TEMAS DE BACTERIOLOGA Y VIROLOGA MDICA 43

Fisiologa y metabolismo bacteriano

G. Varela, G. Grotiuz
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Las bacterias son los organismos ms pequeos que tienen la maquinaria requerida para el crecimiento y la replicacin. Estn
compuestas, como las clulas eucariotas, por protenas, polisacridos, lpidos, cidos nucleicos, entre otros. Estas macro-
molculas pueden formar parte de estructuras celulares ms complejas, como la pared celular y la membrana plasmtica. El
crecimiento bacteriano se define como el aumento ordenado de todos los constituyentes qumicos de la clula. Es un proceso
complejo que supone la replicacin de todas las estruc- turas y componentes celulares a partir de nutrientes exgenos.
El conocimiento de la fisiologa y del metabolismo bacteriano tiene algunas aplicaciones prcticas. En principio permite
conocer el modo de vida y el hbitat de diferentes especies bacterianas. El ser humano actuando como husped, ofrece una
variedad de nichos ecolgicos que se diferencian entre s por aspectos fsicos y qumicos (temperatura, concentracin de oxgeno,
pH, presin osmtica, etc.), en los cuales pueden crecer y multiplicarse distintas especies bacterianas segn sus requerimientos
nutricionales, ambientales y atmosfricos. Adems, permite formular medios de cultivo para el aislamiento e identificacin de los
pat- genos participantes. Desde un enfoque teraputico, nos permite conocer y entender el modo de accin de algunos
antibiticos que bloquean una va metablica o la sntesis de alguna macromolcula esencial para la bacteria.
El trmino metabolismo se refiere al conjunto de reacciones qumicas que se producen en la clula y tiene tres funciones
especficas. La primera es obtener energa qumica del entorno y almacenarla, para luego usarla en diferentes funciones celulares.
La segunda es convertir los nutrientes exgenos en unidades precursoras de los componentes macromoleculares de la clula
bacteriana. Y la tercer funcin es formar y degradar molculas necesarias para cumplir funciones celulares especficas, por
ejemplo: movilidad y captacin de nutrientes.
El metabolismo se produce por secuencias de reacciones catalizadas enzimticamente y se divide en anabolismo y
catabolismo. El proceso por el cual la clula bacteriana sintetiza sus propios componentes se conoce como anabolismo y resulta
en la produccin de nuevo material celular; tambin se denomina biosntesis. La biosntesis es un proceso que requiere energa,
por lo tanto las bacterias deben ser capaces de obtenerla de su entorno para crecer y, eventualmente, multiplicarse. El conjunto de
reacciones degradativas de los nutrientes para obtener energa o para convertirlos en unidades precursoras de la biosntesis, se
conoce como catabolismo.
As, hemos visto dos tipos de transformaciones qumicas que ocurren simultneamente en la bacteria, por lo tanto el
metabolismo es el resultado colectivo de ambas reacciones.
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Las catablicas resultan en la liberacin de la energa qumica contenida en los nutrientes, mientras que las anablicas la
consumen. Por lo tanto, la energa liberada como resultado de las reacciones de oxidacin reduccin del catabolismo, debe ser
almacenada y transportada de alguna manera. Una de ellas es como compuestos con uniones fosfato de alta energa; dichos
compuestos luego se usan como intermediarios en la conversin de la energa conser- vada en trabajo til. El compuesto fosfato
de alta energa ms importante en los seres vivos es el trifosfato de adenosina (ATP). ste se genera en la clula bacteriana por
dos procesos diferentes: fosforilacin a nivel del substrato y fosforilacin oxidativa.

Metabolismo productor de energa

En los seres vivos, la utilizacin de la energa potencial contenida en los nutrientes se pro- duce por reacciones de oxidacin
reduccin. Qumicamente la oxidacin esta definida por la prdida de electrones y, la reduccin por la ganancia de los mismos.
En bioqumica, estas reacciones frecuentemente incluyen tambin la transferencia de tomos enteros de hidrgeno, por lo tanto se
conocen con el nombre de reacciones de deshidrogenacin. En las reacciones de este tipo hay sustancias que ceden electrones
(dadoras) y otras que los aceptan (acepto- ras). En las bacterias de inters mdico los sistemas de oxidacin reduccin
transforman la energa qumica de los nutrientes en una forma biolgicamente til; dichos procesos incluyen la fermentacin y la
respiracin. En la primera, tanto la molcula dadora como la aceptora de electrones, son compuestos orgnicos. En cambio, en la
respiracin hay un aceptor final exgeno, que cuando es el oxgeno se denomina respiracin aerobia y cuando es un compuesto
inorgnico, respiracin anaerobia.
FERMENTACIN En sta los electrones pasan del dador, un intermediario formado durante la degradacin del substrato, hacia
un aceptor constituido por algn otro intermediario orgnico tambin generado durante el catabolismo del substrato inicial. Por lo
tanto, este proceso de oxidacin reduccin no requiere el aporte exgeno de un aceptor final de electrones.
Aunque hay distintos tipos de fermentaciones, todas llevan a una oxidacin parcial de los tomos de carbono del substrato
inicial y liberan, por lo tanto una pequea parte de la energa potencial contenida (Ver figura 1). El rendimiento energtico de este
proceso es menor que el de la respiracin.
En las bacterias se encuentran las tres vas centrales del metabolismo intermediario de los hidratos de carbono: la glucoltica
o de Embden Meyerhof Parnas, la de pentosa fosfato o shunt de las pentosas y la de Entner-Doudoroff.
La va glucoltica que degrada la glucosa se divide en tres etapas principales. La primera es preparativa, con reacciones que
no son de oxidacin reduccin, sin liberacin de energa y con formacin de dos intermediarios de tres tomos de carbono cada
uno. En la segunda etapa, s ocurren reacciones de oxidacin reduccin con liberacin de energa, formacin de ATP por
fosforilacin a nivel del substrato (el ATP se genera en un paso enzimtico espe- cfico) y produccin de dos molculas de
piruvato. En la tercer etapa, nuevamente ocurren reacciones de oxidacin reduccin y se generan los productos finales de la
fermentacin, que varan segn la bacteria en cuestin. Solo una pequea parte de la energa libre que poten- cialmente puede
derivar de la degradacin de una molcula de glucosa queda disponible por esta va, dado que los productos finales son
compuestos en los que el carbono se encuentra todava en estado reducido.
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Por cada molcula de glucosa que entra a esta va, se forman cuatro molculas de ATP y como se consumen dos en la primer
etapa, el balance neto es de dos molculas de ATP por cada molcula de glucosa fermentada. El destino final del metabolito clave,
el piruvato, depende de los procesos empleados para la regeneracin del dinucletido de nicotinamida adenina (NAD) a partir del
dinucletido de nicotinamida adenina reducido (NADH) y as mantener el equilibrio de oxidacin reduccin.
Aunque la va glucoltica es la ms importante en las clulas eucariotas y procariotas, no es la nica. La va de las pentosas es
una ruta multifuncional para la degradacin de hexosas, pentosas y otros hidratos de carbono. Para los fermentadores
heterolcticos es la principal fuente productora de energa, aunque la mayora de las bacterias usan esta va como fuente de
dinucletido de nicotinamida adenina fosfato reducido (NADPH) y de pentosas para la sntesis de nucletidos.
La va de Entner-Doudoroff es la ruta principal para la degradacin de la glucosa en las bacterias aerobias estrictas como
Neisseria y Pseudomonas. Como sucede en la va de las pen- tosas, aqu solo se produce una molcula de ATP por molcula de
glucosa degradada.
El cido pirvico derivado de la glucosa, es un compuesto clave en el metabolismo fer- mentador de los hidratos de carbono.
En su formacin, el NAD es reducido a NADH y ste
Figura 1. Rol central del piruvato en las fermentaciones
TEMAS 46 DE BACTERIOLOGA Y VIROLOGA MDICA debe oxidarse nuevamente a NAD para alcanzar el equilibrio
final de oxidacin reduccin. Las bacterias se diferencian de las clulas eucariotas por la forma en que eliminan el piruvato; en
las bacterias la oxidacin incompleta es la regla y se acumula gran cantidad de metabolitos finales de la fermentacin. El estudio
y el conocimiento de las fermentaciones bacterianas tiene importancia prctica, porque proporciona productos industriales que
son tiles en el laboratorio para identificar las diferentes especies. Entonces, segn los productos finales, tenemos diferentes tipos
de fermentacin: alcohlica, homolctica, heterolctica, del cido propinico, cido mixta, de butanodiol y del cido butrico.
Fermentacin alcohlica Es el tipo de fermentacin ms antigua que se conoce. Produce etanol a partir de glucosa. Aunque
ciertas bacterias producen alcohol, ste es elaborado por otras vas.
Fermentacin homolctica Todos los miembros del gnero Streptococcus, Pediococcus y muchas especies de Lactobacillus
fermentan la glucosa fundamentalmente a cido lctico con poca acumulacin de otros productos finales. En esta reaccin el
piruvato se reduce a cido lctico por accin de la enzima lctico deshidrogenasa, actuando el NADH como dador de electrones.
Esto ocurre en la tercer etapa de la va glucoltica.
Fermentacin heterolctica En este tipo de fermentacin solo la mitad de la glucosa se convierte en cido lctico, el resto se En
transforma esta fermentacin en una mezcla se emplea de anhdrido fundamentalmente carbnico (CO la va 2
), de cido las pentosas frmico, y cido se produce actico, en etc. las bacterias del gnero Leuconostoc y Lactobacillus.
Fermentacin del cido propinico Es caracterstica de algunas bacterias anaerobias como el Propionibacterium (bacilo
gramposi- tivo, no esporulado). Este tipo de fermentacin tiene la ventaja de que genera una molcula ms de ATP.
Fermentacin cido mixta Es caracterstica de la mayora de las enterobacterias. Bacterias como Shigella, Salmonella y E. coli
fermentan las hexosas a travs del piruvato a cido lctico, cido actico, cido succnico y cido frmico.
Fermentacin de butanodiol Varias bacterias como Enterobacter, Serratia y Bacillus producen 2,3-butanodiol durante la
fermentacin de la glucosa. Este deriva de la condensacin de dos molculas de piruvato en una molcula neutra de acetona que
luego es reducida a 2,3-butanodiol.
Fermentacin del cido butrico Se ve en bacterias del gnero Clostridium (bacilo grampositivo, anaerobio y esporulado).
Si bien hasta ahora nos hemos referido solo a la fermentacin de hidratos de carbono como procedimiento para obtener
energa, debemos destacar que otros compuestos orgnicos pueden ser fermentados, por ejemplo: aminocidos (alanina, glicina).
En Clostridium proteolticos, la fermentacin de aminocidos ms caracterstica es la reaccin de Stickland.
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Anteriormente hemos discutido el metabolismo de los hidratos de carbono en ausencia de un aceptor externo de electrones y
hemos visto que solo una pequea parte de la energa potencial contenida en el substrato es liberada. Esto se debe a que la
diferencia entre los po- tenciales de oxidacin reduccin entre la molcula dadora inicial y la aceptora final es muy pequea.
Otras bacterias tienen la capacidad de oxidar completamente el substrato inicial a CO
2
por el proceso conocido como respiracin.
RESPIRACIN Es el proceso por el cual un substrato es oxidado cin de una cadena de electrones ubicada en la completamente
membrana plasmtica, a CO
2
y en agua, la cual con el participa- aceptor final es el oxgeno molecular u otro compuesto inorgnico (nitratos, sulfatos, anhidrido
carbnico, etc.)anaerobia. Los primeros pasos en la respiracin de la glucosa son idnticos a los de la gluclisis, pero mientras
en esta ltima el piruvato es convertido en productos finales de la fermentacin (cido lctico, cido propinico, etc.), en la
respiracin es oxidado completamente oxidada en este a ciclo, CO 2 se mediante generan el tres ciclo molculas de Krebs (ver
figura 2). Por cada molcula de piruvato electrones generados en el ciclo de Krebs, pasan de a coenzimas CO
2
. Al igual que que en la fermentacin, los tienen NAD. Sin embargo, en la respiracin aerobia, los electrones del NADH son
transferidos al oxgeno para regenerar NAD a travs de un sistema transportador, en lugar de cederlos al piruvato.
SISTEMAS TRANSPORTADORES DE ELECTRONES Y GENERACIN DE TRIFOSFATO DE
ADENOSINA Estos sistemas estn compuestos por transportadores (carriers) de electrones, asociados a la membrana plasmtica
y tienen dos funciones bsicas: aceptar electrones de un donador y cederlos a un aceptor y conservar energa liberada durante ese
transporte en forma de ATP por fosforilacin oxidativa.
Existen varios tipos de enzimas de oxidacin reduccin y protenas transportadoras de electrones, entre los que se destacan
las NAD-deshidrogenasas, las flavoprotenas y los ci- tocromos. Las flavoprotenas contienen un derivado de la riboflavina como
grupo prosttico que se reduce y se oxida alternativamente. La riboflavina, conocida como vitamina B2, es necesaria como factor
de crecimiento por algunas bacterias. Los citocromos son protenas que tienen anillos porfirnicos con hierro y tambin se oxidan
y se reducen alternativamente. Hay diferentes tipos de citocromos que se distinguen por sus potenciales de reduccin. Se los
designa con letras a, b, c, etc. Tambin estn las quinonas, sustancias liposolubles relacionadas con la vitamina K, que participan
en el transporte de electrones.
Para entender como se genera el ATP durante el transporte de electrones, debemos recodar su orientacin con respecto a la
membrana plasmtica de la clula bacteriana. La cadena est ubicada como ya dijimos en la membrana plasmtica, de tal modo
que durante el proceso de transporte hay una separacin fsica entre protones y electrones. Los protones quedan fuera de la clula,
mientras que los electrones quedan dentro de sta; en consecuencia se genera un gradiente de pH y un potencial elctrico a travs
de la membrana plasmtica, estando el lado externo cido y cargado positivamente y el interno alcalino y cargado negativamente.
A pesar de su tamao pequeo, ni los hidrogeniones, ni los hidrxidos atraviesan libremente la membrana; por lo tanto, el
equilibrio no puede establecerse espontneamente. Dicho estado energtico de la membrana plasmtica, similar a una batera,
puede ser usado por la clula para realizar un trabajo til, por ejemplo, movilidad o sntesis de ATP. Para la sntesis de ATP un
componente fundamental del proceso es una ATPasa de membrana; enzima que cataliza
TEMAS 48 DE BACTERIOLOGA Y VIROLOGA MDICA Figura 2. Ciclo de Krebs
la reaccin reversible entre difosfato de adenosina (ADP) y ATP. Operando en una direccin y usando el gradiente de protones
generado durante el transporte, dicha enzima cataliza la formacin de ATP a partir de ADP y fosfato inorgnico. Existe una
variedad de agentes qumicos llamados desacopladores que inhiben la sntesis de ATP durante el transporte de electrones sin
alterar el propio proceso de transporte. Ejemplos de estos agentes son el dicu- marol y el dinitrofenol. Son sustancias liposolubles
que impiden la formacin del gradiente de pH y el elctrico, favoreciendo el pasaje de protones a travs de la membrana; de este
modo inhiben la sntesis de ATP. La polimixina B (un antibitico) se adhiere especficamente a la superficie externa de la
membrana, alterando su estructura y propiedades osmticas. Se produce entonces la prdida de metabolitos y la inhibicin de
algunos procesos bioqumicos que tienen lugar a ese nivel, como el transporte de electrones y la sntesis de ATP, entre otros.
Otras sustancias, por ejemplo: cianuro o azida de sodio, bloquean el propio sistema de
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transporte y se denominan inhibidores. Tanto los desacopladores como los inhibidores son venenos celulares que actan en
clulas eucariotas y procariotas.
BALANCE ENERGTICO DE LA RESPIRACIN El resultado neto de las reacciones del ciclo de Krebs es la oxidacin
completa del piruvato a CO (FADH). 2
con formacin El NADH de y el cuatro FADH molculas pueden ser de oxidados NADH nuevamente y una de dinucletido por
el sistema de flavinadenina transportador de electrones. Un total de 15 molculas de ATP son sintetizadas en cada vuelta del ciclo,
Figura 3. Gluclisis
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por lo tanto, dado que cada molcula de glucosa rinde dos de piruvato, 30 molculas de ATP son sintetizadas por cada molcula
de glucosa que entra al ciclo de Krebs (ver figura 3). Esto, sumado a las seis molculas de la reoxidacin del NADH y las dos del
va glucoltica, da un total de 38 molculas de ATP por molcula de glucosa respirada. Adems de sus funciones como
mecanismo generador de energa, el ciclo de Krebs sirve como productor de metabolitos claves para la biosntesis.
La reduccin del oxgeno forma radicales libres que son muy txicos para la bacteria. Entre los ms importantes se encuentra
el superxido. ste es eliminado por las bacterias aerobias y tolerantes del oxgeno, por la enzima superoxidodismutasa que
cataliza la formacin de perxido de hidrgeno, tambin txico. El perxido de hidrogeno es degradado por enzimas como
catalasa y la peroxidasa, a oxgeno molecular y agua. Estas enzimas estn ausentes en las bacterias anaerobias estrictas,
explicando en parte la susceptibilidad que tienen al oxgeno.
En las bacterias aerobias obligadas, el oxgeno es el aceptor final de electrones. Sin embargo, las bacterias anaerobias
facultativas pueden usar, en ausencia de oxgeno, otros compuestos inorgnicos como aceptores finales de electrones, por
ejemplo: nitrato, fumarato, sulfato, etc.
REGULACIN DEL METABOLISMO Cada reaccin metablica est regulada no solo con respecto a otras reacciones, sino
tambin con respecto a la concentracin de nutrientes en el medio. La regulacin se realiza a diferentes niveles: en la actividad
enzimtica y en la sntesis de las enzimas. En la primera, regulacin de la actividad enzimtica, se produce: activacin de enzimas
alostricas, inhibicin por retroa- limentacin, activacin alostrica y cooperatividad. La induccin enzimtica y la represin por
productos finales, son mecanismos de regulacin de la sntesis de enzimas.
En las bacterias anaerobias facultativas la fermentacin (como nica va de produccin de energa) es bloqueada en presencia
de oxgeno, asegurando que el suministro de energa se produzca por respiracin, que consume menos glucosa y acumula menos
lactato. En este fenmeno denominado efecto Pasteur, la enzima fosfofructoquinasa es activada o inhibida segn la relacin entre
el ATP y el ADP, regulando as el consumo de glucosa. Este es un ejemplo de regulacin de la actividad enzimtica por una
enzima alostrica. El ejemplo clsico de regulacin de la sntesis de enzimas lo constituye el opern lactosa. Hay tres enzimas
que participan en la utilizacin de la lactosa (-galactosidasa, galactsido permeasa y galactsido transacetilasa), las cuales tienen
un promotor nico. En ausencia de lactosa, la transcripcin para estas enzimas est bloqueada por un represor que se une al
promotor inhibiendo la accin de la ARNpolimerasa. Cuando se agrega lactosa al medio, sta se une al represor, bloqueando de
este modo su unin al promotor y permitiendo la accin de la ARNpolimerasa y la sntesis de las tres enzimas anteriormente
mencionadas.

Crecimiento bacteriano
Puede ser definido como el aumento ordenado de todos los constituyentes qumicos de la clula. Las condiciones fsicas y
qumicas del medio donde el microorganismo se encuentra afectan marcadamente sus actividades. La comprensin de como
influye el ambiente sobre el crecimiento nos ayuda a explicar la distribucin de los microorganismos en la naturaleza y hace
posible disear estrategias que favorezcan el crecimiento o que nos permita controlarlo. Las bacterias como grupo, son
extremadamente verstiles y tienen gran capacidad para utilizar una amplia gama de nutrientes que van desde compuestos
inorgnicos simples, a compuestos
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orgnicos ms complejos. Los nutrientes se pueden dividir en dos clases: esenciales, sin los cuales la clula no puede crecer y no
esenciales, se usan cuando estn presentes pero no son indispensables. Algunos nutrientes son usados solo como precursores de
macromolculas celulares, otros solo como fuente de energa sin ser incorporados directamente al material celular y otros
cumplen las dos funciones al mismo tiempo. Tambin se pueden clasificar como macro y micronutrientes segn la cantidad
requerida.
MACRONUTRIENTES El carbono es el mayor constituyente de la clula bacteriana, por lo tanto no llama la atencin que
requiera ms carbono que cualquier otro nutriente. Segn la forma en que lo usa, existen fundamentalmente dos tipos de
bacterias: auttrofas y hetertrofas. Las primeras son capaces de sintetizar todos sus componentes orgnicos a partir de
compuestos inorgnicos como el CO mdico. 2
. Como ejemplo de este En cambio, las hetertrofas grupo citamos las bacterias del suelo, que carecen de inters usan sustancias
orgnicas como fuente de carbono. En este grupo se encuentran todas las bacterias de inters mdico.
La glucosa, por ejemplo, es usada como fuente de carbono y de energa. Tambin existen bacterias que pueden usar otras
sustancias orgnicas como fuente parcial o exclusiva de car- bono. Entre las bacterias ms verstiles se encuentran las del gnero
Pseudomonas, muchas de las cuales pueden usar ms de cien compuestos orgnicos.
Despus del carbono, el elemento ms abundante en la clula es el nitrgeno que repre- senta entre el 12 y el 15% del peso
seco. Es el constituyente principal de las protenas y los cidos nucleicos. La mayora de las bacterias son capaces de usar el
amonio como fuente de nitrgeno, mientras que otras pueden usar los nitratos. La reduccin de nitratos, se puede lograr por dos
mecanismos diferentes: reduccin asimiladora, en la cual se reduce por la va del nitrito y reduccin desasimiladora, donde el
nitrato sirve como aceptor final de electrones. La primera est bastante extendida entre las bacterias, mientras que la segunda solo
es comn en bacterias anaerobias y anaerobias facultativas.
El fsforo es usado para la sntesis de cidos nucleicos y de fosfolpidos. La mayora de las bacterias lo usan en forma
inorgnica como fosfato (PO4=). Los fosfatos orgnicos si bien estn distribuidos ampliamente en la naturaleza, para ser usados
deben ser atacados primero por fosfatasas, enzimas que clivan estos compuestos liberando el fsforo inorgnico.
MICRONUTRIENTES Aunque requeridos en cantidades muy pequeas, los micronutrientes son importantes para la nutricin de
la bacteria. Entre estos destacamos el cobalto, el cobre y el manganeso.
FACTORES DE CRECIMIENTO Son sustancias que deben ser aportadas preformadas, porque la bacteria que los requieren no
pueden sintetizarlos a partir de los nutrientes ya sea por falla o ausencia de una va metablica determinada. Estas sustancias
incluyen vitaminas del complejo B, aminocidos, purinas y piri- midinas. Las bacterias que no necesitan factores de crecimiento,
se denominan prototrficas y, las que s los requieren, auxotrficas para ese factor.
REQUERIMIENTOS ATMOSFRICOS Y AMBIENTALES Oxgeno Las exigencias de oxgeno de una bacteria en particular,
reflejan el tipo de metabolismo pro-
TEMAS 52 DE BACTERIOLOGA Y VIROLOGA MDICA ductor de energa. Segn su relacin con el oxgeno, existen
bacterias: anaerobias obligadas, anaerobias facultativas, aerobias obligadas y microaerfilas.
De las primeras (anaerobias obligadas), existen las estrictas y las aerotolerantes. Las bac- terias anaerobias obligadas
estrictas, crecen en ausencia de oxgeno, el cual es muy txico e incluso letal cuando la exposicin es breve. Las segundas
(aerotolerantes) tambin crecen solo en ausencia de oxgeno, pero toleran su presencia un poco ms que las anteriores; por
ejemplo: Clostridium sp. Las bacterias anaerobias facultativas, son capaces de crecer en presencia o en ausencia de oxgeno.
Ejemplo de stas son las bacterias de la familia Enterobacteriaceae. Las aerobias obligadas, requieren oxgeno para su desarrollo.
Dentro de este grupo se encuentran la Pseudomonas. Por ltimo, las microaerfilas crecen mejor con presiones de oxgeno bajas
(3 a 5%); las concentraciones altas (21%) inhiben su crecimiento.
En las bacterias aerobias, anaerobias facultativas y anaerobias aerotolerantes, la enzima superoxidodismutasa impide la
acumulacin del radical superxido; esta enzima est ausente en los anaerobios estrictos. El perxido de hidrgeno formado por
la accin de la superoxidodis- mutasa es destruido con rapidez por la enzima catalasa o peroxidasa, como ya se mencion. En el
laboratorio de microbiologa los requerimientos atmosfricos de oxgeno, pueden determinarse cultivando la cepa en caldo
tioglicolato. Este medio contiene muchos nutrientes, siendo un caldo de enriquecimiento apropiado para casi todas las bacterias
de inters mdico. El cido tiogliclico acta como agente reductor que disminuye el potencial redox del medio, generando un
gradiente de concentracin de oxgeno a lo largo del tubo. En la superficie del medio, la concentracin es similar a la atmosfrica
y va disminuyendo gradualmente hasta que en el fondo del tubo no existe oxgeno disuelto. Las bacterias aerobias estrictas
podrn crecer en la superficie del caldo, las microaerfilas crecern en la franja inmediata que est debajo de la superficie. Las
anaerobias facultativas crecern en todo el tubo, mientras que las anaerobias lo harn en el fondo del mismo.
Anhdrido carbnico Algunas bacterias como Neisseria y la Brucella, tienen muchas enzimas con baja afinidad por presente el
CO
en 2
y la requieren atmsfera una (0.03%).
concentracin ms elevada (10%) de la que habitualmente est
Estos requerimientos atmosfricos mencionados deben ser tenidos en cuenta cuando se realiza el cultivo de estas bacterias.
Potencial de oxidacin reduccin Es un requerimiento fsico del medio de cultivo. ste es un factor crtico para determinar si se
desarrollar o no el inoculo sembrado en dicho medio. Para la mayora de los medios de cultivo en contacto con el aire, el
potencial de oxidacin reduccin es de +0,2 a +0,4V, a pH 7. Las bacterias anaerobias obligadas son incapaces de crecer a menos
que el potencial sea tan bajo como -0,2V. Para establecer dichas condiciones en un medio de cultivo se puede eliminar el oxgeno,
recurriendo a sistemas de cultivo anaerobio o agregando al propio medio compuestos que contengan sulfidrilo, por ejemplo el
tioglicolato de sodio.
Temperatura Es uno de los factores ambientales ms importantes que influyen en la proliferacin y mante- nimiento de la
vitalidad de los microorganismos. Cada bacteria tiene su propia temperatura mnima por debajo de la cual no puede proliferar,
temperatura ptima en la cual el crecimiento es mas rpido y temperatura mxima por encima de la cual no puede multiplicarse.
As, es
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posible distinguir tres grupos de microorganismos segn el rango de temperatura en el que es posible su multiplicacin:
psicrfilas, crecen entre -5 y 30oC, temperatura ptimo de 15oC; mesfilas, crece entre 10 y 45oC, con el ptimo a los 30oC y
termfilas, que crecen entre 25 y 80oC, con el ptimo en 55oC.
En el laboratorio se puede determinar la temperatura ptima de crecimiento, sembrando el microorganismo en estudio en un
medio de cultivo adecuado e incubndolo a diferentes temperaturas, para despus evaluar los rendimientos obtenidos en las
distintas condiciones. Si bien la mayora de los microorganismos de inters medico son mesfilos, pueden existir diferencias
entre las temperaturas de crecimiento ptimas de los mismos, siendo para la mayora de 35 a 37oC.
Concentraciones de hidrgeno Cada microorganismo tiene un rango de pH en cual puede crecer y un pH ptimo bien definido.
Segn en el pH que se obtenga mayor rendimiento, encontramos microorganismos acidfilos, neutrfilos (la mayora de inters
mdico) y alcalfilos, que crecen bien en pH cidos, neutros y alcalinos respectivamente.
Para la mayora de las bacterias de inters mdico, el pH ptimo es de 7,2 a 7,6. Sin em- bargo, hay microorganismos
humanos como M. tuberculosis que resisten valores muy bajos de pH.
Como los microorganismos al multiplicarse y realizar sus funciones metablicas, suelen modificar el pH del medio, ste
puede prepararse con amortiguadores de pH (buffer), los cuales mantiene el pH relativamente constante.
Condiciones osmticas y disponibilidad de agua El agua es un requerimiento esencial para todo ser vivo y la disponibilidad de
sta es un factor importante que afecta el crecimiento de los microorganismos en sus ambientes naturales. Esta disponibilidad no
depende solamente del contenido de agua que haya en el ambiente, porque algunas sustancias y superficies pueden absorber
molculas de agua y por consiguiente reducir la disponibilidad en el ambiente. Las sales y los azcares disueltos en agua,
condicionan la disponibilidad de la misma porque las molculas de agua se asocian y no quedan disponibles para ser usadas por
los microorganismos. La disponibilidad de agua se expresa generalmente como actividad acuosa o potencial de agua.
Generalmente los microorganismos se encuentran en ambientes con menor cantidad de solutos que en el interior celular, por
lo tanto el agua tiende a entrar a la clula por osmosis. Por el contrario, si se encuentran en medios de baja actividad acuosa, el
agua tender a salir de la clula, por lo tanto perder agua. As, encontramos microorganismos que pueden crecer en altas
concentraciones salinas (halfilos) como las que estn en el agua de mar, en altas concentraciones de azcar (osmfilos) como las
que hay en una jalea o en ambientes muy secos (xerfilos). Estos generalmente captan agua de dichos ambientes, gracias a las
altas concentraciones de solutos en su interior. La concentracin de solutos con actividad osmtica dentro de la clula bacteriana
es superior a la concentracin del exterior celular. Con excepcin de las bacterias del gnero Mycoplasma y de las formas lister
(L) que no tienen pared celular, la mayora de las bacterias tienen tolerancia osmtica que les permite soportar grandes cambios
de osmolaridad.
Captacin de nutrientes La concentracin de solutos en el interior de una clula bacteriana es mayor que en el medio
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extracelular. Esto es aplicable tanto al medio natural como a la mayora de los medios de cultivo usados en el laboratorio. La
principal barrera para el paso de solutos entre la clula y el medio externo es la membrana celular. Las bacterias estn rodeadas de
membranas semi- permeables, compuestas por una mezcla compleja de protenas, lpidos y glucoprotenas, que restringen el
ingreso de la mayora de los solutos. Sin embargo, tienen sistemas que permiten el transporte de sustancias pequeas a travs de
dichas membranas. Las molculas de mayor tamao primero deben ser degradadas a molculas ms pequeas por enzimas
(exoenzimas) producidas por la propia bacteria y secretadas al exterior celular. En las bacterias gramnega- tivas estas exoenzimas
se encuentran fundamentalmente en el espacio periplsmico (espacio virtual ubicado entre la membrana externa y la membrana
plasmtica), mientras que en las bacterias grampositivas estn ancladas en la membrana plasmtica. Dichas enzimas son activas
sobre: protenas, polisacridos, lpidos y cidos nucleicos, entre otros. Bacterias como S. aureus, S. pyogenes, y C. perfringens,
elaboran algunas de estas enzimas que contribuyen a la virulencia, destruyendo los componentes vitales de los tejidos del
husped infectado. Pueden ser constitutivas (se sintetizan siempre) o inducibles (se sintetizan solo cuando est presente su
substrato).
Con excepcin del agua y el amonio que ingresan a la clula por difusin pasiva en respuesta a un gradiente de concentracin
a ambos lados de la membrana, el resto de los metabolitos lo hacen por sistemas de transporte ms especficos.
Tanto las porinas, como los canales de maltosa, no requieren consumo de energa. Los primeros son sistemas inespecficos
que permiten el ingreso de molculas pequeas (peso molecular menor o igual a seis mil dalton). Las porinas son protenas
ubicadas en la membrana externa de las bacterias gramnegativas, que forman canales o poros permitiendo el pasaje de las
molculas pequeas e hidroflicas.
En la difusin facilitada, una protena asociada a la membrana celular facilita el equilibrio a ambos lados de la misma,
actuando en conjunto con una quinasa citoplasmtica dependiente de ATP. Estas protenas de membrana se denominan permeasas
y muchas son inducidas por el substrato a ser transportado. Cuando la sustancia es fosforilada por la quinasa citoplasm- tica,
queda atrapada dentro de la clula. La difusin facilitada se parece a la difusin simple, porque el substrato se mueve por un
gradiente de concentracin (de mayor a menor), por lo tanto el propio proceso de transporte no requiere energa. La diferencia
que tiene con la difusin pasiva, es que est mediada por una protena transportadora, es ms rpida y tiene mayor especificidad
de substrato.
El transporte activo permite que los solutos ingresen a la clula en contra de un gradiente de concentracin, consumiendo
energa metablica.
Como ejemplo citaremos al sistema de la -galactsido permeasa, mediante el cual la lactosa (disacrido) es concentrado
dentro de una bacteria como E. coli. El transporte de la lactosa se produce por una permeasa especfica (protena M); dicha
reaccin implica gasto de energa. La energa se usa para disminuir la afinidad de la permeasa por la lactosa en la parte interna de
la membrana celular, favoreciendo su rpida liberacin dentro del citoplasma. Si la generacin de energa es bloqueada por el
agregado de azida de sodio al sistema, la permeasa cataliza la difusin facilitada de la lactosa, cesando el transporte cuando la
concentracin del disacrido sea la misma a ambos lados de la membrana.
En medios aerobios y a pH neutro, la baja concentracin de hierro no permite alcanzar un desarrollo ptimo. Las bacterias
han desarrollado varios sistemas para obtener cantidades adecuadas de dicho elemento. Los siderforos son ligandos de bajo peso
molecular cuya funcin es suministrar hierro a la clula. Aunque existe una variacin importante en la estructura de
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los distintos tipos de siderforos conocidos, la mayora son de dos tipos: catecoles: la entero- bactina es la ms estudiada; e
hidroximatos: producidos por algunos hongos. La enterobactina es un poderoso quelante que E. coli produce rpidamente cuando
existe dficit de hierro y la secreta al medio externo.
Crecimiento de las poblaciones bacterianas El paso esencial para iniciar el estudio de una cepa bacteriana, es el cultivo. Este paso
es importante para proveer de una poblacin de bacterias que puedan ser analizadas mediante pruebas bioqumicas, serolgicas,
genticas y de susceptibilidad a los antibiticos. El cultivo es el proceso de propagacin de los microorganismos en el laboratorio,
que se obtiene apor- tando las condiciones ambientales adecuadas y los nutrientes necesarios para el crecimiento bacteriano.
Debemos recordar que algunas de las bacterias que causan infecciones en seres humanos no son capaces de crecer en medios
artificiales inertes.
Es necesario conocer cuales son los requisitos bsicos de la bacteria en cuestin para su cultivo en el laboratorio (nutrientes,
requerimientos atmosfricos y ambientales), as como los requisitos del o de los tipos bacterianos que se necesite recuperar.
La siembra de un material que contiene bacterias en un medio slido adecuado con la tcnica de aislamiento permite, luego
de un perodo adecuado de incubacin, la recuperacin de millones de bacterias agrupadas en colonias aisladas. stas pueden ser
aisladas nuevamente en un nuevo medio para obtener un cultivo puro.
El crecimiento se define como el aumento del nmero de bacterias en una poblacin determinada (ver figura 4). Es
importante diferenciar entre el crecimiento de una clula individual y el de una poblacin. Dicho crecimiento celular es el
resultado del aumento del tamao de la clula, seguido de su divisin. El crecimiento de una poblacin, en cambio, es el
resultado del aumento del nmero total de clulas, que puede ser cuantificado directamente (contando el nmero de clulas) o
indirectamente (por ejemplo, midiendo la masa celular). El recuento de clulas totales puede determinarse por recuento
microscpico en una cmara con reas de volumen conocido, contando las clulas por unidades. Este recuento, considera la
totalidad de las clulas presentes en la muestra (viables y no viables). Para realizar un recuento de las clulas viables, es necesario
hacer un cultivo en medio slido para contar el nmero de unidades formadoras de colonias (UFC) presentes en un volumen
conocido de la
Figura 4. Curva de crecimiento bacteriano
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muestra. Dicha tcnica puede realizarse por siembra en la superficie de un medio apropiado o por siembra incorporada en agar.
El crecimiento de las poblaciones bacterianas en un sistema de cultivo cerrado (sin entrada ni salida de los componentes del
sistema), est limitado por el agotamiento de los nutrientes o bien por la acumulacin de productos txicos del metabolismo.
Cuando las bacterias se siembran en el laboratorio en un medio lquido (por ejemplo en un tubo de ensayo), se trata de un sistema
cerrado de cultivo. Si se toman muestras a intervalos regulares en diferentes tiempos de incubacin y se realiza un recuento del
nmero de clulas viables por mililitro de cultivo, la representacin grfica de los datos (conteo de clulas viables en funcin del
tiempo) dar la curva de crecimiento caracterstica que consta de cuatro fases: latencia, exponencial, estacionaria y muerte.
FASE DE LATENCIA Las bacterias transferidas de un cultivo en fase estacionaria a un medio fresco, sufren un cambio en su
composicin qumica antes de ser capaces de iniciar la multiplicacin. Hay aumento de los componentes macromoleculares y de
la actividad metablica, casi sin divisin celular, asociado a un incremento de la susceptibilidad a los agentes fsicos y qumicos.
Por lo tanto, la mal llamada fase de latencia implica intensa actividad metablica.
FASE EXPONENCIAL Las clulas se dividen a velocidad constante, determinada por la naturaleza intrnseca de la bacteria y por
las condiciones del medio. Existe gran aumento del nmero total de clulas viables, que puede ser expresado en forma
exponencial. Prximo al final de esta fase, se produce la liberacin de exotoxinas por las bacterias que las producen.
FASE ESTACIONARIA Eventualmente el agotamiento de los nutrientes o la acumulacin de productos txicos determina el cese
del crecimiento. Hay prdida de clulas por muerte, la cual es balanceada por la formacin de nuevas clulas. Cuando esto
ocurre, el conteo total de clulas aumenta levemente aunque el de las bacterias viables permanece constante. Hacia el final de esta
etapa, puede ocurrir la esporulacin en aquellas bacterias que poseen este mecanismo de resistencia.
FASE DE MUERTE Luego de la fase estacionaria, la tasa de muerte se incrementa, el nmero de bacterias viables disminuye
rpidamente y, por lo tanto la curva de crecimiento declina.
Las caractersticas de la curva de crecimiento pueden variar, dependiendo de las caracte- rsticas propias del microorganismo,
del estado metablico del inoculo, del medio de cultivo y de las condiciones de incubacin. Las condiciones fsicas y qumicas
del medio donde el microorganismo crece afectan las actividades de stos. La comprensin de cmo influye el ambiente en el
crecimiento, nos ayuda a explicar la distribucin de los microorganismos en la naturaleza y hace posible disear mtodos que
permitan estudiar y controlar el crecimiento bacteriano.
Adems, existen sistemas de cultivo abiertos que son poco usados en el laboratorio de microbiologa clnica. El cultivo
continuo (con aporte y salida de nutrientes y requerimientos a una tasa constante), permite mantener a las bacterias en una misma
fase de crecimiento
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durante un largo perodo de tiempo (por ejemplo en la fase estacionaria o en la exponencial). Dicha tcnica es interesante por
ejemplo para los procesos productivos.

Medios de cultivo
Son una mezcla equilibrada de nutrientes requeridos a concentraciones que permiten el crecimiento de los microorganismos.
Deben contener todos los nutrientes necesarios en cantidades apropiadas a los requerimientos de los microorganismos y en
condiciones de pH, presin osmtica, oxgeno disuelto, etc., adecuados para el crecimiento. Aunque los diferentes
microorganismos tienen distintas propiedades fisiolgicas y requerimientos nutricionales, la composicin qumica de las clulas
es constante en todo el mundo vivo.
Los medios ms simples estn compuestos por una base mineral se puede suplementar con una fuente de carbono, de energa,
de nitrgeno y con algn factor de crecimiento re- querido. Los medios deben esterilizarse antes de ser usados. Esta esterilizacin
generalmente se realiza con calor hmedo, pero algunos medios con componentes sensibles al calor pueden filtrarse.
Existen muchos medios con diferentes utilidades que pueden ser clasificados de la siguiente manera. Segn su consistencia
en: lquidos, semislidos y slidos. Los medios slidos son usados para el aislamiento bacteriano, mientras que los lquidos son
tiles para el enriquecimiento de una poblacin bacteriana de inters. Segn su composicin: definidos (de composicin qumica
conocida, medios simples) y complejos (con agregados de sustancias no definidas, por ejemplo extracto de levadura). Segn la
cantidad de nutrientes: pobres (por ejemplo el agar simple) y ricos (por ejemplo el agar sangre). Tambin pueden clasificarse en
medios: diferenciales, que permiten diferenciar algunas propiedades distintivas del grupo bacteriano (por ejemplo el uso de
lactosa en agar CLED); y selectivos, que permiten el desarrollo de algunos microorganismos pero no de otros (por ejemplo el
Mac Conckey para la seleccin de bacterias gramnegativas). Tambin existen los medios especiales para el transporte de muestras
o cepas, o aquellos especficos para identificar alguna va metablica determinada.

Bibliografa
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Missouri. Mosby. 2002.
Joklik WK, Willett HP, Amos DB, Wilgert CM. editores, Zinsser Microbiologa. 20a ed. BsAs. Panamericana;
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