mejor comprensin del presente estudio, se

considera conveniente presentar una breve descripcin de
lo que son las fermentaciones alcohlicas, su cintica
y algunas investigaciones afines.

1 Definicin:

Las fermentaciones son reacciones qumicas catalizadas

por sistemas multienzimticos, producidos por microorganis-
mos, en los cuales, una sustancia orgnica se transforma
en uno o ms productos (30, 34).

La fermentacin alcohlica es caracterstica de varias

levaduras, en la cual la molcula de glucosa de seis tomos
de carbono se escinde en dos molculas de etanol, dos tomos
de carbono (C 2H5 OH) y dos molculas de CO2 (24). Este
proceso fue descrito desde 1815, por la ecuacin de Gay-
Lussac (44):

C6H 1206 _________ 2 C 2H5OH + 2 CO2

2. Las Levaduras:

Son organismos unicelulares de tamao entre 5 y 10

con una amplia variedad de formas: esfricas, ovoide,
elipsoidal, cilndrica, filamentosa, etc. Su estructura
interna presenta rganos celulares tpicos. El ncleo
est bien definido y rodeado por una membrana; es decir,
las clulas de las levaduras son eucariticas (38), y su
reproduccin puede ser sexual y/o asexual. Su reproduccin
sexual se realiza por medio de produccin de esporas
(ascosporas), mientras que la asexual por gemacin o por
fisin binaria (10).

3. Efecto de la temperatura sobre la Produccin de Etanol:

Utilizando levaduras de destilera, Windisch y cola-

boradores, han realizado ensayos con diferentes temperaturas
de fermentacin, demostrando que la temperatura ptima
de produccin de alcohol se encuentra en el rango de 24-
37oC. Es importante notar que dentro de ese rango no existe
una diferencia significativa en el nivel de etanol alcanzado
en 48 horas de fermentacin (62, 63).

5
4. Cintica de la Fermentacin alcohlica:

La cintica de la fermentacin se interesa por las

tasas de sntesis de clulas y/o formacin de producto
de fermentacin, y el efecto del medio ambiente en esas
tasas. El estudio de la cintica no necesariamente se limita
al desarrollo de poblaciones y productos. Tambin considera
las clulas destinadas a morir.

Las dos metas del estudio de cintica de la fermenta-

cin son incrementar la productividad de los procesos por
tandas y optimizar el diseo y operacin de los procesos
de fermentacin continua (34).

Se hacen dos tipos de ensayo para obtener datos

cinticos stos son: los sistemas de cultivo dinmico o
por tandas y los sistemas continuos o de estado estable.
Debido a la facilidad con que se pueden hacer los experimen-
tos en frascos agitados, la mayora de datos cinticos
son del tipo por tandas. La dificultad con los experimentos
por tandas es que las condiciones del medio ambiente cambian
continuamente, por consiguiente, es difcil comprender
los eventos en un nivel molecular y desarrollar un
atendimiento real de la cintica. Esto no quiere decir,
sin embargo, que los modelos cinticos que derivan de
experimentos por tandas no son tiles. Realmente, la mayora
de fermentaciones comerciales son efectuadas en forma de
tandas (1). No obstante, las fermentaciones continuas
permiten fijar ciertos parmetros como lo son: temperatura,
tasa de dilucin, pH, nutrientes y otros.

4.1 Tasas y Rendimiento

Rendimiento:

El crecimiento y la formacin de producto por

microorganismos son procesos de bioconversin en los cuales
los nutrientes qumicos que alimentan a la fermentacin
son convertidos a metabolitos y masa celular. Cada una
de estas conversiones puede ser cuantificada por un
coeficiente de rendimiento como la masa celular o producto
formado por unidad de masa de nutriente consumido, Y xis
y Y p, g de clulas y producto, respectivamente (60).

Tasas Volumtricas:

Las tasas de fermentacin pueden ser definidas en

dos bases diferentes, la primera de las cuales es la base
volumtrica, expresada como g de producto producido/litro-
hora, g de sustrato utilizado/litro-hora o g de clulas
producidas/litro-hora (34).

Tasas Especficas:

La segunda base para expresar las tasas de fermentacin

es la base especfica, la cual puede ser definida como
la tasa de cambio de concentracin por unidad de materia
celular. Para determinar la tasa especfica se divide, la
tasa volumtrica en un instante por la densidad bacteriana.
Los trminos volumtricos desaparecen y las unidades tpicas
son: g de producto producido (etanol)/g de clulas-h (que
es la tasa de productividad especfica), g de sacarosa
utilizada/g de clulas-h y g de clulas producidas/g de
clulas-h. Esta ltima es la tasa specfica de crecimiento
(..4) y usualmente expresada como h

De las dos bases mencionadas, las tasas especficas

se prefieren para la cintica y otros estudios fundamentales
de la fermentacin, en las que son ms significativas y
reveladoras de actividad celular (34).

4.2 Modelos cinticos de varias fermentaciones

Se han propuesto muchos modelos para relacionar la

tasa de crecimiento a la concentracin de sustrato, pero
el modelo de Monod es el ms comnmente empleado (16, 25,
42, 59). Este modelo considera el efecto de una concentra-
cin sustrato-lmitante, S, en la tasa especfica de
crecimiento del microorganismo considerado (35), fijando
algunos datos experimentales mucho mejor que otros (57).

En el cultivo continuo al haber logrado un estado

estable, la edad media de la clula permanece constante
(60).

Powell estudi terica y experimentalmente la distri-

bucin de edad en las clulas de una poblacin bacteriana
(42). Si bien su estudio no fue orientado especialmente
a la interrelacin entre la edad de la clula y la actividad
enzimtica, sus conocimientos en distribucin de tiempos
de generacin de clulas en un sistema desarrollado, es
importante para algn estudio cintico de fermentacin.

7
 Shu introdujo un nuevo concepto de edad. El prob
correlacionar la tasa de formacin de producto con la
distribucin de la edad en cultivo de clulas individuales,
ms bien que con estados fisiolgicos de cultivos como
un todo (52).

Kobayashi y col., siguiendo el concepto de edad de

Shu, trataron de asignar condiciones de cultivo a la
levadura con una "edad aparente" (24). En suma, el trmino
"edad acumulativa media", que fue introducido por Aiba
y colaboradores, ser til relacionando las actividades
de enzimas, a la cintica de formacin de producto (4).

Al estudiar el desarrollo exponencial concurrente

y muerte de las poblaciones de clulas de Saccharomyces
cerevisiae, van Uden y col., sugieren ciertos modelos
adicionales que contribuyen a la cintica dl crecimiento
en el rango de temperatura superptima. Dichos modelos
satisfacen los resultados experimentales obtenidos (56).

Powell, declar en una ecuacin compacta la complejidad

de la relacin entre la tasa especifica de crecimiento
y la concentracin del nutriente-limitante:

Y Q S

donde, Y representa el factor de rendimiento, S es

una funcin de la concentracin del nutriente-limitnte
y Q es el factor cintico definido por el estado fisiolgio
de la poblacin (43, 57), Cuando fueron comparadas las
tasas mximas de crecimiento de levadura Saccharomyces
cerevisiae y de etanol, en una serie de fermentaciones
por tandas de glucosa a niveles de pH controlados, se not
que a un pH mayor (aproximadamente 6), di la tasa ms
alta de crecimiento de levadura, mientras que a un pH menor
(aproximadamente 5) di la tasa mayor de sntesis de etanol
(5).

El estudio cintico de inhibicin de producto en

fermentaciones continuas y por tandas realizado por. Aiba
y colaboradores, presenta valores medios de II / =0.35 y
15 .35 50 bajos compBdos con
Y =0.10. Los valores, de Y
e' valor terico de 0,51, debido a que el crecimiento de
clulas fue apreciable (2).

8
 Takehiko Kono estudi la cintica del crecimiento
de clulas microbianas derivando para sto la ecuacin
de tasa de crecimiento de microorganismos,, desde el punto
de vista de las reacciones qumicas (25, 26).

Con respecto a la muerte termal en levaduras, van

Uden realiz fermentaciones en las cuales determin ciertos
parmetros (tasa especfica de muerte termal, energa libre
de activacin, calor de activacin, entropa de activacin)
en 10 especies de levaduras, cuyas temperaturas mximas
variaron de 22 a 49 C, concluyendo que los datos obtenidos
en su trabajo sugieren una correlacin entre las funciones
de temperatura de la muerte termal y las temperaturas
mximas para el crecimiento. Tambin presenta estudios
con levadura sobre la compensacin termodinmica en la
muerte termal microbiana (55, 59).

Las poblaciones microbianas de ecosistemas naturales,

que son expuestas por largos perodos de tiempo a temperatu-
ras superptimas de crecimiento, estn limitadas por una
temperatura mxima de crecimiento, la cual podra ser menor
que la tempe-atura de crecimiento mxima final, medida
en el laboratorio en cultivos por tandas. Para poblaciones
microbianas con caractersticas termales de levaduras
mesofilicas, la temperatura ptima de crecimiento llega
a ser la temperatura mxima efectiva para el crecimiento
cuando uno o ms nutrientes tienen concentraciones suficien-
temente bajas (51).

Flolzberg y col., realizaron un estudio cintico de

la fermentacin alcohlica de zumo de uvas presentando
una serie de ecuaciones para uso en el diseo de procesos
continuos en la elaboracin de vino y encontraron que para
concentraciones de etanol mayores que 26 g/l hay una
definida relacin lineal entre la tasa especfica de creci-
miento y la concentracin de producto (20). Las ecuaciones
que presentaron son, para la cintica del crecimiento en
la fase estacionaria:

dP/dt = B(P m - P)

y para el crecimiento en la fase exponencial,

dP/dt + BP = A(ln n/.i..) - C

 donde, B, C son1 constantes de proporcionalidad en
(gibO cc-h ), (h ) y (gibO cc) respectivamente. N es
la concentracin de clulas (nmero total/cc); P concentra-
cin de producto (g/100 cc), P = S./1.96; S. la concentra-
cin inicial de sustrato (g/00 cc y constante de la
tasa especfica de crecimiento en h (20).

Bazua y Wilke encontraron una concentracin lmite

de etanol para concentraciones alrededor de 70 gil, ms
all de la cual las clulas no crecen ni producen etanol.
Las ecuaciones empleadas que dan una desviacin estndar
aceptables son:
u =u -aP/b - P)
max o
y = y o - a' P/(b' - P)
max
donde a y a' son constantes empricas en h, b y b'
constantes empricas en gil, P es la concentracin de
producto (gil), P valor promedio de P en los ensayos
continuos (g/l), Umax tasa especfica de crecimiento mxima
(h'), u tasa especfica de crecimiento mxima a P = O
(h) y vmax la tasa especfica de produccin de etanol
mxima, y
tasa especfica de produccin de etanol mxima
0 1
aP=Oenh (6).

Finalmente, Levenspiel muestra como tratar la ecuacin

de Monod, en una forma directa para diferentes tipos de
fermentadores (de flujo en pistn, por tandas y flujo de
mezcla) usando el lenguaje general de la ingeniera de
las reacciones qumicas (29).

5. Fermentacin Continua

5.1 Generalidades:

La fenntaci6n continua se inici a principios del siglo XX,,

cuando las levaduras de forrajes fueron producidas por
procesos continuos.

El cultivo continuo de microorganismos es una

herramienta poderosa para revelar reacciones metablicas
microbianas y el crecimiento puede mantenerse por largos
periodos de tiempo. Los sistemas de cultivo continuo se
pueden usar para estudiar el comportamiento del estado

10
estable y no estable (1).

Para que un cultivo continuo tenga xito es necesario

contar con ciertos mtodos de control de nutriente y
traslado de clulas en relacin a una poblacin constante.
Hay para sto dos mtodos conocidos:

a) Quimostato
b) Turbidostato

En el quimost.ato el cultivo siempre se desarrolla

a tasas de crecimiento menores que la mxima y con una
fisiologa anloga a la fase de desaceleracin del cultivo
por tandas; las clulas tienen un desarrollo limite por
el suministro de nutriente.

E1 turbidostato difiere fundamentalmente del quimos-

tato, en que la poblacin crece a la tasa mxima posible,
a las condiciones dadas y con un tipo de medio, con una
filosofa equivalente a la fase exponencial del cultivo
por tandas; los nutrientes no limitan la tasa de poblacin de clulas (17).

5.2 Aspectos sobre Rendimientos:

La mayora de fermentaciones continuas estudiadas

se han llevado a cabo usando un nutriente que limite el
crecimiento, para controlar la actividad del microorganismo
de inters. El nutriente limitante es aquel material el
cual, cuando est sujeto a un cambio de concentracin,
afecta el crecimiento, consumo de sustrato y formacin
de producto de cultivo de microorganismos (1).

Las siguientes ecuaciones consideran tres tipos de

rendimientos a saber:

Rendimiento de Crecimiento

Yx/s = _X/S

Rendimiento de Producto basado en la masa celular

Yp/x =tP/X

11
Rendimiento de Producto basado en la concentracin de
sustrato:

Y15 =

donde,

X = concentracin de masa celular

S = concentracin de sustrato limitante
P = concentracin de producto (etanol)

De las definiciones anteriores se tiene (1):

Y =Y Y
p/s xis p/x
6. Otros Estudios

Roiz describe un nuevo proceso para producir etanol

a partir de caa de azcar denominado "EX-FERM". Consiste
en la extraccin y fermentacin de la sacarosa en la caa
de azcar con cepas adecuadas, de levadura, con ciclos
repetitivos hasta obtener el nivel de etnol deseado (45).
Para la cepa Saccharomyces cerevisiae L-18O obtiene niveles
de etanol de 3.05'/, para el primer ciclo 'y 4.67% para el
segundo ciclo (47).

Haciendo experimentos en frascos en ICAITI, utilizando

la tcnica Ex-Ferm para producir etanol de caa de azcar,
se obtuvo una produccin de etanol de 1.29 a 4 g/100 cc
en el primer ciclo y 4.27 a 5,37 g/100 cc en el segundo
ciclo empleando para sto 37 tipos de Saccharomyces (48).

Bose y Ghose, declararon que en la fermentacin de

jugo de caa es necesario agregar nitrgeno inorgnico
para asegurarse rendimientos de etanol adecuados (9).

Guilln e Imeri, utilizando cinco cepasde Saccharomyces

cerevisiae, en un medio de azcar al 5%, estudiaron la
productividad de etanol en cultivo continuo, estableciendo
que las cepas ms adecuadas para producir etanol son las
cepas L-208 (19) y L-180, L-181 (22).

La cepa L-180 demostr un comportamiento similar a

33 y 36 0 c. A 39 C hubo conversin de azcar a etanol por
esta cesa, a tasas bajas de dilucin, corno por ejemplo
0.167 h , pero no a tasas mayores (19, 22).
12
7. Nomenclatura

Tasa de produccin de clulas, en g/1-h

r =
k= Constante de la tasa de reaccin de la
ecuacin "b", en h1
CR=R=p= Concentracin de etanol, en g/l

CR* = Concentracin lmite de producto inhibitorio

o concentracin de producto a la cual la
fermentacin termina, en g/l
n = Poder txico
CA=Sf= Concentracin final de sustrato, en g/l
CC=C=x= concentracin de clulas (peso seco o biomasa)
en g/1
CM Constante de Monod, concentracin de sustrato
donde la tasa ( r C) es la mitad de la mxima,
en g/1
= Constante de la tasa de reaccin de la
, -1
ecuacion ,,1u , en h
Tiempo de residencia del fluido en el reactor,
en horas
CRO Concentracin inicial de etanol, en g/l
Cco Concentracin inicial de clulas, en g/l

13
 IV, JUSTIFICACIONES

1. Cada vez ms, se acredita el inters por estudiar

la cintica de la fermentacin alcohlica, en cultivos
continuos.

2. Debido a que la temperatura es un factor que repercute

en los costos por enfriamiento del sistema, es
importante establecer la ms adecuada para su funciona-
miento, como tambin ver que tan alta puede ser, sin
que sta tenga un efecto negativo sobre el proceso.

3. Experiencias anteriores establecen que la cepa L-180,

es buena productora de etanol a 33 y 36 C. El estudiar
en ms detalle el comportamiento de esta cepa
proporciona resultados para un estudio de ms fondo
de la cintica de la cepa Sacc.haromyces cerevisiae
L-180. Se escogen las temperaturas de 35 -a 37. C por
ser las ms prximas a la temperatura mayor empleada
en estudios del comportamiento de esta cepas

4. Estudios anteriores han usado medios sintticos; el

uso de jugo de caa representa para la agroindustria
nacional, una alternativa econmica de producir combus-
tibles a partir de productos renovables.

5. Los resultados son de importancia para la implementa-

cin y desarrollo del proceso Ex-Ferm

15
 V. OBJETIVOS

Estudiar la cintica de la cepa Saccharomyces cerevi-

siae L-.-180 a dos temperaturas y determinar la productividad
de etanol y biomasa en dichas temperaturas, en fermentacin
continua.

17
 VI. HIPOTESIS

Utilizando la cepa Saccharomyces cerevisiae L-180,

se espera que:

1., A la menor tasa de dilucin (0.072 h ), se obtendr

un mayor rendimiento de etanol (g/l).

2. A la menor temperatura (35 C) se obtendr una mayor

productividad de etanol (g/l).

3, Habr una relacin proporcional de la temperatura

y la tasa de dilucin empleadas, con respecto a la
produccin de etanol.

4. A la temperatura de 35 0 se obtendr una mayor produc-

tividad celular que a la temperatura de 37 C considera
da.

5. Se observar un incremento en la produccin de biomasa

(g/l) cuando se emplee la menor temperatura (35 C).

6. A temperaturas mayores de 37 oc, la cepa no es capaz

de crecer y fermentar a tasas de dilucin altas.

19
 VII. ASPECTOS METODOLOCICOS

1. Universo del Trabajo

Lo constituye la cepa L-180 procedente de Central

Bureau vor Schimmel-Cultures Yeast Division, Delft, Holanda
(Saccharomyces cerevisiae CBS 2959) (46).

Dicha cepa se escoger tomando en cuenta experiencias

anteriores, que demostraron su buena productividad de etanol.

2. Medios

Recursos Humanos

Personal Tcnico de la Divisin de Investigacin

Aplicada, ICAITII y el suscrito; con la asesora de la Dra.
Sheryl S. de Cabrera y el Ing. Carlos Rolz. As como tambin
la colaboracin especial de la Licenciada Maria del Carmen
S. de Arriola.

2.2 Materiales

2.2.1 Materiales y Equipo:

a. Fermentador: Fermentador Modul-ar marca Gallenkam

FBL-200-W.
b. Microfermentador: Marca New Brunswick Scientific
Inc.
C. Espectrofotmetro: Spectronic 20, Bausch & Lomb.
d. Cromatgrafo de gases: Marcha Perkin Elmer 990, modelc
7127 A, con graficador Hewlett-Packard.
e. Tele-termmetro, YSI modelo 42 SC.
f. Potencimetro: Cole Parmer (CHEMCADET), modelo 5983.
g. Centrfuga: International Refrigerated Centrifuge,
modelo B-20.
h. Autoclave
i. Horno: Weber Electric Oven
j. Congelador
k. Refrigerador
1. Microscopio
M. Incubadora
n. Cmara Neubauer
. Pipeta Thoma
o. Balanza

21
p. LAB-LINE Pyro-Magnestir No. 1266
q. Magnetos
r. Refractmetro Brix
S. Jeringas
t. Hornillas con condensadores 24/40 y simples
u. Mecheros
y. Pinzas
w. Asas
x. Cristalera en general

2.2.2 Composicin de los medios:

a Medio de cultivo inicial (al 10%) para fermentacin
continua

Extracto de levadura 4.00 g

KH2PO4
0.48 g
Na2HPO4 0.07 g
Solucin A 4.00 cc
Solucin B 4.00 cc
Jugo de caa clarificado y
centrifugado 758.00 cc
Agua destilada 234.00 cc

Solucin "A":
CaO 1.12 g
ZnO 0.40 g
FeCl3.6H20 5.40 g
MnCl,. .4H20 1.00 g
CuCl . 6H0 0,17 g
H3B03 0.06 g

Solucin "B":

MgO 10.10 g
HC1 concentrado 45.00 cc
Agua destilada 1.00 1

b. Medio de cultivo inicial para fermentacin por tandas

Extracto de levadura. 20.00 g

KH2P0 0.24 g
Na2HPO4 0.04 g

22

Solucin A 10.00 cc
Solucin B 10.00 cc
Jugo de caa 1.00 1

Sacarosa 120.00 g

c. YMS:

Extracto de levadura 3.00 g

Extracto de malta 3.00 g
Peptona 5.00 g
Sacarosa 10.00 g
Agar 20.00 g
Agua destilada 1.00 1

Medio de cultivo para el inculo

Extracto de levadura 12.50 g

Extracto de malta 31.00 g
Sacarosa 125.00 g
Agua destilada 1000.00 cc

e. Solucin salina estril: NaCl

8.50 g/l
de agua destilada

f. Agua de dilucin: Solucin amortiguadora de fosfato

de Butterfield: Para preparar el agua de dilucin,
se toma 1.25 cc de la solucin concentrada y se lleva
a volumen de 1 litro con agua destilada; se reparte
en volmenes de 99 cc, y se esteriliza a 121 C por
15 minutos.

Solucin concentrada:

KH2PO4 34.00 g

Agua destilada 500.00 cc

Ajustar a pH 7.2 con solucin de hidrxido de sodio,

completar el volumen a 1 litro y guardar.

2.2.3 Reactivos:

a. Etanol absoluto
b. Solucin de sulfato de cobre

23
 C. Solucin de tiosulfato de sodio 0.1 N
d. Almidn
e. HC16Ny1N
f. Yoduro de potasio

2.2.4 Colorantes:

Azul de metileno al 0.025% (w/v), en solucin Ringer

(27).

a. Composicin e la solucin:

Azul de metileno 25.00 mg

NaCl 900.00 mg
KC 1 42.00 mg
CaC1 20 48,00 mg
NaHC3 20.00 mg
Glucosa 1000.00 mg
Agua destilada 100.00 cc

3. Procedimiento

3.1 Esterilizaci6n:

El equipo de fermentacin 0al igual que el medio

utilizado sern autoclaveadosa 121 C. por 25 minutos (8).

3.2 In6culo:

El inculo deber ser reciente (no ms de 24 horas).

En un tubo de cultivo conteniendo Agar YMS en forma
inclinada, se dejar crecer el microorganismo, agregndole
de 10-15 de solucin salina estril para llevarlo y luego se
traspasar . al fermentador en condiciones aspticas (8,
44).

En la fermentacin por tandas se inocularn 6

Erlenmeyers de 500 cc que contendrn 100 cc del medio de
cultivo, colocndolos luego en la incubadora a una tempera-
tura de 35 C con una agitacin de 350 rpm dlit'ante 20-24
horas. Al cabo de este periodo se traspasan al fermentador
tomando en cuenta todas las condiciones aspticas requeridas.

3.3 Condiciones de ensayo

24
3.3.1 Temperaturas: 35 y 37 0
3,3.2 Tasas dediluci6n: 0.072, 0.100, 0.150, 0.200, 0.300
y 0.400 h
3.3.3 Aereacin: O cc/min
Agitacin: 300 rpm
3.3.5 Fuente de Carbono: Jugo de caa clarificado
3.3.6 Volumen del fermentador en condiciones continuas:
400 cc
3.3.7 Volumen del fermentador por tandas: 5000 cc

3,4 Mtodo para fermentacin continua:

Se inocula el fermentador que contiene 400 cc de

medio estril, y se fijan las condiciones de ensayo (tempe-
ratura, aereaci5n, agitacin), dejando que el inculo crezca
por un periodo de 4 horas con una aereacin de 400 cc/mm.

Luego de sto se inicia la alimentacin continua

con la tasa de dilucin menor. Las condiciones de cultivo
continuo se establecern despus de algn tiempo, siendo
sta para la tasa de dilucin de 0.072 h'= 42 horas, para
0.100 h' = 30 horas, para 0.150 h = 20 horas, para
0,200 h' = 15 horas, para1 0.300 h' 10 horas y para la
tasa de dilucin de 0.400 h = 8 horas.

Establecidas las condiciones continuas se muestrea

cada 30 minutos, midiendo la densidad ptica (que determina
la concentracin celular, X, g/l) con el espectrofotmetro,
para asegurarse el estado continuo en el fermentador. Si
no variara la concentracin celular despus de 2 o 3
muestreos, se habrn establecido las condiciones continuas
requeridas (6).

Se toma la muestra en una botella de dilucin conecta-

da a la manguera de salida del fermentador, metida en un
bao de hielo, obteniendo aproximadamente 50 cc de muestra,
determinndosele el pH.0 Se centrifugaran luego 30 cc de
muestra a 10,000 rpm y 4 C durante 10 minutos.
La concentracin de etanol y anlisis de azcares
totales se determinan en el sobrenadante (11, 31) y el
residuo que queda servir posteriormente para la determina-
cin de la biomasa por el mtodo de peso seco (46).

25
 Al establecerse las condiciones continuas se verifica-
rn en el fermentador, las condiciones de ensayo correspon-
dientes.

Para el conteo de levaduras se utilizar una pipeta

Thoma y cmara Neubauer, tomando la muestra en la salida
del fermentador (27).

3.4.1 Mtodo para fermentacin por tandas:

Al fermentador que contiene 5 litros de medio estril

se le inocula y fijan las condiciones de ensayo
correspondientes. Se-. tomarn muestras del cultivo madre,
medio estril sin inocular e inmediatamente despus de
ser inoculado (10-15 mm). Luego se tomar muestra cada
hora hasta 16-20 horas y de ah cada 4-6 horas hasta
cumplirse 50 horas de fermentacin. Se har un recuento
directo despus de 60 minutos de haber inoculado el
fermentador y luego una vez cada cuatro horas.

Utilizando pipetas graduadas y estriles se obtendr

aproximadamente 50 cc de muestra, los cuales se recibirn
en un beaker puesto en un bao de hielo: 0 luego se tomar
el pH, centrifugado despus 30 cc a 4 C y 10,000 rpm
durante 10 minutos.

El sobrenadante servir para anlisis de alcoholes

y azcares totales, mientras que el precipitado se usar
para el anlisis de peso seco (11, 31, 60).

El conteo de levaduras se realiza con los 20 cc

restantes, utilizando el mtodo del hemocitmetro (Ver
inciso 3.5.3).

3.5 Mtodos Analticos

33.1 Medicin de la densidad ptica:

Se utilizar el espectrofotmetro Spectronic 20 a

una longitud de onda de 580 nm, midiendo la transmitancia
de la muestra, utilizando en este caso agua destilada como
blanco. Se prefiere leer el porcentaje de absorbancia cuando
la concentracin celular es baja (7).

3.5.2 Peso Seco:

26
 El residuo, que se obtendr de la centrifugacin
de 30 cc de muestra de cada ensayo, se lava 3 veces con
solucion salina estril y se seca en el horno a 60-80 oC,
durante 48 horas. El tubo que ser previamente tarado,
se pesar despus de 15-20 minutos de estabilizacin en
una desecadora, repitiendo este proceso hasta que el peso
seco sea constante. Obtenindose luego el peso seco en
g/l.

3.5.3 Conteo de levaduras por el Mtodo del Hemocitmetro

(27, 61):

Se tomar la muestra con una pipeta Thoma, utilizando

como lquido de dilucin una solucin de azul de metileno
al 0.025% en solucin Ringer (la cual suministra el mejor
medio para mantener la viabilidad de las clulas de
levadura).

Se agita bien y se descartan las tres primeras gotas,

colocando la cuarta gota en la cmara Neubauer. Al observar
la cmara a travs del microscopio las levaduras viables
sern incoloras y las no viables de color azul.

Clculo:

Nmero de clulas/cc = C.C. x F.D. 1 x F.C. x F.D.2

donde:

C.C. = Promedio de clulas contadas

F.D. 1 = Factor de dilucin si se emplea botella de dilucin

F.C. = Factor de conversin de milmetros cbicos a centme-

tros cbicos (10)

F.D. 2 = Factor de dilucin de la pipeta de Thoma

3.5.4 Determinacin de Etanol:

La concentracin de etanol se determinar por medio

del cromatgrafo de gases Perkin-Elmer 990, que cuenta
con un detector de ionizacin de llama y una columna de
acero inoxidable de 6 pies de largo por 1/8" de dimetro

27
interno, empacado con Poropak "Q" de 100-120 mesh. Las
condiciones a fijar sern:

Temperatura de la columna 120

Temperatura del detector 185 C
Temperatura de inyeccin 150
Flujo de nitrgeno 30 cc/min
Flujo de hidrgeno cc/min
Flujo de aire cc/min
Atenuacin 32
Rango x 10
Velocidad del papel 6.35 mm/mm
Cantidad inyectada .:..60 pl

Se prepara una curva de calibracin, para la cual

se hacen soluciones patrn con etanol al 0.2, 0.4, 0.6,
0.8 y lg/100 cc, que se inyectan en cantidades de 0.6 M1'
se traza una grfica de altura contra concentracin, reali-
zando un anlisis de regresin lineal a los datos para
mayor exactitud; bajo este anlisis se cuantifican todas
las muestras. Se hacen las diluciones respectivas de las
muestras y se inyectan 0.6 Akl en el cromatgrafo, por
triplicado preferentemente. Se toma un promedio de las
lecturas de las muestras en el cromatograma y se utiliza
el anlisis de regresin anterior, para obtener la
concentracin de etanol a partir de la ecuacin siguiente:

P = P xF.D. x D x 10
1 e
Donde, P es la concentracin de g/l de etanol, P la
concentracin de etanol encontrada de acuerdo a" anlisis
de regresin lineal, F.D. el factor de dilucin empleado
y De la densidad del etanol (31).

3.3.5 Determinacin de Azcares totales:

Se miden los grados Brix a las muestras . , con el

refractmetro Brix, para determinar si se hacen diluciones
o se toma una alcuota directa. Luego se procede de acuerdo
al mtodo de Luff-Schoorl, el cual consiste en tratar la
muestra con reactivo de !ehling y determinar despus, por
titulacin con solucin valorada de tiosulfato de sodio,
la cantidad de xido cuproso obtenida por reduccin del
complejo de cobre en la solucin de Fehling (11).

28
3.5.6 Control de Aereacin y Agitacin:

Se hacen directamente en los medidores del fermentador,

33.7. Determinacin de la Temperatura:

Se utiliza el tele-termmetro YSI colocado en el

fermentador.

3.58 Determinacin de pH:

Se medir a la muestra. recolectada, con el potencime-

tro.

3.6 Determinacin de la Cintica del Proceso:

A partir de los datos obtenidos en los distintos

ensayos de fermentacin, a las condiciones de operacin
correspondientes, se calculan las ecuaciones cinticas,
de acuerdo al tipo de las de Monod, siguiendo el estudio
presentado por Levenspiel (29), en el cual se utiliza la
siguiente ecuacin bsica en el lenguaje general de reacto-
res qumicos:

r = k C A CC / ( CA + CM) (a)

Donde r es la tasa de produccin de clulas; CA la concen-

tracin de sustrato, C es la concentracin de clulas;
CM es la constante Monod, la concentracin de sustrato
donde la tasa (re ) es la mitad de la mxima y k es la
constante de tasa 'e reaccin que se determina grficamente.

Para la influencia del producto inhibitorio se tiene:

k (1 - C R /CR*) . (CACC/(CA + CM)) (b)

r
Siendo CR la concentracin de producto (etanol); CR* es
la concentracin lmite de producto inhibitorio y n el 1.
poder txico, que se evala al igual que la constante k,
por un mtodo grfico.

La ecuacin anterior, se utiliza en aquellos procesos

de fermentacin en los cuales no hay recirculacin de

29
clulas, y la alimentacin se encuentra libre de clulas.

La ecuacin del comportamiento bsico para reactores

de flujo de mezcla en estado estable y la cintica se
calcula con la siguiente expresin:

V = C., salida Cj entrada (c)

r.
i, a la condicion de salida

En la que:
= Tiempo de residencia del fluido en el reactor, en
Fi
V = Volumen del reactor, en 1
y = Tasa de flujo volumtrico del fluido dentro y fu
ra del reactor en estado estable, en 1/h
C. = Concentracin de algn reactante o producto,
en g/l
r. = Tasa de reaccin de algn reactante o producto,
en g de producto formado/1.h

Para el caso en que la CACM el agotamiento en sustrato

no disminuye la tasa de reaccii5i, por lo tanto,

CA/(CA + C)_J

y la ecuacin "b" se reduce a la cintica independiente

de sustrato e inhibicin de producto puro, como sigue:

r = k (1 - CR/CR)n. CC
(d)

En el presente estudio se hace una sencilla asuncin

para el tratamiento cintico de los datos, y es, que para
cada unidad de sustrato consumido se producir la misma
cantidad de clulas (biomasa) y de producto R, en todas
las condiciones. Por lo tanto,

rri (e)
= C C - C CO = dcc
rR J
d CR

30
(CR) es el rendimiento, as se asume que los rendimientos
permanecen sin cambios para cualquier sistema, lo cual
es una asuncin razonable, que concuerda con la de otros
investigadores (6).

Para encontrar las constantes cinticas de la ecuacin

se combina la ecuacin "b" con "c" y reordenando se tiene:

1 CM \/1 1
+
k(1 - CR /C R*) [(k(1 - CR/CR)n

con C0 = O.

Si se grafica 7-contra l/CA se pueden obtener CM

k(1 - CR/CR*); y conociendo CR* que se evala a partir
de los ensayos de fermentacin por tandas (vase fig.' 9).
Se pueden encontrar n y k fcilmente tambin con una grfica
de log fk(1 - C R /CR* ) hh ] contra log (1 - Cp/CR*), en donde
el valor de la pendiente corresponde a n y el del intercepto
al log k.

La expresin del comportamiento bsico que relaciona

la entrada con la salida en un reactor de flujo de mezcla
es la ecuacin "c", si se sustituye en sta la ecuacin
y se transforman todas las concentraciones en CR por
medio de la ecuacin "e", se tiene:

CR CRO
g)
( CR - CRO + (R/C) CCO) (1 -

Para el caso especial en que C = O, o donde la aJiintaci6n

entra libre de clulas, se tiene:

O (h)

31
 Si se grafica CR contra k'rse podr ver que el lavado
en el reactor ocurre a = 1 y que la tasa mxima de
produccin depende de una manera sencilla de CR* Y fl

Para encontrar las constantes cinticas de este

experimento, primero se evala CR*.(de ensayos por tandas),
usando un exceso de sustrato y permitiendo que t-+oo.
Reordenado la ecuacin "h" se tiene:

logT'= -log k' + n 1.og ( CR* / ( CR* - CR)) (1)

Si se grafica iogcontra log ( CR*/CR* - CR) se pueden

obtener las constantes cinticas de la reaccin, siendo
la pendiente igual a n y el intercepto a -log k'.

En el presente estudio s las ecuaciones "b" y

representan los modelos cinticos para la fermentacin
de la cepa Saccharomyces c.erevisiae L-180 ensayada,

32
 VIII. RESULTADOS

Los resultados del presente trabajo se obtuvieron

a partir de la fermentacin alcohlica de jugo de caa
por la cepa Saccharomyces cerevisiae L-180, utilizando
dos tipos de ensayo: el sistema de cultivo dinmico o por
tandas y el cultivo continuo. El sistema por tandas se
hace bsicamente para determinar la concentracin mxima
de etanol, arriba de la cual ya no existe ninguna actividad
por parte de las clulas y la fermentacin cesa. Dichos
ensayos se realizaron a las temperaturas de 35 y 37
para el caso del cultivo continuo se emplearon tasas de
dilucin de 0.072, 0,100, 0.150, 0.200, 0.300 y 0.400
h . Los resultados del cultivo continuo representan la
media aritmtica de dos determinaciones realizadas para
cada ensayo.

Los resultados para el cultivo continuo a la tempera-

tura de 35 C se presentan en el cuadro A.1-1., para 37
C en el cuadro A.1.-2. En el cuadro A.1.-3 se presentan
los resultados para una temperatura de 39 oc, los cuales
no se estudiaron a fondo debido a que a tasas de dilucin
altas se presentaron condiciones de lavado en el fermenta-
dor, sin embargo, estos resultados se consideran importantes
puesto que permite seleccionar temperaturas ms adecuadas
para este tipo de procesos fermentativos.

El efecto de la tasa de dilucin y la temperatura

en las clulas viables, recuento total, rendimiento y
productividad de etanol para el cultivo continuo se indica
en la figura 1; este efecto, de la tasa de dilucin y la
temperatura, en la sacarosa final, concentracin de etanol
y biomasa se presenta en la figura 2.

Los resultados para el sistema por tandas a las

temperaturas de 35, 37 y 39C se presentan en los cuadros
A.2-1, A.2-2, A.2-3, A.2-4, A.2-5 y A.2-6. Estos resultados
se presentan sin efectuar la media aritmtica de las
determinaciones realizadas para cada ensayo.

El efecto del tiempo de fermentacin y la temperatura

en la sacarosa consumida, alcoholes y produccin de biomasa
(peso seco) para el cultivo por tandas, se presenta en
las figuras 3, 4, 5, 6, 7 y 8.

33
 El efecto del pH tanto en el cultivo continuo como
en el cultivo por tandas vari de acuerdo a lo indicado
en los cuadros A,1-1, A.,l-2, A1-3 y A.2-6. Sin embargo,
se mantuvo relativamente constante

1. Recuento total y Viabilidad celular:

A la menor temperatura considerada (35 C) as como

tambin a la menor tasa de dilucin (0072 h) en condi-
ciones de cultivo continuo, se presenta un mayor nmero
de clulas por centmetro cbico, mientras que si se aumenta
la temperatura (37 y 39 C) y la tasa de dilucin (OdOO,
0150, O200 0300 y 0400 h) el nmero de clulas por
centmetro cbico tiende a disminuir tal y como se indica
en los cuadros A01-1, A01-2 y A.l-3

Con respecto a la viabilidad celular se puede notar

que existe un mayor nmero de clulas/cc a la menor tempera-
tura y a la menor tasa de dilucin Se presenta un
comportamiento variable para aumentos tanto de temperatura
como de tasas de dilucin; esto se indica en los cuadros
A,l-1, A1-2 y AJ-3; grficamente se presentan en las
figuras la, lb y lc,

A la mayor temperatura considerada (39 C) se pudo

observar el mayor porcentaje de clulas no viables, vase
cuadro A.l-3.

Para el sistema de cultivo por tandas, el recuento

total y la viabilidad de las clulas presentan un comporta-
miento variable, tal y como se indica en los cuadros A.2-
1 y A2-2,

2. Peso seco:

Para el sistema de cultivo continuo, se presenta

a una temperatura de 37 C y una tasa de dilucin de 0072
la mayor concentracin celular (biomasa), disminuyendo
sta a tasas de dilucin mayores. A una temperatura de
35 C se presenta el. mismo comportamiento pero menor
concentracin celular comp g rado con la producida a 37 C.
Para la temperatura de 39 C, el comportamiento es similar,
excepto para las tasas de dilucin de 0.100 h' en las
cuales el comportamiento es variable. Estos resultados

34
se indican en los cuadros A.1-1, A,1-2 y A.1-3; grficamente
estos resultados se muestran en las figuras 2a, 2b y 2c.

La concentracin celular (peso seco o biomasa) en

el sistema de cultivo por tandas a las diferentes condi-
ciones de temperatura y tiempos de fermentacin, es baja
las primeras horas, aumenta a un mximo y luego decrece
horas de fermentacin mayores. Esto se indica en el cuadro
A.2-3; grficamente este comportamiento se muestra en las
figuras 3y 4 Sara una temperatura de 35 0C, en las figuras
5 y 6 para 37 C y en las figuras 7 y 8 para 39 C.

3. Concentracin de etanol:

La concentracin de etanol es mayor a la menor tasa

-1 o
de dilucion y menor temperatura (0.072 h y 35 C),
disminuyendo cuando se aumenta tanto la tasa de dilucin
como la temperatura en el cultivo continuo, vase los
cuadros A,1-1, AJ-2 y A,1-3. En el sistema de cultivo
por tandas, a la menor temperatura y medida que aumenta
l tiempo de fermentacin, aumenta la concentracin de
etanol, tal y como se indica en el cuado A.2-4, tambin
grficamente en las figuras 3 y 4 para una temperatura
de 35C, en las figurs 5 y 6 para 37 C y en las figuras
7 y 8 para 39C. Se encontr adems que la concentracin
de etanol a la cual la fermentacin se inhibe (CR*) fu
para 35 C: 137.2625 y 129.8300 g/l; para 37 C de 129.9123
y 127.19 g/l, y para 39 C de 85.1916 y 93.0732 g/l.

4. Consumo de sustrato:

El consumo de sacarosa disminuye al aumentar la tasa

de dilucin para el sistema de cultivo continuo, teniendo
un comportamiento variable para aumentos en temperatura,
tal y como se indica en los cuadros A.l-1, A,1-2 y A.1-
3.

Para el sistema por tandas el consumo de sacarosa

tiene un comportamiento similar, disminuye a medida que
el tiempo de fermentacin aumenta, como se indica en el
cuadro A.2-5, figuras 3, 4, 5, 6, 7 y 8 correspondientes
cada una a las temperaturas de ensayo.

35
S. Rendimiento de etanol y biomasa,:

El coeficiente de rendimiento de etanol presenta

una tendencia a disminuir con el aumento de la tasa de
dilucin y la temperatura. Sin embargo, para la temperatura
de 35 C y las tasas de dilucin de 0.300 y 0.400 h
aumenta a valores de 0.362 y 0.495 respectivamente. Para
el caso de las temperaturas de 37 c y 39 c el comporta-
miento es similar, el coeficiente disminuye con aumentos
en la tasa de dilucin. El rendimiento promedio para 35
c fue de 0.343, para 37 C de 0.254 y para 39 c de 0.142.

El coeficiente de rendimiento de biomasa aumenta

de acuerdo al aumento de la tasa de dilucin para la
temperatura de 35 C; para 37 y 39 c el comportamiento
es variable y depende de la combinacin temperatura-tase
de dilucin; los valores promedio obtenidos para cada
temperatura son 0.067, 0.063 y 0.019, respectivamente (vase
los cuadros ,A.1-1, A.1-2 y A.1-3). Graficamente este
comportamiento se puede observar en las figuras la, lb
y lc.

6. Productividad de etanol:

La tendencia general de la productividad de etanol

es de disminuir con el aumento de la tasa de dilucin y
la temperatura; sin embargo, para la cepa L-180 considerada,
este comportamiento varia y depende de la combinacin de
la tasa de dilucin y temperatura empleada. Esto se puede
observar en los cuadros A.1-1, A.1-2, A.1-3 y en la figura
1. La productividad ms alta obtenida de 1.500 g/1/h fue
a la temperatura de 35 C empleando una tasa de dilucin
de 0.300 h*

7. Cintica de la fermentacin;

De acuerdo a la generalizacin hecha por Levenspiel

(29) de la ecuacin de Monod, que incluye situaciones de
inhibicin por producto, se adaptaron dos ecuaciones. La
primera que representa el proceso de fermentacin realizado
incluyendo el efecto de inhibicin por etanol, y la segunda
que relaciona la concentracin de producto (etanol) con
el tiempo de residencia en reactores de flujo de mezcla.

36
 Las constantes cinticas de la ecuacin "b", indicada
en el captulo de Aspectos Metodolgicos, se encuentran
graficamnte como se muestra a manera de ejemplo en la
figura 9. Para el presente estudio se aplica regresin
lineal a los datos que se indican en los cuadros A.3-1
y A.3-2.1 Del anlisis de estos datos se obtiene para 35
k = 0.245 h, CM = 2.939 g/l; para 37 C k = 0.186h,
CM = 1.538 g/l.

Debido a que hay concentracin limite de etanol (CR*),

por arriba de la cual la fermentacin cesa y adems que
la constante "n" toma en cuenta este efecto, se puede
aproximar a este limite de varias maneras. Para el presente
estudio una aproximacin lineal es satisfactoria, tomando
en cuenta las condiciones de ensayo bajo las que se realiz
el experimento, es decir, "n" ser igual a uno.

Tomando en cuenta que se realizaron dos determinacio-

nes para cada temperatura, las ecuaciones obtenidas para
35 C en trminos de la produccin de clulas (biomasa)
son:

= 0.245 ( 1_CR 137.2625)1CA/(CA. + 2.939)3

r = 0.245(1 - CR/129.83) 1 CA/(CA + 2939)]

La ecuacin promedio para esta temperatura siempre

en trminos de la produccin de biomasa es:

r =0.245 (1 - CR/133.5460) {A'A + 2.939)]

En trminos de la produccin de etanol, la ecuacin

promedio para 35 C es:

r = rC f = 1.45 (1 - CR/133.546 ) [CA / ( CA + 2.939)]

Para la temperatura de 37 C, las ecuaciones en

trminos de la produccin de biomasa son:

r = 0.186 (1 - CR /129.9123 ) [cA/(cA + 1.538)]

37
 r = 0.186 (1 - CR /127.19) [ cA/cA + 1.538)1

La ecuacin promedio para esta temperatura:

r = 0.186 (1 - cR/128.5512)[CA/(CA + 1.538

En trminos de la produccin de etanol, la ecuacin promedio

para 37 C es:

r =rtR/C]= 0.712(1- CR/ 128.5512)[cA/(cA + 1.538)]

Las propiedades de la ecuacin "i" se muestran en

las figuras 10 y 11 las cuales muestran que para 35 C
7
el tiempo de lavado ( -lavado) es igual a 1.249 h y 1.243
h siendo el tiempo de lavado promedio ( 'flrom.) igual a 1.246
h; y la concentacin de etanol ptima de 21,89 y 21.93
g/l siendo CR = 21.91 g/l, y el tiempo de residencia ptima
del fluido en el eactor de flujo de mezcla de 2.498 y
2.485 h, siendo el opt. = 2.492 h.

Para 37 C, Tlavado = 1.239 y 1.236 h, Tprom. =

1.238 h; cR opt. = 22.67 y 22.67 g/l; CR opt. = 22.67
g/l y el tiempo de residencia ptimo 7opt. = 2.477 h y
2.472 h,lopt.. = 2.475 h.

A una temperatura de 39 0 el tiempo de lavado es de 1.169

y 1.185 h, Ylavado = 1,177 h. CR, opt. = 23.276 y 23.327
g/l; CR opt = 23.302 g/l, y finalmente Topt = 2.337
y 2.369 ' h y el promedio que corresponde a Topt. 2.353
h.

La ecuacin !g? representa otra generalizacin de

la ecuacin de Moriod, para la cual en el presente estudio
se toma el caso especial de la ecuacin "h", que ordenada
de una mejor manera para encontrar las constantes cinticas,
toma la forma de la ecuacin "1". Analizando los datos
presentados en los cuadros A.3-3, A.3-4 y A.3-5, y aplicn-
doles regresin lineal se obtienen los valores de las
constantes cinticas. Vase la figura 12 a menra de
ilustracin. Para la temperatura de 35 c, n= 5.27 y 4.92;

38
k = 0.5117 y 0.5087 h' y los valors promedio iguales a:

n = 5.095 y k = 0.5102 h', Para 37 C, n= 4.73 y 4.61,

k = 0.3534 y 0.3531 h', siendo los valores promedio n=

4.67

y k 0.3533 h. Para 39 C, n.=2.66 y 2.99, k=O. 3204 y

-1 - 1
0.3222 h , los valores promedio de: n=2.82 y ;-0
.3213h -

8. Otros modelos:

El efecto inhibitorio de etanol en la levadura Saccha-

romyces cerevisiae en cultivo continuo bajo condiciones
en donde--la E6iEentracin de etanol se produce por la
levadura misma, se ha estudiado ampliamente (21) y se
puede representar por la ecuacin:
Kp
C
.(=R
K +C K +Y /(C -C)
S s P ps sf s

En el presente estudio se encontr que los valores de los pa

rmetros cinticos que se ajustan a dicha ecuacin son,para35
1.029 h', K 5=2.94 gil, K p = 5.19 gIl y Y =0.303.

Para 37 C:A= 0.60 h', K = 1.54 gIl, K=5.58 g/l

0.380.

Para el modelo propuesto por Monod (35) y que ha sido

ampliamente estudiado por medio de la ecuacin,

M =Yiax.

se obtuvo para una temperatura de 35 o .-, =0.244998

h yK
s
= 2.9389 gil, y para 37
Alax. h y

1.537 g/l.

39
 IX. DISCUSION DE RESULTADOS

La produccin de etanol as como tambin los efectos

inhibitorios en la levadura, se han estudiado ampliamente
en sistemas de cultivo continuo y en sistemas de cultivo
por tandas. El cultivo continuo permite que a una tasa
de crecimiento constante las levaduras crezcan por largos
perodos de tiempo, adicionando continuamente los nutrientes
necesarios y removiendo del fermentador el medio gastado
y las levaduras suspendidas. En el sistema por tandas esta
tasa de crecimiento no es constante, sin embargo los modelos
cinticos que derivan de ste son ampliamente estudiados
(4, 10, 15, 26).

El presente estudio se realiz en condiciones bajo

las cuales, la concentracin de etanol en el medio se
produjo por la levadura misma, lo cual concuerda con
trabajos realizados por algunos investigadores (2, 21);
con tasas de dilucin de 0.072, 0.100, 0.150, 0.200, 0.300
y 0,400 h y temperaturas de 35, 37 y 39 C las cuales
se escogieron tomando en consideracin experiencias ante-
riores que indican que bajo esas condiciones la levadura
Saccharomyces cerevisiae L-180 es una buena cepa productora
de etanol (6, 19, 2246).

A pesar de las variantes encontradas (con relacin

a la combinacin de temperatura-. tasa de dilucin), los
valores de recuento total y viabilidad fueron altos. Para
una temperatura de 35 C, los porcentajes de viabilidad
celular fueron superiores al 94%, para 37 c superiores
al 93% y para la temperatura de 39 C se pudo notar que
este porcentaje disminuy considerablemente, a valores
superiores de 71%. Bajo las condiciones de ensayo reali-
zadas, estos resultados son aceptables (35, 36).

En el sistema de cultivo continuo se encontr en

general, que al aumentar la temperatura se presentaba una
disminucin en la produccin de clulas (biomasa), para
aumentos en la tasa de dilucin los cambios observados
dependan especficamente de que combinacin se hiciera,
de esta tasa con la temperatura (15). Para el cultivo por
tandas el comportamiento que se muestra en la produccin
de biomasa es similar al reportado por algunos investiga-
dores, aumenta a las primeras horas de fermentacin alcanza
un mximo y luego comienza a disminuir (5, 8, 51).

41
 La concentracin de etanol es mayor a la menor tasa
de dilucin y menor temperatura, disminuyendo para aumentos
en cada una de estas variables, para el sistema de cultivo
continuo. Para el cultivo por tandas a la menor temperatura
y a medida que aumenta el tiempo de fermentacin aumenta
la concentracin de etanol, esto concuerda con estudios
realizados por otros investigadores (5, 15, 16, 62). es
importante hacer notar que el objetivo principal de los
ensayos de cultivo por tandas fue el de determinar la
concentracin mxima de etanol a la cual la fermentacin
termina. Los resultados promedio obtenidos resultaron ser
de 133.546 qi para una temperatura de0 35 C, de 128.551
g/l para 37 C y de 89,132 g/l para 39 C; los dos primeros
valores son bastante satisfactorios ya que comparados con
los reportados con otros investigadores son valores altos;
los de Bazua y Wilke de 93.1-93.84 g/l (6), Holzberg y
col. 68,5 g/l (20) y, Alba y colaboradores 76.4 g/l (2).
Los valores de concentracin mxima encontrados presentan
desviaciones bastante discretas, de 5,26, 1.92 y 5.57
respectivamente para cada condicin de ensayo. Los
resultados anteriores muestran que la cepa Saccharomyces
cerevisiae L-180 es bastante resistente a altas concentra-
ciones de etanol, lo cual la hace muy adecuada para usos
industriales.

Analizando los resultados del cultivo continuo se

nota que hay un mayor consumo de sacarosa a tasas de
dilucin bajas, disminuyendo l consumo con aumentos en
las tasas de dilucin; el efecto de las temperaturas sobre
el consumo de sacarosa fue variable y dependi de la combi-
nacin realizada de temperatura-tasa de dilucin, lo cual
concuerda con trabajos afines (4, 43, 51). Para el4sistema
de culttPb por tandas el consumo de sacarosa presenta el
mismo comportamiento, aumenta a medida que aumenta el tiempo
de fermentacin.

En el presente estudio los coeficientes de rendimiento

de etanol fueron bajos (el ms alto de 0.495 g/g) en
comparacin con el valor terico de 0.51 g de etanol/g
de sacarosa; experimentalmente se ha encontrado que los
valores de los coeficientes de rendimiento de etanol son
en general menores que el valor, terico. Esto se debe a
que parte del sustrato se puede usar para produccin de
biomasa y a que existe un tipo de inhibicin por produccin
no solo d etanol sirio de otros productos tales como: glicerol,

42


cidos orgnicos, aldehdos, steres o alcoholes superiores

(8, 49, 51, 54, 60).

Las ecuaciones cinticas propuestas en el presente

estudio son una generalizacin simple de la ecuacin de
Monod, desarrolladas por Levenspiel (29). La ecuacin "b"
representa el proceso de fermentacin y adems toma en
cuenta la influencia de producto inhibitorio y cuyos
resultados promedio, en trminos de la produccin de
biomasa,

r = 0.245 (1 - CR / 133.5460 ) [CA/(CA + 2.939)] para

35C
o
r = 0.186 (1 - CR/128.5512)[CA/(CA + 10538)]para

37 C

as como tambin las ecuaciones obtenidas en triUos de

la produccin de etanol,

rR = 1.45 (1 - CR /133.5460 ) CA/(CA + 2.939)] para 35 C

0,712 (1 - CR /128.5512 ) [CA/(CA + 1.538)] para 37

r
0
demuestran claramente que hay un limite definido de concen-
tracin (CR*) por arriba del cual el proceso de fermentacin
cesa, lo cual concuerda con estudios realizados por otros
investigadores (2, 20, 29). La asuncin realizada en la
ecuacin "b", con respecto a la constante emprica "n"
es adecuada, ya que "n" toma en cuenta el hecho de que
se puede aproximar al limite de concentracin mxima de
producto (CR*) de varias maneras: linealmente (n=l), con
una cada rpida en la tasa de reaccin seguida por un
acercamiento lento a la concentracin de producto (CR*,
n> 1); o viceversa (n<1); y adems concuerda con otros
investigadores que han utilizado al caso especial de la
ecuacin "b", en el cual se asume n=l, para fijar los datos
experimentales encontrando que los resultados que se
obtienen son muy satisfactorios (20).

43
 La otra ecuacin que se presenta para relacionar
la concentracin de producto (etanol) con el tiempo de
residencia en el reactor, est representada por la ecuacin
y expresa el comportamiento para el caso especial en
el que existe suficiente alimentacin o desarrollando
esta ecuacin se obtuvieron las ecuaciones "h" e "i". Las
propiedades de la ecuacin "h" se muestran en las figuras
10 y 11. Las constantes cinticas se obtuvieron a partir
de la ecuacin "1".

Los valores encontrados a partir de las figuras 10

y 11, que muestran que el mayor tiempo promedio de lavado
para la fermentacin a las distintas condiciones de ensayo
se obtuvo a una temperatura de 35 C (1.246 h) y el menor
a 39 C (1.177 h), concuerda con los resultados obtenidos;
y para la temperatura de 39 C con lo que se observ
experimentalmente, en el sentido de que las condiciones
de lavado que se presentaron influyeron para que en el
tratamiento cintico de los datos, no se considera la
aplicacin de la ecuacin "b". Para la temperatura de
35c, se comprueba que el tiempo promedio de lavado
concuerda con lo reportado utilizando condiciones de ensayo
similares (33).

Los resultados encontrados para las constantes

cinticas de la ecuacin "i", son bastante aceptables lo
cual concuerda con investigaciones afines, y la nica
diferencia en los valores obtenidos depende de la cepa
de levadura empleada (33).

Con la ecuacin "h", se demuestra que la tasa de

produccin mxima depende de una nErlera sencilla decR* y fl estos
resultados obtenidos se pueden comprobar con las expresiones
matemticas derivadas por Leverispiel y colaboradores (29),
en los que CR , opt. 7C n + 1 y para n=i, Tpt. 2 '1avado
R4'/
De estas expresiones cinticas, estudiadas muy poco
experimentalmente para diferentes tipos de cepas (33),
se deduce que los resultados obtenidos son bastante satis-
factorios, tomando en cuenta que el error que pudiera
existir se puede considerar mnimo puesto que depende ms
que todo de los mtodos analticos empleados, adems tomando
en consideracin las condiciones de ensayo bajo las cuales
se realiz este estudio.

44


La produccin de etanol por la Saccharomyces

cerevisiae e inhibida por producto (etanol), y eso ha
sido estudiado por varios investigadores (2, 4, 6). Los
resultados reportados en el presente estudio, empleando el modelo
cintico presentado por Hoppe y Hansford (21) para cultivo
continuo, son bastante aceptables para las condiciones
de ensayo utilizadas. Comparando estos valores con los
reportados en la literatura, para el efecto inhibitorio
de etanol, se nota que este modelo provee de una base
cintica para el diseo de procesos de fermentacin por
tandas y para procesos por lotes alimentados. Se facilitan
adems evaluaciones econmicas de diversos procesos
continuos que se realicen (vase el cuadro 1).

Cuadro 1.
Constantes cinticas para procesos de fermentacin.

Este Hoppey .iew '1Aiba y Bazua

trabajo ~f0,1 .&.,,kShoda Cysewski Pironti Wilke
(21) (14) (2) (13) 1 (40) (6)

o 30
c 35 37 30 28 30 35 35

u (h-1 1.03 0,60 0.64 0.31 0.43 0.58 0.26 0.

-1 4.9 15.5 0.
K (ql ) 2.94 1.54 1.54 -

K(g1) 5.19 5.58 5,58 20.6 55 5.0 13.7 40

0.30 0,38 0.38 0.39 0.35 0.44 0.47 0.

PS

Los resultados obtenidos para el modelo Monod, estu-

diado ya por muchos investigadores, son vlidos exclusiva-
mente para la cepa L-180.

45
 X. CONCLUSIONES

1. Los valores promedio de las constantes cinticas

de la ecuacin "b", pasa la cepa Saccharomyces
cerevisiae L-180, son a 35 C:

k = 0.245 h_ CM = 2.939 g/l, CR* = 133.55

g/l

A 37 C:

k = 0,186 h', CM= 1.538, CR* = 128.55 gIl

2. Los valores promedio de las constantes cinticas

de la ecuacin "i' t , para la cepa Saccharomyces
cerevisiae L-180, son a 35 C

= 0.510 h', n = 5,095, CR* = 133.55 gIl

A 37 C:

= 0,353 h', n = 4.671, CR* = 128.55 g/l

A 39 c:

k' = 0.321 h', n = 2,824, CR* = 89.13 gIl

3. Los valores de las constantes encontrados para las

ecuaciones cinticas corresponden a modelos matemti-
cos sencillos que correlacionan el crecimiento y
la produccin de etanol de la cepa L-180.

4. Existe un limite de concentracin de etanol (producto

inhibitorio) por arriba del cual la fermentacin
cesa y la Saccharomyces cerevisiae L-180 ya no es
capaz de continuar0 con sus actividades metablicas
normales. Para 35 C el lmite promedio es de 133.55
g/l, para 37 C de 128.55 g/l y para 39 C de 89.13
g/l.

5. La cepa L-180 cumple con las propiedades requeridas

de una Saccharanyces cerevisi para uso a nivel industrial: hbil
para efectuar una eficiente fenitacin alcohlica de az(icares,

47
 estabilidad de la cepa, viabilidad y ser capaz de
fermentar a altas concentraciones de etanol.

6. Durante el desarrollo del proceso de fermentacin

los valores de pH se mantuvieron relativamente
constantes

7. Para el cultivo continuo el aumento de la temperatura

y la tasa de dilucin provocaron una disminucin
en el consumo de azcar, produccin de etanol y
rendimientos. En relacin al recuento total, viabili-
dad y peso seco, los resultados obtenidos dependieron
de la combinaci6n hecha entre temperatura-tasa de
dilucin,

8. No se present ningn cambio aparente en la morfologa

de la levadura Saecharomyces cerevisiae L-180 asociado
con la inhibicin de etanoL

48
 XI.

La levadura L-180 resulta ser tolerante a altas

concentraciones de etanol, sera adecuado realizar
una fermentacin por tandas utilizando un medio de
concentracin inicial de azcares, mayor de 25% para
establecer as si los lmites de concentracin mxima
de producto (etanol) pueden ser mayores que los
reportados.

2. Bajo las condiciones anteriores realizar un estudio

ms completo de la cintica de inhibicin por sustrato
y por producto en el proceso de fermentacin, aplican-
do la ecuacin "b".

3, Investigar la adaptacin de la cepa L-180 a altas

concentraciones de etanol, seria la base para realizar
una nueva serie de experimentos, debido a que en
la produccin a nivel industrial son deseables las
altas concentracions de alcohol para tener una buena
economa en las torres de destilacin.

49
 XII. REFERENCIAS

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57
XIII. ANEXOS

59
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 Cuadro A.2-3. Datos de concentracin celular (peso seco), a las

temperaturas de 35, 37 y 39C.

PESO SECO X, en 9/1

Horas de Muestra
35C 37C 39C

0.25 1 '2166 4.97033 3.06667 1.66667 1.56667 1.80000

1 2 1. 8433 1.17000 2.00000 2.26667 1.29999 2.13333
2 3 2.1033 1.11000 2.76667 .2.33334 1.33334 2.53333
3 4 2.1533 1.55000 3.23334 3.33334 1.50000 4.00000
4 5 3.9900 2.29000 3.76667 4.86667 2.06667 4.23333
5 6 5.2666 4.43333 5.10000 5.03333 2.33333 4.93334
6 7 6.1200 4.96667 5.56667 5.78572 2.50000 6.10000
7 8 7.0000 7.34334 6.43333 7.36667 3.36667 7.30000
8 9 8.3733 9.03733 7.53334 8.76667 3.80000 8.53572
9 10 9.2233 10. 85334 9.23334 10.06667 4.43333 9.66667
10 11 10.3766 11.92667 10.76667 11.30000 6.33333 .11. 26667
11 12 11.1733 13. 41333 12. 03334 12.40000 6.86667 12.70000
12 13 12.2500 13. 75334 12.84375 13. 30000 7.00000 12. 70000
13 14 13.2566 13. 90334 13.40000 13.56667 7.06667 12.73333
14 15 13.2833 13. 70665 13.83334 15.10000 7.10000 12. 63335
15 16 13.3733 15. 35667 12.86667 14.26667 7.23333 10.93335
16 17 13.6900 14.17333 12.86667 13. 16667 7.26667 10.93335
17 18 14.0266 14.12334 12. 63334 12. 73334 7.73334 10. 70000
18 19 14.0666 13. 50667 12.13333 12. 46667 8.03333 10.43335
19 20 14.3066 13. 46667 11. 73334 12.16667 8.10000 10.16665
20 21 14.4833 13. 37667 11. 70000 11. 70000 7.53334 10.00000
21 22 16.0833 12. 86000 11. 43334 11. 23334 6.96667 9. 66665
22 23 17.4266 10.88000 11. 43334 11. 16664 6.93334 9.40000
23 24 12.9266 10.75334 10.50000 10.96667 6.90000 9.16665
24 25 -12.2900 9.76000 10.06667 10.26667 6.73334 8.73333
26 26 12.0300 9.35667 9.63334 9.70000 4.566651 6.56665
28 27 11.8133 8.73334 8.70000 8.33334
29 28 9.4535 8.52334 8.60000 7.53332
42 29 8.5066 7. 47334 6.96667 7.16667 4.40000 6.53333
45 30 8.0733 6.65667 6.66667 6.87000
48 31 5.5766 6.32000 6.63667 6.76667
50 32 3.3 6.05333 6.50000 6.46667

65
Cuadro A.2-4 Datos de Concentracin de Etanol, a las temperaturas de 35, 37

y 39C.

P, en g il -

Horas de Muestra
37C 39C
Fermenta No. 35C
clon

2.2199 2.5900 7.8040 6.3990 6.2901 5.3380

0.25 1
2 2.3542 2.7700 8.01970 8.0975 6.0735 6.0152
1
2 3 2.7571 3.2800 10.2317 8.1370 6.4539 6.1474

4 2.8045 3.300 15.2770 8. 2160 7.4751 7.2954

3
5 4.3843 5.4000 17.3871 8. 6900 7.9087 10.3778
4
5.4905 6.8500 18.7534 16.3925 9.9366 12.8557
5 6
7 7.7420 8.7300 28.1362 20.5400 12.7317 16.8333
6
8 12.4030 14.620 34.4732 23.4235C 14.2488 23.1363
7
9 14.8915 15.4400 46.0556 43.4500 14.3009 29.5958
8
10 16.9850 16.2500 50.6114 51.9425 16.3198 36.2898
9
11 19.9475 17.8600 51.1584 52.4560 22.7449 43.3757
10
12 25.7540 24.4300 60.8498 54.9050 28.1552 48.0731
11
13 26.9390 32.0100 62.1169 56.4850 34.5838 55.1199
12
14 34.0490 32.1600 72.6938 64.6220 37.8813 61.1484
13
15 40.6850 41.4400 73.9306 65.6293 40.0791 68.7043
14
16 41.7120 45.6200 74.2324 75.9980 45.4053 70.6616
15
17 43.4500 50.8700 74.2324 84.5300 51.0688 73.7939
16
18 44.2400 53.5400 75.7689 90.8500 57.7174 78.8835
17
19 47.0050 54.0600 76.8473 91.6400 60.7609 80.8407
18
19 20 50.8183 54.4800 81.9230 91.6400 63.0005 83.5800
20 21 60.7313 62.7100 82.5372 96.9725 63.7194 84.4806
21 22 101. 2188 75.1100 82.6913 99.1450 69.9762 84.7552
22 23 109.0200 92.5200 89.3056 100. 3300 71.6668 87.4945
23 24 119. 6850 101.3000 95.1516 105. 4650 76.3160 91.7388
24 25 123. 0425 111.6300 97.3971 105.8600 77.2462 92.1970
26 26 123.6350 114.6200 98.7500 106.2555 78.2179 92.6552
28 27 123.6350 115.0800 103.3024 106.4525
29 28 126. 4000 115.0800 104.6869 116 .1300
42 29 130.7450 118.3500 118.8377 117. 31 50 85.1916 193.0732
45 30 131.1400 121.6200 120.0682 124. 8200
31 131. 5350 122.9400 126.5781 125.8075
50 32 137.2625 129.8300 129.9123 127. 1900

66
Cuadro A.2-5 Datos de concentracin de Sustrato, a las temperaturas de 35,
37 y 39C.

Horas de Muestra

Fermenta- No. 35C 37C 39C
cin

0.25 1 248.6822 247.4056 242. 9928 248.2302 249. 0984 245. 689
1 2 239.1174 228.9515 222.6368 232.2518 205.7511 221.2825
2 3 214.9242 224.0670 221.5190 221.7644 177. 1654 200. 594
3 4 214.3067 219.1870 221.5100 211.3186 174. 5759 197. 376
4 5 211.6466 211.9284 216.5450 193. 1966 171.9902 195.399E
5 6 196. 3665 209.4420 199.3561 185.1560 171 .4988 154.525
6 7 183.1595 180.9853 175. 93 50 148.32 07 166. 9941 152.035
7 8 156. 3419 168. 3820 160.7757 128.2311 159. 4915 149.5465
8 9 156. 3419 153. 2612 148.3207 97.9021 157. 0167 142.017
9 10 128.9977 129. 8555 143.3121 94. 81 04 144. 5370 119.4539
10 11 112. 8484 120.4171 123. 3569 76.9231 139.5007 109.4891
11 12 92.5781 102.8636 107. 0039 67.1463 121. 9512 92.0097
12 13 75.2327 80.0628 99.5629 56.8071 114. 4666 81.927?
13 14 68.1795 72.5225 82.3004 48.7805 104.5211 63.8037
14 15 54.0731 58.0179 70.8661 37.8182 84.4391 61.8102
15 16 35.0473 45.9309 58.8235 31.7690 69.8908 60.8141
16 17 25.3909 36.2612 49.7804 21.1031 57.7090 51.5261
17 18 21.7232 31.4264 46.3931 16.3855 35.9877 43.1655
18 19 19.7484 22.0744 36.4078 10.5516 35.7920 35.9098
19 20 18.8072 14.0210 35.5867 5.7554 30.7692 37.0844
20 21 13.1654 8.3804 35.4411 5.5156 27.8177 34.3511
21 22 9.4037 7.7357 23.7026 4.0767 23.9808 33.5366
22 23 8.1502 5.1572 19.0170 3.8369 22.6481 33.2656
23 24 5.0154 2.5786 15. 20350 3.5971 20.8333 32.4544
24 25 3.4481 2.5786 14.9546 3.5971 20.0594 28.7770
26 26 3.1346 1.9339 7.6923 3.5971 18.7562 14.3885
28 27 2.5076 1.9339 7.6923 3.1175
29 28 2.5076 1.9339 7.6923 3.1175
42 29 2.5076 1.9339 7.1942 3.1175 6.4748 1 7.9239
45 30 2.5076 1.9339 7.1942 3.1175
48 31 1.8807 1.4504 7.1942 2. 87 77
50 32 1.8807 0.2417 7.1942 2.8777

67


Cuadro A.2-6 Datos de pH a las temperaturas de 35, 37 y 39C

pH
Tiempo de Muestra
Fermentacin, No. 35C 37C 39C
en Horas

0.25 1
1 2 5.55 5.25 5.45 5.45 5.40 5.35
2 3 5.40 5.20 5.40 5.45 5.25 5.35
3 4 5.35 5.20 5.40 5.40 5.20 5.35
4 5 5.30 5.20 5.35 5.35 5.10 5.30
5 6 5.20 5.20 5.20 5.25 5.00 5.30
6 7 5.09 5.00 5.10 5.10 5.00 5.10
7 8 5.00 4.90 4.90 4.95 4.90 5.00
8 9 4.95 4.85 4.80 4.85 4.80 4.81
9 10 4.89 4.80 4.75 4.80 4.70 4.80
10 11 4.85 4.75 4.70 4.75 4.60 4.80
11 12 4.80 4.70 4.65 4.90 4.50 4.70
12 13 4.75 4.70 4.60 4.90 4.40 4.60
13 14 4.70 4.70 4.60 4.70 4.40 4.60
14 15 4.70 4.70 4.60 1 4.70 4.35 4.55
15 16 4.70 4.70 4.60 4.70 4.30 4.55
16 17 4.65 4.70 4.60 4.70 4.35 4.50
17 18 4.65 4.70 4.60 4.50 4.35 4.50
18 19 4.65 4.70 4.60 4.60 4.20 4.40
19 20 4.65 4.65 4.60 4.60 4.30 4.40
20 21 4.70 4.65 4.60 4.65 4.80 4.40
21 22 4.70 4.75 4.60 4.75 4.80 4.50
22 23. 4.70 4.80 4.60 4.75 4.80 4.50
23 24 4.70 4.90 4.65 4.75 4.80 4.60
24 25 4.65 4.95 4.65 4.75 4.70 4.65
26 26 4.80 5.00 4.70 4.75 4.55 4.70
28 27 4.85 5.05 4.80 4.85 4.70 5.00
29 28 5.10 5.05 4.80 4.90
42 29 5.10 5.05 4.80 4.95
45 30 5.10 5.05 4.85 4.95
48 31 5.10 5.05 4.85 4.95
50 32 5.10 5.05 4.85 4.95

68


rl

ANEXO 3. DATOS PARA LA EVALUACION DE LA CINETiCA DE LA FERMENTACION

M .. y "k"
Cuadro A.3-1. Evaluacin de las constantes cinticas, "C

de la ecuacin b para 35C.

Y, CA. lIGA. CR. C (GR/CC) inter-

en horas en g il en hg en hg en gil pendiente

13.89 1.2038 0.83070 43.10 6.4444 6.68798 11.99709 4.08155

10.00 6.7400 0.48368 36.20 4.6667 7.75709
6.67 24.847 0.04025 28.60 4.0000 7.15000
5.00 30.960 0.03230 20.50 4.6667 4.39282
3.33 79.500 0.01258 15.00 2.3333 6.42866
2.50 108.387 0.00923 6.20 2.0000 3.10000

CR/CC = 5.92

Cuadro A.3-2. Evaluacin de las constantes cinticas, "CM y k' de

la ecuacin "b para 37C.

C, h/CA CR. C, (CR/CC) inter-

en horas en g il en 119 en g/l en g/l pendiente cepto

13.89 0.9670 1.03413 34.80 6.6667 5.21997 8.26047 5.37239

10.00 55.236 0.01810 34.00 6.0000 5.66667
6.67 64.334 0.01554 19.40 4.6667 4.15711
5.00 69.3508 0.01442 6.30 3.3333 1.89002
3.33 72.3585 0.01382 5.80 2.0000 2.90000
2.50 80.9248 0.01236 5.20 1.6667 3.11994

CR/CC = 3.83

69


Cuadro A.3.-3. Evaluacin de las constantes cinticas "n" y

k'"de la ecuacin U para 35C y duplicado

1 CR CR* log C R* 109

en horas log en gil en gilC'
C.R* - CR

13.89 1.14270 43.10 137.2625 0.16367 0.17521

10.00 1.00000 36.20 0.13296 0.14196
6.67 0.82413 28.60 y 0.10147 0.10807
5.00 0.69897 20.50 0.07025 0.07464
3.33 0.52244 15.00 0.05026 0.05332
2.50 i 0.39794 6.20 j 129.8300 0.02007 0.02125

Cuadro A.3-4. Evaluacin de las constantes cinticas n" y

"k" de la ecuacin U para 37C y duplicado

C R . J C R*91. log ICR* I109Ci*

en horas logr j en g/l J en 1
-
_R*- CRJJ
d

13.89 1.14270 34.80 129.9123 0.12541 0.13883

10.00 1.00000 34.00 0.13178 0.13508
6.67 0.82413 19.40 0.07024 0.07187
5.00 0.69897 6.30 0.02159 0.02206
3.33 0.52244 5.80 0.01984 0.02027
2.50 0.39794 5.20 127.1900 0.01774 0.01813

70


Cuadro A.3-5 Evaluacin de las constantes cinticas "n" y

o k'" de la ecuacin "1" para 39C y duplicado

Y, CR CR*
r
en horas logY en gil en gil 109LR* log R*
___
CR*CR

13.89 1.14270 37.10 85.1916 0.24833 0.22084

10.00 1.00000 32.00 0.20455 0.18297
6.67 0.82413 16.20 0.09160 0.08305
5.00 0.69897 6.90 y 0.03668 0.03345
3.33 0.52244 5.00 0.02627 0.02398
2.50 0.39794 0.50 93.0732 0.00256 0.00234

71
 3* e

e
e
2a los 1.0 ;
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O O 00 0 0
o .O w,O 6 0
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OO o 000 o
D. So h1 D. so
Flg.1. Y a 35 C FIS. lb . T = 37 c

O Rscu.uto
total (Al
I.1110
Viables
A.
- .Y PS
Gato'

! 4 * iO
X Prodscj%?
(PD)

!
Dod
D, so

FIgIc. 7 39 oC

FIgura 1. f seto do la t@sa de dllsc$a y la tsprature so si rscusiio

total 4 svod*uc, vlabl9dsd, rs,dI.lssto y productividad
4. taasl so .0ItIvo Coati....
72
 I0
6.0
loo

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o)
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D. seki D. en II1
FIg.zp.T.35C Rg. 2Ir e 37 'c

o Etasol
0
Sacarosa

o)
7 Piso seco

a?

ddd O d d

D. 99 k-
Fig.tc. T . 39 c
FIgura 2. Efecto di lo taso de dll.CI,n y lo t.mp.rotura en lo
concintroclon de etanol, sacarosa y biomasa (peso seco),
en cultivo coellnuo.
73
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79
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CM

Fique 9. Grfico para encontrar las consIatss d. weasda

generalizada di Mosod, s un reactor di flujo do
muda dods C 0 O. LOS puntos scu(dos si
muestran uidcamsots como Ilustroclo'n.

80
 CR
&

40
ti- OS g/i (21.93)

E 96k (2.465)
249 Ii (1.243)

CR,OP$. pile edo

lo

ItT

CR
37'C

CR, opt. a 22.67 911 (22.67)

u 2.477 Ji (2.472)
1. 239 ii(I. 236)
CR, opt.
20 II
- duplicado
II
SI
1 Si
1 SI
/ II

LE
VbII
II
Yfi
-
- JI
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r. . ii
,.
Plpura lO. Coacsatracldn de etanol Contra tiempo de residencia, para la cintica
de Inhibicin por producto puro en un reactor de flujo de mezclo
dotid. c 0 O para 3 y 37 ' y duplicado,
81
 CR

me

30

g/l
C R opt.
20

Topt.

opt. 23.327 91'1

ropt. a 2.389 Ji
1.185 Ji

4 ,04kT
Topt.
Figuro II. Cancstrcjo' de etonol contra tIempo di re.idsncja para ioclndtico
de inhibiclon por producto puro en un reactor di flujo de mezcla donde
CC0 a O, para 39 'C y duplicado.
82
 I.og 7'

Log

LOQ

Figura 12. Ms'todo poro vIuO, los constantes poro lo chstjco d.

Inhibiclon por producto puro, la reactores di mezcla
completo donde C 0 Z O. Los puntos Incluido* si
Mustron unlCom,nt. Como ilustracin.

83
- 1