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    Conservación de Cepas Glicerol

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    Pedro Peralta Macotela
    El documento describe los métodos para la criopreservación de cepas bacterianas utilizando glicerol como agente crioprotector. El glicerol permite disminuir drásticamente la actividad metabólica de las células bacterianas al congelarlas y así preservarlas a largo plazo. El procedimiento implica mezclar cultivos bacterianos en fase estacionaria con una solución de glicerol al 10-25%, equilibrar durante 30 minutos a temperatura ambiente, fraccionar en viales y almacenar a -70

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    Conservación de Cepas Glicerol

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    Pedro Peralta Macotela
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    El documento describe los métodos para la criopreservación de cepas bacterianas utilizando glicerol como agente crioprotector. El glicerol permite disminuir drásticamente la actividad metabólica de las células bacterianas al congelarlas y así preservarlas a largo plazo. El procedimiento implica mezclar cultivos bacterianos en fase estacionaria con una solución de glicerol al 10-25%, equilibrar durante 30 minutos a temperatura ambiente, fraccionar en viales y almacenar a -70

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    El documento describe los métodos para la criopreservación de cepas bacterianas utilizando glicerol como agente crioprotector. El glicerol permite disminuir drásticamente la actividad metabólica de las células bacterianas al congelarlas y así preservarlas a largo plazo. El procedimiento implica mezclar cultivos bacterianos en fase estacionaria con una solución de glicerol al 10-25%, equilibrar durante 30 minutos a temperatura ambiente, fraccionar en viales y almacenar a -70

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    Conservación de Cepas Glicerol

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    Pedro Peralta Macotela
    El documento describe los métodos para la criopreservación de cepas bacterianas utilizando glicerol como agente crioprotector. El glicerol permite disminuir drásticamente la actividad metabólica de las células bacterianas al congelarlas y así preservarlas a largo plazo. El procedimiento implica mezclar cultivos bacterianos en fase estacionaria con una solución de glicerol al 10-25%, equilibrar durante 30 minutos a temperatura ambiente, fraccionar en viales y almacenar a -70

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    Mesa #4

    Laboratorio de Tpicos de Bacteriologa Cnica

    Conservacin de cepas: Glicerol

    Objetivo

    Disminuir al mnimo la actividad del microorganismo a largo plazo mediante la


    criopreservacin.

    Introduccin
    dcdlcmdlmcedlmc

    Mtodo ideal de conservacin

    Cultivos puros, sin contaminacin.


    Sobrevida del 70-80% del inculo.
    Genticamente estables.

    Fundamento

    Congelamiento y descongelamiento rpido.


    Glicerol. Agente crioprotector no inico (neutraliza el efecto de las sales).
    La congelacin disminuye la actividad metablica drsticamente de una clula por la
    disminucin de agua disponible hasta el caso de prcticamente anularlo con nitrgeno
    lquido (-196C).
    Compuesto qumico no txico, atraviesa con facilidad la membrana celular y se acumula
    intracelularmente. Reduce al mnimo los efectos perjudiciales del aumento de la
    concentracin de solutos y la formacin de cristales de hielo lisis celular.
    Temperatura:
    En aquellos congeladores que slo alcanzan temperaturas entre 20 C y 40 C, no son
    aconsejables, entre otras cosas porque debido a la gran concentracin de solutos que existen en
    la suspensin celular, su punto de congelacin baja. El dao que se produce en las clulas es
    debido a que a estas temperaturas hay frecuentes congelaciones y descongelaciones. Si se
    aade un crioprotector no inico, como por ejemplo el glicerol, se reduce la cantidad de hielo que
    se produce y se evita el aumento de la concentracin inica.
    La congelacin debe ser lenta a la par con una descongelacin rpida. Condiciones:
    Un C por minuto hasta -20C y luego un rpido descenso en la temperatura.
    Temperatura de conservacin ms baja recomendada es -70C (esto
    recristalizacin intracelular).

    Microorganismos

    Hongos y bacterias.

    evita

    la

    Mesa #4

    Laboratorio de Tpicos de Bacteriologa Cnica

    Mesa #4

    Laboratorio de Tpicos de Bacteriologa Cnica

    Procedimiento
    Los microorganismos pueden ser preservados de -5 a -20 C por 1-2 aos por congelacin en
    cultivo en caldo o en suspensiones celulares en viales. Para los procesos de profunda
    congelacin requieren crioprotectores como el glicerol o DMSO, cuando son almacenadas a -70C
    o en nitrgeno lquido de -156 a -196C. Con cultivos en caldo se toman de la mitad o pasada la
    fase logartmica del crecimiento y mezclado con un volumen igual de 10 a 20% (v/v) de glicerol o
    de 5 a 10% (v/v) de DMSO. Alternativamente, se puede preparar una suspensin de glicerol al
    10% v/v de crecimiento del microorganismo desde las cajas petri. En este caso la suspensin es
    pipeteada a viales criognicos o ampolletas, se congela y se almacenan.
    Solucin de glicerol (alcohol) 10-25 %.
    Temperatura: -70 C
    Preparacin pre-congelado:
    Periodo de equilibrio.
    Se inocula en el medio lquido, se incuba hasta la fase estacionaria, centrifugar, se retira el
    pellet y se resuspende en 25 mL caldo, aadir el crioprotector (glicerol).
    Tiempo: 30 minutos a temperatura ambiente. El agente crioprotector puede ser
    txico para las clulas si el tiempo de equilibrio es demasiado largo.
    Fraccionamiento en viales.

    Reconstitucin (deshielo).
    Descongelacin rpida: bao Mara (37 C)
    Crioviales:
    Criotolerancia, tapa a rosca y oring. Mxima capacidad de almacenamiento y
    facilidad de manejo.
    Colocar 0,5-1,0 mL de la suspensin de celular, no llenar.
    Recuperacin post-congelado.
    Una vez recuperadas, nunca utilizar los microorganismos inmediatamente en pruebas
    fisiolgicas, realizar de 1-2 pasajes previos (estrs celular).
    Transferir a medios adecuados (caldos o medios agarizados).
    Tiempo de incubacin: puede disminuir la velocidad de crecimiento.

    Factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de las cepas

    Temperatura de almacenamiento:
    Nitrgeno lquido: -196 C (forma gaseosa -140 C).
    Se utiliza para la conservacin de bacterias, virus y lneas celulares. Existen varios problemas
    prcticos: el nitrgeno se evapora continuamente por lo que se debe rellenar regularmente; se
    deben utilizar recipientes que resistan bien estas temperaturas y que estn bien cerrados para
    evitar la entrada del nitrgeno.

    Mesa #4

    Laboratorio de Tpicos de Bacteriologa Cnica

    Ultrafreezer: hasta -96 C.


    Congelador: -20 a -40 C.
    Alta densidad celular:
    Usar entre 107-104 clulas/mL: lisis de parte del inculo.
    Edad de las clulas:
    Velocidad de crecimiento promedio (18 horas, 1 semana, 20 das).
    Lo ideal es la preservacin en la fase log tarda o al inicio de su fase estacionaria
    (mayor resistencia a la congelacin y descongelacin).
    Si se trata de cepas que cuentan con un estado de esporulacin, se debe realizar en
    ese momento.
    Nucleacin cristalina:
    Velocidad de congelacin: 1-10 C/minuto minimiza el efecto de la concentracin
    de los solutos durante la nucleacin.
    La congelacin paulatina evita la lisis celular.

    Ventajas

    Viabilidad 7-10 aos. Glicerol 20% garantiza viabilidad por 3 aos.


    No se han reportado cambios a nivel gentico.
    Apto para gran variedad de microorganismos.
    Sencillo, pre-tratamiento mnimo.

    Desventajas

    Requiere equipo especial, aumenta el costo.


    Suministro constante de energa.
    Especio fsico refrigerado.
    No apto para el envo de cepas

    Mesa #4

    Laboratorio de Tpicos de Bacteriologa Cnica

    Bibliografa
    1.
    2.

    3.

    Burguet LN, Sierra PN, Acosta EM. Evaluacin de una formulacin para la conservacin de cepas de
    Pseudomonas aeruginosa. Revista CENIC Ciencias Biolgicas, Vol. 45, No. 1, pp. 51-56, 2014.
    Arencibia DF, Rosario LA, Gmez R. Mtodos Generales de Conservacin de Microorganismos.research Gate
    (2008)
    Morales GY, Duque E, Rodrguez AO, De la Torre J, Martnez CR, Prez TR, Muoz RJ. Bacterias preservadas, una
    fuente importante de recursos biotecnolgicos. BioTecnologa (2010) Vol 14 no 2

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