ELISA

ELISA (acrnimo del ingls Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por

inmunoabsorcin ligado a enzimas) es una tcnica de inmunoensayo en la cual un
antgeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz
de generar un producto detectable como cambio de color o algn otro tipo; en
ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe
un anticuerpo primario que reconoce al antgeno y que a su vez es reconocido por un
anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La
aparicin de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometra el
antgeno en la muestra.
Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular est presente
en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo,
involucra a un gran nmero de variables, tales como selecin de reactivo, temperatura,
medicin de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los
pasos sucesivos y al resultado de la prueba.
La interaccin antgeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar
si un paciente tiene una infeccin o una enfermedad autoinmune. Pero como prueba
diagnstica, posee diversas limitaciones que conviene conocer:
-En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no
significa necesariamente que el paciente est enfermo. El cuerpo de una persona que ha
estado enferma y que ya se ha recuperado, puede seguir produciendo anticuerpos. Esto
originara un falso positivo.
-En segundo lugar, hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo
que stos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso
negativo. Sera el caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia,
o que se encuentren en el periodo ventana de la infeccin en el momento de realizar la
prueba, o que estn infectadas por una cepa extraa.
-En tercer lugar, pueden aparecer falsos positivos cuando se da inespecificidad entre
antgeno-anticuerpo.
En estos casos de diagnstico de enfermedad es recomendable la eliminacin (mediante
centrifugacin) de clulas de la sangre que puedan interferir con el ensayo y pueda

ocasionar un resultado falso positivo, careciendo aqul de especificidad. Tambin,

debemos tener en cuenta que cuando se trata de diagnosticar una enfermedad que posee
un valor predictivo positivo bajo en una determinada poblacin, es decir, que esa
enfermedad tiene muy baja incidencia en dicha poblacin, es necesario volver a
confirmar el resultado positivo mediante otro mtodo de diagnostico independiente.
Normalmente, se lleva a cabo un western blot donde se detecta la presencia de varios
anticuerpos, simultneamente, frente a la misma infeccin en una muestra. El resultado
del western se considera positivo cuando aparecen al menos 5 bandas, que indica que 5
anticuerpos diferentes estn presentes en el sujeto frente a esa infeccin. Entonces es
cuando se diagnostica como positivo a dicho paciente.
Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es verstil,
robusto, simple en su realizacin, mediante el uso de la fase slida, una separacin fcil
entre la fraccin retenida y la fraccin libre.
Adems se han propuesto y desarrollado diferentes mtodos de amplificacin de la seal
(luminiscentes, cascadas enzimticas...) que han permitido elevar la sensibilidad de
algunos ELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal.
Este mtodo ha tenido una enorme aplicacin en todos aquellos campos en los que se
precisaba la cuantificacin de productos mediante anticuerpos: diagnstico clnico,
deteccin viral, clasificacin de anticuerpos en isotipos, bsqueda de anticuerpos
monoclonales, etc.

Contenido

1 Dispositivos empleados en ELISA

2 Fases de un ensayo ELISA

3 Tipos de ensayos ELISA

4 Quimioluminiscencia

5 Marcadores enzimticos ms comnmente utilizados

6 Prueba ELISPOT

7 Enlaces externos

Dispositivos empleados en ELISA

Se han ensayado numerosas fases slidas, desde los tubos de cristal de los orgenes a las
actuales microplacas de 96 pocillos de plstico tratado para aumentar su capacidad de
absorcin (fenmeno de superficie) de molculas y con fondos de pocillo pticamente
claros para poder realizar las medidas de densidad ptica en instrumentos especficos,
espectrofotmetros de lectura de placas que han recibido el nombre de lectores ELISA.
Actualmente se estn desarrollando dispositivos de mayor capacidad, por ejemplo con
384 y 1536 pocillos, adecuados para los sistemas de 'screening' masivo de los sistemas
robotizados (HTS, 'High-throughput system')

Los lectores ELISA son espectrofotmetros capaces de realizar lecturas seriadas de

cada uno de los pocillos de la placa ELISA. A diferencia de un espectrofotmetro
convencional, con capacidad de leer todas las longitudes de onda del ultravioleta y el
visible de manera continua, los lectores de ELISA disponen de sistemas de filtros que
slo permiten la lectura de una o pocas longitudes de onda. Son la que se corresponden
con las necesarias para determinar la densidad ptica de los cromgenos ms
comnmente utilizados.

Fases de un ensayo ELISA

Bajar ELISA.gif !!! Pademostracin!!!
Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes:
1. Conjugacion del anticuerpo o del antgeno con un enzima (peroxidasa,

fosfatasa alcalina...). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los

ensayos directos e indirectos, sandwich, etc. El antgeno marcado se emplea en
ensayos de competicin de antgeno. Dicha unin anticuerpo-enzima o antgenoenzima ha de producirse durante un determinado periodo de tiempo en aras de
producir una solucin coloreada y que pueda ser valorada visualmente o
cuantificada por medio de un espectrofotmetro (normalmente a una longitud de
onda de 414 nm). Si no transcurre el tiempo adecuado para que se de la reaccin,
no se evidenciar ningn color, interpretndose este resultado como un falso
negativo, disminuyendo la sensibilidad de la tcnica.
2. Unin del antgeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unin de anticuerpos o
antgenos se realiza con facilidad a la superficie de plsticos tratados que tienen
gran afinidad por protenas. As, el procedimiento de recubrimiento de los
pocillos debe realizarse cuidadosamente. Si se usa poco antgeno, se pueden

obtener falsos positivos. Por el contrario, si se usa demasiado antgeno, el exceso

dar lugar a una reaccin falsa negativa.
3. Formacin de una o ms capas de inmunocomplejos. En el caso del antgeno

unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antgeno marcado

(ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antgeno y un
secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo mtodo
permite la amplificacin de la seal al poderse unir uno o ms anticuerpos
secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la
placa se incuba con una mezcla de antgeno y antgeno marcado. Se ensayan
diferentes relaciones de antgeno fro frente a una cantidad fija de antgeno
marcado. Es el ensayo de competicin del antgeno. En esta etapa es muy
importante controlar los factores tiempo y temperatura de incubacin para evitar
la aparicin de falsos negativos. En el caso del tiempo, si es inferior a 15
minutos, no ocurrir la interaccin antgeno-anticuerpo y el color no ser
evidente al final del ensayo, dando un falso negativo. Por su parte, si la
temperatura de incubacin es muy baja, la formacin del complejo antgenoanticuerpo tampoco se completar en el tiempo establecido, mientras que si es
muy alta, las protenas (antgeno y anticuerpo) se desnaturalizan y por tanto
disminuyen su capacidad para interaccionar, dando igualmente falsos negativos.
4. Revelado de la reaccin enzimtica. Despus de un lavado para eliminar todos

las molculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se aade el

sustrato enzimtico en solucin. Se deja reaccionar y se lee la densidad ptica
(D.O.) mediante espectrofotometra.

Tipos de ensayos ELISA

Se han desarrollado mltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la

cuantificacin de un antgeno en solucin, la deteccin de un anticuerpo en una solucin
(por ejemplo en el clonaje de anticuerpos monoclonales) o la determinacin de la
subclase (idiotipo) de un anticuerpo. A continuacin se describen los ms comunes.

ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se
preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se
encuentra el antgeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la
presencia de antgeno en la solucin analizada. Es necesario incluir controles
negativos que sern muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina,...)
pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antgeno buscado.

Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el

antgeno buscado).

ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de la misma forma a la

anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de
deteccin emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antgeno y uno
secundario marcado contra el primario. La deteccin tiene mayor sensibilidad
por presentar una amplificacin de seal debida a la unin de dos o ms
anticuerpos secundarios por cada primario. Es el ensayo ms popular, como lo es
la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un
mismo sistema enzimtico permite cuantificar una gran variedad de antgenos,
por eso es un mtodo ms polivalente y barato, aunque se pierda algo de
precisin por tener un eslabn ms con respecto al mtodo directo. La dilucin
de la solucin que contiene el anticuerpo primario (por ejemplo: suero
sanguneo) es un factor muy importante a tener en cuenta para evitar la aparicin
de falsos negativos, ya que si la muestra est muy diluida no saldr positiva si la
titulacin de anticuerpos es muy baja. Es decir, aunque los anticuerpos estn
presentes, la prueba no da positivo porque la concentracin de anticuerpos
especficos contra el antgeno que est pegado en el fondo del pocillo no es
suficiente como para dar una seal detectable.
El ELISA indirecto es el mtodo de eleccin para detectar la presencia de
anticuerpos sricos contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH),
agente causante del sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Segn
esta tcnica, protenas recombinantes de la envoltura y el ncleo del VIH se
absorben como antgenos en fase slida a los pocillos. Las personas afectadas de
VIH producen anticuerpos sricos contra eptopos en estas protenas vricas. En
general, el ELISA indirecto permite detectar anticuepos sricos contra VIH
desde las primeras seis semanas de una infeccin.
ELISA sndwich (Ensayo de captura de antgeno y deteccin mediante
inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el
pocillo con un primer anticuerpo anti-antgeno. Despus de lavar el exceso de
anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antgeno, que
ser retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Despus de
un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solucin
con un segundo anticuerpo anti-antgeno marcado. As pues cada molcula de
antgeno estar unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo
anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y
sensibilidad debido a la amplificacin de seal que permite el segundo
anticuerpo.

Quimioluminiscencia

Durante determinadas reacciones qumicas, la luz generada por este fenmeno

constituye una alternativa conveniente y muy sensible para las mediciones de
absorbancia en ELISA. Los tipos de ELISA que recurren a la quimioluminiscencia
utilizan un sustrato que genera luz, en lugar del sustrato cromgeno de las reacciones
ELISA ordinarias. Tales son los casos de la oxidacin del compuesto luminol por
perxido de hidrgeno y la enzima peroxidasa de rbano (HRP), que producen luz.
La luz que se genera en dichas reacciones puede detectarse gracias a su capacidad de
sensibilizar una pelicula fotogrfica. La medicin cuantitativa de la emisin de luz
puede hacerse mediante el uso de un luminmetro. La ventaja de las pruebas de
quimioluminiscencia sobre las cromgenas es la mejora de la sensibilidad. En general,
el lmite de deteccin puede aumentarse al menos diez veces si se cambia un sustrato
cromgeno por uno que emita luz, y ms de doscientas veces cuando se adicionan
agentes potenciadores.

Marcadores enzimticos ms comnmente utilizados

En la tabla siguiente se recogen los marcadores enzimticos ms comnmente
empleados en ensayos ELISA, los sustratos que se emplean para su revelado y el modo
de prepararlos.
Enzima Sustrato Tampn
HRPO (peroxidasa de rbano) OPD 10 mg/25 mL de tampn citrato sdico 0.15
M pH 5; aadir microL de 30% perxido de hidrgeno 30%
TMB 2.5 mg/250 microL de DMSO; hasta 25 ml con tampn citrato sdico
0.1M pH 6; aadir 5 microL de perxido de hidrgeno 30%

ABTS 60 mg/100 mL de tampn citrato sdico 0.1 M pH 6; aadir 35 microL de

perxido de hidrgeno 30%; parar con fluoruro sdico 1.25%; leer a 405 nm

DAB 10 mg/20 mL de tampn Tris 50 mM pH 7.4; filtrar y aadir 20 microL de

perxido de hidrgeno 1%

CNP 6 mg en 1 mL de metanol; aadir 10 mL de tampn Tris 50 mM pH 7.4;

filtrar y aadir 40 microL de perxido de hidrgeno 30%

AEC 80 mg en 1 mL de N,N'-dimetilformamida + 200 microL de tampn

acetato 0.1 M pH 4.5; filtrar y aadir 50 microL de perxido de hidrgeno 30%

ASA 80 mg/100 mL de agua destilada caliente; ajustar a pH 6.0 con 1 mM

NaOH y aadir 10 % por volumen de 0.05% perxido de hidrgeno; parar con
25 microL de NaOH 1 M

AP (Fosfatasa alcalina) PNPP 5 mg/5 mL de tampn dietanolamina-HCl 0.1 M

pH 9.8 +1 mM cloruro de magnesio

NAPFB (A) 4 mg de fosfato de naftol en 200 microL de dimetilformamida en un

tubo de vidrio, (B) 10 mg de sal Fast Blue BB/ 10 ml de tampn Tris 0.05M pH
9.2 - 2 mM cloruro de magnesio. Mezclar A + B y filtrar.

NAPR (A) 4 mg de fosfato de naftol en 200 microL de dimetilformamida en un

tubo de vidrio, (B) 10 mg de sal Red BB/ 10 ml de tampn Tris 0.05M pH 9.2 2 mM cloruro de magnesio. Mezclar A + B y filtrar.

BCIP 1 mg/mL en solucin AMP (2-amino-2-metil-propanol)

beta-G ONPG 2.5 mg/ml en tampn fosfato sdico 0.1 MpH 7.0 + 1 mM cloruro
de magnesio + 0.1 M beta-mercaptoetanol

ureasa BP 8 mg/1.48 ml de 0.01M NaOH; llevarlo a 100 ml con agua

desionizada; aadir 100 mg de urea y EDTA a 0.2 mM; ajustar el pH a 4.8 con 1
mM NaOH o HCl; almacenar a 4 C

PG IS Aadir a cada placa de ELISA 25 microL de cada uno de los reactivos

siguientes en secuencia : (A) 1% (peso/vol) gelatina en 0.1 M tampn fosfayo
pH 7.0, (B) 1% (peso/vol) almidn en agua destilada caliente, (C) 3.04 mg/mL
de benzil-penicilina en 0.1 M tampn fosfato pH 7.0 (5000 U/mL), (D) 0.01 N
ioduro en 0.1 M KI solucin stock (en una botella oscura).

Prueba ELISPOT
Una variante de la prueba ELISA, llamada ELISPOT, es capaz de detectar
cuantitativamente el nmero de clulas en una poblacin productora de anticuerpos
especficos contra un antgeno determinado o un antgeno contra el que se dispone de un
anticuerpo especfico. Aqu, las placas se recubren con el antgeno reconocido por el
anticuerpo de inters o con el anticuerpo especfico para el antgeno cuya produccin se
valora. Seguidamente, se aade a las placas recubiertas una suspensin de la poblacin
celular que se investiga e incuba. Las clulas se disponen en la superficie de la placa, y
las molculas secretadas reactivas a las molculas de captura son unidas en la cercana
de las clulas secretoras, producindose un anillo de complejos antgeno-anticuerpo
alrededor de cada clula que sintetiza la molcula de inters. Despus, la placa se lava y
un anticuerpo unido a enzima especfico para el antgeno secretado, o para la especie de
anticuerpo secretado, se aade y deja que se unan. El posterior revelado del ensayo
mediante adicin de un sustrato cromgeno o emisor de luz adecuado, indica la posicin
de cada clula productora de anticuerpo (o de antgeno) como un punto de color o luz.