Western blot

Resultado del Western blot: una membrana con las protenas separadas en la electroforesis unidas, de las que
slo se disciernen aquellas contra las se ha aadido un anticuerpo.

El Western blot, inmunoblot o electrotransferencia , es una tcnica analtica usada para

detectar protenas especficas en una muestra determinada (una mezcla compleja de protenas,
como un extracto tisular). Mediante una electroforesis en gel se separan las protenas atendiendo al
criterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Hay casi tantas posibilidades
como tipos de electroforesis existen. Luego son transferidas a una membrana
adsorbente (tpicamente de nitrocelulosa o de PVDF) para poder buscar la protena de inters
con anticuerpos especficos contra ella.1 2 Finalmente, se detecta la unin antgenoanticuerpo por actividad enzimtica o fluorescencia, entre otros mtodos. De esta misma forma se
puede estudiar la presencia de la protena en el extracto y analizar su cantidad relativa respecto a
las otras protenas.
Esta tcnica es hoy en da imprescindible en varios campos de la biologa, como la biologa
molecular, la bioqumica, la biotecnologa o lainmunologa. Existe toda una industria especializada
en la venta de anticuerpos (monoclonales y policlonales) contra decenas de miles de protenas
diferentes.3 4
El Western blot fue desarrollado en el laboratorio de George Stark, en la Universidad de
Stanford.2 El nombre (Western, occidental en ingls) le fue dado por W. Neal Burnette,5 y consiste
en un juego de palabras con una tcnica anloga pero que usa DNA, el Southern (sureo) blot, que
en este caso debe su nombre a su descubridor, Edwin Southern. Otras tcnicas que fueron
nombradas siguiendo este criterio son el Northern blot (en el que se separa e identifica RNA),
el Eastern blot, el Southwestern blot.

ndice
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1Pasos del Western blot

o

1.1Preparacin de la muestra

1.2Electroforesis en gel

1.3Transferencia

1.3.1Difusin simple

1.3.2Transferencia al vaco

1.3.3Electrotransferencia

1.4Bloqueo

1.5Deteccin
1.5.1Mtodo en dos pasos

1.5.1.1Anticuerpo primario

1.5.1.2Anticuerpo secundario

1.5.1.2.1Radiactividad

1.5.1.2.2Anticuerpo unido a una enzima

1.5.1.2.3Marcaje fluorescente

1.5.1.2.4Sistema avidina/estreptavidina

1.5.1.2.5Deteccin con oro

1.5.2Mtodo en un paso

1.6Anlisis

1.6.1Deteccin colorimtrica

1.6.2Deteccin quimioluminiscente

1.6.3Deteccin radioactiva

1.6.4Deteccin fluorescente
1.7Exploraciones secundarias
2Aplicaciones

2.1Investigacin

2.2Diagnstico

3Protocolos

4Vase tambin

5Enlaces externos

6Referencias

Pasos del Western blot[editar]

Preparacin de la muestra[editar]
Las muestras pueden ser tomadas de un tejido entero o de un cultivo celular:

Una pequea cantidad del tejido se introduce en un buffer de extraccin. Despus se

procede a homogeneizarlos, sea con una licuadora (para grandes volmenes de
muestra), con un homogenizador (para muestras pequeas) o por sonicacin. Por ltimo
se centrifuga para obtener las protenas en el sobrenadante, la fraccin no precipitada. 6

Las clulas pueden lisarse por uno de esos mtodos mecnicos. Tambin pueden
usarse detergentes, sales o tampones que favorezcan la lisis y solubilicen las protenas.
A veces se aaden inhibidores de proteasas y fosfatasas que evitan la digestin por las
enzimas celulares de las protenas y de las fosfoprotenas, respectivamente.7

Los materiales deben estar a bajas temperaturas (~4 C) para evitar la desnaturalizacin
proteica. Para separar protenas de compartimentos y orgnulos celulares es preciso combinar
tcnicas mecnicas - como filtraciones y centrifugaciones - y bioqumicas.

Electroforesis en gel[editar]
Artculo principal: Electroforesis en gel

Las protenas de la muestra sern separadas mediante una electroforesis en gel en funcin de
uno o varios (en las electroforesis bidimensionales) de estos criterios: punto isoelctrico, peso
molecular y carga elctrica. La naturaleza de la separacin depende del tratamiento de la
muestra y de la naturaleza del gel.
La electroforesis en gel ms frecuente, conocida como SDS-PAGE, hace uso de gel de
poliacrilamida y de tampn con dodecilsulfato (SDS). En esta tcnica las protenas sufren un
tratamiento por agentes reductores que provocan la prdida de las
estructuras secundaria y terciaria y mantiene los polipptidos en este estado desnaturalizado.
De este modo, la estructura tridimensional de las protenas no influye en la electroforesis, y
pueden separarse nicamente en funcin del tamao.

Transferencia[editar]
Para que las protenas sean accesibles a la deteccin por anticuerpos, se las transfiere desde
el gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa o de PVDF. Esta transferencia puede
realizarse por difusin, por vaco o por accin de un campo elctrico (electrotransferencia).
Las membranas que se emplean en el Western blot se caracterizan por su capacidad de unir
protenas de forma inespecfica (es decir, se adhieren a todas las protenas con idntica
afinidad):

las membranas de nitrocelulosa, aunque no se conoce exactamente la naturaleza de las

interacciones membrana - protena, se sabe con cierta seguridad que se trata de
interacciones no covalentes de naturaleza hidrfba.

en las membranas de PVDF, la unin est basada en interacciones hidrofbicas y de

dipolos entre la membrana y las protenas. Como particularidad, deben ser humedecidas
con metanol o etanol antes de exponerlas a tampones acuosos, debido a su
alta hidrofobicidad y a la ausencia de surfactantes.

Las membranas de nitrocelulosa son ms baratas que las de PVDF, aunque son tambin ms
frgiles, tienden a tornarse quebradizas cuando se secan y no pueden ser sometidas a varias
pruebas consecutivas.8
Tambin pueden usarse otros soportes, como las membranas de nylon o el papel activado. Sin
embargo, no son tan usados como los anteriores.
Difusin simple[editar]
En la transferencia por difusin simple se ponen en contacto las superficies del gel
electrofortico y de la membrana y, sobre sta, se dispone un taco de papeles de filtro. Con el
fin de facilitar el proceso, puede ponerse encima una placa de vidrio y un objeto pesado. Este
montaje se coloca sobre un tampn, que ascender por capilaridad hacia el papel de filtro
arrastrando consigo las protenas. Al llegar a la membrana, quedarn retenidas en ella.
Este protocolo no est muy extendido actualmente, puesto que la cantidad de protena
transferida a la membrana es muy baja, mucho menor que con la electrotransferencia. Sin
embargo, ha ganado cierta popularidad por una modificacin que permite obtener mltiples
transferencias de un mismo gel, permitiendo de esta forma realizar varias pruebas sobre geles

virtualmente idnticos. Esta modificacin es viable cuando no es necesaria una transferencia

cuantitativa de protena.9 10
Transferencia al vaco[editar]
En esta tcnica, se aade el poder de succin de una bomba conectada a un sistema de
secado de planchas de gel, el cual lleva las protenas desde el gel hasta la superficie de la
membrana de nitrocelulosa.11 Este mtodo es vlido tanto para protenas de alto como de
bajo peso molecular.10
Electrotransferencia[editar]
Este mtodo se basa en una corriente elctrica y un tampn de transferencia para llevar las
protenas desde el gel hacia la membrana. Para ello, se apilan en el orden descrito los
siguientes elementos (del polo negativo o ctodo al positivo o nodo): esponja, varios papeles
de filtro empapados en buffer de transferencia, gel, membrana, ms papeles de filtro
empapados y otra esponja. Este montaje, llamado coloquialmente sandwich, se dispone en el
sistema de transferencia y se aplica una corriente elctrica, de magnitud acorde a los materiales
empleados, al tiempo disponible,... Las protenas del gel se desplazan hacia el polo positivo y
quedan atrapadas por la membrana.1

Tras la transferencia, se suele proceder a la tincin del gel con Azul de Coomassie (un
colorante de protenas) para comprobar que en efecto una parte importante del material
proteico ha pasado a la membrana.
La electrotransferencia es hoy en da la tcnica de transferencia ms usada gracias a la
velocidad del proceso y al elevado porcentaje de protena que se transfiere (especialmente en
comparacin con las otras tcnicas).

Bloqueo[editar]
Puesto que la membrana escogida necesita poder unirse protenas de forma inespecfica, es
preciso bloquear los lugares de unin que han quedado libres tras la transferencia. En caso
contrario, el anticuerpo (de naturaleza proteica) empleado en la deteccin puede unirse a ellos,
dificultando la distincin del complejo antgeno-antgeno que se forma con la protena que se
busca.
En el bloqueo se incuba la membrana con una solucin de protenas, tpicamente de albmina
de suero bovino o ASB (ms conocida por sus siglas en ingls, BSA), leche en polvo o casena,
con una diminuta fraccin de detergente, como Tween 20 o Tritn X-100. Las protenas en

solucin se unirn a todos aquellos lugares de unin de la membrana que no estn ya

ocupados por las transferidas desde el gel. De este modo, el anticuerpo slo podr unirse a su
antgeno especfico, reduciendo as el ruido de fondo y los falsos positivos.

Deteccin[editar]
En la deteccin se comprueba la presencia en la membrana de una determinada protena. Para
ello se emplea un anticuerpo especfico contra ella unido a enzima que, en presencia de su
sustrato, catalice una reaccin colorimtrica (produce color). De esta forma, se hace patente la
unin con el antgeno, la protena, as como su localizacin.
El proceso tradicionalmente se ha realizado en dos pasos, aunque ahora es posible la
deteccin en un nico paso, lo cual es til en ciertos campos.
Mtodo en dos pasos[editar]
Los dos pasos de los que consta este mtodo de deteccin son la unin del anticuerpo
primario y la del anticuerpo secundario.

Anticuerpo primario[editar]
El primer paso es permitir la unin de un anticuerpo primario contra la protena buscada. ste
se consigue inoculando dicha protena o uno de sus eptopos (regiones capaces de
desencadenar la respuesta inmune) a un animal (como un conejo o una cabra) o a un cultivo
celular. Adems, como la protena se ha desnaturalizado durante laelectroforesis en gel, es
preciso que el anticuerpo reconozca especficamente la protena desnaturalizada. La presencia
del elemento extrao debera desencadenar una respuesta inmune cuyo resultado incluya la
produccin del anticuerpo, primario en este caso, ya que reconoce la protena.
As pues, tras el bloqueo se incuba en agitacin moderada la membrana con una disolucin de
anticuerpo primario (0,5 - 5 g/ml). La disolucin consiste en un tampn salino, con cloruro de
sodio por lo general, con un pH cercano a la neutralidad, una pequea fraccin de detergente y,
en ocasiones, protenas disueltas, como ASB o leche en polvo. La membrana junto con la
disolucin pueden ser introducidas en una pequea bolsa de plstico. Esta incubacin puede
durar desde 30 minutos a una noche entera. La temperatura a la que puede tener lugar es
igualmente variada; en general, las elevadas temperaturas favorecen las uniones ms
especficas.
Anticuerpo secundario[editar]

Tras lavar la membrana para eliminar el anticuerpo primario que no se ha unido, se expone
al anticuerpo secundario. ste reconoce de forma especfica una regin concreta del anticuerpo
primario. Suelen estar marcados para ser detectables (unin a biotina, a
una enzima reporter como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa del rbano (HRP), etc.). Varios
de estos anticuerpos se unirn a cada anticuerpo primario, amplificando la seal.
Los anticuerpos secundarios proceden de animales o de cultivos de hibridomas de origen
animal. Por ejemplo, un anticuerpo secundario "anti-ratn" es aquel capaz de reconoces casi
todos los anticuerpos primarios obtenidos de ratones. Igualmente hay anticuerpos "anti-cabra",
"anti-conejo"... Su uso presenta ciertas ventajas: econmicas, por permitir a un laboratorio
compartir una nica fuente de anticuerpos secundarios; y dan resultados mucho ms
consistentes.
Tambin pueden emplearse protenas no anticuerpos, como las protenas A y G.
Radiactividad[editar]

Unin del anticuerpo primario a la protena de inters. A este se une la protena A o la protena G para
ser detectada.

Es una alternativa al uso de anticuerpos secundarios que consiste en protenas de unin a

anticuerpos marcadasradiactivamente. Esta protena puede ser, por ejemplo, la protena
A de Staphylococcus aureus12 o la protena G13 marcadas con 125I (un istopo
radiactivo de yodo). Las protenas mencionadas tienen la capacidad de unirse a anticuerpos de
forma inespecfica, por lo que se unirn al primario.
Este mtodo apenas se usa actualmente, por ser significativamente ms caro, peligroso y lento
que los otros. Sin embargo, presenta ventajas: es muy sensible, da bandas que permiten una
precisa cuantificacin; y la imagen autoradiogrfica puede ser reproducida fcilmente y con
gran precisin para su publicacin.10
Anticuerpo unido a una enzima[editar]

Anticuerpo secundario unido a la peroxidasa de rbano, de modo que puede catalizar la reaccin
quimioluminiscente.

Un mecanismo de deteccin simple y rpido consiste en unir al anticuerpo secundario enzimas

que catalicen la transformacin de un sustrato soluble en un producto insoluble. De esta forma,
en el posterior anlisis quedar una mancha all donde est la protena de inters. Enzimas
como la peroxidasa de rbano (HRP) o una fosfatasa alcalina son vlidas para este
mecanismo.10 Por ejemplo, la peroxidasa puede catalizar la oxidacin del 4-cloronaftol en
presencia de un 1% deperxido de hidrgeno. El resultado es que el primero forma una mancha
de precipitado oscura.14 Otras tcnicas, comoELISA o ELISPOT, tambin emplean este mtodo
de deteccin.
Otro mtodo ms sofisticado consiste en la unin de una enzima que catalice una reaccin
quimioluminiscente. Las anteriormente citadas enzimas tambin son vlidas en este caso,
aunque cada una usa un agente quimioluminiscentediferente. En el caso de la peroxidasa,
cataliza la oxidacin del luminol en presencia de perxido de hidrgeno. La fosfatasa alcalina
cataliza la defosforilacin del adamantil-1-2-dioxetano fosfato, reaccin que genera luz. Si se
coloca una pelcula fotogrfica sobre la membrana, la exposicin a la luz que se desprende en
la reaccin permite detectar la actividad enzimtica.
Marcaje fluorescente[editar]
Otro mtodo basado en el mismo principio emplea anticuerpos unidos
a fluorocromos del infrarrojo cercano, como el 2 - metoxi - 2,4 - difenil - 3 (2H) - furanona
(MDPF) o el rojo Nilo. Estos compuestos emiten una cantidad de luz constante (estado esttico)
cuando se excitan de manera constante, permitiendo una deteccin muy precisa y una
cuantificacin del antgeno ms exacta que la de la quimioluminiscencia, que se realiza durante
un estado dinmico.
El rojo Nilo no es puede usarse para teir bandas en membranas de PVDF; sin embargo es
posible realizar la tincin en el gel SDS - PAGE y luego transferirlo a la membrana de PVDF.
Esto ltimo presenta una ventaja, y es que no es necesario realizar una tincin del gel para
comprobar la transferencia proteica.15
Sistema avidina/estreptavidina[editar]
Otra opcin es emplear un anticuerpo primario unido covelentemente a molculas de biotina.
Despus la deteccin se llevar a cabo con una protena de unin a la misma, como
la estreptavidina o la avidina.
Deteccin con oro[editar]
Otra tcnica, conocida como Golden blot, consiste en la deteccin de los anticuerpos primarios
con protena A unida a partculas de oro. El resultado es una membrana con manchas rojas,
causadas por el oro, all donde est la protena. 16 La sensibilidad del mtodo puede
incrementarse con una tincin fotoqumica de plata: el oro cataliza la reduccin de los iones
plata a plata metlica en presencia de otro agente reductor, como la hidroquinona; la plata
forma de este modo unas manchas visibles bajo microscopio ptico. Se consigue as una
sensibilidad comparable a la de las tcnicas radiactivas.10 17
Mtodo en un paso[editar]
Histricamente la deteccin se ha realizado en dos pasos por la relativa facilidad que supone
producir anticuerpos primarios y secundarios en procesos separados. Esto ofrece a
investigadores y empresas enormes ventajas en lo que a flexibilidad se refiere, y aade un
efecto amplificador al proceso. Sin embargo, debido a la llegada de los anlisis de protenas de
alto rendimiento y los menores lmites de deteccin ha crecido el inters por desarrollar

sistemas de deteccin en un solo paso que aumentaran la rapidez del proceso al tiempo que
reducen los consumibles. Esto requiere un anticuerpo que reconozca al mismo tiempo la
protena de inters y una "etiqueta" detectable. Se incuba de manera similar al anticuerpo
primario del proceso en dos pasos, y, tras una serie de lavados, ya se puede detectar
directamente.

Anlisis[editar]
Tras el lavado de las sondas marcadas no unidas, se procede a la deteccin de aquellas que s
se han unido a la protena de inters.
Deteccin colorimtrica[editar]
La deteccin colorimtrica depende de la incubacin del Western blot con un sustrato que
reacciona gracias a la enzima reporter (una peroxidasa, por ejemplo) unida al anticuerpo
secundario. Pasa as de ser un compuesto soluble a una forma insoluble de otro color que
precipita cerca de la enzima tiendo as la membrana. Se procede despus a un lavado en el
que se elimina el tinte soluble. La cuantificacin proteica se evala por densitometra (cuan
intensa es la mancha) o por espectrometra.
Deteccin quimioluminiscente[editar]
La deteccin quimioluminiscente requieren la incubacin de la membrana con un sustrato, que
emitir luminiscencia al ser expuesto al reporter que trae unido el anticuerpo secundario. La luz
emitida es captada por una pelcula fotogrfica o, ms recientemente, por cmaras CCD, que
toman una imagen digital del Western blot. Se analiza la imagen por densitometra para evaluar
la cantidad relativa de mancha y cuantifica el resultado en trminos de densidad ptica.
Actualmente hay programas que permiten realizar anlisis ms profundos si se aplican ciertos
estndares, como la obtencin del peso molecular.

Deteccin radioactiva[editar]
Los marcadores radiactivos no requieren sustratos enzimticos; en su lugar se coloca una
pelcula fotogrfica contra el Western blot y la actividad radiactiva del marcador provoca la
aparicin en ella de regiones oscuras. stas se correspondern con las bandas de las protenas
de inters. Su alto precio y su riesgo para la salud y la seguridad han provocado su desuso en
los ltimos tiempos.
Deteccin fluorescente[editar]
En la deteccin con marcadores fluorescentes se procede a la excitacin lumnica de stos que
les provoca una excitacin. sta es detectable por un fotosensor, como una

cmara CCD equipado con los filtros de emisin apropiados. Se consigue as una imagen digital
del Western blot que puede ser analizado para obtener el peso molecular o la cuantificacin
proteica. La fluorescencia es considerada uno de los mtodos de anlisis ms sensibles.

Exploraciones secundarias[editar]
Una caracterstica de las membranas de PVDF, de la que carecen las de nitrocelulosa, es su
capacidad de quitar los anticuerpos y volver a explorar la membrana con otros anticuerpos.
Aunque hay protocolos que permiten hacer lo mismo en membranas de nitrocelulosa, la
robustez de las de PVDF facilita la eliminacin de los anticuerpos, permitiendo ms reusos
antes de que el ruido de fondo es tan grande que impide continuar con los experimentos. Otra
diferencia es que, a diferencia de la nitrocelulosa, el PVDF debe ser empapado en etanol,
isopropanol o metanol al 95% antes de ser usado. Adems, las membranas de PVDF tienden a
ser ms delgadas y ms resistentes a los daos durante su uso.

Aplicaciones[editar]
Investigacin[editar]
Actualmente, el Western blot es una de las tcnicas ms usadas en el estudio de la biologa
molecular.18

Diagnstico[editar]

Prueba de VIH: Aunque el VIH suele detectarse mediante la tcnica ELISA, el Western Blot
se usa como prueba confirmatoria cuando el ELISA da un resultado positivo en un grupo
que no es de riesgo o en una poblacin donde la prevalencia del virus es muy baja.
Mediante el Western blot se buscan los anticuerpos anti-VIH en una muestra de suero
humano. Se transfieren a una membrana las protenas de clulas que, se sabe, estn
infectadas por el VIH. Entonces, se incuba el suero que hay que probar con esta
membrana. Este paso es equivalente a la incubacin con el anticuerpo primario; si hay
anticuerpos anti-VIH en el suero, sern estos los que realicen el papel de anticuerpo
primario. Se lava, para eliminar los anticuerpos no unidos, y la membrana se vuelve a
incubar con un anticuerpo secundario anti-humano unido a una enzima-seal. La aparicin
de bandas indica la presencia de protenas contra las cuales el suero del paciente contiene
anticuerpos, es decir, el paciente es seropositivo.

Se emplea como prueba definitiva de la encefalopata espongiforme bovina, comnmente

llamada "enfermedad de las vacas locas".

Algunas clases de la prueba para la enfermedad de Lyme usan el Western blot.

En veterinaria, ocasionalmente se emplea el Western blot para confirmar la presencia

del FIV en gatos.

En la prctica clnica, el Western Blot se utiliza para diagnosticar enfermedades infecciosas,

ms frecuentemente famoso, el VIH. Algunos laboratorios clnicos inmunofluorescencia
emplean tcnicas de Western Blot como confirmacin as como pruebas (tales como la
deteccin de anticuerpos circulantes anti-colgeno VI anticuerpos en la epidermlisis
ampolla adquirida o varios anti-protenas propias en pnfigo paraneoplsico). A menudo,
Sin embargo, estas aplicaciones clnicas son suplantados por ms productivos ELISA con
costo reducido y el rendimiento acelerado.

ELISA
Para otros usos de este trmino, vase Elisa.

La tcnica ELISA (acrnimo del ingls Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay: ensayo por
inmunoadsorcin ligado a enzimas) es una tcnica de inmunoensayo en la cual
un antgeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpoenlazado a una enzima capaz de
generar un producto detectable, como cambio de color o algn otro tipo; en ocasiones, con el fin de
reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce
al antgeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la
enzima anteriormente mencionada. La aparicin de colorantes permite medir indirectamente
mediante espectrofotometra el antgeno en la muestra.
Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular est presente en la
muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un
gran nmero de variables, tales como seleccin de reactivo, temperatura, medicin de volumen y
tiempo, que si no se ajustan correctamente, puede afectar los pasos sucesivos y el resultado de la
prueba.
ndice
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1Usos

2Dispositivos empleados en ELISA

3Fases de un ensayo ELISA

4Tipos de ensayos ELISA

5Quimioluminiscencia

6Marcadores enzimticos ms comnmente utilizados

7Prueba ELISPOT

8Referencias

Usos[editar]
La interaccin antgeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un
paciente tiene una infeccin o una enfermedad autoinmune. Pero como prueba diagnstica, posee
diversas limitaciones que conviene conocer:

En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa

necesariamente que el paciente est enfermo. El cuerpo de una persona que ha estado
enferma y que ya se ha recuperado puede seguir produciendo anticuerpos. Esto originara un
falso positivo.

En segundo lugar, hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que
estos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo. Sera el
caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se encuentren en
el periodo ventana de la infeccin en el momento de realizar la prueba, o que estn infectadas
por una cepa extraa.

En tercer lugar, pueden aparecer falsos negativos cuando se da inespecificidad entre

antgeno-anticuerpo.

En estos casos de diagnstico de enfermedad, es recomendable la eliminacin (mediante

centrifugacin) de clulas de la sangre que puedan interferir con el ensayo y puedan ocasionar un
resultado falso positivo, careciendo aquel de especificidad. Tambin, debemos tener en cuenta que
cuando se trata de diagnosticar una enfermedad que posee un valor predictivo positivo bajo en una
determinada poblacin es decir, que esa enfermedad tiene muy baja incidencia en dicha
poblacin, es necesario volver a confirmar el resultado positivo mediante otro mtodo de
diagnstico independiente. Normalmente, se lleva a cabo un western blot donde se detecta la
presencia de varios anticuerpos, simultneamente, frente a la misma infeccin en una muestra. El
resultado del western se considera positivo cuando aparecen al menos 5 bandas, que indica que 5
anticuerpos diferentes estn presentes en el sujeto frente a esa infeccin. Es entonces cuando se
diagnostica como positivo a dicho paciente.

Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es verstil, robusto y
simple en su realizacin, mediante el uso de la fase slida, una separacin fcil entre la fraccin
retenida y la fraccin libre.
Adems se han propuesto y desarrollado diferentes mtodos de amplificacin de la seal
(luminiscentes, cascadas enzimticas...) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos ELISA
a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal.
Este mtodo ha tenido una enorme aplicacin en todos aquellos campos en los que se precisaba la
cuantificacin de productos mediante anticuerpos: diagnstico clnico, deteccin viral, clasificacin
de anticuerpos en isotipos, bsqueda de anticuerpos monoclonales, etc.

Dispositivos empleados en ELISA[editar]

Se han ensayado numerosas fases slidas, desde los tubos de cristal de los orgenes hasta las
actuales microplacas de 96 pocillos de plstico tratado, para aumentar su capacidad de adsorcin
(en su superficie) de molculas, y con fondos de pocillo pticamente claros que permitan realizar las
medidas de densidad ptica en instrumentos especficos, espectrofotmetros de lectura de placas
que han recibido el nombre de lectores ELISA. Actualmente se estn desarrollando dispositivos de
mayor capacidad por ejemplo, con 384 y 1536 pocillos, adecuados para los sistemas
de screening masivo de los sistemas robotizados (HTS, High-throughput system).

La tcnica ELISA.

Los lectores ELISA son espectrofotmetros capaces de realizar lecturas seriadas de cada uno de
los pocillos de la placa ELISA. A diferencia de un espectrofotmetro convencional, con capacidad de
leer todas las longitudes de onda del ultravioleta y el visible de manera continua, los lectores de
ELISA disponen de sistemas de filtros que solo permiten la lectura de una o pocas longitudes de
onda; son la que se corresponden con las necesarias para determinar la densidad ptica de los
cromgenos ms comnmente utilizados.

Fases de un ensayo ELISA[editar]

Fases de un ensayo ELISA, en italiano:

*ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay (ensayo inmunoenzimtico) principios de base.
*Pocillo
*Anticuerpo primario especfico para el antgeno que hay que individualizar. Est ligado al fondo del pocillo.
*Agregado de la solucin en la cual se busca la presencia del antgeno.
*Unin del antgeno con el anticuerpo primario.
*Lavado
*Agregado del anticuerpo secundario especfico conjugado con una enzima.
*El anticuerpo secundario conjugado con la enzima se liga al antgeno.
*Lavado
*Agregado del sustrato de la enzima.
*La enzima convierte el sustrato en un compuesto coloreado (amarillo, en este ejemplo).
*Prueba positiva.

Las cuatro fases de un ensayo ELISA son las siguientes:

1. Conjugacin del anticuerpo o del antgeno con una enzima (peroxidasa, fosfatasa
alcalina...). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e
indirectos, sandwich, etc. El antgeno marcado se emplea en ensayos de competicin de
antgeno. Dicha unin anticuerpo-enzima o antgeno-enzima ha de producirse durante un
determinado perodo de tiempo en aras de producir una solucin coloreada y que pueda ser
valorada visualmente o cuantificada por medio de un espectrofotmetro (normalmente a
una longitud de onda de 414 nm). Si no transcurre el tiempo adecuado para que se d la
reaccin, no se evidenciar ningn color, interpretndose este resultado como un falso
negativo y disminuyendo la sensibilidad de la tcnica.
2. Unin del antgeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unin de anticuerpos o antgenos
se realiza con facilidad a la superficie de plsticos tratados que tienen gran afinidad por
protenas. As, el procedimiento de recubrimiento de los pocillos debe realizarse
cuidadosamente. Si se usa mucho antgeno, se pueden obtener falsos positivos. Por el
contrario, si se usa poco antgeno, el exceso dar lugar a una reaccin falsa negativa.
3. Formacin de una o ms capas de inmunocomplejos. En el caso del antgeno unido a la
placa, se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antgeno marcado (ELISA directo) o

empleando un anticuerpo primario anti-antgeno y un secundario anti-primario marcado

(ELISA indirecto). Este segundo mtodo permite la amplificacin de la seal al poderse unir
uno o ms anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo
unido a la placa, se incuba con una mezcla de antgeno y antgeno marcado. Se ensayan
diferentes relaciones de antgeno fro frente a una cantidad fija de antgeno marcado. Es el
ensayo de competicin del antgeno. En esta etapa es muy importante controlar los factores
tiempo y temperatura de incubacin para evitar la aparicin de falsos negativos. En el caso
del tiempo, si es inferior a 15 minutos, no ocurrir la interaccin antgeno-anticuerpo y el
color no ser evidente al final del ensayo, dando un falso negativo. Por su parte, si la
temperatura de incubacin es muy baja, la formacin del complejo antgeno-anticuerpo
tampoco se completar en el tiempo establecido, mientras que si es muy alta, las protenas
(antgeno y anticuerpo) se desnaturalizan y, por tanto, disminuyen su capacidad para
interaccionar, dando igualmente falsos negativos.
4. Revelado de la reaccin enzimtica. Despus de un lavado para eliminar todas las
molculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos, se aade el sustrato
enzimtico en solucin. Se deja reaccionar y se lee la densidad ptica mediante
espectrofotometra.

Tipos de ensayos ELISA[editar]

Se han desarrollado mltiples variantes de ensayos ELISA que permiten la cuantificacin de un

antgeno en solucin, la deteccin de un anticuerpo en una solucin (por ejemplo en el clonaje de
anticuerpos monoclonales) o la determinacin de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo. A
continuacin se describen los ms comunes.1

ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan
recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antgeno.
Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antgeno en la solucin
analizada. Es necesario incluir controles negativos que sern muestras del mismo tipo que las
analizadas (sangre, orina...), pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antgeno
buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antgeno
buscado).2

ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de la misma forma a la anterior. Los
controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de deteccin emplea dos
anticuerpos: uno primario contra el antgeno y uno secundario marcado contra el primario. La
deteccin tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificacin de seal debida a la unin
de dos o ms anticuerpos secundarios por cada primario. Es el ensayo ms popular, como lo es

la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema

enzimtico permiten cuantificar una gran variedad de antgenos; por eso es un mtodo ms
polivalente y barato, aunque se pierda algo de precisin por tener un eslabn ms con respecto
al mtodo directo. La dilucin de la solucin que contiene el anticuerpo primario por ejemplo,
suero sanguneo es un factor muy importante a tener en cuenta para evitar la aparicin de
falsos negativos, ya que si la muestra est muy diluida, no saldr positiva si la titulacin de
anticuerpos es muy baja. (Es decir, aunque los anticuerpos estn presentes, la prueba no da
positivo porque la concentracin de anticuerpos especficos contra el antgeno que est pegado
en el fondo del pocillo no es suficiente como para dar una seal detectable.).
El ELISA indirecto es el mtodo de eleccin para detectar la presencia de anticuerpos
sricos contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), agente causante del sndrome
de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Segn esta tcnica, protenas recombinantes de la
envoltura y el ncleo del VIH se absorben como antgenos en fase slida a los pocillos. Las
personas afectadas de VIH producen anticuerpos sricos contra eptopos en estas protenas
vricas. En general, el ELISA indirecto permite detectar anticuepos sricos contra VIH desde
las primeras seis semanas de una infeccin.3

ELISA sndwich (Ensayo de captura de antgeno y deteccin mediante

inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con
un primer anticuerpo anti-antgeno. Despus de lavar el exceso de anticuerpo, se aplica la
muestra problema en la que se encuentra el antgeno, que ser retenido en el pocillo al ser
reconocido por el primer anticuerpo. Despus de un segundo lavado que elimina el material
no retenido, se aplica una solucin con un segundo anticuerpo anti-antgeno marcado. As,
pues, cada molcula de antgeno estar unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y
un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y
sensibilidad debido a la amplificacin de seal que permite el segundo anticuerpo.

ELISPot. ELISpot es un mtodo altamente sensible en la inmunologa para enumerar las

clulas que producen una citoquina dada. Las clulas se estimularon en una placa de
microtitulacin per-recubierta con un anticuerpo especfico anti-analito. En respuesta a la
estimulacin, las clulas liberan citocinas que se unen al anticuerpo anti-analito. Despus
de una etapa de lavado, que elimina las clulas de los pozos, la ubicacin de citoquinas
secretadas se visualiza mediante un anticuerpo de deteccin marcado con enzima y su
sustrato cromognico correspondiente. El resultado final es un conjunto de manchas de
color, cada uno de los cuales representa un rea donde se haba localizado una clula que
secreta la citoquina. Existe un mtodo de ELISpot estndar y una variacin denominada de
clulas dendrticas DC-ELISpot para la deteccin de las clulas tras la estimulacin con
oligopptidos y antgenos de protena, respectivamente.

Quimioluminiscencia[editar]

Ensayo ELISA para el VIH.

Durante determinadas reacciones qumicas, la luz generada por este fenmeno constituye una
alternativa conveniente y muy sensible para las mediciones de absorbancia en ELISA. Los tipos
de ELISA que recurren a la quimioluminiscencia utilizan un sustrato que genera luz, en lugar del
sustrato cromgeno de las reacciones ELISA ordinarias. Tales son los casos de la oxidacin del
compuesto luminol por perxido de hidrgeno y la enzima peroxidasa de rbano (HRP), que
producen luz. La luz que se genera en dichas reacciones puede detectarse gracias a su
capacidad de sensibilizar una pelcula fotogrfica. La medicin cuantitativa de la emisin de luz
puede hacerse mediante el uso de un luminmetro.
La ventaja de las pruebas de quimioluminiscencia sobre las cromgenas es la mejora de la
sensibilidad. En general, el lmite de deteccin puede aumentarse al menos diez veces si se
cambia un sustrato cromgeno por uno que emita luz, y ms de doscientas veces cuando se
adicionan agentes potenciadores.

Marcadores enzimticos ms comnmente utilizados [editar]

En la tabla siguiente se recogen los marcadores enzimticos ms comnmente empleados en
ensayos ELISA, los sustratos que se emplean para su revelado y el modo de prepararlos.
Enzima sustrato tampn

HRPO (peroxidasa de rbano) OPD 10 mg/25 mL de tampn citrato sdico 0,15 M pH 5;

aadir microL de 30 % perxido de hidrgeno 30 %.

TMB 2,5 mg/250 microL de DMSO; hasta 25 ml con tampn citrato sdico 0,1 M pH 6;
aadir 5 microL de perxido de hidrgeno 30 %.

ABTS 60 mg/100 mL de tampn citrato sdico 0,1 M pH 6; aadir 35 microL de perxido de

hidrgeno 30 %; parar con fluoruro sdico 1,25 %; leer a 405 nm.

DAB 10 mg/20 mL de tampn Tris 50 mM pH 7,4; filtrar y aadir 20 microL de perxido de

hidrgeno 1 %.

CNP 6 mg en 1 mL de metanol; aadir 10 mL de tampn Tris 50 mM pH 7,4; filtrar y aadir

40 microL de perxido de hidrgeno 30 %.

AEC 80 mg en 1 mL de N,N'-dimetilformamida + 200 microL de tampn acetato 0,1 M

pH 4,5; filtrar y aadir 50 microL de perxido de hidrgeno 30 %.

ASA 80 mg/100 mL de agua destilada caliente; ajustar a pH 6,0 con 1 mM NaOH y aadir
10 % por volumen de 0,05 % perxido de hidrgeno; parar con 25 microL de NaOH 1 M.

AP (fosfatasa alcalina) PNPP 5 mg/5 mL de tampn dietanolamina-HCl 0,1 M pH 9,8 + 1 mM

cloruro de magnesio.

NAPFB (A) 4 mg de fosfato de naftol en 200 microL de dimetilformamida en un tubo de

vidrio (B) 10 mg de sal Fast Blue BB/10 ml de tampn Tris 0,05 M pH 9,2 - 2 mM cloruro de
magnesio. Mezclar A + B y filtrar.

NAPR (A) 4 mg de fosfato de naftol en 200 microL de dimetilformamida en un tubo de vidrio

(B) 10 mg de sal Red BB/ 10 ml de tampn Tris 0,05M pH 9,2 - 2 mM cloruro de magnesio.
Mezclar A + B y filtrar.

BCIP 1 mg/mL en solucin AMP (2-amino-2-metil-propanol).

beta-G ONPG 2,5 mg/ml en tampn fosfato sdico 0,1 M pH 7,0 + 1 mM cloruro de
magnesio + 0,1 M beta-mercaptoetanol.

ureasa BP 8 mg/1,48 ml de 0,01 M NaOH; llevarlo a 100 ml con agua desionizada; aadir
100 mg de urea y EDTA a 0,2 mM; ajustar el pH a 4,8 con 1 mM NaOH o HCl; almacenar a
4 C.

PG IS Aadir a cada placa de ELISA 25 microL de cada uno de los reactivos siguientes en
secuencia: (A) 1 % (peso/vol) gelatina en 0,1 M tampn fosfayo pH 7,0; (B) 1 % (peso/vol)
almidn en agua destilada caliente; (C) 3,04 mg/mL de benzil-penicilina en 0,1 M tampn
fosfato pH 7,0 (5000 U/mL); (D) 0,01 N ioduro en 0,1 M KI solucin stock (en una botella
oscura).

Prueba ELISPOT[editar]
Una variante de la prueba ELISA, llamada ELISPOT, es capaz de detectar cuantitativamente el
nmero de clulas en una poblacin productora de anticuerpos especficos contra un antgeno
determinado o un antgeno contra el que se dispone de un anticuerpo especfico. Aqu, dichas
placas se recubren con el antgeno reconocido por el anticuerpo de inters o con el anticuerpo
especfico para el antgeno cuya produccin se valora. Seguidamente, se aade a las placas
recubiertas una suspensin de la poblacin celular que se investiga e incuba. Las clulas se
disponen en la superficie de la placa, y las molculas secretadas reactivas a las molculas de
captura son unidas en la cercana de las clulas secretoras, producindose un anillo de
complejos antgeno-anticuerpo alrededor de cada clula que sintetiza la molcula de inters.
Despus, la placa se lava y un anticuerpo unido a enzima especfico para el antgeno
secretado, o para la especie de anticuerpo secretado, se aade y deja que se unan. El posterior
revelado del ensayo mediante adicin de un sustrato cromgeno o emisor de luz adecuado

indica la posicin de cada clula productora de anticuerpo (o de antgeno) como un punto de

color o luz.4

Pcr;
El

estudio molecular tambin se denomina reaccin en cadena de la

polimerasa (PCR). Es la prueba ms sensible que hay para las personas
con leucemia mieloide crnica (LMC). Las pruebas de PCR pueden servir
para diagnosticar la LMC y tambin para determinar lo bien que su
cuerpo est respondiendo al tratamiento y para mantener bajo control el
exceso de clulas de LMC.
Las pruebas de

PCR pueden medir niveles muy bajos de clulas de leucemia que no se

pueden detectar en una prueba citogentica. Mientras que las pruebas
citogenticas pueden detectar una clula de LMC de una muestra de entre 20
y 500 clulas, las pruebas moleculares pueden detectar una clula
de LMC en un intervalo de entre 100 000 y 1 000 000 de clulas.
En las pruebas moleculares se emplea una muestra de sangre o de mdula
sea para contar los transcritos BCR-ABL, que son el ARN que codifica la
fabricacin de protenas bcr abl en las clulas de leucemia.
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