SELECCIN

MANTENIMIENTO Y
MEJORA DE CEPAS
INDUSTRIALES

SELECCIN DE CEPAS MICROBIANAS

El xito de un proceso fermentativo comienza con la
adecuada seleccin del microorganismo a utilizar.

tener en cuenta lo siguiente:

1. La cepa a utilizar debe ser genticamente estable.
2 Su velocidad de crecimiento debera ser alta.
3. La cepa debe estar libre de contaminantes, incluidos
fagos.
4. Sus requerimientos nutricionales deben ser satisfechos
con medios de cultivo de bajo costo.
5. Debe ser de fcil conservacin por largos perodos de
tiempo, sin prdida de sus caractersticas particulares.
6. Debe llevar el proceso fermentativo en tiempo corto.
7. Si el objetivo del proceso es un producto, ste debe ser
de alto rendimiento y de fcil extraccin.

OBTENCIN
Pueden obtenerse por aislamiento a partir de fuentes naturales o
de una coleccin de cultivos.
A nivel industrial, en general, cada firma posee su propia coleccin de
organismos, muchos de los cuales han sido mejorados a travs de tcnicas
clsicas de mutacin o de ingeniera gentica.
Sin embargo, estas cepas slo son empleadas por la industria que las
posee, debido al gran valor comercial de las mismas.

COLECCIONES O BANCOS DE CULTIVOS

Existen en el mundo muchas colecciones depositarias de cultivos,
como:
"American Type Culture Collection",(ATCC) USA, la cual mantiene
bacterias, levaduras, algas, actinomycetes, mohos, protozoos, virus
y lneas celulares;
"Colletion Nationale de Cultures de Microorganismes del Institut
Pasteur, Francia;
"Northern Regional Research Laboratory (NRRL), de Peoria, USA, y
"National Collection of Type Cultures", Londres, Inglaterra.

COLECCIONES O BANCOS DE CULTIVOS

Abreviatura

Nombre

Localizacin

ATCC

American Type Culture Collection

Rockville, MD, Estados

CBS

Centraalbureau voor Schimmekul turen

Unidos

CCM

Czechoslovak Collection of Mkroorganisms Baarn, Holanda

CDDA

Canadian Department of Agricultura

J. E. Purkyne University,

CMI

Commonwealth Mycological Institute

Brno, Repblica Checa

DSM

Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Ottawa, Canad

FAT

und Zellkulturen GmbH

Kew, Reino Unido

IAM

Faculty of Agriculture, Tokyo University

Braunsweig, Alemania

NCIB

Institute of Applied Microbiology

Tokyo, Japn

NCTC

Nationa l Collection of Industrial Bacteria

Universidad de Tokyo, Japn

NRRL

National Collection of Type Cultures

Aberdeen, Escocia

PCC

Northern Regional Research Laboratory

Londres, Reino Unido

Pasteur Culture Collection

Peora, IL, Estados Unidos

Pars, Francia

AISLAMIENTO DEL AMBIENTE.

La fuente ltima de todas las cepas es el ambiente natural,
( agua, suelo, plantas y desechos)
Por ejemplo, en suelos tratados con pesticidas se pueden
encontrar organismos adaptados a la degradacin de estos
productos qumicos; o en larvas de insectos muertos agentes
causales de la muerte.
Elegida la fuente de aislamiento, se escoge la tcnica a usar:
a) aislamiento directo,
b) Enriquecimiento del cultivo: consiste en incrementar en
una poblacin mixta el nmero de organismos de inters en
relacin al resto.
De esta forma se busca favorecer el crecimiento de un tipo
dado de microorganismos mediante condiciones de cultivo
adecuadas al mismo, o de condiciones inapropiadas para el
desarrollo de los otros.
Esto se logra mediante el empleo de medios de cultivo con
inhibidores.

MANTENIMIENTO O CONSERVACIN DE CEPAS

Los objetivos de la conservacin de los cultivos son:
a) preservar la pureza gentica del cultivo sin prdida
de sus propiedades bioqumicas;
b) preservar los niveles de su productividad inicial

c) lograr que el cultivo pueda ser transportado y

manejado con facilidad.
Tanto para el mantenimiento, preparacin y propagacin
de inculos se deben usar mtodos reproducibles que no
produzcan variaciones o prdidas de las caractersticas de
la cepa empleada.

MTODOS DE PRESERVACIN O MANTENIMIENTO MS IMPORTANTES:

Subcultivo.

Consiste en un repique peridico del cultivo en un medio nutritivo fresco. El

intervalo de transferencia vara con el microorganismo, debiendo considerarse
el medio adecuado para cada especie.
Una vez desarrollados los cultivos se mantienen a 4 C durante lapsos que
oscilan entre 15 das y 2 meses.
Inconvenientes: a) incremento de la posibilidad de mutacin con cada
transferencia, con prdida de las caractersticas del organismo b) riesgo de
contaminacin; c) alteraciones en el medio de cultivo, durante la estada en
fro, en la cual se produce una desecacin gradual del mismo.

Mantenimiento bajo capa de aceite

Consiste en cubrir completamente el cultivo despus de su desarrollo en

medio slido, con una capa de aceite mineral o vaselina estril.
Los cultivos en esta forma se pueden conservar a temperatura ambiente o
an mejor en heladera por perodos de varios aos.
Algunos autores sostienen que en estas condiciones los microorganismos
pueden continuar reproducindose, con posibilidades de aparicin de
mutantes.

Congelacin
Requiere el crecimiento del cultivo hasta la fase estacionaria,
cuando las clulas son ms resistentes a los daos por
congelacin y descongelacin.

El agente crioprotector ms empleado es glicerol al 10%,

dimetilsulfxido, glucosa, dextranos, sacarosa, suero de conejo,
lactosa y extrato de malta.
La suspensin celular es colocada en ampollas (vidrio o plstico)
y sellada antes de colocarla bajo nitrgeno lquido.
Una velocidad de congelacin lenta y una rpida descongelacin
rinden mayores nmeros de clulas viables.
la temperatura de conservacin, la ms baja recomendada es -70
C, ya que a temperaturas ms altas ocurren algunas
recristalizaciones, las cuales si son intracelulares son letales para
las clulas.

Cultivos en tierra

La tierra estril puede ser inoculada con un cultivo e

incubada varios das para inducir esporulacin de bacilos
aerobios y anaerobios.
Producida la esporulacin la tierra es secada y el cultivo
mantenido de esta forma en una atmsfera seca o en
refrigerador.
El mtodo es utilizado ampliamente con hongos y
actinomycetes, los cuales han sido mantenidos en estas
condiciones varios aos.

Preservacin en celulosa
consiste en embeber tiras de papel de filtro con una
suspensin densa de organismos en suero, glutamato de
sodio u otro agente, las mismas son posteriormente
colocadas en tubos para su posterior secado bajo vaco.
De esta forma se conservan cepas de Streptomyces y
Salmonella por perodos de hasta 2 aos a temperatura
ambiente.

Liofilizacin
Mtodo mas adecuado de preservacin.
Se parte de un cultivo de fase estacionaria resuspendiendo
las clulas en un medio crioprotector.
Estas son congeladas a unos -40 C y deshidratada
mediante una sublimacin en vaco hasta valores de
humedad del orden del 1%;
La liofilizacin es apropiada para la conservacin de la
mayora de las bacterias, conservacin de esporos,
actinomycetes y muchos hongos incluidas levaduras.
No es adecuada para clulas animales, algas y hongos en
fase de micelio.
Suele ocurrir que el crecimiento despus de la
rehidratacin tiene una fase de retardo extendida.

MEJORAMIENTO DE MICROORGANISMOS INDUSTRIALES

En general los organismos aislados de la naturaleza producen
metabolitos de inters industrial en niveles muy bajos, por lo
que se hace necesario incrementar estos rendimientos para
mejorar la rentabilidad de los procesos.
Existen dos formas de mejorar el rendimiento:

Mediante la optimizacin del medio de cultivo.

Mediante el mejoramiento gentico de la cepa.

Como la productividad potencial de un organismo es

controlada por su genoma, este puede ser modificado para
incrementar los rendimientos.
La produccin de penicilina, con Penicillium chrysogenum ha
pasado de 1-10 ug/mL, inicial hasta 50 000 ug/ml.
Se han seleccionado cepas de bacterias mutantes que ofrecen
mejores rendimientos.
Generalmente, las bacterias mutantes se separan de las
silvestres hacindolas crecer en un medio selectivo, donde slo
dichas mutantes sobreviven.

MEJORAMIENTO GENTICO
La obtencin de cepas modificadas genticamente se puede
realizar por
1) Seleccin natural de variantes,
2) Mutacin inducida,
3) Recombinacin gentica.

1. SELECCIN NATURAL
Se conoce que en cada divisin celular hay una pequea
probabilidad de que ocurra un cambio gentico, en algunas
clulas de una colonia.
La frecuencia de mutaciones espontneas vara entre 10-6 a 10-9
mutaciones por genoma y por generacin.

La seleccin de variantes naturales, se logra observando las

caractersticas morfolgicas de las colonias, que se asocian con
mayor o menor productividad, lo que permite seleccionar los
clones deseados.
Un procedimiento simple de "screening" selectivo para un tipo
particular de mutantes, consiste en realizar un plaqueo con
medio selectivos usando drogas, metales, etc., donde solo
sobreviven los mutantes resistentes.
Igual procedimiento se sigue sometiendo poblaciones a la
accin de la luz ultravioleta.

2.-MUTACIN INDUCIDA.
implica dos etapas: el tratamiento de la poblacin con el

mutgeno y el aislamiento de los mutantes.

El empleo de diferentes agentes resulta en distintos "espectros" de

mutantes.

Los agentes mutgenos pueden ser:

1) Fsicos, como la luz UV, con longitud de onda de 200 a 300 nm, por
tiempos de 0.5 a 20 minutos, tratando de lograr muertes entre el 90 y
99.9%.
2) Qumicos: Se emplean en concentraciones del orden de 0.05 M con
exposiciones de 0.5 a 12 horas a temperatura constante
(a) Acido nitroso, induce transiciones A-T --- G-C y/o deleciones por uniones
cruzadas en el interior de la cadena.
b) N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG), que produce alta tasa de
mutacin con baja mortandad.
c) Anlogos de base. Producen transiciones, como el 5-bromuracilo y la 2aminopurina.
d) Mutgenos estructurales, como la proflavina o naranja acridina que actan
como agentes de intercalado en la estructura, promoviendo adiciones o
deleciones simples durante la sntesis.

2.1.-MUTANTES CON NIVELES MEJORADOS DE METABOLITOS PRIMARIOS

Las concentraciones de los metabolitos estn reguladas por dos principales
sistemas: inhibicin y represin "feed back".

En la inhibicin, el producto final de una va metablica inhibe la

actividad de una enzima (normalmente la primera) de la va, cundo se
alcanza un valor mximo de concentracin intracelular del producto (caso
de biosntesis de aminocidos).
La primera enzima de la va es de tipo "alostrica", y el producto final se une
a ella en el centro regulador (no compite con el sustrato por el centro activo),
afectando la unin de la enzima al sustrato. Es un control fino y casi
instantneo.

La represin es aquella donde el producto final de una va

metablica previene la sntesis de una enzima o de todas las
que catalizan la va mencionada.

Esto ocurre impidiendo la transcripcin del gen del ADN al

ARNm.
Los mecanismos de regulacin son ms complejos en caso de
vas biosintticas ramificadas donde los productos de cada
brazo son raramente requeridos por el organismo en igual
proporcin.
Como se ve, el conocimiento de la va metablica y su
control facilita la construccin del mutante deseado.

2.2.-Modificacion frecuentes:
a) el mutante no reconoce la presencia del inhibidor o
represor.
Los mutantes que no producen inhibidores o represores por
producto final pueden ser empleados para la produccin de
intermediarios en caminos no ramificados, o de intermediarios
y productos finales en caminos ramificados.
Al no producirse el producto final de la ruta, el control de la
misma es eliminado, pero como estos productos son esenciales
para el crecimiento, los mismos se deben incorporar al medio
en concentraciones tales que permitan el desarrollo, pero que
no ejerzan el control normal por inhibicin o represin.
En este caso los mutantes son auxotrficos para uno o ms
productos finales.

b) no se produce producto final, que es el que controla la

enzima clave de la va metablica

Cuando P es el producto requerido, no es apropiado tener un

auxtrofo.
La solucin es modificar el organismo de tal forma que la
primer enzima (a) no reconozca la presencia de niveles
inhibidores de P.
El aislamiento de tales mutantes se puede alcanzar a partir de
mutantes resistentes a metabolitos anlogos.

c) modificacin en la permeabilidad de la membrana celular.

Permite excretar el producto con facilidad.

Ejemplo en la fermentacin de cido glutmico, un mutante de
Corynebacterium glutamicum, cuya permeabilidad puede ser
modificada por el nivel de biotina.
O sea la permeabilidad celular es controlada por la
composicin del medio de cultivo; de esta forma el organismo
puede excretar glutamato (50 g/L ) con bajas concentraciones
de biotina (5 ug/L ).

2.3.- MUTANTES PRODUCTORES DE ENZIMAS DE INTERS INDUSTRIAL

Solamente se tendrn en cuenta las enzimas

degradativas, cuya produccin puede ser controlada
por induccin, represin "feed back" y/o represin
catablica.
Las mutaciones pueden tener lugar en un gen
regulador, eliminando la produccin de un represor
activo.
Los mutantes que producen enzimas inducibles en
ausencia de inductor se denominan mutantes
constitutivos.

2.4.- MUTANTES CON MEJORES RENDIMIENTOS DE METABOLITOS SECUNDARIOS

Un factor del proceso de control es la regulacin "feed back" lo

que significa que la acumulacin de metabolitos secundarios
(penicilina, cloranfenicol, cicloheximida, cte.) limita su propia
sntesis.
En el caso de caminos ramificados como el de penicilina, la
acumulacin intracelular de lisina disminuye su produccin,
efecto que se revierte por el agregado de a-aminoadipato.
Algunos tipos de regulacin "feed back" involucran a fosfato
inorgnico, el cual regula la actividad de fosfatasas.
En algunos casos la adicin del fosfato al medio de cultivo
limitado se asocia con un incremento de ATP con disminucin de
la formacin de antibitico.

Debido a que la produccin de estos metabolitos es afectada

por mecanismos de control genticamente determinados, las
mutaciones pueden tener efectos importantes en el
mejoramiento de cepas.

2.5.-INCONVENIENTES DE LOS MUTANTES

Los programas de mejora suelen ser muy largos y tediosos, y a
menudo no dan los resultados deseados
La mutagnesis origina mutaciones aleatorias en el organismo, la
mayor parte de las cuales son negativas para su supervivencia, o
empeoran algunas de sus caractersticas originales.
Mutaciones que conducen a la aparicin de propiedades nuevas
positivas son raras, y el proceso de su bsqueda es complicado.
Esto obliga a trasladar la mutacin "positiva" a un fondo gentico
distinto (cepa silvestre previamente seleccionada). Esto complica y
alarga la mejora gentica.
Los organismos seleccionados pueden acumular mutaciones
desconocidas
En las especies dotadas de sexualidad, la mejora por recombinacin
gentica est limitada al cruce entre razas de la misma especie, o de
especies compatibles

3. RECOMBINACIN GENTICA
Los virus por infeccin mixta pueden intercambiar material gentico
entre especies.
En bacterias el fenmeno de recombinacin se observa en:
1) Conjugacin: transferencia de material gentico a travs de pilis.
2) Transduccin: Transferencia de ADN de una clula a otra por un
vector viral.
3) Transformacin: Recombinacin por insercin de un ADN aislado, a
una bacteria receptora.
Fusin de protoplastos. Produce intercambio de material gentico
entre diferentes especies. La incubacin de protoplastos resulta en
regeneracin de la pared celular y reversin a una clula de morfologa
normal, para recuperar un organismo. La fusin celular es seguida por
fusin nuclear.
Esta tcnica se emplea en la obtencin de hibridomas .El cultivo de
este tipo de clulas produce anticuerpos monoclonales, que pueden
ser usados para combatir tumores.

3.1.- OBTENCIN DE NUEVAS CEPAS POR INGENIERA GENTICA

La dcada de 1970 marca el comienzo de la unin entre las

tcnicas bioqumicas para manipular el ADN in vitro con las
tcnicas genticas para transferir el ADN de una clula a otra.
A travs del procedimiento de clonado de ADN, genes de
cualquier tipo pueden ser tomados de su ambiente natural,
analizados, alterados y reinsertados en el mismo tipo de
organismo o en otro diferente.
As se pueden producir: solventes, productos qumicos,
hormonas, antgenos, enzimas y sustancias de inters
farmacolgico, a travs del clonado de genes especficos en
organismos de interes.
El aspecto principal del clonado es la propagacin de un
fragmento determinado de ADN en una lnea celular en
crecimiento. Este fragmento, para poder propagarse debe ser
unido a una molcula transportadora o vector capaz de
multiplicarse en el husped.

IDENTIFICACIN DE CLONES DE INTERS

La identificacin de los clones de inters entre cientos o miles
de clones representa un problema que demanda tiempo y que
depende de la sensibilidad y especificidad del sistema de
deteccin.
Muchos mtodos utilizan sondas radiactivas de gran
especificidad que contienen secuencias complementarias al
ADN de inters.
La identificacin puede hacerse obteniendo una rplica de las
colonias en un filtro, las cuales son posteriormente lisadas, el
ADN fijado al filtro, hibridizado con la sonda y detectado por
autoradiografa.