UNIVERSIDAD AUTNOMA DEL PER

FACULTAD DE INGENIERIA Y ARQUITECTURA

ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE
INGENIERIA AMBIENTAL

ANLISIS MICROBIOLGICO DE MUESTRAS

AMBIENTALES
AUTORES

BELLIDO REDOLFO, Diego

LEON GERONIMO, Susan
VILCA ARCELA, Carol

DOCENTE

Gonzalo Gallo Mendoza

CICLO/SECCIN

304 D

SEMESTRE

Ciclo 2016

LIMA SUR-PER
2016

OBJETIVOS

Reconocer de manera experimental la importancia del anlisis de

muestras ambientales.

Observar mediante un microscopio las caractersticas de los

microorganismos encontrados en el medio de cultivo Agar Saboraud
mediante el mtodo de sedimentacin en placa.

Demostrar de manera prctica mediante diversos mtodos, la presencia

de microorganismos en el ambiente que nos rodea, en este caso el
laboratorio de microbiologa de la Universidad Autnoma del Per.

CONCLUSIONES
o La gran cantidad de microorganismos presentes en el medio ambiente
ya sea aire, suelo, agua es un factor determinante para la importancia
que se le debe dar al momento de su estudio, ya que de acuerdo a los
resultados obtenidos podemos realizar un control microbiolgico.

o Con ayuda de asas de siembras logramos obtener pequesimas

muestras de hongos y posteriormente adicionndole una gota de lugol a
cada lamina para distinguir las caractersticas a nivel microscpico del
hongo.
o Con estos anlisis podemos concluir que existe una gran cantidad de
microorganismo en el ambiente (en este caso el laboratorio de
microbiologa), los mtodos empleados facilitan el reconocimiento de los
microorganismos.

PREGUNTAS
1. Investiga los parmetros de calidad microbiolgica para los
mtodos empleados.
o

Anlisis microbiolgico

Criterios microbiolgicos

Gel refrigerante

Hisopo:

Peligro

Riesgo

Vigilancia sanitaria

2. Investigue como se logran condiciones de esterilidad en ambientes.

El ozono es un gas muy efectivo para combatir las bacterias que estn
en un ambiente y desinfectarlo correctamente. Incluso su empleo no es
costoso. Con esto, podramos decir que el ozono se convierte en la
forma ideal de esterilizar el ambiente.
Se pueden utilizar ozonificadores, los cuales lanzan el ozono al aire para
que ste acte y termine con todas las bacterias, grmenes y tambin
con los olores; un aspecto que es muy particular en lugares sanitarios y
que causa desagrado a ms de uno. De este modo, el ozono ataca,
combate y elimina a las bacterias reduciendo el riesgo de contagio de
enfermedades.
3. Investigue sobre mtodos rpidos para el control microbiolgico de
ambientes
A) SEDIMENTACIN
Es el mtodo ms rudimentario de medicin de microorganismos en el
ambiente. Consiste en la exposicin de placas de Petri al ambiente
durante un cierto tiempo.
Este mtodo tiene la ventaja de que se puede realizar en todas las
condiciones habituales de trabajo y en tiempo real, es el ms econmico
y requiere muy poco tiempo de dedicacin.
El resultado ha de expre|sarse como: u.f.c (unidades formadoras de
colonias) /cm2/hora (no puede referirse a un volumen de aire, por lo que

los resultados no pueden ser cuantitativos/volumen de aire, pero si

comparativos).
Los tiempos de exposicin no deben ser extremadamente largos para
evitar que se reseque la superficie de la placa.
Se utilizan placas de Petri estndares de 90 mm de dimetro y los
medios ms utilizados son:
Agar de Triptona y Soja (T.S.A) para el recuento de aerobios (ref. 064PA0031, para placas preparadas y ref. 1-200 para el medio
deshidratado).
Agar Rosa de Bengala o Agar de Sabouraud cloranfenicol para el
recuento de hongos (Ref. 064-PA0038 o 064-PA0026, para placas
preparadas y ref. 1-301 o 1-166 para el medio deshidratado).
En el caso de control de salas blancas recomendamos utilizar placas
preparadas e irradiadas, de esta forma evitamos introducir
contaminacin en la sala y los recuentos son fi ables.
Ref. 064PA0031I, placas de 90 mm de dimetro de T.S.A irradiadas.
Ref. 064PA0026I, placas de 90 mm de dimetro de Agar Sabouraud
Cloranfenicol irradiadas.
El Agar Rosa de Bengala es un medio selectivo para la deteccin de
hongos que, adems de los requerimientos nutritivos para el desarrollo
de los mismos, incorpora el indicador de Rosa de Bengala que, adems
de teir las levaduras de color rosado, facilitando su contaje, impide el
crecimiento masivo de mohos tales como Rhizopus y Neurospora
permitiendo as detectar otros de crecimiento ms lento. Recomendamos
por tanto este medio para ambientes frecuentemente contaminados con
este tipo de mohos.
Se puede recurrir al uso de otros medios selectivos cuando nos interese
controlar grupos concretos de microorganismos, por ejemplo el Agar
MacConKey o el Agar Rojo Bilis Violeta para entero bacterias o
coliformes, el Agar Baird Parker para estafilococos, etc. No dude en
consultarnos y le indicaremos cul puede ser el medio idneo para su
control.
B) RECOGIDA EN MEDIO LQUIDO
Consiste en hacer pasar un volumen determinado de aire en forma de
burbujas a travs de un caldo de cultivo o solucin isotnica, en los
cuales, tericamente, quedan retenidos la mayor parte de los
microorganismos.

El recuento de microorganismos se realiza a partir de la siembra de

alcuotas de esta muestra, pudiendo utilizar a continuacin las distintas
tcnicas de anlisis cuantitativo (NMP, inclusin en agar, filtracin).
Este mtodo es ms laborioso que el anterior y necesita ms utillaje
(bomba de vaco o trompa de agua, material de vidrio). Se introducen
por tanto en el ambiente ms variables (el propio utillaje y el analista,
que debe estar presente mientras se efecta el muestreo).
En este caso no existe peligro de desecacin del medio de cultivo y hay
exactitud en el recuento que se puede expresar en u.f.c/m3 de aire. Una
posible proliferacin bacteriana en el lquido puede conducir a errores en
la cuantificacin.
Los medios de cultivo que se utilizan son los mismos que en el caso de
la sedimentacin y adems, la Ref. 3-156 Agua de Peptona o Ref. 6-073
Solucin Ringer, que se utilizan como lquido de burbujeo en la recogida
de la muestra.
C) FILTRACIN
Se hace pasar un volumen determinado de aire a travs de un filtro en el
cual quedan retenidas las partculas portadoras de microorganismos.
Se pueden utilizar distintos tipos de filtros, siendo los ms comunes los
de membrana celulsica, o los de gelatina, los cuales se llevan
directamente sobre un medio de cultivo slido o bien se lavan,
realizando posteriormente siembras en un medio slido a partir del
lquido de lavado.
Tiene las mismas ventajas y desventajas que el mtodo anterior, a
excepcin de que en este caso s que puede producirse la muerte de
microorganismos por desecacin con volmenes de muestreo superiores
a 250 l.
Los medios de cultivo utilizados son los mismos que para el mtodo de
sedimentacin. Si se hace un lavado de las membranas, se requiere
tambin la ref. 3-109 Lquido de lavado para membrana filtrante.
D) IMPACTACIN
Un volumen determinado de aire se impacta sobre un medio de cultivo
slido.
Existen varios equipos basados en este mtodo:
1. Recolector de Andersen 6 niveles
2. Recolector de Andersen 1 nivel

3. Recolector de hendidura CASELLA

4. Recolector RCS (Reuter Centrifugal System)
5. Muestreador SAS (Surface Air System)
Este mtodo es el ms costoso en cuanto a material y a mantenimiento.
Requiere formacin del analista y su presencia durante el muestreo, por
lo que, en el ambiente, se incluyen variables distintas a las habituales en
tiempo real. Disminuye el tiempo de recogida de la muestra. En
muestreos prolongados y en condiciones de sequedad y altas
temperaturas puede desecarse el medio de cultivo.
Los muestreadores SAS estn preparados para trabajar con placas de
Rodac estndar o placa de 90 mm, sin embargo otros requieren material
especial, que slo suministra el mismo proveedor que vende el equipo.
MUESTREADORES DE AIRE AMBIENTAL SAS (SURFACE AIR
SYSTEM)
El sistema ms cmodo y rpido para efectuar el muestreo ambiental y
la deteccin de contaminaciones de tipo biolgico.
Pueden utilizarse placas RODAC (utilizada en el control de superficies) o
placas petri convencionales de 90 mm.
Facilita el trabajo bajo GLP y GPM gracias a un completo sistema de
microprocesador, que permite el registro en memoria de fecha, hora,
volmenes de muestreo, e incluso datos de la sala y del operador.
Puede memorizar hasta 32 registros y transmitirlos a un PC o impresora
gracias a un interface, RS 232.

TCNICAS DE
SUPERFICIES

MUESTREO

DE

MICROORGANISMOS

EN

Los instrumentos y superficies de trabajo, debido a las condiciones

habituales de uso, o bien, a causa de una deficiente desinfeccin,
pueden actuar como reservorios de los contaminantes biolgicos.

Normalmente el mtodo no recupera todos los microorganismos, pero si

proporciona una valiosa informacin.
Los procedimientos bsicos para el muestreo de superficies son:
A) MTODO DE LA PLACA DE CONTACTO (PLACA RODAC)
El mtodo de contacto directo del agar con los microorganismos que se
multiplican (RODAC=
Replicate Organisms Direct Agar Contact) utiliza placas Petri especiales,
ideales para la investigacin de grmenes en superficies. Se usa medio
de cultivo TSA o diferentes medios selectivos a conveniencia.
Se aade a una placa de Rodac, un medio de cultivo slido
(seleccionado en funcin de los microorganismos buscados), en ligero
exceso, para que la superficie quede convexa.
Modo de empleo
La placa se coloca sobre la superficie a muestrear de una forma directa,
mantenindola inmvil y presionando.
Cerrar e invertir la placa para su incubacin, a temperatura y tiempo
adecuados segn el medio y determinacin realizada.
B) LAMINOCULTIVOS
La utilizacin de sistemas analticos cada vez ms rpidos y ms
prcticos es una exigencia comn en todos los laboratorios de control
microbiolgico.
Los lamino cultivos son sistemas prcticos, estudiados y diseados
especialmente para la determinacin cuantitativa y cualitativa de los
microorganismos en todos aquellos sectores productivos en los cuales
es necesario el control de la micro biota contaminante.
Este sistema analtico ofrece las siguientes ventajas:
Permiten la determinacin cualitativa y cuantitativa de los
microorganismos.
La presencia de dos medios de cultivo en un solo soporte permite
efectuar muestreos separados con un solo lamino cultivo.
El cierre hermtico con tapn roscado disminuye la posibilidad de
contaminacin accidental y mejora la estabilidad del producto.
Su reducido volumen facilita el transporte, almacenamiento y permite
una mejor gestin del espacio siempre escaso de la estufa de
incubacin.
Los lamino cultivos se presentan en dos versiones:
Una estudiada para el muestreo y control de lquidos: lamino cultivos
con dos o tres medios de cultivo, y otra pensada para el control de
superficies: lamino cultivos con dos superficies. En este caso poseen un
soporte flexible que con la simple presin de la mano puede doblarse en
ngulo de 90 respecto al tapn, permitiendo as una posicin
perfectamente paralela con la superficie a muestrear.

Modo de empleo e interpretacin de resultados

Para muestras lquidas:
La inmersin del lamino cultivo en las muestras lquidas permite que
parte de las bacterias presentes en el lquido se adhieran al medio de
cultivo. El nmero de microorganismos que se fijan sobre el sustrato
nutritivo es proporcional a la poblacin de la muestra. Tras la incubacin,
si la muestra estaba contaminada, se desarrollarn colonias visibles
sobre el lamino cultivo.
Aflojar el tapn y sacar el lamino cultivo del tubo sin tocar la superficie
del agar.
Sumergir el lamino cultivo totalmente en el recipiente que contenga la
muestra, durante un mximo de 5 segundos.
(El mismo tubo del lamino cultivo puede servir de recipiente para ser
llenado con el lquido de muestra, recordando siempre de vaciarlo tras la
inmersin. Si se dispone de poco volumen de muestra, dejarla gotear
sobre el lamino cultivo con ayuda de una pipeta Pasteur.)
Dejar escurrir el exceso de muestra del medio de cultivo.
Volver a meter el lamino cultivo en su tubo y roscarlo bien.
Incubarlo en la estufa, en posicin vertical, durante el tiempo y la
temperatura indicada.
Sacar el lamino cultivo y comparar la densidad de las colonias crecidas
con la siguiente tabla de patrones que indica la carga microbiana
correspondiente por ml de muestra lquida.
El recuento microbiano en lquidos de la tabla se ha realizado por
comparacin con las figuras adjuntas y se expresa en unidades
formadoras de colonias (u.f.c) por ml.
Si el recuento obtenido es superior a 100.000 unidades formadoras de
colonias por ml, se recomienda repetir el proceso a partir de una dilucin
de la muestra en Agua de Peptona y luego multiplicar los resultados por
el factor de dilucin. De esta forma conseguiremos resultados ms
fiables.

Para superficies:
Aflojar el tapn y sacar el lamino cultivo del tubo sin tocar la superficie
del agar.
Plegar la paleta del lamino cultivo apoyando un dedo sobre el borde del
extremo (Vase imagen en la pgina anterior).
Apoyar el medio de cultivo n 1 sobre la superficie a muestrear, cuidando
que el contacto sea total, ejerciendo una ligera presin, pero sin
desplazarlo.
Girar el lamino cultivo y repetir el mismo procedimiento con el medio n
2. Muestrear en una superficie muy prxima a la anterior, pero sin que
coincida. Si la superficie a controlar no es plana o es de difcil acceso,
tomar la muestra con un hisopo estril humedecido en Ringer o Agua de
Peptona y despus hacerla girar sobre toda la superficie del medio n 1
del lamino cultivo. Repetir la operacin para el medio n 2.
Para la toma de muestras de superficies tratadas con desinfectantes o
detergentes utilizar lamino cultivos con medios de cultivo que contengan
neutralizante, de esta forma se inhiben los restos de estas sustancias
que puedan quedar en la superficie y pudiendo verificar la actividad
bactericida de los desinfectantes.
Anotar la zona de muestreo correspondiente a cada tipo de agar.
Volver a meter el lamino cultivo en su tubo y roscarlo bien.
Incubarlo en la estufa, en posicin vertical, durante el tiempo y la
temperatura indicada.
En caso de ser necesarias unas condiciones de convencin para
proceder a la incubacin, se recomiendan las siguientes:
Hongos y levaduras: 24-48 h a 25-30 C
Resto de determinaciones: 24-48 h a 37 C
Sacar el lamino cultivo y comparar la densidad de las colonias crecidas
con la tabla de patrones que indica la carga microbiana correspondiente
por ml de muestra lquida.
El recuento microbiano de las superficies se lleva a cabo contando las
colonias presentes en cada uno de los medios del lamino cultivo y se
divide entre 10. Este resultado corresponder a las unidades formadoras
de coloniaC).

MTODO
DEL
ESCOBILLN O FROTIS
Se utilizan torundas estriles de algodn; es un mtodo especialmente
indicado para superficies de difcil acceso para las placas de contacto o
los lamino cultivos, como superficies flexibles, irregulares o muy
contaminadas. La recuperacin de los microorganismos depende de la
textura de la superficie, de su naturaleza y del tipo de flora. A pesar de
sus limitaciones, este mtodo es rpido, sencillo y barato para calcular la
flora microbiana de superficies y herramientas.
Modo de empleo
Se coloca una plantilla estril en la superficie a examinar y se refriega
con cuidado la zona expuesta con un escobilln humedecido en solucin
de Ringer (ref. 6-073, 064-TA2120 o 064-TA2159), o en Agua de
Peptona Tamponada (ref. 2-277 o 064-TA0100), para facilitar la toma de
muestra.
En este caso si la superficie ha sido limpiada con detergentes o
desinfectantes se recomienda usar medios de cultivo con neutralizantes,
como por ejemplo el Agar Letheen Modifi cado (ref. 1-237), o
TSA+Polisorbato+Histidina+Lecitina (ref. 1-613,064-PA0075).
A continuacin se introduce el escobilln en un tubo con 10 ml de
solucin salina y se agita. Se obtiene un dilucin 1/10. Si se sospecha
que la superficie est muy contaminada, se prepara un banco de
diluciones con 9 ml de Ringer.
Las placas se inoculan con alcuotas de 0,1 ml en placa s de TSA. Se
hace un duplicado como mnimo por siembra. Con el asa de Drigalsky,
previamente esterilizada a la llama con alcohol, se reparte el inculo por
toda la superficie, efectuando movimientos de rotacin hasta que el
lquido queda completamente absorbido.
Otra opcin es realizar siembras directamente en medio slido, haciendo
girar la torunda por toda la superficie del agar.

Las placas sembradas se incuban en posicin invertida, Cerrar e invertir

la placa para su incubacin, a temperatura y tiempo adecuados segn el
medio y determinacin realizadas por cm2.
El equipo MAS-100 NT es un instrumento de alto rendimiento que est
basado en el principio de muestreado de aire Andersen, el cual aspira
aire a travs de una placa perforada. El flujo de aire resultante es
dirigido sobre una placa estndar de agar. Despus del ciclo de
coleccin, la placa Petri es incubada y las unidades formadoras de
colonias (UFC) son contadas.
El MAS 100 NT opera con un dispositivo de succin de alto
rendimiento y el volumen aspirado es continuamente monitoreado. El
sistema mide el flujo de aire que ingresa y regula el volumen aspirado a
un valor constante estndar de 100 litros por minuto. Este equipo regula
automticamente el volumen de acuerdo a la presin y temperatura
ambiental arrojando resultados comparables de forma constante. Para
mediciones en rea biolimpias y/o de contaminacin controlada, el
volumen de muestra recomendado de acuerdo a parmetros
internacionales debe ser de 1000 litros.

EQUIPOS ENERCIALES:
IMPACTADORES:
Muestreador de rendija:
En estos muestreadores, el aire penetra a travs de una serie de
rendijas a una velocidad determinada, y es impulsado sobre la superficie
de impacto, que puede ser una placa con medio de cultivo.

Frascos borboteadores:
Funcionan conduciendo una corriente de aire al interior de un frasco que
contiene un medio de captacin lquido. Las partculas son transferidas
al lquido, qu puede ser agua destilada, soluciones salinas tamponadas
o medios de cultivo diluidos

RESULTADOS
o Mtodo de sedimentacin en placa:

Agar Saboraud.: Despus de la exposicin al ambiente de trabajo,

al cabo de dos horas, se obtuvo gran presencia de hongos de
distintos tipos, con caractersticas visibles, esto debido a la gran
actividad por parte de los alumnos dentro del laboratorio dentro
del tiempo de exposicin de la placa con el medio de cultivo.

Agar TSA: Luego de la exposicin se obtuvo gran presencia de

grmenes, alrededor de 213ufc en un rea de 78.53cm 2, debido a
la ubicacin de la placa en el aula, que era cerca a las ventanas
por donde ingresa el aire del exterior.
A = r2
Para una placa de 10 cm de dimetro el rea es
A = 3,14 x 5cm2 = 78.53 cm2

o Mtodo del enjuague: En las tres pruebas realizadas, Agar(TSA,

Saboraud, EMB) los resultados fueron en el primer caso 10 ufc, en el
segundo caso que es el Agar Saboraud obtuvimos 25ufc, y en el EMB
negativo sin presencia de m.o.
o Mtodo del Hisopado: En las tres pruebas se obtuvo gran presencia de
microorganismo que se extendan por toda la superficie del medio de
cultivo.
o Mtodo de placa Rodac: Se realizaron dos pruebas por cada medio de
cultivo, realizando la impresin en distintos puntos del rea de trabajo,
de esa manera se obtuvo gran presencia de microorganismos en
algunos casos.

ANEXOS
Mtodo del enjuague.

Mtodo del hisopado.

Mtodo de sedimentacin.

Mtodo de placa rodac.

Hisopado

Enjuague

Placa Rodac

Enjuague

Hisopado

Sedimentacin