INFORME N7: Tcnicas de cultivo de microorganismos:

Caractersticas de crecimiento en medio de cultivo

Aislamiento y recuento en placas
PROFESOR: Ramos Chaupn, Roberto Ral
MESA: 5

INTEGRANTES:

- Aldon Pizarro, Beln

- Olortegui Pajuelo, Thala
- Salas Chambi, Yuli Mnica
- Cabrera Montes, Pedro Luis

2014

I.

INTRODUCCIN:

Sembrar un microorganismo es colocarlo en un ambiente artificial apropiado para

que lleve a cabo su metabolismo, su desarrollo y su reproduccin. Las tcnicas de
siembra varan segn el estado fsico del medio o las necesidades del
microorganismo. Una condicin bsica de la siembra es que se realice bajo
condiciones rigurosas de asepsia, ya que es indispensable evitar el crecimiento de
grmenes del ambiente en el cultivo.
Muchas especies bacterianas son tan parecidas morfolgicamente que es
imposible diferenciarlas slo con el uso del microscopio; en este caso, para
identificar cada tipo de bacteria, se estudian sus caractersticas bioqumicas
sembrndolas en medios de cultivo especiales. As, algunos medios contienen un
producto que inhibe el crecimiento de la mayora de las especies bacterianas, pero
no la de un tipo que deseamos averiguar si est presente. Otras veces el medio de
cultivo contiene determinados azcares especiales que slo pueden utilizar
algunas bacterias. En algunos medios se aaden indicadores de pH que cambian
de color cuando uno de los nutrientes del medio es fermentado y se generan
catabolitos cidos. Si las bacterias son capaces de producir fermentacin, generan
gases que pueden ser apreciados cuando el cultivo se realiza en un tubo cerrado
Si el cultivo tiene un solo tipo de microorganismo se le denomina cultivo puro.
Cuando encontramos ms de un tipo de microorganismo se llama entonces cultivo
mixto. El proceso mediante el cual se separan los microorganismos se denomina
aislamiento y la forma de sembrar puede realizarse de
varias formas,
dependiendo de la prueba y del medio de cultivo empleado.
II.

OBJETIVOS:

Observar las caractersticas de crecimiento de los microorganismos al

trasplante en medios de cultivo lquido y slido.

Separar colonias individuales a partir de una mezcla de microorganismos

utilizando tcnicas de aislamiento.

III.

MARCO TERICO

El proceso de colocar las bacterias u otros microorganismos cultivables en

medios de cultivo, recibe el nombre de siembra, esta operacin la podemos
realizar a partir de muestras biolgicas (orina, pus, secreciones, etc.), de
anlisis de control de calidad (alimentos, aguas, cosmticos, medicamentos,
etc.), procedentes de muestras ambientales (agua, suelo, aire, etc.) o de un
cultivo microbiano a otro. Por otro lado, si la realizamos de un cultivo a otro se
denomina subcultivo o repique.
Una vez que ha sido preparado un medio de cultivo (Agar Gelatina, Agar Mc
Conkey, etc.), puede ser inoculado e inmediatamente incubado en condiciones
que favorezcan el crecimiento microbiano. En la toma de muestras de un
medio (solido, liquido o aire), mayormente se tiene una poblacin mixta,
entonces si se quiere cultivar una especie de la muestra se debe realizar
tcnicas de aislamientos que permitan obtener cultivo axnicos o puros. Un
cultivo puro o axnico es aquel que contiene un solo tipo de microorganismo y
que procede de una sola clula, el crecimiento de esta origina, en medio
slido, una masa de clulas fcilmente reconocibles o visibles que recibe el
nombre de colonia.
Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo
de ste en medios de cultivo y condiciones de laboratorio controladas. La
poblacin de microorganismos desarrollada en un medio se denomina cultivo.
Cuando ste contiene una sola especie de microorganismo, se denomina
cultivo puro o axnico, cuando contiene ms de una especie de
microorganismos se denomina cultivo mixto. Un cultivo tipo contiene una
especie conocida de microorganismos y es conservada en el laboratorio para
realizar diversos ensayos y estudios.
Tcnicas de siembra de medios de cultivo en tubos
Se tiene siembra en medios de cultivo contenido en tubos, ya sea caldo, caldo
nutritivo, agar inclinado, otros. As se observaran en las colonias su intensidad
de enturbiamiento, aparicin de pelcula o sedimento en el tubo, tambin
poder determinar un crecimiento mvil o no.

a) Siembra en tubos por estras simples: Se toma con asa de siembra

previamente esterilizado por flameado una cantidad de muestra adecuada.
Se aade al tubo desde el fondo de la superficie de este, realizando
movimientos ascendentes en zig-zag hasta completar toda la superficie del

medio. Este mtodo es utilizado para conservar cepas durante largos

periodos, as como para la realizacin de ciertas bioqumicas, como, por
ejemplo, la prueba de la ureasa.

b) Siembra en
tubos por
picadura:
Consiste en
introducir la
aguja de Klle
en el medio
de cultivo
semislidos
como por
ejemplo, el medio de oxidacin fermentacin de Hugh-Leiffson.

Tcnicas de aislamiento

Un modo de estudiar un ecosistema microbiano consiste en aislar de l los

microorganismos y estudiar sus propiedades en cultivos de laboratorio. El
aislamiento es importante porque se obtienen cultivos para estudios
experimentales en el laboratorio y para las aplicaciones en los campos de
la biotecnologa y la microbiologa industrial y ambiental (Madigan, 2009).
Hernndez (2003) nos dice que se ha desarrollado una serie de tcnicas
microbiolgicas para aislar microorganismo y obtener cultivos puros. A
continuacin se mencionan tres de ellas:
Aislamiento por agotamiento de superficie o estras: Se tomar con el
asa de siembra (previamente esterilizado por flameado) una cantidad
adecuada de muestra problema depositando el inoculo en uno de los
extremos superiores de la placa; a partir de aqu se realizaran
movimientos en zig-zag de un extremo a otro de la placa no tomndose en
ningn momento nuevo inoculo y no levantndose el asa hasta concluir la
siembra de toda la placa.
Aislamiento por diluciones: Se dispondr de una serie de tubos con
medio de cultivo especfico o agua estril segn los casos. Se adicionara
una cantidad de muestra solida o liquida en los tubos sabiendo la cantidad
de muestra o inoculo que se aade en el tubo inicial. Se agitara hasta
homogenizacin. Con pipeta estril se tomara una cantidad especfica o
exacta y se adicionara al segundo tubo, que se homogeniza. Repetimos la
operacin anterior con el tercer tubo y as sucesivamente hasta obtener la
dilucin deseada. Con la dilucin esperada, por ejemplo, 10 -3 y 10-4,
inocular en placas de cultivo una cantidad de inoculo exacta y extender
con un asa ce Digrasky previamente estril. Incubar a temperatura precisa
durante unas 24 horas y posteriormente recontar. Existen muchas
variaciones de este mtodo. Una de ellas es hacerlo en medio de cultivo
con agar, donde se mezcla en los tubos la muestra y se diluyen hasta
obtener la dilucin deseada; posteriormente son vertidos en placa y se
deja solidificar.

IV.

PARTE EXPERIMENTAL:

Ejercicio 1: Tcnicas de cultivo de Microorganismos: Caractersticas de

crecimiento en medio de cultivo.

MATERIALES:

Cultivo de microorganismos de 18 horas.

Asa y aguja de Klle
Mechero
Tubos con agar nutritivo inclinado
Tubos con agar nutritivo vertical
Tubos con caldo nutritivo

PROCEDIMIENTO:
1. Se esteriliz el asa de Klle por flameo a la llama.
2. Se tom el tubo con el cultivo de 18 horas, se retir el tapn, flameando la
boca del tubo al mechero y se obtuvo una pequea porcin del cultivo con
ayuda del asa de Klle. Flamee la boca del tubo antes de volver a taparlo.
3. Se tom el tubo con caldo nutritivo, y con los mismos cuidados anteriores
introduzca el asa en el lquido para dejar el inculo. Homogenizando la mezcla
girando el tubo entre las palmas de la mano.
4. Se repiti el procedimiento 1 para obtener ms inculo, pero usando esta
vez aguja de Klle.
5. Se tom el tubo con agar inclinado y realizamos la siembra depositando el
inculo a lo largo de una sola lnea descrita desde la base de la inclinacin
hasta el extremo.
6. Se repiti el procedimiento 1 para obtener inculo, usando nuevamente
aguja de Klle.
7. Se tom el tubo con agar vertical y realizamos la siembra por picadura
profunda del medio.
8. Se rotul los tubos sembrados y se mand a incubar a 37C por 24 horas.
9. Cuando se cumpli el tiempo de incubacin, se evalu el crecimiento y
anotamos sus resultados.
Ejercicio 2: tcnicas de cultivo de microorganismos: Aislamiento y recuento
en placas
MATERIALES:

Tubos de caldo conteniendo una mezcla de microorganismos

Tubos con 12 ml de agar nutritivo licuado y mantenido a 50 C
Placas Petri estriles
Placas con agar Manitol
Placas con agar Mac Conkey
Asa , aguja de Klle

PROCEDIMIENTO:
A) Aislamiento por estras
1. Se tom el tubo de caldo que contiene la mezcla de microorganismos
y con ayuda de la aguja de Klle previamente esterilizada a la llama,
se retir el inculo.
2. Se tom la placa con agar Manitol con la mano izquierda y con ayuda
de los dedos pulgar e ndice levante hacia un lado la tapa, procurando
que la parte expuesta se encuentre bajo la influencia del mechero. No
descubrimos por completo la placa, as se procur evitar mayor
contaminacin. Con la aguja cargada de inculo, se hizo estras sobre
toda la superficie del medio, procurando trazar una ltima estra sobre
toda la superficie del medio, procurando trazar una ltima estra en un
espacio libre. Cierre la placa.
3. Se esteriliz el asa a la llama nuevamente.
4. Se repitieron los pasos 2 y 3 para la placa con agar Mac Conkey.
5. Se mandaron las placas en incubacin a 37C por 24 horas.
6. Se observaron el desarrollo de colonias individuales y describimos sus
caractersticas de forma, elevacin, consistencia, bordes, etc.
Diferenciamos las caractersticas de las colonias desarrolladas en el
medio selectivo-diferencial.

B) Aislamiento por diluciones

1. Se tom el tubo de caldo conteniendo la mezcla de microorganismos y
con ayuda del asa de Klle retirando inculo.
2. Tomamos un primer tubo de agar licuado y mantenido a 50 C y
transfiriendo aspticamente el inculo. Esterilizamos el asa a la llama

3.

4.

5.
6.

del mechero. Con el tubo cerrado mezcle el inculo con el medio,

hacindolo girar entre las palmas de las manos.
La idea era transferir una asada del agar mezclado con el inculo
hacia un segundo tubo de agar licuado. Repetir la operacin anterior
para obtener una mezcla homognea.
Verter el contenido de cada tubo por separado en dos placas Petri
estriles y rtelas lentamente para distribuir el medio de manera
uniforme. Identificar cada dilucin.
Incubar las placas a 37 C por 24 horas.
Examinar el crecimiento de las colonias en las placas; sin embargo,
solo tuvimos resultados de la primera incubacin porque se solidific
el agar licuado, de la segunda disolucin, antes de ser transferido a la
placa que le corresponda. Haga un recuento de colonias, si el
estimado no es inferior a 30 ni superior a 300. Describa las
caractersticas diferenciales de las colonias observadas.

V. RESULTADOS:
Muestra: Staphylococcus sp.
a Crecimiento en estras sobre agar inclinado :

Cantidad: Ninguna
Distribucin
Ninguna

de

la

superficie:

Forma de crecimiento: Ninguna

Consistencia
Ninguna
b

del

crecimiento:

Pigmentacin: Ninguna
Crecimiento en agar vertical por
picadura profunda:

lnea
la

Crecimiento: Limitada a la
de inoculacin o picadura y en
superficie.

c Crecimiento en caldo nutritivo:

Cantidad: Ninguna
Apariencia o tipo: Ninguna

Tcnicas de Aislamiento y recuento:

a) Aislamiento por estras:

Se observ un crecimiento
de colonias.
Borde: entera
Forma: circular

Se observ crecimiento de
colonias
Borde: entera
Forma: puntiforme

b) Aislamiento por dilucin:

Se
observaron
pequeas
colonias (de menor dimetro) y
muy unidas entre s, debido por
la gran cantidad de bacterias
depositadas en el agar licuado.

VI.

DISCUSION:

A) Caldo nutritivo
El crecimiento de las bacterias en medios lquidos se hace con el
objetivo de observar la respuesta que tienen las bacterias con
respecto al oxgeno; se manifiesta por la aparicin de turbidez o
sedimento, velo en la superficie del medio y olor caracterstico. Sin
embargo no se encontr ningn crecimiento bacteriano de
Staphylococcus sp.
B) Agar inclinado
Segn la gua de laboratorio Microbiologa (2000) las formas que se
presentan son las siguientes arborescente, granulado, equinulado,
rizoide y filiforme. Sin embargo no se encontr ningn crecimiento
bacteriano de Staphylococcus sp.
C) Agar vertical
En los resultados de en agar vertical el crecimiento fue limitado a la
lnea de inoculacin o picadura y en la superficie.
Despus de haber sembrado los microorganismos en agar vertical se
confirm que los gneros que formaban parte de la mezcla de
bacterias son anaerobios facultativos, ya que estos se desarrollaron
muy bien tanto en la superficie del medio de cultivo como en la
profundidad.
De acuerdo a ECOLOGIA.UNALM, a menos que tengas un cultivo
fresco de 24 horas directo de la incubadora, no vers muchos tubos

con turbidez, debido a las bacterias tienden a depositarse cuando se

refrigeran por varios das. Despus de esto se formar un anillo o una
pelcula en la superficie del tubo. Al pasar el tiempo observara si se
forma en los tubos el fenmeno de precipitacin. Una vez completo
este paso, mezcla las bacterias agitando, dando golpes, rodando el
tubo en la palma de tu mano. Una vez mezclado, podr observar
turbidez, floculacin, o una apariencia de hilo dentro del caldo.
Este fue uno de los posibles causantes de la variacin en los
resultados con las discusiones pues, al ser un cultivo viejo como se
explic no se podra apreciar muy bien las caractersticas propias de la
bacteria.
Aislamiento y recuento de placas
A) Por estras o agotamiento en superficie:
Para esta tcnica se usa una mezcla de bacterias (E.coli,
Staphylococcus sp. y Bacillus sp.); segn Gamazo (2005) los
microorganismos se encuentran en comunidades complejas en la
naturaleza; por ello la tcnica ms utilizada en los laboratorios de
microbiologa que permite que cada bacteria viable (viva) sea aislada
en la superficie del medio slido es esta.
De esta manera se desarrollar hasta formar un cmulo de bacteria,
que se hace visible como una colonia aislada, contabilizndose como
unidades formadoras de colonias, para su posterior investigacin.
En nuestros resultados se observa que en las placas Petri, hay un
mayor crecimiento microbiano en el agar Manitol, tambin se observa
en las colonias eran pequeas y de color amarillo, Rodrguez (2007)
menciona que el agar manitol es un medio de cultivo altamente
selectivo pues al contener cloruro de sodio NaCl (7.5%), aumenta la
presin osmtica ,originando la proliferacin de bacterias
osmoresistentes, y la presencia de manitol evidencia la fermentacin
que hubo, es por ello la coloracin amarilla que presento, como
consecuencia solo creci las cepas de gnero Staphylococcus sp,
pues son las nicas que cumplen estas dos condiciones. Garca
(1994).
Se utiliz el agar Mac Conkey para el aislamiento de Gram negativas
de fcil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos, ya que en el
medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para

el desarrollo bacteriano y la lactosa es el hidrato de carbono

fermentable (Food and Drug Administration, 1995)
Se observa que en las placas Petri, hay crecimiento microbiano en el
agar Mac Conkey. Este agar es de tipo selectivo debido a la mezcla de
sales biliares y cristal violeta que inhiben el desarrollo de gran parte de
flora Gram positivas. (Food and Drug Administration, 1995)
En el agar Mac Conkey las poblaciones eran grandes y de color
violeta debido a que eran Gram negativas, se poda contar eran 12
colonias. En cambio en el agar Manitol eran varias colonias muy
pequeas y de color amarillo y con mal olor debido a que haba
fermentado el manitol.
B)

Por diluciones:

En este caso, se quiere hacer el recuento de bacterias para determinar el

nmero de bacterias existentes en una muestra o cultivo, puede ser en
un determinado volumen o determinando el nmero de bacterias vivas
existente, ya que cada bacteria da lugar a una colonia diferente, y luego
se cuenta el nmero de colonias que se han desarrollado (recuento
viable), segn De la Rosa (2003).
En la primera dilucin las colonias eran pequeas y estaban muy juntas
lo cual se haca difcil de contar, en la secunda dilucin eran pocas
colonias y de aspecto brilloso. Esta tcnica sirve para diferenciar que tipo
de microrganismos estamos trabajando y mantenerlo fresco.

VII.

CONCLUSIONES:
Es importante tener bien claro el procedimiento, para llevar a cabo la
preparacin de los medios de cultivo, porque de estos dependen el
crecimiento de los distintos microorganismos.
Es necesario trabajar con las suficientes medidas de asepsia y esterilidad,
para que el aislamiento sea exitoso y para evitar posibles contaminaciones
externas en nuestro medio de cultivo.

El cultivo en caldo nutritivo permite observar el crecimiento de la cepa en

presencia o ausencia de oxgeno.
El medio de cultivo slido permite una seleccin y diferenciacin entre el
crecimiento de las bacterias presentes en la mezcla.
Mediante las tcnicas de aislamiento se pueden separar colonias
individuales partiendo de una mezcla de microorganismos como se realiz
en la prctica, de este modo nos permite visualizar de manera objetiva las
colonias.
El agar Manitol es un medio de cultivo selectivo y diferenciado para las
cepas de genero Staphylococcus y agar Mc Conkey para los E. coli.

Con la prctica se demuestra que uno de los mtodos de cultivos de

organismo puros ms sencillos de usar y aun as muy efectivo, es mediante
el aislamiento por estras, mediante la estriacin que poco a poco dar
lugar a colonias formadas por organismos nicos que se van desarrollando
en el Agar, tal como se puede observar en la placa con agar Mc Conkey.

VIII.

CUESTIONARIO:

Ejercicio n 1
1 Por qu algunos microorganismos desarrollan en caldo un
caracterstico crecimiento tipo clula? Qu factores sustanciales
podran alterar la formacin de una pelcula superficial?
Presentan este tipo de crecimiento porque es un medio de cultivo lquido,
las bacterias segn su forma de crecimiento invadirn todo el caldo si es
posible.
El factor que podra alterar la formacin de la pelcula es el oxgeno, ya que
si son bacterias aerobias tendrn la pelcula en la superficie, si son aerobias
facultativas en el medio y si son anaerobias se sedimentarn en el fondo.
2 Cuando utiliza tubos de agar inclinado para el estudio de las
caractersticas de crecimiento es preferible inocular con aguja de Klle
y no con asa Por qu?
Es preferible que el instrumento de inoculacin sea retirado a lo largo del
mismo camino que se us para atravesar inicialmente el medio. Solo se pica
el agar con un movimiento uniforme y recto, por eso se usa la aguja de Klle
y no el asa.
3 Qu factores influenciarn en la abundancia de crecimiento en caldo,
agar inclinado y agar vertical?

En cualquier medio de cultivo es de primordial importancia ajustar el pH, ya

que an cuando la mayora de los microorganismos crecen mejor en pH
neutro, algunos requieren de pH alcalino o cido, por lo que al proporcionar
un pH adecuado se favorecer el crecimiento del microorganismo de inters
y la obtencin del cultivo. Con este mismo propsito durante la incubacin se
deben proporcionar las condiciones adecuadas para el microorganismo en
estudio. El crecimiento ptimo de los microorganismos se presenta a
temperaturas que la mayora de las veces estn relacionadas con la de su
hbitat natural.
Ejercicio n 2:
1. Qu procedimiento seguira a continuacin del desarrollo en estos
ejercicios para obtener el cultivo puro de cada cepa contenida en la
muestra? Cmo podramos comprobar que estas cepas obtenidas
finalmente corresponden a las colonias aisladas?
Sera tomar muestras de las colonias aisladas que deben formarse al final de
las estras y ponerlas en medios de cultivo para su desarrollo y posterior
identificacin.
En el caso de aislamiento por diluciones, debe tomarse la muestra de la
placa que luego de varias diluciones, presenta un menor nmero de colonias
aisladas, lo que facilita recogerla y sembrarla en un medio adecuado para su
desarrollo y posterior identificacin.
La comprobacin de que las cepas obtenidas pertenecen a las colonias
aisladas, podra hacerse, sembrando la muestra en un medio que contenga
determinado nutriente, al que slo responde este tipo de microorganismo, o
regulando los niveles de oxgeno, dependiendo del tipo de respiracin que
presenta el microorganismo de la muestra.
2. Qu factores limitan el tamao de las colonias en una placa de
cultivo?
Existen diversos factores que limitan el tamao de las colonias en un placa
de cultivo; una de ellas es el pH, dependiendo del rango de pH del medio; el
contenido de agua, influenciar en la forma y tamao de la colonia; el
potencial de xido reduccin; el contenido nutricional presente en el medio
cultivo; los constituyentes antimicrobiales y las estructuras biolgicas.
3. Suponga que recibe una muestra de leche en polvo y se le pide
determinar el nmero total de colonias por gramo. Plantee una

metodologa cuantitativa basada en diluciones sucesivas para resolver

el problema.
Tomamos una muestra de un gramo de leche en polvo y la diluimos en
aproximadamente 10 mL de medio de cultivo. De la mezcla, se transfiere 1
mL a otro tubo, el cual contenga 9 mL de una solucin salina. A continuacin,
se procede a homogenizar y se toma finalmente, 1 mL de esta solucin y se
le transfiere a otro tubo con 9 mL de solucin salina. Posteriormente, se
vierte 1 mL de cada tubo en tres placas Petri y se procede a incubarlas a 30
C por 24 horas. Transcurrido el tiempo, se realiza el conteo de las colonias
en la placa que haya menor nmero de stas y el resultado se multiplica por
10, pues fue la tercera dilucin.
4.

En qu consiste la tcnica del nmero ms probable y qu usos

tiene?
El mtodo del nmero ms probable (NMP), nos proporciona un recuento de
viables. Se basa en el principio de que una nica clula viva puede
desarrollarse y producir un cultivo turbio. El NMP requiere la realizacin de
una serie de diluciones seriadas al dcimo de la muestra de cultivo, en un
medio lquido adecuado para el crecimiento de dicho organismo.
Posteriormente, se incuban las muestras de dichos tubos problema. Una vez
que ha pasado suficiente tiempo como para que crezca el microorganismo,
se examinan los tubos. Aquellos tubos que fueron inoculados con una o ms
clulas microbianas a partir de la muestra, se pondrn turbios, mientras que
los tubos que no recibieron ninguna clula permanecern transparentes. A
medida que se aumenta el factor de dilucin, se alcanzar un punto en el
cual algunos tubos contendrn tan slo un organismo y otros, ninguno. Al
determinar la probabilidad de que los tubos no recibieran ninguna clula, se
puede determinar el nmero ms probable de microorganismos presentes en
la muestra original, utilizando para ello una tabla estadstica.
La precisin del nmero ms probable aumenta con el nmero de tubos que
se usan, aunque cinco tubos por dilucin se consideran como una relacin
apropiada entre la precisin y la economa. El mtodo del NMP se utiliza para
contar microorganismos que son difciles de cultivar en medio slido.
Tambin se usa para determinar el nmero de clulas de un cultivo mixto que
pueden crecer en un medio lquido determinado. Por ejemplo, puede
emplearse para determinar la contaminacin del agua potable, determinando
el nmero de bacterias que pueden crecer en un medio que contiene lactosa.
Estas bacterias probablemente sean Escherichia coli provenientes de aguas

residuales contaminadas, y la presencia de E. coli en el agua potable es una

prueba presuntiva de contaminacin.
5. De qu manera se pueden preservar cepas puras por largos
perodos?
A) Mtodos de eleccin o de conservacin a largo plazo .
Son los mejores porque en ellos se paraliza el crecimiento de las clulas
microbianas, pero stas no han muerto. As se garantiza al mximo la
estabilidad gentica, por evitarse la aparicin de generaciones sucesivas.
a) Conservacin por congelacin:
Se congelan las clulas en suspensin en un lquido con un agente
crioprotector y se guardan a temperaturas inferiores a cero grados
centgrados, con lo que el agua se congela. De esta forma, al no disponer las
clulas de agua en forma lquida, no hay crecimiento. Cuando se quiere
trabajar con las clulas as conservadas, se recuperan subiendo la
temperatura. Este es el mejor mtodo de conservacin desde todos los
puntos de vista, pero tiene el inconveniente de requerir aparatos especiales.
b) Conservacin por liofilizacin:
Tampoco se da crecimiento en las clulas conservadas por este mtodo,
puesto que se les ha quitado el agua mediante la liofilizacin, que es un
proceso suave. Con ello la estabilidad gentica es alta, pero a veces no tanto
como en la congelacin, porque la liofilizacin se consigue por sublimacin
del hielo de las clulas.

B) Mtodos alternativos:
Son los que se utilizan cuando no se pueden emplear los mtodos de
eleccin, bien por carecer de los equipos necesarios, o bien porque la cepa
microbiana no resiste los tratamientos de la conservacin por estos mtodos.
Conviene tener en cuenta que nunca se debe usar un nico mtodo
alternativo, sino que se recomienda conservar el microorganismo empleando
varios de estos mtodos.
a) Conservacin por transferencia peridica:
La cepa microbiana se guarda en forma de cultivo activo en el medio de
cultivo en el que ha crecido. Sin embargo, estas clulas no pueden

permanecer indefinidamente en el mismo tubo, porque al seguir activas

excretan productos txicos del metabolismo que se acumulan, provocando el
envejecimiento y muerte celulares, por lo que es necesario transferirlas a otro
tubo con medio de cultivo fresco.
b) Conservacin por suspensin en agua destilada o en agua de mar
estril:
Es un mtodo alternativo muy utilizado y que da altos porcentajes de
viabilidad en diversos tipos de microorganismos, tanto hongos filamentosos
como levaduras y algunas bacterias. Consiste en suspender en agua estril
unas cuantas clulas del cultivo que se quiere conservar. Se pueden
preparar en criotubos de los anteriormente mencionados. En este caso la
concentracin celular no debe ser superior a 10 4-105 clulas/ml en el caso de
bacterias y levaduras. Para los hongos filamentosos que no esporulan, se
pueden poner en suspensin trocitos de agar con el crecimiento del hongo.
En el caso de microorganismos marinos, la suspensin se hace en agua de
mar diluida.
C) Mtodos restringidos:
En este grupo se engloban mtodos no empleados habitualmente, pero a los
que es necesario recurrir a la hora de conservar grupos de microorganismos
muy determinados que no resisten bien la liofilizacin o la congelacin, como
por ejemplo los gneros bacterianos Spirillum, Rhodospirillum, etc. Los
cuatro mtodos que vamos a citar se basan en la paralizacin del
crecimiento por eliminacin del agua disponible para las clulas.

a) Desecacin en papel de filtro.

Se utiliza un papel bastante absorbente (Whatmann n 3) que se impregna
con una solucin muy densa de clulas y se deja secar al aire (en
condiciones estriles). Tambin es posible desecarlos por el procedimiento
que se llama desecacin lquida (L-Dry) porque se utiliza para ello el
liofilizador, pero sin que haya habido congelacin previa de las clulas.
b) Desecacin en suelo, arena, silicagel, etc.

Se aaden las clulas a estos sustratos que las protegern al desecar. Los
microorganismos productores de esporas se pueden conservar durante
bastante tiempo por este mtodo.
c)Desecacin en bolitas de alginato.
ste es un procedimiento bastante eficaz. Las clulas se encuentran en una
matriz de alginato y la eliminacin del agua se hace por tratamiento con
soluciones hipertnicas sucesivas y posterior desecacin al aire hasta que se
pierde un 70% de su contenido en agua.
d) Desecacin en sal gorda para halobacterias.
Para su conservacin por este mtodo se mezclan las clulas con sal y se
dejan desecar espontneamente. Debido a la higroscopicidad de la sal, la
desecacin no es total, pero las clulas dejan de multiplicarse por ser
insuficiente el nivel de agua disponible.
6. Qu tcnicas de cultivo se emplean para aislar microorganismos
anaerbicos?
Para el cultivo de microorganismos anaerobios estrictos: En medio lquido,
aadimos al medio de cultivo agentes reductores que toman el O2 disuelto
en el agua y forman H2o. Estos agentes son cistena o tioglicolato, por
ejemplo. Otra manera es bombeando CO2 o N2 libre de 02 al medio,
mediante burbujeo.
En medio slido, se emplean jarras de anaerobiosis o jarras de Gas-Pak. Su
tamao es similar al de un termo. En su interior se colocan las placas Petri
invertidas. El recipiente se cierra con una tapa hermtica. En la parte inferior
hay un catalizador de paladio. Para conseguir la anaerobiosis, introducimos
sobres de anaerobiosis, que contienen NaCO3 y borohidruro de sodio. Al
aadir agua al sobre, se libera H2 y CO2. El oxgeno presente se reduce a
agua. Para verificar la anaerobiosis hay un indicador, que consiste en una tira
de papel impregnada con azul de metileno. En condiciones aerbicas, la tira
es azul, pero sino, es transparente. En la tapa hay un manmetro con el que
medimos la presin interna, ya que se estn desprendiendo CO2 y H2.

IX. BIBLIOGRAFA:

HERNANDEZ, A. 2003. Microbiologa industrial. Primera edicin.

Editorial EUNED. San Jos, Costa Rica.

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