PRCTICAS DEL LABORATORIO

DE MICROBIOLOGA:
BACTERIOLOGA Y MICOLOGA

M PAZ MERINO JIMNEZ

MIREIA LLINARES MARCELO
 PRCTICAS DEL
LABORATORIO DE
MICROBIOLOGA:
BACTERIOLOGA Y
MICOLOGA

A mi padre.
M. Paz Merino

A los tres hombres ms importantes que

han pasado por mi vida.
M. Llinares

Agradecemos a los doctores S. Simeon y E. Collado por el importante aporte que han hecho
con la documentacin cedida desinteresadamente para la realizacin de nuestro libro.

Agradezco como profesora de la Rama Sanitaria, la gran ayuda que para mi ha supuesto la
utilizacin de su libro PRACTICAS DE MICROBIOLOGA para la imparticin de mis clases en
el laboratorio de Microbiologa en los centros educativos donde he ejercido la docencia referente
a dicho laboratorio. Ha sido una gua inmensamente eficaz para la organizacin de mi trabajo.
Gracias nuevamente por vuestra ayuda

M PAZ MERINO JIMNEZ

Profesor tcnico de formacin profesional
Especialidad procedimientos de diagnstico clnico y ortoprotsico

MIREIA LLINARES MARCELO

Tcnico superior en laboratorio de diagnstico clnico

1
Primera edicin, 2012

Autoras: M Paz Merino Jimnez y Mireia Llinares Marcelo

Maquetacin: Patricia Penavella Soto
Edita: Educlia Editorial, S.L.
Imprime: Ulzama

ISBN: 978-84-15161-87-5

Depsit Legal: V-2442-2012

Printed in Spain/Impreso en Espaa.

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Alguna de las imgenes que incluye este libro son reproducciones que se han realizado acogindose al derecho de cita que
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 NDICE DE PRCTICAS

PRCTICA 1. MANEJO DEL MICROSCOPIO.

PRCTICA 2. DISTRIBUCIN DE MICROORGANISMOS EN LA NATURALEZA.

Parte A. Visualizacin de agua estancada.
Parte A.2. Visualizacin de suspensin de tierra.
Parte B. Visualizacin de un alimento contaminado.

PRCTICA 3. RECONOCIMIENTO DE MATERIAL.

PRCTICA 4. ESTERILIZACIN POR CALOR SECO.

PRCTICA 5. ESTERILIZACIN POR CALOR HMEDO.

PRCTICA 6. ACTIVIDADES DE ESTERILIZACIN Y DESINFECCIN.

PRCTICA 7. PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO.

7.1. Preparacin de agar nutritivo en tubo.
7.2. Preparacin de yeme en tubo.
7.3. Preparacin de TSA en tubo.
7.4. Preparacin de Mc Conckey en placa.
7.5. Preparacin de CLED en placa.
7.6. Preparacin de Sabouraud en placa.
7.7. Preparacin de agar Columbia en placa.
a) Preparacin de agar chocolate.
b) Preparacin de agar sangre.
7.8. Preparacin de medio O/F en tubo.
7.9. Preparacin de agua de peptona.
7.10. Preparacin de medio AHK en tubo.
7.11. Preparacin de caldo nitratado.
7.12. Preparacin de medio Christensen en tubo.
7.13. Preparacin de medio Falcow.
7.14. Preparacin de medio Clark y Lubs o VRMP.
7.15. Preparacin de medio Citrato de Simmons en tubo.
7.16. Preparacin de Mueller Hinton en placa.

PRCTICA 8. TCNICAS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO.

8.1. Tcnica de Kirby Bauer.
8.2. Tcnica de siembra por inundacin.
8.3. Tcnica de zig-zag.
8.4. Tcnica de estras mltiples.
8.5. Tcnica de los cuatro cuadrantes.
8.6. Tcnica de los tres giros.
8.7. Tcnica de estra en superficie inclinada.
8.8. Tcnica de picadura en superficie inclinada.
8.9. Morfologa macroscpica de las colonias.
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 PRCTICA 9. URINOCULTIVO.

PRCTICA 10. PLEGADO DE UN FILTRO.

PRCTICA 11. TCNICAS DE OBSERVACIN DE GRMENES VIVOS.

PRCTICA 12. PREPARACIN DE REACTIVOS Y COLORANTES PARA TINCIONES SIMPLES.

12.1. Azul de metileno.
12.2. Fucsina fenicada bsica.
12.3. Nigrosina.

PRCTICA 13. PREPARACIN DE REACTIVOS Y COLORANTES PARA TINCIONES DIFERENCIALES.

TINCIN DE GRAM.
13.1. Violeta de genciana.
13.2. Lugol.
13.3. Decolorante de Gram.
13.4. Fucsina diluida.
13.5. Safranina.

PRCTICA 14. PREPARACIN DE REACTIVOS Y COLORANTES PARA TINCIONES DIFERENCIALES.

TINCIN CIDO-ALCOHOL RESISTENCIA.
14.1. Fucsina fenicada de Ziehl Neesen.
14.2. Alcohol clorhdrico.
14.3. Azul de metileno de Ziehl Neesen.

PRCTICA 15. PREPARACIN DE REACTIVOS Y COLORANTES PARA TINCIONES ESTRUCTURALES.

TINCIN DE ESPORAS.
15.1. Verde malaquita.
15.2. Solucin acuosa de safranina.

PRCTICA 16. PREPARACIN DE REACTIVOS Y COLORANTES PARA TINCIONES ESTRUCTURALES.

TINCIN DE CPSULAS.
16.1. Nigrosina.
16.2. Fucsina diluida.

PRCTICA 17. REALIZACIN DE UNA TINCIN SIMPLE.

PRCTICA 18. REALIZACIN DE UNA TINCIN NEGATIVA.

PRCTICA 19. REALIZACIN DE UNA TINCIN DE GRAM.

PRCTICA 20. REALIZACIN DE UNA TINCIN DE CIDO-ALCOHOL RESISTENCIA O DE ZIEL NEESEN.

PRCTICA 21. REALIZACIN DE UNA TINCIN DE ESPORAS.

PRCTICA 22. REALIZACIN DE TINCIN DE CPSULAS. MTODO DE BURRI O DE LA TINTA CHINA.

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 PRCTICA 23. PRUEBAS BIOQUMICAS.
23.1. Metabolismo hidrocarbonado.
23.1.1. Prueba xido-fermentativa de Hugg y Leiffson.
23.1.2. Prueba de produccin de cido y gas.
23.1.3. Prueba b-d-galactosidasa (ONPG).
23.2. Enzimticas.
23.2.1. Prueba de la oxidasa.
23.2.2. Prueba de la catalasa.
23.2.3. Prueba de reduccin de nitratos.
23.2.4. Prueba ureasa.
23.2.5. Prueba de la coagulasa.
23.3. Metabolismo de las protenas.
23.3.1. Hidrlisis de gelatina.
23.3.2. Prueba de las descarboxilasas.
23.4. Sistemas multiprueba.
23.4.1. Prueba AHK.
23.4.2. Prueba IMVIC.
- Prueba del Indol.
- Prueba rojo de metilo.
- Prueba Voges Proskauer.
- Prueba citrato.
23.4.3. Sistema en tira y tubo.
- Sistema de tiras API.
- Sistema en tubo (Enterotube).

PRCTICA 24. ANTIBIOGRAMA POR LA TCNICA DE DIFUSIN EN DISCO.

PRCTICA 25. SIEMBRA EN CONDICIONES ANAEROBIAS.

PRCTICA 26. TCNICA DE SIEMBRA DE HONGOS. TCNICA DEL PORTAOBJETOS.

PRCTICA 27. TCNICA DE SIEMBRA DE HONGOS. TCNICA DEL CUADRADITO DE AGAR.

PRCTICA 28. TCNICA DE SIEMBRA DE HONGOS. TCNICA DE HOYO EN PLACA.

PRCTICA 29. TCNICA DE SIEMBRA DE HONGOS. TCNICA DEL CUBRE INCLINADO EN PLACA.

PRCTICA 30. TCNICA DE SIEMBRA DE HONGOS. TCNICA DE LA GOTA PENDIENTE.

PRCTICA 31. TCNICA DE VISUALIZACIN DE HONGOS. VISUALIZACIN DIRECTA CON LA TCNICA

DE LA CINTA ADHESIVA.

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 PRCTICA 26. TCNICA DE SIEMBRA DE HONGOS.
TCNICA DEL PORTAOBJETOS.

VISIN MACROSCPICA

MATERIAL

- Alcohol.
- Mechero Bunsen.
- Portaobjetos.
- Placa Petri.
- Papel filtro.
- Agua destilada.
- Medio de cultivo Agar Sabouraud.
- Pipeta Pasteur estril.
- Asa de siembra.
- Muestra de hongos.
- Estufa Pasteur.

TCNICA

1. Preparar 100 ml de medio de cultivo Agar Sabouraud estril (prctica 7.6).

2. Limpiar el portaobjetos con alcohol, secar y flamear.

3. Cubrir el portaobjetos con una fina capa de medio de cultivo (todava en estado lquido)
con la ayuda de una pipeta Pasteur estril.

4. Dejar secar el medio.

5. Recortar un crculo de papel de filtro de la misma medida que la placa de Petri.

213
6. Colocarlo en el fondo de la placa y humedecerlo con un poco de agua destilada para
mantener el ambiente hmedo para el crecimiento del hongo.

7. Con el asa de siembra esterilizada y humedecida con agua estril tomar un poco de
muestra de hongo.

8. Colocar la muestra en el centro del portaobjetos realizando un pequeo movimiento

circular con el asa.

9. Colocar el portaobjetos en la placa de Petri.

10. Incubar a 25oC el tiempo necesario para el crecimiento del hongo.

RESULTADOS

- Indica con una fotografa el resultado obtenido.

- Explica lo que observas.

214
PROCEDIMIENTO EN IMGENES

1 2

Preparar 100 ml de Sabouraud Limpiar portaobjetos

3 4

Cubrir con medio Sabouraud Dejar secar

5 6

Cortar crculo de papel de filtro Humedecer

7 8

Tomar muestra Sembrar en el centro del porta

215
 VISIN MICROSCPICA

MATERIAL

- Cubreobjetos.
- Pipeta Pasteur.
- Colorante azul de lactofenol.
- Muestra ya incubada (tcnica del portaobjetos).
- Pinzas.
- Mechero Bunsen.
- Microscopio.

TCNICA

1. En el portaobjetos donde habamos realizado la tcnica, echamos una gota de azul

de lactofenol.

2. Poner un cubreobjetos encima.

3. Observar al microscopio a 40x.

PROCEDIMIENTO EN IMGENES

1 2

Gota azul en porta Cubre sobre la muestra

Observar al microscopio

216
RESULTADOS

- Indica con una fotografa el resultado microscpico obtenido.

- Explica lo que observas.

217
 PRCTICA 27. TCNICA DE SIEMBRA DE HONGOS.
TCNICA DEL CUADRADITO DE AGAR.

VISIN MACROSCPICA

MATERIAL

- Alcohol.
- Mechero Bunsen.
- Placa Petri con medio agar Sabouraud.
- Bistur.
- Pinzas.
- Asa de siembra.
- Muestra con hongos.
- Portaobjetos.
- Cubreobjetos.
- Placa Petri vaca.
- Papel filtro.
- Agua destilada.
- 2 capilares de microhematocrito.
- Estufa.
- Regla.
- Tijeras.

TCNICA

1. Dibujar en un papel un cuadradito de 15x15 cm. Colocar sobre el papel la placa con
agar Sabouraud y cortar un cuadrado siguiendo las lneas dibujadas anteriormente
con la ayuda de un bistur estril.

2. Con unas pinzas estriles coger el cuadradito de agar y ponerlo en el centro de un

portaobjetos. El portaobjetos deber haberse limpiado anteriormente con alcohol y
flameado.
218
3. Coger con el asa de siembra, esterilizada y humedecida, un poco de muestra.

4. Sembrar tocando con el asa en los cuatro laterales del cuadrado.

5. Colocar un cubreobjetos limpio sobre el agar.

6. Colocar el portaobjetos en una placa con papel de filtro humedecido y dos capilares.

7. Incubar a 25oC el tiempo necesario para el crecimiento del hongo.

PROCEDIMIENTO EN IMGENES

1 2

Cortar cuadrado de agar Colocar en portaobjetos

3 4

Coger muestra Sembrar en los laterales

5 6

Colocar cubreobjetos Colocar en la cmara hmeda

219
RESULTADOS

- Indica con una fotografa el resultado obtenido.

- Explica lo que observas.

220
 VISIN MICROSCPICA

MATERIAL

- Portaobjetos.
- Cubreobjetos.
- Pipeta Pasteur.
- Colorante azul de lactofenol.
- Muestra ya incubada (tcnica del cuadradito de agar).
- Pinzas.
- Mechero Bunsen.
- Microscopio.

TCNICA A

1. Cogemos un portaobjetos, lo limpiamos con alcohol y lo flameamos.

2. Con unas pinzas esterilizadas cogemos el cubreobjetos que habamos puesto sobre
el cuadradito de agar.

3. Ponemos una gota de azul de lactofenol en el porta.

4. Poner el cubre sobre la gota de azul de lactofenol.

5. Observar al microscopio a 40x.

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PROCEDIMIENTO EN IMGENES

1 2

Limpiar portaobjetos Coger el cubre

3 4

Poner gota de azul Poner cubre sobre la gota de azul

TCNICA B

1. Coger un cubreobjetos, limpiar con alcohol y flamear.

2. Con las pinzas esterilizadas retiramos el cuadradito de agar que quedar sobre el

portaobjetos.

3. En el portaobjetos ponemos una gota de azul de lactofenol.

4. Poner el cubreobjetos limpio sobre la gota de azul de lactofenol.

5. Observar al microscopio a 40x.

222
RESULTADOS

- Indica con una fotografa los resultados microscpicos obtenidos.

- Explica lo que observas.

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