Centrifugacion CSCL

CENTRIFUGACIN DE DNA POR CSCL
La centrifugacin con CsCl (cloruro de cesio) es un mtodo para separar ADN

por densidad.
Para separar al ADN separado con base en densidad, EL ADN se mezcla con
CsCl y es centrifugado a muy alta velocidad (p. ej., 50,000 rpm) en una
ultracentrifuga por muchas horas. Como los tubos giran, las fuerzas opuestas
de sedimentacin y difusin producen un gradiente lineal estable de CsCl con
la ms baja densidad arriba y la densidad ms pesada en el fondo. Al formarse
el gradiente de CsCl, el ADN se equilibra en el gradiente donde su densidad
iguala la densidad del circundante CsCl. Si el ADN de una densidad est
presente, el resultado ser una sola banda de ADN. Si dos ADN estn presentes
con densidades diferentes, el resultado ser dos bandas de ADN.
Experimento de Meselson y Stahl

Meselson y col. (1957) desarrollaron una tcnica de centrifugacin en
gradiente de densidad. Cuando se centrifuga a alta velocidad un solucin
densa (saturada) de un soluto de bajo peso molecular (ClCs 7,7 M,
sucrosa, etc.) se produce un equilibrio entre dos fuerzas opuestas, la de
difusin del soluto y la fuerza de sedimentacin, como consecuencia se
produce un gradiente de densidad que aumenta en la direccin de la
fuerza centrfuga (aumenta a medida que avanzamos hacia el fondo del
tubo de centrifuga). Si aadimos al centrifugar una molcula de ADN, est
migrar hacia el fondo del tubo hasta llegar al punto en que la densidad
del soluto de bajo peso molecular (la densidad del ClCs) coincide con la
densidad del ADN centrifugado (densidad de flotacin). Posteriormente, es
posible aislar las molculas de ADN de diferente densidad practicando un
orificio en el fondo del tubo y sacando varias fracciones diferentes.
Tambin es posible pinchar el tubo con una jeringa, justo en la posicin de
la banda y extraer el ADN contenido de esa zona del tubo.
TCNICAS DE PATCH CLAMP
Cell attached
La pipeta se posiciona sobre la membrana celular donde se consigue una
muy buena conexin generando un sello de alta resistencia (del orden del
giga ohm). Segn el tamao de la pipeta, esta puede lograr la conexin
con un canal (canal nico) o con varios canales (macro parche). Esta
configuracin permite la manipulacin de la clula intacta, lo que impide
la posibilidad de cambiar fcilmente la composicin del medio interno
(intracelular). Por otra parte, ya que la pipeta se comporta como el medio
extracelular, la composicin de sta puede ser modificada segn las
necesidades del investigador.
Whole cell
Para llevar a cabo esta tcnica es necesario lograr primero la
configuracin cell attached. Una vez conseguido el gigasello (resistencia
del orden del giga ohm), es necesario romper la membrana que est por
debajo del orificio de la pipeta provocando con esto, el contacto elctrico

directo con el citoplasma, de tal modo, que la solucin de registro ubicada
en el interior de la pipeta queda en contacto con el medio interno de la
clula. Un mtodo comn para romper la membrana es aplicarle una
pequea succin al parche.
Ya que el volumen de una clula es pequeo comparado con la pipeta de

parche, la composicin del fluido intracelular puede ser considerado igual
al de la solucin de registro que llena la pipeta. Si lo que se desea es
emular una situacin fisiolgica, entonces la pipeta deber ser llenada con
una solucin de composicin inica que se acerque lo ms posible a la
composicin interna de la clula.
En muchos casos es posible aplicar parche perforado, donde el contacto
elctrico con el citosol es establecido por la adicin a la pipeta de agentes
perforadores de membrana. Agentes perforadores como la nistatina o la
amfotericina B perforan la membrana, por lo que solamente molculas
pequeas como los iones pueden pasar a travs de los agujeros
producidos, manteniendo de este modo la composicin citoplasmtica
intacta, en cuanto a su composicin orgnica.
Outside out
Esta tcnica provee al investigador un control total del ambiente del
parche y de los canales inicos que se encuentran en ste, tanto elctrica
como qumicamente.
Outside out, se refiere a que la cara externa de la membrana celular
queda orientada hacia el bao, mientras que por el contrario, la
configuracin inside out utiliza la cara intracelular orientada hacia el bao.
La configuracin outside out es obtenida simplemente tirando la pipeta de
la membrana celular, una vez obtenida la configuracinwhole cell. De este
modo, la membrana se rompe y segn las propiedades de los fosfolpidos,
estos se vuelven a juntar formando nuevamente un parche en la pipeta.
Ahora entonces, la solucin inica contenida en la pipeta ser como el
interior de la clula. Los parches outside out pueden ser utilizados para
estudiar el efecto de factores extracelulares en el canal, ya que la
composicin del bao puede ser fcilmente alterada durante el registro.
Inside out
La configuracin inside out es obtenida desde la configuracin cell
attached. Una vez en esta configuracin, a travs de un suave tirn la
pipeta es separada de la membrana formndose una vsicula alrededor
de la boca de la pipeta. La vescula puede ser rota al sacar la pipeta del
bao y exponer la vescula al aire. Esto produce un parche donde la cara
interna de la membrana celular queda expuesta hacia el exterior (bao) y
la cara externa queda expuesta al interior de la pipeta. Los parches inside
out son ideales para estudiar el efecto de factores citoslicos en los

canales.

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La centrifugacin con CsCl (cloruro de cesio) es un mtodo para separar ADN

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