Técnicas Analíticas en Un Laboratorio Farmacéutico

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE INGENIERA, CIENCIAS SOCIALES Y

ADMINISTRATIVAS

SECCIN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIN

PROPUESTA DE MEJORA UTILIZANDO DISEO DE EXPERIMENTOS EN EL DESARROLLO DE
TCNICAS ANALTICAS EN UN LABORATORIO FARMACUTICO

T E S I S

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
M A E S T R O E N
I N G E N I E R A I N D U S T R I A L
P R E S E N T A:
C. NANCY BARAJAS GONZLEZ
DIRECTORES DE TESIS:
DR. MIGUEL NGEL LPEZ FLORES
M. EN I. JUAN JOS HURTADO MORENO

MXICO, DF. AO 2011

Quisiera expresar mi ms sincero
agradecimiento a todas aquellas
personas e instituciones que de alguna
manera han sido participes de en el
desarrollo de la presente Tesis:
A mis directores de tesis Dr. Miguel ngel
Flores Lpez, y M en I Juan Jos Hurtado;
quienes fueron pieza clave para concluir
mis estudios de maestra, gracias por su
amistad y su confianza.
A mis profesores M en C. Mara
Guadalupe Obregn Snchez, M en C
Carlos Gutirrez, M en C Junior Sandoval
por su colaboracin desinteresada.
A mi esposo Edgar por su amor y apoyo
incondicional, que ha sido mi fortaleza
para seguir adelante.
A mi familia, por estar a mi lado en esta
etapa de mi vida
A UPIICSA por brindarme la oportunidad
de seguir superndome.

II

NDICE
RESUMEN ............................................................................................................................... VII
ABSTRACT ............................................................................................................................. VIII
INTRODUCCIN ........................................................................................................................ 1
CAPTULO 1
GENERALIDADES Y SITUACIN ACTUAL DE LA INDUSTRIA FARMACUTICA................................. 3
1.1. ANTECEDENTES .................................................................................................................... 3
1.2. FARMACOPEA DE LOS ESTADOS UNIDOS MEXICANOS .......................................................... 5
1.3. TCNICAS INSTRUMENTALES ................................................................................................ 7
1.4. VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LAS TCNICAS INSTRUMENTALES .................................. 10
1.5. INTERS FARMACUTICO EN LAS TCNICAS INSTRUMENTALES .......................................... 12
1.6. CLASIFICACIN DE LAS TCNICAS INSTRUMENTALES .......................................................... 14
CAPTULO 2
SEPARACIONES CROMATOGRFICAS ....................................................................................... 16
2.1. DESCRIPCIN GENERAL DE LA CROMATOGRAFA ............................................................... 16
2.2. CLASIFICACIN DE LOS MTODOS CROMATOGRFICOS ..................................................... 18
2.2.1. TIPOS DE CROMATOGRAFA ............................................................................................ 18
2.2.2. TCNICAS CROMATOGRFICAS........................................................................................ 21
2.3. CROMATOGRAFA LQUIDA EN COLUMNA .......................................................................... 23
2.3.1. CROMATOGRAMA ........................................................................................................... 26
2.3.2. RELACIONES DE TIEMPO .................................................................................................. 27
2.3.3. RELACIONES DE VOLUMEN .............................................................................................. 28
2.3.4. FACTOR DE SELECTIVIDAD ............................................................................................... 29
2.4. EFICIENCIA DE LA COLUMNA .............................................................................................. 31
2.4.1. ALTURA DE PLATO ........................................................................................................... 31
2.4.2. ENSANCHAMIENTO DE BANDA ........................................................................................ 33
2.5. CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN ............................................................. 38
2.5.1. INSTRUMENTACIN EN HPLC .......................................................................................... 39
2.5.2. BOMBAS .......................................................................................................................... 40
2.5.3. INYECTORES .................................................................................................................... 42
III

2.5.4. COLUMNAS ..................................................................................................................... 43
2.5.5. FASE ESTACIONARIA ........................................................................................................ 45
2.5.6. FASES MVILES ............................................................................................................... 47
2.5.7. DETECTORES ................................................................................................................... 48
CAPTULO 3
DISEO DE EXPERIMENTOS ..................................................................................................... 50
3.1 PLANEACIN DE UN EXPERIMENTO ..................................................................................... 50
3.2 EL CONCEPTO DE ROBUSTEZ ............................................................................................... 52
3.3 FACTORES DE CONTROL, RUIDO Y DE SEAL ....................................................................... 53
3.4 ARREGLOS ORTOGONALES .................................................................................................. 57
3.5 RAZN SEAL/RUIDO .......................................................................................................... 58
CAPTULO 4
APLICACIN DEL DISEO DE EXPERIMENTOS EN EL DESARROLLO DE UN MTODO ANALTICO . 61
4.1. DESARROLLO DEL EXPERIMENTO........................................................................................ 61
4.2. DETERMINACIN DE FACTORES ......................................................................................... 62
4.3. METODOLOGA .................................................................................................................. 64
4.4. ANLISIS DE RESULTADOS .................................................................................................. 74
CONCLUSIONES ...................................................................................................................... 78
REFERENCIAS .......................................................................................................................... 80
BIBLIOGRAFA CONSULTADA ................................................................................................... 81
IV

NDICE DE FIGURAS
Figura 1.1 Primera Farmacopea Mexicana ...................................................................................... 6
Figura 1.2. Componentes bsicos de un instrumento analtico ..................................................... 10
Figura 1.3 Clasificacin de los mtodos instrumentales ................................................................ 15
Figura 2.1 Tipos de separacin cromatogrfica. ............................................................................ 20
Figura 2.2 Separacin cromatogrfica. ......................................................................................... 24
Figura 2.3 Perfiles de concentracin del soluto A y B a dos tiempos diferentes. ........................... 25
Figura 2.4. Cromatograma ........................................................................................................... 27
Figura 2.5. Efecto de la selectividad con en cambio de la composicin de fase mvil. ................... 30
Figura 2.6 Curva tpica de la Van Deemter .................................................................................... 35
Figura 2.7 Contribuciones al ensanchamiento de banda. .............................................................. 37
Figura 2.8 Equipo de HPLC modelo HP1200 .................................................................................. 40
Figura 2.9 Bomba de dos pistones en serie ................................................................................... 41
Figura 2.10 Vlvula de inyeccin utilizada en HPLC ....................................................................... 43
Figura 2.11 Columna de acero ...................................................................................................... 45
Figura 2.12 Estructura del gel de slice para cromatografa. .......................................................... 46
Figura 3.1 Clases de factores ortogonales de acuerdo a su efecto sobre la madia (eje X) y/o
variabilidad (eje Y). ...................................................................................................................... 54
Figura 3.2 Arreglos ortogonales ms frecuentes ........................................................................... 58
Figura 4.1 Metodologa analtica para la determinacin de la concentracin de Dinitrato de
isosorbida. ................................................................................................................................... 61
Figura 4.2 Diagrama bsico de un sistema de HPLC. ..................................................................... 62
Figura 4.3 Cromatogramas del Corrida 1 ...................................................................................... 66
Figura 4.10 Cromatogramas del Corrida 8 .................................................................................... 73
V

NDICE DE TABLAS
Tabla 1.1 Tcnicas instrumentales utilizadas en la identificacin y determinacin de estructura
qumica ........................................................................................................................................ 13
Tabla 2.1 Clasificacin de los mtodos cromatogrficos ............................................................... 22
Tabla 2.2 Mtodos utilizados para el clculo de N. ....................................................................... 33
Tabla 2.3 Caractersticas generales de las columnas cromatogrficas empleadas en HPLC ............ 44
Tabla 3.1 Razn seal/ruido para las diferentes tipos de variables de respuesta .......................... 60
Tabla 4.1 Descripcin de los factores a combinar en el experimento. ........................................... 63
Tabla 4.3 Factor A. pH de la solucin de sulfato de amonio .......................................................... 64
Tabla 4.4 Factor B. pH de la solucin de sulfato de amonio .......................................................... 64
Tabla 4.5 Factores C y D. Flujo de la bomba y temperatura de la columna cromatogrfica ........... 65
Tabla 4.7 Condiciones experimentales de la corrida 1. ................................................................. 66
Tabla 4.10 Condiciones experimentales de la corrida 4 ................................................................ 69
Tabla 4.11 Condiciones experimentales de la corrida 5. ............................................................... 70
Tabla 4.15 Factores y niveles del experimento ............................................................................. 75
Tabla 4.16 Tabla ANOVA para el experimento .............................................................................. 76
Tabla 4. 17 Corrida final ............................................................................................................... 76
Tabla 4.18 Comparacin del mtodo actual con el mtodo propuesto. ........................................ 77
Tabla 4.19 Resultados obtenidos con el mtodo propuesto ......................................................... 77

VI

Abreviaturas y unidades
CFS: Cromatografa de fluidos supercrticos
CGL: Cromatografa Gas-Lquido
CGS: Cromatografa Gas-Slido
CLAE: Cromatografa Lquida de Alta Eficiencia
CLAR: Cromatografa Lquida de Alta Resolucin
CLL: Cromatografa Lquido-Lquido
CLS: Cromatografa Lquido-Slido
COFEPRIS: Comisin Federal para la Proteccin contra Riesgos
FEUM: Farmacopea de los estados Unidos Mexicanos
HPLC: Cromatografa lquida de alta presin (Hight Performance Liquid Cromatigraphic)
ODS: Octadecilsilano
pH: potencial de hidrgeno
RMN: Resonancia magntica nuclear
USP: Farmacopea de los Etados Unidos (United States Pharmacopeia)
m: micrmetros
cm: centmetros
mL/min: mililitros/minuto
mm: milmetros
ppm: partes por milln
psi: libras de presin

VII

RESUMEN
El presente trabajo surge de la necesidad del laboratorio de control de calidad de optimizar las
tcnicas de anlisis instrumental en la elaboracin de medicamentos en una empresa
farmacutica para reducir el tiempo de anlisis de las muestras proponiendo por medio del diseo
de experimentos una nueva metodologa de anlisis para optimizar el proceso de control y
liberacin del producto cumpliendo con la normas establecidas.
Para lograrlo se realiz una serie de experimentos en donde se utiliz un equipo de cromatografa
de alta resolucin (HPLC) para la determinacin de la concentracin del compuesto dinitrato de
isosorbida en presentacin de tabletas, cambiando la longitud de columna cromatogrfica que
utiliza actualmente y modificando algunos de los factores que influyen en el proceso
cromatogrfico para mejorar los tiempos de anlisis y poder utilizar esta tcnica mejorada en
productos similares.
Se analizaron los diferentes factores que influyen en el proceso cromatogrfico para la
modificacin de los factores a utilizar, por medio del diseo de experimentos permiti establecer
la combinacin de factores que nos permitira reducir el tiempo de retencin del compuesto. Al
reducir el tiempo de retencin del compuesto, se reduce en general el tiempo del anlisis, as
como el consumo de solventes utilizados en la cromatografa, haciendo ms eficiente el proceso.
La tcnica mejorada podr implementarse en otras pruebas con caractersticas similares.

VIII

ABSTRACT
This work arises from the need for quality control laboratory to optimize the instrumental analysis
techniques in the development of drugs in a pharmaceutical company to reduce the analysis time
of samples proposed by designing experiments a new method of analysis to optimize the process
control and product release in compliance with the standards.
To achieve this, made a series of experiments where we used a team of high resolution
chromatography (HPLC) to determine the concentration of compound isosorbide dinitrate tablets
presentation, changing the length of chromatographic column is currently using and modifying
some factors influencing the chromatographic process to improve analysis times and improved use
this technique in similar products.
We analyzed the different factors influencing the chromatographic process for the modification of
the factors to be used, by design of experiments allowed to determine the combination of factors
that enable us to reduce the retention time of the compound. By reducing the compound
retention time, reducing overall analysis time and consumption of solvents used in
chromatography, making the process more efficient. Improved technique can be implemented in
other similar tests.
1

INTRODUCCIN
En un ambiente tan competitivo como lo es la industria farmacutica, surge la necesidad de
desarrollar tcnicas analticas ms eficientes, con resultados rpidos y fiables durante el proceso
de fabricacin para una pronta liberacin de los medicamentos al mercado. Uno de los objetivos
del laboratorio de control de calidad es el desarrollo y mejora de las tcnicas de anlisis
hacindolas mucho ms eficientes y rpidas. La industria farmacutica se ha caracterizado desde
sus inicios; por la necesidad de alcanzar altos niveles de calidad, para lo cual fue desarrollando
procedimientos que han evolucionado con una reglamentacin estricta; para ello se buscan
alternativas para mejorar y hacer ms eficientes los procesos, una de estas alternativas es la
modificacin de las tcnicas instrumentales.
En Mxico la Secretara de Salud ejerce las atribuciones de regulacin, control y fomento sanitario
a travs de la Comisin Federal para la Proteccin contra Riesgos Sanitarios (COFEPRIS), siendo
una de sus funciones realizar el control de los medicamentos y los insumos relacionados al mismo.
La Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos (FEUM), es el documento expedido por la
Secretara de Salud que consigna los mtodos generales de anlisis y los requisitos sobre
identidad, pureza y calidad de los frmacos, aditivos, medicamentos, productos biolgicos y
biotecnolgicos.
El objetivo de este trabajo es disminuir el tiempo de anlisis en la prueba de valoracin de
dinitrato de isosorbida 10 mg tabletas por Cromatografa Lquida en Columna de Alta Resolucin
utilizando diseo de experimentos, en un laboratorio farmacutico de Control de Calidad,
cambiando la longitud de la columna cromatogrfica de 25 cm a 5 cm. Para lograrlo se
identificaran las condiciones que influyen durante el proceso cromatogrfico y por medio del
diseo de experimentos realizar la combinacin de factores para disminuir el tiempo el tiempo de
retencin del compuesto.
En el captulo 1 del presente trabajo se realiza una descripcin del panorama general de la
industria farmacutica, as como la reglamentacin que existe en relacin a la regulacin y control
2

de medicamentos, se revisa la importancia y la incursin de las tcnicas instrumentales de anlisis
en la industria farmacutica, su clasificacin, ventajas y desventajas.
En el captulo 2 se revisan los conceptos relacionados con la tcnica de separacin cromatogrfica
por HPLC utilizada en el laboratorio de control de calidad para evaluar caractersticas como
identidad y pureza de un frmaco. Se describen los factores que intervienen durante las
separaciones cromatogrficas que nos ayudaran a la realizacin de los experimentos posteriores.
En el captulo 3 se realiza una descripcin general de los fundamentos del diseo factorial de
experimentos, que nos servirn para planear y realizar los experimentos. Los principios que se
presentan en este captulo constituyen la base para la estructura del estudio de investigacin del
presente trabajo.
En el captulo 4 se presenta el desarrollo de los experimentos, con los factores seleccionados
utilizando un arreglo factorial L8, se realiza el anlisis de resultados Para finalizar, al final del
captulo se presentan las principales conclusiones obtenidas y se definen posibles futuras lneas de
investigacin.

3

CAPTULO 1
GENERALIDADES Y SITUACIN ACTUAL DE LA INDUSTRIA FARMACUTICA
1.1. ANTECEDENTES
En la industria farmacutica, el anlisis instrumental es una herramienta importante para la
fabricacin de medicamentos, por su efecto en la salud, los medicamentos alcanzan una
importancia social mayor que los productos de otras industrias. El secretario de Salud de Mxico
defini dicha importancia: Es incuestionable que la salud es un requisito primordial para lograr el
bienestar de la sociedad. No puede haber desarrollo econmico pleno, ni disfrute de la libertad en
su significado ms amplio, si no se tiene salud (Secretara de Salud 2005).
La industria farmacutica es un elemento importante en el sistema de atencin a la salud. Est
constituida por numerosas organizaciones pblicas y privadas dedicadas a la investigacin,
desarrollo, fabricacin y comercializacin de medicamentos para la salud humana y animal
(Gennaro 1990). Los principios activos utilizados en los medicamentos presentan grandes
actividades farmacolgicas y toxicolgicas, las inversiones de la industria farmacutica en
investigacin y desarrollo, as como los modernos avances cientficos y tecnolgicos aceleran el
descubrimiento y desarrollo de productos farmacuticos innovadores con una mejor actividad
teraputica y menos efectos secundarios para los pacientes.
Los adelantos en el genoma humano y otros avances tecnolgicos comenzaron a dar resultados a
partir del 2005, los laboratorios farmacuticos y biotecnolgicos estn desarrollando
medicamentos para enfermedades como cncer, enfermedades neumolgicas, as como
enfermedades cardiacas y vacunas para el SIDA (VIH) entre otros. La industria farmacutica
requiere la inversin de grandes capitales debido a los gastos asociados a la Investigacin y
desarrollo, la autorizacin de comercializacin, la fabricacin, la garanta y el control de calidad, la
comercializacin y las ventas (Spilker 1994).
4

A mediados de siglo XIX La farmacopea, haba sido obtenida recopilando la sustancias simples de
la medina antigua, era una mezcla de medicina verncula y mgica, la medicina cientfica se
desarrollo a partir de la segunda mitad de ese siglo, debido a los avances vinculados con este
campo del conocimiento (Gmez 2008). Empiezan a ver avances en las reas cientficas ligadas a la
qumica, biologa y medicina, posteriormente un proceso de convergencia de conocimientos
procedente de estas disciplinas, que hizo posible el surgimiento de la farmacologa y el inicio del
aprovechamiento de la industria farmacutica en la acumulacin de conocimientos tcnicos y
productivos de otras industrias como la qumica en la elaboracin de pigmentos y colorantes.
Estos tres elementos formaron la base cientfica y tcnica que hizo posible el nacimiento de la
industria farmacutica.
La evolucin del conocimiento se inicio antes, pero el hecho que cambio definitivamente el modo
de concebir la medicina y la investigacin farmacutica fue la publicacin de Darwin, en 1859, de
la teora de la evolucin por seleccin natural, este hecho rompi con el paradigma establecido en
la investigacin cientfica y dio pauta al establecimiento de las teoras de la medicina moderna y la
industria farmacutica.
El desarrollo de los antibiticos, en especial el descubrimiento de la penicilina, es el detonador de
la industria farmacutica, descubierta por Fleming en 1928, no es hasta la dcada de los cuarenta
cuando se industrializa comercialmente. La produccin a gran escala se logro en empresas
estadunidenses como Glaxo y Pfizer, dando lugar a la investigacin de nuevos antibiticos. A
principios de los sesenta ya se fabricaban una gran cantidad de medicamentos para numerosas
enfermedades sin embargo el principal problema eran los efectos secundarios en los
pacientes(Gmez 2008). Esto dio origen a un cambio a fondo de las normas de produccin de
frmacos.
Un novedoso enfoque se dio gracias al avance en las reas de fisiologa, farmacologa, enzimologa
y biologa celular. Con este nuevo conocimiento se logro identificar a cada clula como una como
una estructura anatmico-fisiolgica y bioqumica muy especfica, lo cual permiti disear
frmacos capaces de interferir en la estructura celular y por ende afectar el proceso vital de las
bacterias, virus y clulas cancerosas. Bajo este esquema las primeras en competir fueron las
5

compaas estadounidenses, inglesas y suizas en tanto que las europeas y suizas se quedaron
rezagadas.
La biotecnologa a tomado importancia en los ltimos 30 aos debido a la acumulacin de los
conocimientos de los mecanismos de la vida misma: El desciframiento de la estructura y la funcin
del cdigo gentico (Corona y Jimnez 2003). La evolucin de las ciencias biolgicas dio origen a
desarrollo de la ingeniera gentica la cual tuvo una rpida aplicacin en la industria y el comercio.
De hecho la produccin de nuevas sustancias biotecnolgicas ha superado los compuestos de base
tradicional. El centro mundial de estos desarrollos se encuentra en Estados Unidos pas lder en la
produccin de medicamentos de origen biotecnolgico.
En general la evolucin de la industria farmacutica est vinculada al conocimiento cientfico. El
desarrollo de las capacidades presentes y futuras dependen de la formacin de slidos equipos de
investigacin en ciencias bsica, si ello todo intento por aumentar las capacidades cientficas y
tecnolgicas no ser real. Los gobiernos y el sector privado deben de coordinar sus esfuerzos en
centros de investigacin de alto nivel as como de Investigacin y desarrollo.
1.2. FARMACOPEA DE LOS ESTADOS UNIDOS MEXICANOS
En el contexto nacional, de acuerdo al Reglamento de Insumos para la Salud en su titulo primero,
artculo 2, fraccin IX, la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos (FEUM) se define como:
al documento expedido por la Secretara que consigna los mtodos generales de anlisis y los
requisitos sobre identidad, pureza y calidad de los frmacos, aditivos, medicamentos, productos
biolgicos y dems insumos para la salud.
En Amrica el desarrollo de las tecnologas enfocadas a la cuantificacin de los principios activos
inicio a partir de la segunda mitad del siglo XIX en Estados Unidos, la primera farmacopea que se
publico en este pas fue en al ao de 1820, siendo la primera en el continente americano, estaba
constituida por cinco secciones y en ella se enumeraban los metales, plantas y otros ingredientes
para uso medicinal. Proporcionaba las recetas para la mezcla de medicamentos, sufri muchas
revisiones a lo largo de los siglos XIX y XX. Hoy en da contiene las normas para la potencia, pureza,
envasado y etiquetado de los medicamentos en los Estados Unidos.
6

La Farmacopea Mexicana fue publicada por primera vez en 1846 y estaba constituida de tres
partes: la primera dedicada a las sustancias simples de origen natural, la segunda a preparaciones
qumicas y la ltima a las preparaciones farmacuticas. En la primera seccin aparecen 495
productos de origen vegetal, 28 provenientes del reino animal y 51 de origen mineral. En los
apartados dedicados a cada uno ellos se incluye el nombre vulgar seguido del cientfico, las partes
que se utilizan del mismo y su aplicacin teraputica.

Figura 1.1 Primera Farmacopea Mexicana
Fuente: (Academia farmacutica 1846)
Durante el trascurso del siglo XX tuvo varias modificaciones, las pginas del texto oficial incluyeron
a los nuevos frmacos que iban sintetizndose en los laboratorios nacionales y trasnacionales,
destacan los antibiticos, anestsicos y hormonas. En la edicin del ao 1952 incluyo por primera
vez la clebre penicilina, la sal de sodio de Pentabarbital y la Testosterona. Tambin inclua una
seccin dedicaba especficamente a los mtodos oficiales para llevar a cabo determinaciones
fsicas y qumicas, as como las caractersticas del equipo y material para llevarlas a cabo.
En la actualidad la Comisin permanente de la Farmacopea Mexicana forma parte de un proyecto
de armonizacin que incluye a la USP, La Farmacopea Argentina y la Brasilea. Este grupo creado
en el ao 2000, se rene varias veces al ao con la premisa de armonizar los formatos, contenidos
y criterios de las cuatro farmacopeas activas en el continente americano.
7

Su enfoque es claramente industrial y el principal objetivo es el de facilitar las relaciones
comerciales de importacin y exportacin de materias primas y formas farmacuticas. Las tcnicas
analticas utilizadas para la evaluacin de estos productos es prioritaria en la agenda, sin embargo
existen dificultades derivadas de las diferencias en el grado de desarrollo tecnolgico en la regin.
En el caso de Mxico se busca cumplir con lo estipulado en la USP, que son ms estrictos, antes
que los de la Farmacopea Mexicana, esto con el fin de exportar productos a Cnada y Estados
Unidos. Los costos derivados del equipo e instrumental para realizar las pruebas de calidad, son en
la mayora de los casos prohibitivos para los pequeos y medianos laboratorios nacionales, que
son los principales usuarios del cdigo nacional, ms apegado a la realidad tecnolgica del pas.
1.3. TCNICAS INSTRUMENTALES
La aplicacin de las tcnicas instrumentales se inicio en el siglo XIX con Kuster y Gruters, los cuales
sentaron las bases de las valoraciones conductimtricas, posteriormente se desarrollaron las
valoraciones potenciomtricas con aplicadas a las reacciones de oxido reduccin y de
precipitacin. En 1922 Heyrovsky descubri la polarografa constituyendo un avance en el anlisis.
En la dcada d los treinta se el descubrimiento de los electrodos de vidrio sensibles a los iones de
H
+
(hidrgeno), constituyo un avance importante ya que haca posible la determinacin de pH de
forma rpida y continua, el suceso dio paso al desarrollo de tcnicas volumtricas cido-base.
Durante el primer tercio del siglo haba la necesidad de analizar componentes trazas, a
concentraciones inferiores a 0. 01% en un numero grande de muestras y en tiempos relativamente
cortos, esto provoc un gran desarrollo de las tcnicas instrumentales. En pases como Estados
Unidos el desarrollo de los mtodos instrumentales se utilizaba ya de forma rutinaria al comenzar
la dcada de los cuarenta utilizaban espectrofotmetros de luz ultravioleta e infrarroja, los
espectros de emisin, los fluormetros, los polargrafos, entre otros.
En la primera mitad de la dcada de los cuarenta, el proyecto Manhatan, que estaba relacionado
con la construccin de la bomba atmica, impuls de manera considerable los mtodos
instrumentales como el de intercambio inico, microanlisis y anlisis de trazas entre otros. En el
campo de qumica inorgnica las tcnicas cromatogrficas especialmente la cromatografa de
8

gases y de capa fina experimentaron un desarrollo continuo a partir de mediados de los aos
cincuenta, aunado a los avances en espectroscopia infrarroja, posteriormente a la espectrometra
de masas y resonancia magntica nuclear.
Con el desarrollo de la absorcin atmica se consigui mejorar los resultados que se obtenan por
la tcnica de fotometra de llama, esta nueva tcnica se hizo casi insustituible para el anlisi de
metales a nivel de trazas, finalmente durante los aos ochenta con la entrada de las tecnologas de
informacin, modifico profundamente las tcnicas analticas instrumentales, tanto en utilizacin
de computadoras controladoras de los instrumentos como en el manejo de mucha informacin
obtenida de las medidas experimentales, esto les permiti a los analistas evaluar los resultados
estadsticos y comparar los resultados analticos con los datos almacenados, as como comparar
las seales obtenidas en los equipos.
El anlisis instrumental es una ciencia que durante los ltimos aos ha tomado gran inters en
cuanto al anlisis e investigacin farmacutica, hoy en da forma parte de los controles que
realizan los laboratorios farmacuticos (Oriol y Del Castillo 1998). Las tcnicas instrumentales han
llegado a ser una prctica habitual del analista farmacutico con el uso de instrumentos tales
como el espectrofotmetro ultravioleta-visible, el potencimetro para determinacin del pH o el
cromatgrafo de lquidos de alta resolucin.
El concepto de tcnicas instrumentales abarca una idea mucho ms amplia que la analtica ya que
estas tcnicas suelen usarse en el proceso de elaboracin de medicamentos para efectuar ajustes
en el pH, viscosidad, densidad trasparencia y color, entre otros a fin de que los medicamentos
cumplan con las especificaciones establecidas, debido a esto las tcnicas instrumentales son
necesarias para el desarrollo de nuevos frmacos.
Los mtodos qumicos para la identificacin y cuantificacin de las formas farmacuticas en el
siglo XIX eran muy reducidos. El instrumental con el que se contaba y los fundamentos detrs de
su diseo no eran lo suficiente robustos para hacer determinaciones precisas y repetibles, no se
conocan lo suficiente los fundamentos cualitativos y cuantitativos de las tcnicas de anlisis.
Conforme avanza el siglo XIX aumentan los conocimientos en la materia y empiezan a
desarrollarse en gran medida las tcnicas de anlisis de las formas farmacuticas as junto con
9

como las novedosas tcnicas de aseguramiento de la calidad e identidad de los compuestos
contenidos en los medicamentos, como era de esperarse se empezaron a unificar criterios en
cuanto a las metodologas quedando asentados en cdigos oficiales. Las farmacopeas se
convirtieron en requisitos indispensables para asegurar la calidad e identidad de los
medicamentos as tambin como para su comercio y distribucin
Instrumentos analticos
Los instrumentos analticos ayuda a la qumica analtica a caracterizar la materia, para esto se
utilizan ciertas propiedades analticas de la materia que nos pueden ayudar a establecer de una
manera ms clara su composicin ya sea cualitativa o cuantitativa. Estas propiedades la podemos
observar directamente de la materia, y en el caso ms general pueden ser provocadas mediante
un proceso fsico o mediante una reaccin qumica. As puede considerarse a un instrumento
analtico como un dispositivo que convierte una seal, que no puede ser detectable directamente
por el ser humano, en una forma que si lo es (Hernndez y Claudio 2002). En la figura 1.1 se
muestra los componentes de los que consta un instrumento analtico: generador de seales,
detector, procesador de seales y dispositivo de lectura.

El generador de seales produce una seal generalmente relacionada con la concentracin del
analito, se utilizad dos mtodos generales en la generacin de seales, la aplicacin de una seal
externa en la muestra, , un ejemplo de este tipo de seal se puede observar en la espectroscopia
de absorcin, la otra forma es la creacin de un ambiente sobre la muestra que permite al analito
producir una seal, este tipo de seal la observamos en las mediciones potenciomtricas, hay que
tomar en cuenta las caractersticas fsicas del instrumento tanto como las propiedades
fisicoqumicas de la muestra.
El detector es un dispositivo que convierte un tipo de seal en otro, en la medicin de pH, el
detector es el electrodo de vidrio que trasforma la actividad de iones H
+
en un potencial elctrico,
mientras que en espectrofotometra ultravioleta o visible, el detector es un tubo fotomultiplicador
que trasforma la seal radiante en una corriente elctrica. La seal que proviene del detector se
modifica en un procesador de seales, adaptndose al dispositivo de lectura, en muchas de las
ocasiones se produce nicamente una amplificacin, finalmente el dispositivo de salida trasforma
10

la seal procesada en otra seal intangible para el observador. Este puede ser un desplazamiento
de la aguja en alguna escala, una serie de nmeros o un trozo de papel.

Figura 1.2. Componentes bsicos de un instrumento analtico
Fuente: (Hernndez y Claudio 2002)
1.4. VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LAS TCNICAS INSTRUMENTALES
Los mtodos instrumentales renen una serie de caractersticas que los distinguen de otros
mtodos empleados en la qumica clsica, dentro de las ventajas de los mtodos instrumentales se
encuentran las siguientes:
Los mtodos qumicos, estn normalmente sujetos a precisiones subjetivas del observador, como
por ejemplo al momento del vire de un indicador, en cambio las tcnicas instrumentales son
mtodos ms objetivos en este sentido ya que nos proporcionan informacin exacta de la
composicin de las muestras.
Generacin de
seales
Detector
Procesador de
seales
Dispositivo de
lectura
0,769
11

Son normalmente mtodos ms precisos, presentando menor oscilacin entre medidas sucesivas y
una mayor reproducibilidad en los resultados que los mtodos qumicos.
Suelen ser ms sensibles, algunas de estas tcnicas como por ejemplo la absorcin atmica
alcanza una sensibilidad asombrosa en el campo de investigacin de trazas de metales a
concentraciones del orden de 0.1 ppm, lo que difcilmente podra asegurarse con un mtodo
qumico.
Una caracterstica muy interesante de los mtodos instrumentales es que permiten efectuar
determinaciones de mucho menor duracin que otros mtodos empleados en de manera clsica.
Un operador bien entrenado puede realizar anlisis con gran rapidez. Esto explica la gran difusin
que han adquirido los mtodos instrumentales en la industria farmacutica.
En mucho de los casos no se altera la muestra, esto es interesante en el caso de productos
biolgicos ya que se cuenta pequeas cantidades de muestra para realizar un serie de ensayos y
proceder a la recuperacin de la misma si se considera conveniente.
Los mtodos instrumentales en general son mtodos ms selectivos y no requieren de una
separacin previa, los mtodos qumicos normalmente responden a radicales qumicos que
pueden estar presentes en muchas sustancias similares como por ejemplo los grupos cido,
aminas, sulfricos entre otros, o bien en grupos de tomos de valencia y otras caractersticas
similares. Los mtodos instrumentales responden a la totalidad de la molcula o bien dan
resultados propios y diferenciados para cada tomo o in. Como por ejemplo podemos citar la
cromatografa lquida de alta resolucin en donde obtenemos resultados cualitativos y
cuantitativos de la muestra o bien la espectrofotometra infrarroja que es tan caracterstica de
cada molcula que se a dado en llamar la huella dactilar de las molculas.
Finalmente los mtodos instrumentales permiten una fcil adaptacin a aparatos de registro
grafico y a instrumentos de clculo que facilitan las operaciones que podran resultar engorrosas
posteriores a cualquier determinacin analtica y restaran tiempo al tiempo de anlisis total, esto
resulta particularmente interesante debido a que en los centros se realizan una gran cantidad de
12

mediciones y se desea evaluar las medidas sucesivas por procedimientos estadsticos o cuando
interesa guardar y comparar los resultados con diferentes mtodos.
Asimismo las tcnicas instrumentales presentan una serie de desventajas entre los que podemos
mencionar:
Representan elevados costos, la mayor parte de estos mtodos requieren de instrumentos con un
elevado valor que no suelen estar al alcance de los pequeos laboratorios, sin embargo en la
actualidad, debido a la gran difusin que han adquirido las tcnicas analticas, los fabricantes de
instrumentos ofrecen sus instrumentos a precios cada vez ms asequibles, si bien no suelen ser
adecuados para la investigacin, tienen un gran inters en la utilizacin en el control de calidad.
Otro de los inconvenientes que puede representar el uso de tcnicas instrumentales es el de
requerir tcnicos expertos en el manejo de los instrumentos. Sin embargo en el manejo de
instrumentos salvo que sea muy complejo, el perodo de aprendizaje no es superior al requerido
para adquirir prctica con cualquier mtodo qumico de anlisis.
La mayora de los instrumentos requieren de una calibracin previa con un patrn de calidad que
debe de haberse controlado previamente por un procedimiento qumico o con otro aparado
controlado correctamente, aunado a la calibracin peridica de los instrumentos estos deben de
tener una calificacin de instalacin y operacin al momento de su adquisicin y posteriormente
una validacin (en ciertos casos), esto representa costos a las compaas.
1.5. INTERS FARMACUTICO EN LAS TCNICAS INSTRUMENTALES
Las tcnicas instrumentales desempean un papel muy importante en el rea farmacutica
utilizndose en cada una de las etapas de la existencia de un frmaco, es decir, en la investigacin
y desarrollo de un nuevo compuesto, en la formulacin galnica del mismo, en las etapas de
produccin y control (Oriol y Del Castillo 1998). Los mtodos nos proporcionan una informacin
precisa y completa de las propiedades fsico-qumicas de los medicamentos. La obtencin de la
informacin necesaria se puede obtener de distintas formas:
13

Identificacin y determinacin de la estructura qumica. La informacin estructural de un
medicamento hace tiempo estaba condicionada a la degradacin de la sustancia y a los estudios
de los productos de la degradacin, actualmente la informacin se obtiene principalmente de la
molcula intacta con mtodos instrumentales fsico-qumicos, con lo que se obtuvo un gran ahorro
en tiempo y una mayor objetividad de los resultados obtenidos. En la tabla 1.1 se resumen los
principales mtodos instrumentales utilizados para la determinacin de la estructura qumica de
los medicamentos.
Mtodo instrumental Principal informacin que suministra
Potenciometra Identificacin de los grupos ionizable
Voltametras Identificacin de cationes, bases orgnicas y otras funciones
oxidables o reducibles electrolticamente
Electroforesis Identificacin de compuestos ionizables por comparacin
patrones
Espectroscopia de emisin Identificacin de trazas de metales y cationes metlicos
Espectroscopia de ultravioleta-
visible
Identificacin de grupos cromforos
Espectroscopia infrarroja Identificacin de grupos funcionales por comparacin de
patrones
Espectroscopia de RMN Identificacin de carbono e hidrgeno y su entorno
Espectroscopia de rayos X Identificacin de los elementos, caracterizacin de los
tomos de algunos elementos en diversos entornos
Dispersin rotatorio ptica Determinacin de la estereoqumica de los compuestos con
centros asimtricos
Tabla 1.1 Tcnicas instrumentales utilizadas en la identificacin y determinacin de estructura
qumica
Fuente: Basado en (Oriol y Del Castillo 1998)
Determinacin de la homogeneidad y pureza de los medicamentos La tcnica ideal para esta
finalidad es la que explicaremos con mayor amplitud en el captulo 2, es la cromatografa, tambin
la electroforesis y la espectrometra de masas, proporcin abundante informacin al respecto, se
14

suelen utilizar las tcnicas combinadas. Las tcnicas analticas empleadas para esta finalidad son:
cromatografa de HPLC, cromatografa de intercambio inico, cromatografa en gel, cromatografa
plana, cromatografa de gases, electroforesis de zona, electroforesis capilar, espectroscopia de
masas, entre otros.
Valoracin cuantitativa, esta aplicacin es quizs la ms importante en la industria farmacutica,
numerosos mtodos se utilizan frecuentemente para esta finalidad, algunas de tcnicas utilizadas
deben de combinarse con otras tcnicas por ejemplo cuando se emplea cromatografa en capa
fina o electroforesis se puede combinar con tcnicas de espectrofotometra UV-Visible para logra
una evaluacin cuantitativa de suficiente precisin.
Algunas de las tcnicas como la cromatografa en HPLC y la fluormetra proporcionan una gran
sensibilidad que las hace particularmente adecuadas para la cuantificacin de trazas en los
medicamentos ya sea en lquidos biolgicos o en rganos de animales, por lo que resultan
auxiliares eficaces en estudios farmacocinticas y de biodisponibilidad. Entre las tcnicas ms
usadas se encuentran: la espectroscopia de absorcin atmica, espectroscopia de emisin de
plasma, espectroscopia UV-Visible, fluorimetra, conductimetra, potenciometra, cromatografa de
HPLC , tcnicas radioqumicas.
Determinacin de constantes fsicas y fsico-qumicas de los medicamentos, estas constantes
caractersticas y propias de los productos farmacuticos tales como el punto de fusin, peso
especifico, viscosidad, dureza, ndice de refraccin, rotacin ptica, pH, humedad, etc. Estas
tcnicas son relativamente sencillas pero de uso frecuente en el proceso de fabricacin y control
de medicamentos.
1.6. CLASIFICACIN DE LAS TCNICAS INSTRUMENTALES
Los mtodos analticos utilizados en la qumica analtica se clasifican en mtodos qumicos e
instrumentales, los mtodos qumicos se basan en las reacciones qumicas y los mtodos
instrumentales surgen de la revolucin tecnolgica e industrial en la cual surgen una gran cantidad
de tcnicas instrumentales basadas en las interacciones materia-energa para los cuales no es
15

esencial una reaccin qumica. Los mtodos instrumentales se clasifican en: espectroscopa,
electroqumica y cromatografa.
Los mtodos instrumentales constituyen una herramienta importante para la evaluacin de los
productos farmacuticos en los diferentes controles que existen durante el proceso de fabricacin
de un medicamento, permite conocer con precisin la composicin de las materias primas,
principios activos, excipientes entre otros.

Figura 1.3 Clasificacin de los mtodos instrumentales
Fuente: Elaboracin propia

Cromatografa de gases
Tcnicas de cromatografa lquida de alta resolucin
Tcnicas
espectroscpicas
Espectrofotometra de visible y ultravioleta
Espectrofotometra de fluorescencia y fosforescencia
Espectrometra atmica (emisin y absorcin)
Espectrofotometra de infrarrojo
Espectroscopa de rayos X
Tcnicas
electroqumicas
Potenciometra (electrodos de pH y selectivos de iones)
Voltamperometra
Tcnicas voltamperomtricas
Tcnicas de redisolucin
Tcnicas amperomtricas
Coulombimetra
Electrogravimetra
Tcnicas de conductancia
Tcnicas
cromatogrficas
Tcnicas
diversas
Anlisis trmico
Espectrometra de masas
Tcnicas cinticas
Tcnicas conjuntadas
o acopladas
(GCMS) (cromatografa de gases espectrometra de masas)
(ICP NIS) (plasma con acomplamiento inductivo
espectrometra de masas)
(GCIR) (cromatografa de gases espectrometra de
infrarrojo)
(MS MS) (espectrometra de masas espectrometra de
masas)
16

CAPTULO 2
SEPARACIONES CROMATOGRFICAS
2.1. DESCRIPCIN GENERAL DE LA CROMATOGRAFA
La cromatografa es un mtodo en el cual los componentes de una mezcla son separados en una
columna adsorbente en una fase mvil (Weston y Brown 1997). La tcnica fue desarrollada por el
botnico ruso M.S Tswett en sus experimentos para la separacin de pigmentos en plantas. La
primera descripcin del mtodo se realizo en una publicacin suya de 1903, posteriormente en
1906 publico una descripcin ms detallada. El nombre de cromatografa que Tswett utiliz para
describir esta tcnica se deriva del griego escribir en color debido a que observ anillos (bandas)
en sus columnas de carbonato de calcio, aunque puntualizo que no solo se podan separar
sustancias coloreadas(Cela, Lorenzo et al. 2002).
Durante los siguientes 20 aos, de acuerdo con (Cela, Lorenzo et al. 2002) la cromatografa no fue
apenas del objeto de inters y solo existen algunos artculos hacia 1915, los trabajos de Lederer y
Kunh en la separacin de carotenoides coinciden con el inicio de esta nueva poca. En 1936 se
publica el primer libro dedicado a la cromatografa, dos aos ms tarde aparece la primera
descripcin de cromatografa en capa fina sobre un vidrio. En 1939 Brown utiliz la cromatografa
circular en papel, en 1941 Martin y Synge introducen la cromatografa por particin en columna.
En 1944 Consden, Gordon, y Martin publican los primeros artculos de cromatografa en papel. En
1947 Boyd, Tompkins, Spedding, Rieman, y otros trabajan con cromatografas de intercambio
inico problemas analticos.
Durante esos 20 aos se conocieron prcticamente todas las variantes de la cromatografa, tal y
como las conocemos hoy en da. En 1952 James y Martin desarrollaron de la cromatografa de
gases. En 1959 aparece el primer artculo relativo a cromatografa en gel. A partir de la dcada de
los sesenta nace el HPLC que ha jugado un papel fundamental en los laboratorios analticos como
de qumica orgnica y bioqumica. HPLC son las iniciales de High Performance Liquid
Chromatography que ha sido traducido en formas diversas al castellano: Cromatografa Lquida de
17

alta resolucin (CLAR), Cromatografa Lquida de Alta Eficacia (CLAE), Cromatografa lquida de alta
presin, etc. En este trabajo utilizaremos el acrnimo en ingls HPLC para designar la tcnica.
La cromatografa es un mtodo muy utilizado que permite la separacin, identificacin y
determinacin de los componentes qumicos en mezclas complejas. Ningn otro mtodo es tan
potente y de aplicacin tan general como la cromatografa (Skoog, West et al. 2005). Es difcil
describir rigurosamente al trmino cromatografa, ya que se ha aplicado ese nombre a varios
sistemas y tcnicas. Sin embargo todos los mtodos tienen en comn el uso de la fase estacionaria
y una fase mvil. Los componentes de una mezcla son transportados a travs de una fase
estacionaria por el flujo de una fase mvil, y las separaciones se basan en las diferencias de
velocidad de migracin entre los distintos componentes de las mezcla.
La caracterstica que distingue a la cromatografa de la mayora de los mtodos fsicos y qumicos
de separacin, es que se ponen en contacto dos fases mutuamente inmiscibles. Una fase es
estacionaria y la otra mvil. Una muestra que se introduce en la fase mvil es transportada a lo
largo de la columna que contiene una fase estacionaria distribuida(Ferreira Gonzlez y Universidad
de Zaragoza. Servicio de Publicaciones 2007). Las especies de la muestra experimentan
interacciones repetidas (repartos) entre la fase mvil y la fase estacionaria. Cuando ambas fases se
han escogido en forma apropiada los componentes de la muestra se separan gradualmente en
bandas en la fase mvil. Al final del proceso los componentes separados emergen en orden
creciente de interaccin con la fase estacionaria. El componente menos retardado emerge
primero, el retenido ms fuertemente eluye al ltimo. El reparto entre las fases aprovecha las
diferencias entre las propiedades fsicas y/o qumicas de los componentes de la muestra.
Para explicar mejor el fenmeno cromatogrfico nos basaremos en dos fundamentos; el primero
se refiere a las propiedades fsico-qumicas de los analitos: solubilidad (tendencia a disolverse),
adsorcin (tendencia a ser retenidos en slidos finamente divididos), volatilidad (tendencia a pasar
a un estado gaseoso), tamao, carga, reactividad qumica o bioqumica, etc.La mezcla a separar se
coloca en una situacin experimental donde observamos la solubilidad de los componentes en dos
lquidos diferentes, como ocurre en cromatografa de lquidos, se debe de cumplir con las
siguientes condiciones: Los componentes del sistema empleado deben de estar en ntimo contacto
entre s, y el equilibrio establecido entre estos componentes debe ser lo ms completo posible.
18

El segundo fundamento se basa en el hecho de que es muy improbable que dos especies
presenten cuantitativamente el mismo par de propiedades fsico-qumicas frente a un sistema
cromatogrfico dado, debido a estas diferencias, que pueden ser muy pequeas, se basa la
separacin cromatogrfica. Si transformamos la idea de un equilibrio esttico establecido entre las
fases, en un equilibrio dinmico, se tiene la realidad del fenmeno cromatogrfico. La fase mvil
fluye a travs de la fase estacionaria.
Las propiedades de los componentes de una mezcla determinan su movilidad entre s respecto a
la fase mvil. Se eligen las condiciones experimentales y las fases cromatogrficas para que los
componentes de las mezcla se muevan a distinta velocidad. La base de la separacin
cromatogrfica ser la diferencia de velocidad de migracin de los mismos. La cromatografa se
puede aplicar a cualquier mezcla soluble o voltil, de hecho, algunos autores suelen dividir las
tcnicas de separacin en cromatogrficas y no cromatogrficas. La eleccin de una tcnica
especfica depender de la naturaleza y cantidad de muestra, del objetivo de la separacin, la
limitacin del tiempo y equipo disponible.
Una primera distincin en cuanto a las tcnicas cromatogrficas se refiere a la integracin
continua o no de un sistema de deteccin, cualquier cromatgrafo ya sea de lquidos o gases
lleva incorporado dicho sistema, en cambio en cromatografa plana no conlleva a un sistema de
deteccin.
2.2. CLASIFICACIN DE LOS MTODOS CROMATOGRFICOS
Para clasificar los mtodos cromatogrficos se deben de atender dos criterios bsicos: el
fundamento del proceso cromatogrfico y lo que nos conduce a los tipos de cromatografas, y la
forma en que se realiza el proceso cromatogrfico, es decir, lo que constituye las distintas tcnicas
cromatogrficas (Valcrcel y Gmez 2003).
2.2.1. TIPOS DE CROMATOGRAFA
Segn el fundamento de separacin los distintos tipos de cromatografa pueden clasificarse de
acuerdo a la naturaleza de la fase estacionaria y la fase mvil.
19

1. Segn la naturaleza de la fase estacionaria
1.a. Si es un slido, cabe distinguir entre:
Cromatografa de adsorcin: La fase estacionaria slida absorbe al componente que inicialmente
se encontraba en la fase mvil (lquida o gaseosa).
Cromatografa de intercambio inico: En este tipo de cromatografa existen aniones como SO
3
-
o
cationes como el N(CH
3
)
3
+
, covalentemente unidos a la fase estacionaria slida. Los iones en
disolucin de carga opuesta son atrados por fuerzas electroestticas.
Cromatografa de exclusin(o de geles): La fase estacionaria es un gel formado por polmeros no
inicos que separa molculas por su tamao, las molculas de mayor tamao pasan ms
rpidamente que las de menor tamao.
Cromatografa de afinidad: Es un tipo especial de cromatografa, emplea interacciones especficas
entre una clase de molculas de soluto y una segunda molcula que esta covalentemente unida en
la fase estacionaria.
1.b. Si es un lquido que se encuentra soportado por un slido inerte se trata de
cromatografa de particin
En la cromatografa de particin o de reparto utiliza una fase estacionaria (lquido o gas) sobre un
superficie de soporte slido, el soluto est en equilibrio entre el lquido estacionario y la fase
mvil.
En la figura 2.1 se muestran los diferentes tipos de separacin cromatogrfica antes descritos.
(a)Cromatografa de adsorcin, (b) Cromatografa de intercambio inico, (c) Cromatografa de
exclusin molecular, (d) Cromatografa de afinidad, y (e) Cromatografa de particin o reparto.
20

Figura 2.1 Tipos de separacin cromatogrfica.
Fuente: (Harris 2007)

El soluto se adsorbe
en la superficie de la
fase estacionaria.
(a) Cromatografa de adsorcin
Los aniones mviles
quedan retenidos
junto con los cationes
que estn unidos
covalentemente en la
fase estacionaria.
Las molculas
pequeas penetran
en los poros de las
partculas.
Resina de intercambio
inico. Solo puede
fijar aniones.
(b) Cromatografa de intercambio inico
Se excluyen las
molculas grandes
(c) Cromatografa de exclusin molecular
Una clase de molcula
en una mezcla
compleja se une a una
molcula que esta
unida
covalentemente a la
fase estacionaria
Todas las dems
molculas
simplemente se
eliminan
(d) Cromatografa de afinidad
Seccin trasversal de
una columna tubular
abierta.
El soluto se disuelve
en la fase lquida con
que esta recubierta la
superficie del soporte
slido.
(e) Cromatografa de particin o reparto
21

2. Basado en el mtodo de operacin o el mecanismo por el cual una muestra es removida a
travs de una columna dependiendo de la naturaleza de la fase mvil lquido
2.a. Si es un lquido, cromatografa lquida, cabe distinguir:
Cromatografa lquido-lquido (CLL), ambas fases son lquidas por tanto se trata de una
cromatografa de particin.
Cromatografa lquido-slido (CLS), en la fase estacionaria es slida (cromatografa de adsorcin,
intercambio inico, exclusin, afinidad).
2.b. Si es un gas, cromatografa de gases:
Cromatografa gas-lquido (CGL), es un tipo de cromatografa de particin.
Cromatografa gas-lquido (CGS), es una cromatografa de adsorcin.
2.c. Si es un fluido supercrtico (fluido calentado a una temperatura superior a una
temperatura crtica, simultneamente comprimido a una presin mayor a su presin
crtica), se trata de cromatografa de fluidos supercrticos (CFS), que puede ser de
particin o adsorcin.
En la figura 2.2. Se resume la clasificacin de los tipos de cromatografa segn la naturaleza de la
fase mvil.
2.2.2. TCNICAS CROMATOGRFICAS
Segn la forma de llevar a cabo la separacin cromatogrfica, segn el dispositivo o forma de
obtener el contacto entre la fase mvil y la fase estacionaria, cabe distinguir dos grandes tipos de
tcnicas cromatogrficas: en columna y plana.
Cromatografa en columna: En este tipo de cromatografa se utiliza un tubo cilndrico, en el
interior se coloca la fase estacionaria y a travs de ella se hace pasar la fase mvil. El flujo de la
fase mvil (lquido o gas) a travs de la fase estacionaria se puede conseguir por presin,
capilaridad o por gravedad.

22

Clasificacin general Mtodo
especfico
Fase estacionaria Tipo de equilibrio
Cromatografa de gases Gas-Lquido (GLC) Lquido absorbido o unido a una Reparto entre gas y lquido
Cromatografa lquida
Gas-Slido Slido Adsorcin
Lquido-lquido o Lquido absorbido o unido a una
Lquido-slido o Slido Adsorcin
intercambio Resina de intercambio inico Intercambio inico
Exclusin por Lquido en los intersticios de un Reparto/tamizado
Afinidad Lquido con un grupo especifico Reparto entre lquido
Cromatografa de fluidos
supercrticos (SFC)

Especie orgnica unida a una
superficie slida
Reparto entre fluido
supercrtico y superficie unida

Tabla 2.1 Clasificacin de los mtodos cromatogrficos
Fuente: (Skoog, Turiel Trujillo et al. 2005)
Cromatografa plana: La fase estacionaria se coloca en una superficie plana y se distinguen dos
tipos de cromatografa plana:
- Cromatografa en papel, en la que el papel acta como soporte de la fase estacionaria
(cromatografa de particin).
- Cromatografa en capa fina, un slido acta como fase estacionaria, o como soporte de la
fase estacionaria se extiende en una capa delgada sobre una placa, generalmente de
vidrio, en la cromatografa plana esta excluido el uso de una de un gas como fase mvil,
por lo que sta siempre es lquida.
23

2.3. CROMATOGRAFA LQUIDA EN COLUMNA
La cromatografa lquida en columna es una variedad de la cromatografa en la que la fase mvil es
lquida y pasa a travs de la fase estacionaria, slida o lquida, que esta retenida en un recinto
cilndrico, la modalidad clsica de la cromatografa lquida en columna consiste en hacer pasar
mediante gravedad la fase lquida sobre un soporte slido (de dimetro de partcula grande),
retenido en una columna recta, generalmente de vidrio de dimensiones considerables , varios
centmetros de dimetro y una altura de 5 a 10 veces el dimetro y recogida del eluido en
fracciones. El experimento de Twestt fue de este tipo en 1903 aunque la cromatografa lquida en
columna fue propiamente descrita por Kunh y Lederer en 1930.
La configuracin clsica o a baja presin presenta varios inconvenientes desde el punto de vista
clsico, es lenta y poco eficaz tanto en la capacidad de discriminar entre solutos as como el
nmero de solutos que pueden separarse, es tediosa por la necesidad de la intervencin de un
operador a menos que se tenga un colector automtico de las fracciones y no proporciona
directamente un cromatograma, debido a estas razones las aplicaciones de la cromatografa
lquida en columna fueron restringidas, en contraste con el desarrollo de la cromatografa de
gases, que hacia los aos setenta ya existan cromatgrafos de gases comercializados.
El la figura 2.2 muestra como se resuelven mediante elucin dos componentes de una muestra, A
y B, en una columna empaquetada. La columna consiste de un tubo de dimetro estrecho
empaquetada con un slido inerte finamente dividido que contiene la fase estacionaria sobre su
superficie. La fase mvil ocupa los espacios abiertos entre las partculas de empaquetamiento.
Inicialmente a t
0
, una disolucin de muestra que contiene la mezcla A y B en la fase mvil se
introduce en la cabeza de una columna como una porcin estrecha, aqu los dos componentes se
distribuyen entre la fase mvil y la fase estacionaria. Entonces se produce la elucin, forzando a
los componentes de la muestra a pasar a travs de la columna mediante la adicin continua de
nueva fase mvil.
Con la primera introduccin de nueva fase mvil, el eluyente (la porcin de la muestra contenida
en la fase mvil) desciende a lo largo de la columna, donde tiene lugar nuevos repartos entre la
24

fase mvil y la fase estacionaria (tiempo t
1
). El reparto entre la nueva fase mvil y la fase
estacionaria tiene lugar simultneamente en el sitio original de la muestra.
La adicin de ms disolvente hace que las molculas de soluto desciendan por la columna en una
serie continua de transferencias entre las dos fases. Dado que el movimiento del soluto solo puede
ocurrir en la fase mvil, la velocidad media a la que el soluto se mueve depende de la fraccin de
tiempo que pase en la fase mvil. Esta fraccin es pequea para los solutos que son fuertemente
retenidos por la fase estacionaria (componente B en las figura 2.1 y grande cuando la retencin en
la fase mvil es ms probable (componente A). En el caso ideal las diferencias resultantes en la
velocidad hacen que los componentes de una mezcla se separen en bandas o zonas a lo largo de la
columna, en la figura 2.2. se muestra la separacin de una mezcla A y B por cromatografa de
elucin en columna (a) y la seal del detector a las distintas etapas de elucin (b).

Figura 2.2 Separacin cromatogrfica.
Fuente: Elaboracin propia, basado en (Skoog, Turiel Trujillo et al. 2005)
Detector
Fase mvil
A
B
A+B
A
B
B
A B
Columna
empaquetada
Muestra
(a)
t
0
t
1
t
2
t
3
t
4
S
e
a
l

d
e
l

d
e
t
e
c
t
o
r
tiempo
(b)
25

El aislamiento de las especie separada se consigue entonces haciendo pasar a travs de la columna
una cantidad suficiente de fase mvil para que las bandas individuales lleguen al extremo final
sean eludidas de la columna), donde pueden ser recogidas o detectadas tiempos t
3
y t
4
como se
puede observar en la Figura 2.3.

Figura 2.3 Perfiles de concentracin del soluto A y B a dos tiempos diferentes.
Fuente: (Skoog, Turiel Trujillo et al. 2005)
Constante de distribucin
Todas las separaciones cromatogrficas se basan en las diferencias en el grado en que los solutos
se distribuyen entre la fase mvil y la fase estacionaria. Para la especie de soluto el equilibrio
implicado se describe con la ecuacin
(2.1)

La contante de equilibrio
de esta reaccin se conoce como la constante de distribucin, la cual

se define como:
(2.2)

Donde a
A
es la actividad del soluto A en la fase estacionaria y
es la actividad en la fase
mvil. A menudo se sustituye c
s
, la concentracin analtica molar del soluto en la fase estacionaria,
t
1
t
2
C
o
n
c
e
n
t
r
a
c
i
n
Distancia de migracin
26

por
y c
M
por su concentracin analtica molar en la fase mvil,
. Por lo tanto, la
ecuacin 2 suele escribirse como:
(2.3)

La constante de distribucin, en el caso ideal es constante en un amplio intervalo de las
concentraciones del soluto; es decir,
directamente proporcional a
. En la figura 2.5 el pico

pequeo de la izquierda representa un soluto que no est retenido en la columna y, por lo tanto
llega al detector inmediatamente despus de iniciada la elucin. As su tiempo de retencin t
M
. Es
aproximadamente igual al tiempo que requiere una molcula de la fase mvil para pasar a travs
de la columna.
2.3.1. CROMATOGRAMA
Un cromatograma representa la respuesta o seal del sistema de deteccin que se traduce
visualmente en una pantalla o en un papel, la evolucin de un parmetro que depende de la
concentracin instantnea del soluto a la salida de la columna, en funcin del tiempo, volumen de
eluyente o distancia en el lecho cromatogrfico. El cromatograma contiene la informacin
analtica relativa a la muestra (nmero de picos, deteccin cualitativa o cuantitativa de uno o
varios componentes) o del funcionamiento del sistema cromatogrfico. Los aspectos
termodinmicos y cinticos de la separacin cromatogrfica quedan reflejados en el
cromatograma, es decir, en la situacin y forma del pico correspondiente a cada soluto analito.

27

Figura 2.4. Cromatograma
Fuente: (Valcrcel y Gmez 2003)
2.3.2. RELACIONES DE TIEMPO
La situacin de un pico esta especificada por la retencin que se define como el retraso que sufre
un analito en la columna cromatogrfica en relacin con una sustancia inerte(trazador), no
retenida, que est sometida a las mismas condiciones de la muestra introducida en el sistema. Se
denomina tiempo muerto (t
0
) al intervalo de tiempo que trascurre desde que el trazador es
insertado al principio del lecho cromatogrfico hasta que sale del mismo, este tiempo se puede
calcular si se conoce la velocidad media de la fase mvil (U) y la longitud de la columna (L),
entonces t
0
=-L/U.
El tiempo de retencin absoluto (t
R
) de un soluto es el tiempo que trascurre desde la introduccin
hasta su salida y es siempre mayor que t
0
. Debido a la dificultad de marcar con precisin el
instante en el que inicia el proceso es frecuente utilizar como origen de las abscisas del
cromatograma, el momento en el que aparece el pico del trazador, que de manera general se
incorpora previamente a la muestra, as se define el tiempo de retencin ajustado tR para un
analito, este es el tiempo que trascurre desde que aparece el pico del trazador y el analito,
entonces tenemos que:
Seal del
detector
continuo
Lnea
de base
Inicio del
proceso
seal del
trazador
inerte
Pico 1
Pico 2
tiempo
Lnea
de base
1 2
28

(2.4)

Uno de los parmetros de importancia es el factor de capacidad o de retencin que nos sirve para
caracterizar a un soluto en sistema cromatogrfico, es adimensional y se define como:
(2.5)
=

El tiempo de retencin absoluto queda:
(2.6)
1 +
2.3.3. RELACIONES DE VOLUMEN
En cromatografa en columna, la retencin de un soluto puede evaluarse en funcin del volumen
en lugar de tiempo ya que tienen mayor significancia prctica, las relaciones de volumen
adquieren un significado fsico qumico. La cromatografa lquida la compresibilidad de la fase
mvil puede despreciarse, por lo que los volmenes de retencin se calculan mediante el producto
de sus correspondientes tiempos (minutos) por el flujo (F, expresado generalmente en mL/min).
(2.7)
=
As puede definirse, el volumen muerto de la columna (V
0
), que es el volumen que ocupa la misma
fase mvil:
(2.8)

29

El volumen de retencin (V
R
) que es el volumen de fase mvil necesario para que se realice la
elucin del soluto:
(2.9)

El volumen de retencin ajustado ser:
(2.10)

El factor de capacidad o retencin es el mismo, por lo que los resultados entre si son:
(2.11)
=

;

1 +
2.3.4. FACTOR DE SELECTIVIDAD
El factor de selectividad en un sistema cromatogrfico es la medida de la diferencia de los tiempos
de retencin (o volmenes) entre dos picos y describe que tan efectiva es la separacin de dos
compuestos. La selectividad es usualmente definida en trminos de como:
(2.12)
=

La selectividad de una columna est en funcin principal del material de empacamiento, aunque
tambin se puede obtener algo de control con el cromatgrafo usando la fase mvil y la
temperatura. El valor de puede estar alrededor de la unidad (1), cuando el tiempo de retencin
de dos componentes es idntico (t
1
=t
2
), si el primer componente de inters es eluido en el
30

volumen muerto. Si es aproximadamente 1, sin tomar en cuenta el numero de platos tericos o
el tiempo en que los picos estn en la columna, pueden no estar separados.
Para incrementar se debe de cambiar la composicin de la fase mvil, no es suficiente cambiar la
concentracin de la fase mvil, si alteramos la naturaleza de uno de los componentes puede ser
suficiente. Por ejemplo en la figura 2.5 muestra el efecto de la separacin de acetonaftaleno y
dinitronaftaleno cambiando la fase mvil de 23% de diclorometano/77% pentano a 5% de
piridina/95% pentano, el valor de cambia de 1.05 cuando se utiliza diclorometano a 2.04 cuando
se usa piridina.

Figura 2.5. Efecto de la selectividad con en cambio de la composicin de fase mvil.
Fuente: Basado en(Weston y Brown 1997)
La capacidad y la selectividad de la columna son variables que pueden ser controladas por el
fabricante de columnas, la eficiencia y la resolucin pueden ser controladas por el equipo de
cromatografa, para obtener una mejor separacin, la eficiencia cromatogrfica puede ser
mejorada si se minimiza el ensanchamiento de banda. La columna puede tener la capacidad de
retener los solutos y una adecuada selectividad para resolver los analitos de inters (Weston y
Brown 1997).
Lnea
de base
Lnea
de base
Lnea
de base
Lnea
de base
Seal del
detector
Seal del
detector
a)
a)
31

2.4. EFICIENCIA DE LA COLUMNA
Las caractersticas termodinmicas del comportamiento de un soluto, son las que determinan la
situacin de la zona , mancha o pico a travs de las relaciones de tiempo, espacio o volumen, otro
de los aspectos fundamentales que observamos en el cromatograma se denomina
ensanchamiento de banda , que se puede definir como el rea, zona o el ancho del pico
cromatogrfico. Este fenmeno ocurre porque al moverse la mezcla a travs de la columna, los
diferentes componentes interactan y son retenidos varios grados por la fase estacionaria, esta
interaccin aunada al camino que deben atravesar los componentes a travs del material de
empaque, causa un incremento en el ancho de banda.
La eficiencia de la columna, es el nmero que describe ensanchamiento de los picos como una
funcin de retencin y es descrita en trminos del nmero de platos tericos. Una columna
cromatogrfica es ms eficaz cuando menos son los ensanchamientos de banda que origina. Dos
teoras fueron desarrolladas para describir la eficiencia de la columna, ambas son usadas en la
cromatografa moderna. La teora de platos propuesta por Martn y Synge provee una simple y
conveniente ruta para medir el desempeo y eficiencia, mientras que la teora desarrollada por
Deemter et. al., provee un significado de las contribuciones del ensanchamiento de banda de
modo que se optimiza la eficiencia.
2.4.1. ALTURA DE PLATO
La expresin emprica derivada en la teora de plato terico es generalmente aplicable a todos los
tipos de columnas cromatogrficas, aunque las relaciones solo son validas nicamente para picos
gaussianos, por conveniencia son tambin aplicados a picos no simtricos. El mejor supuesto en la
teora de plato terico es que existe un equilibrio instantneo establecido por el soluto entre la
fase estacionaria y la fase mvil. La desventaja de la teora de plato terico es que no considera los
efectos del ensanchamiento de banda en la separacin, ni la influencia de variables como el
tamao de partcula de la fase estacionaria, viscosidad del eluente y el caudal en el rendimiento de
la columna.
El modelo propuesto en la teora de platos, la columna cromatogrfica es considerada como un
numero consistente de laminas o platos que permite el equilibrio entre la fase estacionaria y la
32

fase mvil. Mientras ms grande sea el nmero de platos tericos (N), la columna es ms eficiente.
El movimiento del soluto a travs de la columna es considerado como una transferencia gradual
de un plato terico al siguiente. Cuando ms fino es el plato terico mayor es nmero, esto puede
ser previsto a una determinada longitud de la columna.
(2.13)
=

Donde L es la longitud de la columna (en milmetros). As mientras menor sea la altura de un plato
terico (H), mayor es la eficiencia de la columna. En general el valor de H es pequeo para fases
estacionarias de tamao de partcula pequeo, flujos bajos de fase mvil, baja viscosidad de la
fase mvil, altas temperaturas de separacin y molculas pequeas de soluto.
La eficiencia N, est definida en trminos del tiempo de retencin (t
R
) del soluto, medido en la
base del pico, y la desviacin estndar, , de la poblacin del soluto como:
(2.14)
=

Donde la para un pico gaussiano esta dad por:
(2.15)
=

2.345
=

4
=

.
5

Como se muestra en la figura 2.6 W es el ancho del pico a diferentes alturas en la curva, N puede
ser calculado de diferentes maneras dependiendo de donde se mida el ancho. La ms
comnmente usada para el clculo de N es el mtodo de la tangente debido a su relativa
simplicidad, pero el mtodo de 5 provee de una gran sensibilidad de la coleo del pico. En la tabla
2.2 se muestran los diferentes mtodos para calcular N.
33

Mtodo Frmula
Altura media del pico
= 5.54

Tangente = 16

5 = 25

Tabla 2.2 Mtodos utilizados para el clculo de N.
Fuente: (Weston y Brown 1997)
La eficiencia puede variar de acuerdo a los parmetros fsicos de la columna como la longitud, el
dimetro, el material de construccin de la columna, tambin se puede variar cambiando los
parmetros qumicos como el tamao de partcula del material de empacamiento o la velocidad
de la fase mvil.
2.4.2. ENSANCHAMIENTO DE BANDA
Existen tres mecanismos predominantes para el trasporte del soluto a travs de la columna
cromatogrfica (1) trasporte convectivo de la fase mvil a medida que fluye entre las partculas de
la columna, (2) trasporte difusivo a travs de la fase mvil estancada en la columna empaquetada
y (3) trasporte perfusivo a travs de los poros de las partculas. La teora desarrollada por Van
Demmter y posteriormente modificada, considera los factores de difusin que contribuyen al
ensanchamiento de banda en la columna (varianza de la columna,
2
col
) .
Ecuacin general de Van Demmter:
(2.16)
= +

+
34

Donde H representa la eficiencia de la columna y el promedio de la velocidad lineal de la fase
mvil, el termino de A representa la contribucin del ensanchamiento de banda por difusin de
remolinos, el termino B representa la contribucin de la difusin longitudinal y C representa la
contribucin para la resistencia a la transferencia de masa. La difusin no est restringida al
trasporte de soluto a travs de la fase mvil estancadas, sin embargo tambin ocurre que el soluto
es llevado por trasporte convectivo entre las partculas en la columna. Huber encontr que existen
al menos cuatro trminos que deben de ser considerados para definir adecuadamente la eficiencia
de una columna, y la contribucin de estos factores a la eficiencia son descritos en la ecuacin
modificada de Van Deemter:
(2.17)
= +
+

+

En la ecuacin C representa la contribucin del ensanchamiento de zona para la resistencia a la
trasferencia de masa en la fase estacionaria y la fase mvil respectivamente.
Debido a que H representa la varianza de la columna o el ensanchamiento de banda, el valor de H
puede mantenerse en el mnimo. Una forma de determinar las condiciones experimentales que
puedan minimizar la zona de dispersin y maximizar la eficiencia es proporcionado por el uso del
la curva de Van Deemter es una grfica que muestra la altura del plato en funcin de la velocidad
lineal de la fase mvil (Figura 2.6). Los datos son determinados experimentalmente usando
medidas del tiempo de retencin, volumen vacio o volumen muerto, y el ancho de pico para
determinar N, y por lo tanto, H a diferentes caudales. De acuerdo con la curva a flujos por debajo
del ptimo, la eficiencia depende de los efectos de difusin (termino B). A flujos altos la eficiencia
disminuye a causa de la trasferencia de masa, o C, termino cada vez ms importante, en la figura
2.6 el termino de A es una constante independiente del flujo.
35

Figura 2.6 Curva tpica de la Van Deemter
Fuente: (Garca de Marina y Castillo 1988)
A pesar de la reduccin de la eficiencia a caudales altos, es comn operar el sistema a flujos altos
para ahorrar tiempo y costos de operacin, por lo tanto, la curva puede ser usada para determinar
las mejores condiciones para minimizar el tiempo de anlisis consistente con un valor de H
aceptable.
Difusin por remolinos.
La no homogeneidad en las velocidades de flujo y en la longitud de los caminos alrededor de las
partculas del empaque es el primero de los factores. Deben existir caminos de flujo de longitud
desigual a travs de cualquier empacado que no sea perfecto. Algunas molculas de soluto de una
especie nica pueden ser barridas a travs de la columna cerca de la pared, donde la densidad del
empacado es comparativamente baja, en particular en columnas de dimetro pequeo. Otras
molculas del soluto pasan por el centro de la columna, con un empacado ms compacto y a una
correspondiente menor velocidad. Las molculas que siguen un camino ms corto eluyen antes
que aquellas que siguen caminos ms errticos (y largos). Esto provoca para cada soluto un
ensanchamiento de la banda de elucin.
Para minimizar el efecto, las partculas del empaque deben tener un dimetro promedio tan
pequeo y deben ser empacadas tan uniformemente como sea posible. Por supuesto, conforme
Velocidad lineal promedio, u u
opt
A
A
l
t
u
r
a

d
e
l

p
l
a
t
o
,

h
36

las partculas son ms pequeas, la presin necesaria para impulsar la fase mvil a travs de la
columna ser mayor y ms difcil ser empacar la columna de manera uniforme. De todas formas,
debido a la mayor eficiencia que se obtiene con partculas de menor dimetro, la longitud de la
columna puede reducirse en alguna medida. Debe establecerse un compromiso entre el tamao
de las partculas, la longitud de la columna y la presin requerida. En cromatografa gas lquido,
cuando se utilizan pelculas en el interior de las columnas capilares el trmino es despreciable.
Difusin longitudinal
La difusin longitudinal, o axial es el movimiento molecular aleatorio dentro de la fase mvil, es
un segundo proceso que produce ensanchamiento del pico. La contribucin de la difusin
longitudinal a la altura del plato es significativa slo a velocidades bajas de fase mvil. Entonces,
las velocidades altas de difusin del soluto en la fase mvil pueden causar que las molculas se
dispersen axialmente mientras emigran lentamente a travs de la columna. Si esto pasa se
produce ensanchamiento del pico.
Transferencia de masa
La resistencia a la transferencia de masa del soluto en la superficie de la fase estacionaria figura
2.7 (b) es otro factor que contribuye al ensanchamiento del pico. El movimiento molecular lento
dentro de la fase estacionaria significa un mayor tiempo de residencia en esta fase de una
molcula de soluto, mientras que otras molculas avanzan con la fase mvil. Conforme la fase
mvil se mueva ms rpidamente a travs de la columna y ms lenta sea la transferencia de masa,
ms ancha ser la banda del soluto que eluye de la columna. Se deben escoger lquidos no
viscosos para la fase estacionaria de manera que el coeficiente de difusin no sea indebidamente
pequeo. Es benfico reducir el espesor de la fase estacionaria, aunque disminuye la capacidad de
la columna.
Otro trmino que afecta a la anchura de banda es el correspondiente a la resistencia a la
transferencia de masa radialmente entre lneas de corriente de fase mvil adyacentes. (Figura 2.7)
Disminuir el tamao de las partculas de la fase estacionaria siempre es til para reducir la altura
del plato. En cromatografa lquida en columna, en contraste con la cromatografa gas lquido, las
37

mayores diferencias provienen de (1) la disminucin en un factor de 10000 en el valor del
coeficiente de difusin del soluto en la fase mvil cuando la fase mvil est constituida por un
lquido en lugar de un gas y (2) la presencia de zonas de fase mvil estancada, atrapada dentro de
los poros y canales de la fase estacionaria. Las molculas de soluto se mueven por difusin hacia
dentro y hacia afuera de estos poros, figura 2.7. Estas molculas se retrasan en su movimiento
hacia adelante, relativo a la banda principal de un soluto dado, y nuevamente se produce un
aumento en la dispersin molecular.
Tambin la velocidad de la fase mvil difiere entre un punto y otro debido a las perturbaciones
provocadas por las partculas de soporte. Las lneas de corriente del lquido de la fase mvil
cercanas a los lmites de las partculas se mueven lentamente, mientras que las lneas de corriente
cercanas al centro entre partculas se mueven ms rpidamente. Por difusin lateral las molculas
de soluto se transfieren constantemente a una lnea de corriente diferente. Por lo tanto, la
obstruccin del camino de una molcula de soluto se debe tanto a la difusin entre lneas de
corriente, como a la necesidad de viajar alrededor de las partculas de la fase estacionaria.

Figura 2.7 Contribuciones al ensanchamiento de banda.
Fuente: (Katz, Eksteen et al. 1998)
Difusin por remolinos
(a)
Transferencia de masa en
la fase mvil
(c)
la fase estacionaria
(b)
la fase mvil estancada
(c)
Pared de
la
columna
38

El efecto de zonas estancadas se puede minimizar de varias formas. La estructura interna del
empaque se puede hacer impenetrable; un ejemplo son los empaques peliculares con un ncleo
slido y la superficie recubierta. La reduccin del dimetro de las partculas es muy efectiva.
Tambin se puede elegir soportes que tengan poros muy amplios, de forma que el lquido fluya
fcilmente hacia dentro y hacia afuera y aun a travs de los canales de los poros.
2.5. CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN
Para que la cromatografa lquida en columna sea una modalidad competitiva en comparacin a la
cromatografa de gases, se necesita trabajar a elevadas presiones en lugar de utilizar solo la fuerza
de gravedad para hacer pasar la fase mvil a travs de la fase estacionaria. As lo predijo Giddings
en 1965 y se desarrollaron las primeras aplicaciones con Kirkland, Huber y Holvach hacia 1967.
Una presin entre 500 y 5000psi de fase mvil permite reducir el tamao de partcula de la fase
estacionaria, que aunque muy empaquetada, deja que la fase mvil atraviese, de esta manera se
aumenta la eficiencia de separacin, tambin se reduce drsticamente el tiempo de separacin de
5 a 50 veces en comparacin con la modalidad de baja presin. Esta nueva modalidad permiti
tambin la deteccin continua del eluido, es decir un instrumento que separa y suministra la
informacin cualitativa y cuantitativa.
Entre las tcnicas cromatogrficas ms conocidas cuya fase mvil es un lquido, la cromatografa
lquida de alta eficiencia (HPLC)es la ms conocida y la que trataremos en este trabajo, el xito de
esta tcnica cromatogrfica se debe a la posibilidad de actuar de forma muy precisa sobre la
selectividad de los compuestos a travs de la eleccin de la columna y de la composicin del
eluyente, es decir, aprovechar las interacciones disolucin/fase mvil/fase estacionaria, el
intercambio de iones o las de interaccin hidrofbica aumenta aun ms las posibilidades del
HPLC.
La tcnica por HPLC constituye una tcnica analtica de uso muy generalizado, deriva de una
evolucin de la cromatografa preparativa en columna, cuyos resultados, en trminos de
selectividad y resolucin, han mejorado mucho por la miniaturizacin y la utilizacin de fases
estacionarias muy elaboradas. Estas fases constituidas generalmente por partculas esfricas cuyo
dimetro se encuentra de entre 2 y 5m, provocan una prdida de presin importante en la
39

columna. Por lo tanto, es necesario aplicar una fuerte presin a la fase para obtener un caudal
conveniente.
2.5.1. INSTRUMENTACIN EN HPLC
La cromatografa lquida en columna, se desarrolla en instrumentos llamados cromatgrafos, el
cual proporciona informacin sobre la composicin al tener un detector continuo integrado en el
sistema hidrodinmico cromatogrfico. En la figura 2.7 se muestra un diagrama esquemtico de
los componentes de un cromatgrafo de lquidos

Figura 2.7 Diagrama bsico de un sistema de HPLC
Fuente: (Weston y Brown 1997)
El cromatgrafo consiste de un contenedor del disolvente (Fase mvil), (b) una bomba que mueve
el eluyente y la muestra a travs del sistema, (c) un inyector de la muestra, (d) una columna que
provee el soluto de separacin, (e) un detector que nos permite visualizar la separacin de los
componentes y (f) un recipiente de residuos. En la figura 2.8 se puede observar un equipo de HPLC
, es un ejemplo de una instalacin modular, aqu se muestra un equipo modelo HP1200 que
incluye un inyector automtico que, que permite el funcionamiento continuo, un controlador de
temperatura de la columna, los compuestos que son eluidos , despus de su paso por el detector
UV .
En la actualidad existen una gran cantidad de cromatgrafos en el mercado, existen dos grandes
opciones segn la concepcin instrumental, la ms econmica y verstil responde a un diseo
modular como el ejemplo de la figura 2.8, de tal manera que sobre el diseo bsico puedan ir
40

acoplndose o sustituyndose, diversos mdulos o sustituir los detectores, cada vez es ms
frecuente en el mercado la opcin integral que tiene la ventaja de control nico a travs de un
microprocesador, lo que sin duda reduce la intervencin humana y eleva la seguridad del proceso
analtico , pero tiene los inconvenientes de la falta de flexibilidad (los mdulos no pueden operar
independientemente) y su elevado costo.

Figura 2.8 Equipo de HPLC modelo HP1200
2.5.2. BOMBAS
Los equipos de HPLC utilizan al menos una bomba para forzar el paso de la fase mvil a travs de
la columna cuyo relleno, muy compacto, es responsable de una sobrepresin muy importante a
nivel del inyector, esta presin puede alcanzar 20,000 KPa (200 bares) segn el caudal de la fase
disolventes
(fase mvil)
desgacificador
bomba
inyector
columna
detector
Computadora
Registrador
41

mvil, su viscosidad y el tamao de partculas en la fase mvil. Se utilizan bombas de alta presin
diseadas para mantener un caudal sin pulsos y estable, incluso cuando la composicin de la fase
mvil varia, estas bombas pueden ser de un solo pistn o bien llevar dos pistones que funcionan
en oposicin y situados en serie para evitar las interrupciones de caudal que resultan de la fase de
relleno. Para regular el caudal, el desplazamiento de los pistones se controla por un motor de
pasos asociado a una leva de forma particular.
En la figura 2.8 podemos observar el funcionamiento de dos pistones en serie el embolo que se
encuentra en la parte de abajo expulsa una cantidad de disolvente del doble a la del embolo de
arriba, debido a que su dimetro es mayor, (a) y (b). En (a) El volumen del eluyente almacenado en
el cilindro corresponde al embolo B y es enviado a la columna, mientras tanto el embolo A aspira
una nueva cantidad del eluyente, en (b) cuando el embolo expulsa el eluyente, la mitad de este
rellena el cilindro del embolo B, y de esta manera regula el caudal. En (c) se tienen dos mbolos de
igual dimetro pero uno de ellos tiene un recorrido y una velocidad del doble de la del otro. En el
grafico se observa las variaciones del flujo en funcin del movimiento de los mbolos.

Figura 2.9 Bomba de dos pistones en serie
Fuente: Basado en (Rouessac, Rouessac et al. 2003)
B
entrada
d
i
s
o
l
v
e
n
t
e
salida
A
B
entrada
d
i
s
o
l
v
e
n
t
e
salida
A
d
i
s
o
l
v
e
n
t
e
entrada
embolo extendido
embolo contrado
salida
Sensor de presin
tiempo
c
a
u
d
a
l
42

Dependiendo de su diseo, los cromatgrafos pueden incluir una o varias bombas, situada en la
entrada o en la salida, estas estn asociadas a una cmara de mezcla. Las bombas permiten liberar
un eluyente de composicin fija (modo isocrtico), o de composicin variable para hacer un
gradiente de elucin. Para un sistema por gradiente se debe de tener en cuenta que la
composicin de la mezcla no se modifique por accin de la presin.
2.5.3. INYECTORES
La inyeccin de un volumen preciso de muestra debe hacerse a la entrada de la columna en un
corto periodo de tiempo para perturbar los menos posible el rgimen de circulacin establecido
por columna y el detector, para ello se utiliza una vlvula de alta presin de varias vas manual o
automatizada, en el caso de inyectores automticos, esta vlvula debe de resistir presiones que
puedan sobrepasar los 30,000KPa, En la figura 2.10 se puede observar el funcionamiento de una
vlvula para HPLC, la cual funciona en dos tiempos:
a) Posicin de carga, la bomba y la columna estn conectadas, la muestra es introducida a
presin atmosfrica, con la ayuda de una jeringa en un depsito tubular denominado
bucle, este puede ser de diferentes volmenes, puede ser exterior o puede estar
integrado en el bloque de la vlvula
b) Posicin de inyeccin, la muestra es introducida en el flujo de la fase mvil por una
rotacin de la palanca de 60que permite invertir el sentido de circulacin del bucle, el
volumen inyectado debe de ser unas 5 a 10 veces mayor que la del bucle.
43

Figura 2.10 Vlvula de inyeccin utilizada en HPLC
Fuente: Elaboracin propia basado en (Harris 2007)
2.5.4. COLUMNAS
La columna es la parte esencial del cromatgrafo, ya que en ella a travs de diferentes
mecanismos (absorcin, particin, intercambio inico exclusin, etc.), tiene lugar la separacin o
discriminacin entre analitos e interferentes. El gran aumento de la eficiencia cromatogrfica de
HPLC respecto a la alternativa clsica se basa en la disminucin del tamao de partcula de la fase
estacionaria, lo que implico un aumento en la presin de trabajo. Para la reproducibilidad de los
datos en necesario que exista una gran homogeneidad en la distribucin de la fase estacionaria,
esto implica la necesidad de que existan tcnicas precisas y complejas de preparacin de las
columnas.
En la actualidad en el mercado existen una gran variedad de columnas cromatogrficas y en la
tabla 2.3 podemos observar las caractersticas geomtricas distribucin bsica de las columnas
convencionales para cromatografa lquida clsica de las columnas y su material de relleno, as
como las condiciones hidrodinmicas de trabajo.
Al
desage
Bucle de
muestra
Al
desage
Entrada de
disolvente
Jeringa
(a) Posicin de carga (b) Posicin de inyeccin
A la
columna
A la
columna
Jeringa
Entrada de
disolvente
44

Las columnas para HPLC convencionales, las primeras que se usaron fueron las de
empaquetamiento de pelcula. El material (fase estacionaria) consiste en bolitas esfricas
regulares (30-70m) de un slido no poroso generalmente de vidrio, recubiertas de una capa (1-
3m) de material activo cromatogrfico poroso de naturaleza polimrica. Debido a la densidad
elevada de las mismas, se logra un empaquetamiento uniforme de la columna. La distribucin
entre la fase mvil y la fase estacionaria es ms factible si se tratara de molculas porosas del
mismo tamao.
Caractersticas
geomtricas
Cromatografa
clsica
HPLC
Empaquetamiento de
la pelcula
Micro
particular
Micro
columnas
Dimetro columna (mm) 20-70 1-3 2-6 0.05-1
Longitud columna (cm) 200-100 50-100 10-50 10
3
-5X10
3

Dimetro de partcula
(m)
150 30-70 5-10 5-30
Presin (atm) 1 30-50 100-200 150-250
Caudal (mL/min) 0.1 0.5-5.0 1-2 10
-4
-5X10
-2

Tabla 2.3 Caractersticas generales de las columnas cromatogrficas empleadas en HPLC
Fuente: (Valcrcel y Gmez 2003)
La capacidad y eficiencia de la columna con el tipo de empaquetamiento antes mencionado
aumenta cuando se sustituye el recubrimiento posterior por un tratamiento especial de las esferas
de vidrio (30-60m) para que adquieran una micro zona externa (1-3m), tambin de vidrio, el
volumen de p oro de estas esferas es muy pequeo, lo que origina una rpida difusin de los
solutos en ambos sentidos, debido a esta caracterstica son adecuadas cuando se requiere un gran
velocidad de determinacin. En la figura 2.11 s e muestra una columna de acero utilizada
comnmente en HPLC.
45

A medida la columna est precedida de una pre-columna corta, denominada guardacolumna,
rellena de la misma fase estacionaria que retiene los compuestos y as se logra aumentar la
duracin de la vida de la columna cromatogrfica, peridicamente se cambia esta precolumna. No
obstante antes del anlisis, es aconsejable pasar las muestras por un filtro de porosidad menor a
0.5m.

Figura 2.11 Columna de acero
Fuente: (Harris 2007)
2.5.5. FASE ESTACIONARIA
Existen varios materiales orgnicos e inorgnicos que sirven para el relleno de las columnas, uno
de los ms comnmente usado es el gel de slice, slido amorfo rgido cuya frmula es SiO
2
(H
2
O)
n

(con n muy prximo a cero), se utiliza convenientemente trasformado, en el 80% de aplicaciones.
Este material bsico, completamente diferente a la slice cristalina (SiO
2
), pero que puede servir de
materia prima para su sntesis, se prepara en forma de esferas (porosas o no) con un dimetro
muy regular de unos 2 a 5m. Estas partculas esfricas de dimensin homognea aseguran un
relleno compacto de las columnas que evita la aparicin de caminos preferenciales para la fase
mvil.
46

El gel de slice es un material muy polar, el cual tiene una distribucin de red tridimensional, no
tiene una estructura ordenada como la slice cristalina, es un polmero inorgnico reticulado
(figura 2.12) que conlleva agrupaciones silanoides de nmero variable, que han resistido a la fase
final de coccin . Estas agrupaciones son las responsables de las propiedades catalticas cidas.
La calidad de un gel de slice para cromatografa depende de varios parmetros como por ejemplo
la estructura interna, el tamao de los granos, la porosidad abierta (dimensin y distribucin de
los poros), la superficie efectiva, la resistencia a la compresiny la polaridad.

Figura 2.12 Estructura del gel de slice para cromatografa.
A pesar de tener una capacidad de adsorcin elevada, el gel de slice, sus caractersticas han
evolucionado con el trascurso del tiempo, para muchas de las aplicaciones debe rehidratarse
parcialmente (3 a 5%) de agua para acondicionarla. Para disminuir la polaridad, a menudo
excesiva, se aprovecha la reactividad de los grupos silanos que se encuentran el superficie para
fijar molculas orgnicas a travs de enlaces covalentes, las fases enlazada cuya polaridad puede
ajustarse con facilidad, estn en el origen en la cromatografa de reparto de polaridad de fase
inversa utilizada en casi todas las separaciones cromatogrficas por HPLC.
47

Podemos distinguir entre estas slices modificadas con fase enlazada dos tipos: fases monomericas
y polimricas.
Fases monomericas (10 -15m de espesor), resultan de la reaccin de un monmero en presencia
de un base con silanos de superficie de este modo se pueden obtener las fases RP-8
(agrupamiento dimetiloctilsilano), RP-18 u ODS (agrupamiento de metiloctadesilano). Cerca de la
mitad de los grupos silanoles presentes estn enlazados.
Fases polimricas (25m), para este tipo de fase enlazada se utiliza di-o-triclorosilano en presencia
de vapor de agua, la cual provoca la polimerizacin en disolucin del reactivo antes de depositarse
y enlazarse a la slice. De este modo se obtiene una capa polimrica reticulada.
Al lado de las fases enlazadas que comportan cadenas lineales de alquilo de 8 a 18 tomos de
carbono, que se pueden utilizar desde pH 2 a pH 10, existen otras que llevan cadenas de grupos
aminopropilo, cianopropilo, benzilo, o fases mixtas que confieren una cierta polaridad al conjunto.
La naturaleza del grupo enlazado caracteriza las caractersticas separativas de las columnas con
fase enlazada y el gel de slice pierde su papel esencial que tena como fase estacionaria.
2.5.6. FASES MVILES
La interaccin que existe entre la fase estacionaria (normal o de polaridad) influye sobre los
tiempos de retencin de los solutos, la polaridad de la fase estacionaria permite distinguir dos
situaciones:
Si la fase estacionaria es polar, la cromatografa se realiza en fase normal, en este caso se utilizar
un fase mvil poco polar.
Si la fase estacionaria es muy poco polar, la cromatografa se denomina en fase reversa, o
cromatografa hidrfoba y en este caso se utilizara una fase mvil polar (lo ms utilizado son
mezclas de metanol o acetonitrilo con agua).
Cuando modificamos la polaridad de la fase mvil estamos actuando directamente sobre el
coeficiente de distribucin o reparto K, es decir sobre el factor de retencin k de los compuestos.
Los cromatografistas deben hacer una buena eleccin de la fase mvil en funcin de los
48

compuestos que hay que separar. La formacin de enlaces modificados conduce a una prdida
importante de polaridad. Cuando se utiliza un fase elanzada que podemos imaginar constituida
por esferas de slice recubiertos con una capa de parafina, el orden de elucin es opuesto al que
estamos a acostumbrados a ver en una fase normal. De este modo, se utiliza un eluyente polar, un
compuesto polar migra ms rpido que un compuesto apolar, en estas condiciones se retienen
ms los hidrocarburos. Se realizan gradientes de elucin para disminuir la polaridad del eluyente
durante la separacin (por ejemplo mezclas de agua/acetonitrilo, cuya concentracin en
acetonitrilo crece durante la elucin).
2.5.7. DETECTORES
El sistema de deteccin se trata de un modulo del cromatgrafo de lquidos situado a la salida de
la columna, que proporciona de forma continua informacin acerca de la composicin del flujo
que circula a travs de l. Generalmente origina una seal elctrica continua, que debidamente
amplificada y registrada, constituye el cromatograma, del que se extrae informacin cualitativa y
cuantitativa de la muestra inyectada.
Un detector debe de reunir ciertas caractersticas para su empleo: alta sensibilidad (del orden de
10
-12
-10
-11
g/mL), lo que implica un bajo ruido de fondo, la respuesta universal a todos los solutos,
amplio rango lineal de concentracin (5-6 ordenes de magnitud volumen mnimo en la celda de
flujo, para evitar la dispersin de los solutos, debe de ser no destructivo, en caso de que se
requiera recoger fracciones, insensible a cambios de presin temperatura, etc. Debe de operar
continuamente durante largo tiempo ser asequible a la automatizacin. Los modos de deteccin
ms utilizados se basan en las propiedades pticas de los compuestos (absorcin, fluorescencia e
ndice de refraccin).
Detectores espectrofotomtricos
Este tipo de detectores se basan en la ley de Lamber-Beer =
la absorbancia A de de la fase
mvil se mide a la salida de la columna, a una o varias longitudes de onda en el UV o visible, la
intensidad depende del coeficiente de absortividad molar
caracterstico, lo que hace que no sea

posible el clculo de las concentraciones de cada una de las especies detectadas por medida
49

directa de las reas de los picos, que no considerara estos coeficientes de absortividad
especficos. La fase mvil debe mostrar una absorbancia despreciable. Para aquellos compuestos
que no poseen un espectro de absorcin aprovechable, se recurre a formar derivados de los
analitos. Para los detectores existen dos modelos bsicos de deteccin monocromtica o
policromtica, en la primera como su nombre lo indica permite aislar una longitud de onda
especifica y el modelo policromtico permite registrar la absorbancia en varias longitudes de onda
al mismo tiempo o tambin percibir todo un campo de longitudes de onda sin interrumpir la
circulacin en la columna. El detector de arreglo de diodos permite no solamente obtener un
cromatograma sino tambin proporciona informaciones espectrales que puedan servir para
asegurar la identidad de los compuestos separados.
Detectores espectrofluorimtrico
Los compuestos fluorescentes remiten, en forma de luz, toda una parte de la radiacin de la
fuente luminosa a la que estn sometidos. La intensidad de la fluorescencia es proporcional a la
concentracin de la sustancia a condicin de que esta sea dbil, el campo de aplicacin de este
tipo de detector es muy sensible y selectivo, puede ampliarse aplicando reacciones de formacin
de derivados fluorescentes. Para estos procedimientos se sita un reactor antes de la columna
(precolumna)o bien entre la columna y el detector (postcolumna) para realizar una o varias
reacciones sobre los compuestos para hacerlos fluorescentes.
Detector refractomtrico
Su funcionamiento se basa en lo que ocurre cuando un haz luminoso (mono o policromtico) pasa
a travs de una clula que contiene dos compartimentos, uno de los cuales se rellena solo con una
fase mvil y el otro con eluyente a la salida de la columna. La diferencia de los ndices de
refraccin entre los dos lquidos que aparecen cuando un soluto se mezcla con el eluyente, se
traduce en un desplazamiento angular del haz refractado. En la prctica la seal corresponde a la
medida en continuo de la retroalimentacin que hay que proporcionar a un elemento ptico para
compensar el haz reflejado.

50

CAPITULO 3
DISEO DE EXPERIMENTOS
3.1 PLANEACIN DE UN EXPERIMENTO
La planeacin es una actividad que permite eficacia, eficiencia y efectividad en el trabajo. En la
investigacin experimental, la planeacin implica disear el experimento. El diseo estadstico de
un experimento da la posibilidad de que ste sea realizado de una manera eficiente, es decir, con
el mnimo de recursos materiales y tiempo (Ross 1996).
El xito de un experimento radica en alto porcentaje en la calidad de su planeacin. El diseo de
experimentos de puede aplicar a problemas o situaciones en las que se quiere investigar y/o
probar conjeturas en las que se compartan dos o ms situaciones para las causas o factores
involucrados (Montgomery 2007).
Un programa de investigacin es un esfuerzo organizado de un cientfico para adquirir
conocimientos sobre un proceso natural o artificial. El programa completo puede necesitar de
muchos estudios individuales, cada uno con objetivos especficos. Normalmente, los estudios
individuales responden preguntas y proporcionan piezas de informacin afines que, en conjunto,
satisfacen las metas del programa.
Al iniciar el estudio, el investigador sagaz desarrolla una lista de verificacin de aspectos
concretos; algunos de los que suelen incluirse son: objetivos especficos del experimento
identificacin de los factores que influyen y cules de ellos varan y cules permanecen constantes
caractersticas a medir procedimientos particulares para realizar las pruebas o medir las
caractersticas nmero de repeticiones del experimento bsico a realizar recursos y materiales
disponibles.
Se pueden hacer preguntas sencillas para enfocar las actividades Las preguntas sencillas, pero que
impliquen un reto, auxilian en el proceso de diseo, aunque se tenga una hiptesis de
investigacin bien definida como mvil del estudio de investigacin.
51

Las preguntas que centran nuestra atencin a travs del proceso de diseo incluyen: Cul es mi
objetivo?, Qu quiero saber? y Por qu quiero saberlo?. Las preguntas de seguimiento
productivo para cada actividad en el proceso, tales como: Cmo voy a realizar esta tarea? y
Por qu hago esta tarea?, dirigen la atencin a definir el papel de cada actividad en el estudio
de investigacin.
Las componentes del estudio se analizarn por separado en las siguientes secciones, pero estn
interrelacionadas y en un estudio real el investigador debe integrarlas. Para empezar, a
continuacin se establece el vocabulario concreto que se usar para expresar las ideas.
Uno de los objetivos del diseo de experimentos es conseguir determinadas caractersticas
relacionadas con la calidad de los productos y que los procesos sean ptimos. En algunos de los
casos se desea que los valores sean lo ms grande posible (por ejemplo, el nmero de piezas
procesadas por unidad de tiempo), o en otros casos, se desean valores lo ms pequeos posibles
(por ejemplo, la menor vibracin en un cuarto de pesado de materias primas), o un tercer caso, en
donde se desean valores prximos a una determinada referencia (por ejemplo, el peso de una
tableta).
Los valores de las caractersticas de calidad dependen de variables que pueden ser: longitud,
velocidad, tensin, temperatura, entre otros, o cualitativas como materiales, disposicin, abierto,
cerrado. El diseador puede controlar algunas de estas caractersticas, mientras que otras
dependen del proceso de produccin del entorno o la utilizacin.
Experimentar es cambiar deliberadamente las condiciones del funcionamiento de los sistemas a
utilizar, para mejorar el conocimiento de los productos o procesos, y a la vez orientar las acciones
a tomar en el diseo y desarrollo. El objetivo bsico del diseo de experimentos, basado en
tcnicas y metodologas estadsticas, consiste en determinar un conjunto de pruebas a realizar
para obtener el mximo conocimiento sobre el sistema con el mnimo nmero de experimentos.
El diseo de experimentos tiene su procedencia en estudios de R. Fisher y las aplicaciones a la
agronoma a partir de 1930, pero prcticamente no trascendi al campo de la ingeniera hasta
mucho ms tarde, hacia 1970 en Japn con los tra bajos de G. Taguchi, pusieron nfasis en el
52

concepto de diseo robusto, poco sensible a las variaciones (Riba 2002). El diseo de
experimentos parte de la idea de que el mejor momento para poner las bases de la calidad de los
productos y procesos es durante las etapas de especificacin y concepcin.
En la ingeniera de calidad, es de gran importancia mejorar la productividad y la calidad, por
ejemplo, minimizar el nmero de productos defectuosos en la fabricacin. Las acciones
pertinentes incluiran determinar el intervalo ptimo de inspeccin y los lmites de control para
ajustar el proceso, establecimiento de sistemas de mantenimiento preventivo, disear el proceso
de conexin del sistema para conseguir la mxima automatizacin y racionalizar los sistemas de
inspeccin. Todas las actividades son evaluadas mediante las consideraciones de la funcin de
prdida de calidad, la evaluacin econmica es necesaria para todos los mtodos.
3.2 EL CONCEPTO DE ROBUSTEZ
El diseo robusto de experimentos en el cual existen factores de ruido no controlables,
considerados de manera explcita o implcita, cuyo efecto se pretende minimizar de forma
indirecta (es decir, sin controlarlo directamente) a fin de encontrar combinacin de niveles de los
factores de proceso que si se pueden controlar y en donde el efecto de dichos factores es mnimo.
Dicho de otra manera en un experimento robusto se trata de lograr que el producto o proceso
tenga el desempeo adecuado sin que afecten las fuentes de variacin no controladas(Gutirrez
Pulido y Vara Salazar 2004). El significado de la palabra robusto es en el sentido de hacer el
proceso o producto insensible o resistente a factores de ruido que no est en nuestras manos
controlar.
El diseo robusto se enfoca a la fabricacin de productos y procesos robustos, lo cual se logra
mejor durante la etapa en que se concibe y disea un nuevo producto; adems en esta etapa es
posible reducir el costo al incluir materiales ms econmicos que cumplan con la funcin
deseada(Taguchi y Asian Productivity Organization 1988). Tener un proceso robusto significa que
este funcione bien aunque varen una serie de factores (de ruido) que no se puedan controlar,
como variables ambientales (temperatura, humedad, etc.), cansancio de los operadores, cambio
en el turno y de lotes, variaciones no controlables en variables de proceso, acumulacin de
suciedad, etc.
53

3.3 FACTORES DE CONTROL, RUIDO Y DE SEAL
En un proceso existen bsicamente dos tipos de factores: controlables y no controlables (o de
ruido). En el diseo robusto es conveniente tener una clasificacin ms detallada del tipo de
factores controlables que puedan influenciar el proceso, en cuanto a su efecto sobre la media y la
variabilidad de la respuesta de inters. Se distinguen cuatro tipos de factores de inters(Gutirrez
Pulido y Vara Salazar 2004):
Afecta a la media y a la variabilidad.
Afecta solo a la variabilidad.
Afecta solo a la media.
No afecta a la media ni la variabilidad.
Cuando en un diseo clsico se afirma que un factor tiene un efecto sobre la respuesta, por lo
general se quiere decir que el factor tiene efecto sobre la media de la caracterstica de calidad. En
cambio en el diseo robusto se tiene ms presente que el efecto de un factor tiene efecto sobre la
media de la caracterstica de calidad. En cambio en el diseo robusto se tiene ms presente que el
efecto de un factor tambin puede ser sobre la variabilidad, o sobre la media y la variabilidad de
manera simultnea. Estos cuatro casos se representan en la figura 3.1 en el eje horizontal se
muestra el efecto sobre la media y en el eje vertical el efecto sobre la variabilidad. El factor clase I
afecta a la media y a la variabilidad y, el caso 2 solo a la variabilidad, el caso III afecta solo a la
media y la clase IV no afecta a ninguna de las dos.

Figura 3.1 Clases de factores ortogonales de acuerdo a su efecto sobre la madia (eje
Fuente:
El factor de clase I tiene una relacin curva con la variable de respuesta: considerando dos niveles
(A
1
y A
2
) de este factor es claro de la grfica que una misma oscilacin o variacin del factor sobre
cada uno de estos niveles, (representadas por las curvas sobre ellos) tiene un efecto distinto sobre
la variable repuesta. En el nivel A
nivel A
1
, es decir en el nivel A
oscilaciones del factor. Es claro que al mismo tiempo en A
que A
1
.
El factor de control de clase II se representa interactuando con un factor de ruido . Esta interaccin
tiene efecto principalmente en la variabilidad, ya que el factor de ruido no se controla y seguir
variando entre sus valores extremos Z
media de la caracterstica es la misma. Lo ms relevante de esta interaccin es que el nivel A
54
Clases de factores ortogonales de acuerdo a su efecto sobre la madia (eje
variabilidad (eje Y).
Fuente:(Gutirrez Pulido y Vara Salazar 2004)
la variable repuesta. En el nivel A
2
la variable respuesta Y tendr una variabilidad menor a la del
, es decir en el nivel A
2
se tiene un comportamiento ms robusto del proceso a las posibles
oscilaciones del factor. Es claro que al mismo tiempo en A
2
, la media de la caracterstica es mayor
tor de control de clase II se representa interactuando con un factor de ruido . Esta interaccin
variando entre sus valores extremos Z
1
y Z
2
, de manera que en cualquiera de los niveles (A

Clases de factores ortogonales de acuerdo a su efecto sobre la madia (eje X) y/o
Y tendr una variabilidad menor a la del
se tiene un comportamiento ms robusto del proceso a las posibles
, la media de la caracterstica es mayor
tor de control de clase II se representa interactuando con un factor de ruido . Esta interaccin
n cualquiera de los niveles (A
1
yA
2
) La
1
del
55

factor de control se minimiza el efecto del factor ruido sobre la variabilidad de Y. Entonces se
puede afirmar que en el nivel A
1
el proceso es ms robusto al efecto del factor ruido. Este tipo de
relacin entre un factor de control y un factor de ruido es la idea fundamental que permite el
diseo robusto. Si en un experimento dado los factores de control actuaran independiente de los
factores de ruido ser imposible hacer diseo robusto, ya que no existir una combinacin de los
primeros que minimicen el efecto de los segundos.
El factor clase III afecta solo a la caracterstica de calidad. La variabilidad que parara a la respuesta
Y por la oscilacin de este factor es la misma en cualquier lugar de su rango. Este tipo de factor es
til para llevar la media a su valor nominal una vez elegidos los niveles de los factores clase I y
clase II que minimizan la variabilidad, de aqu que el factor clase 3 se le llame factor de ajuste. Esto
es con los factores de clases I y II es posible elegir las condiciones ms robustas, reduciendo la
variabilidad de la respuesta, pero la media se mover de su valor deseable, con el factor clase III
esta se regresa a su valor nominal sin afectar la variabilidad. Finalmente el factor clase IV no tiene
efecto ni en la media ni en la variabilidad y de este se elige su nivel ms econmico como el mejor.
A La medida en la que se conoce la relacin entre los factores controlables y no controlables con la
variable respuesta, se est en posicin de establecer mejores condiciones de operacin del
proceso. El diseo robusto se trata de de sacra ventaja principalmente de los factores de control
clase II que interactan con factores de ruido: se trata de elegir un valor controlable que hace al
proceso ms insensible al ruido. Despus se busca ajustar el valor nominal con un factor de ajuste
(clase III).
Factor seal
Muchos de los productos estn diseados para trabajar en diferentes niveles de desempeo y de
acuerdo a los deseos del usuario o consumidor. En otras palabras, el usuario puede elegir la seal
(o valor promedio de la respuesta) que desea en un momento dado del producto. Se llama factor
seal al dispositivo que permite cambiar el nivel de operacin de acuerdo a los deseos del usuario.
56

El factor seal permite cambiar el valor de la media de la caracterstica de calidad, y es deseable
que la variabilidad de cada nivel de operacin se mnima. Es decir el producto debe ser robusto a
cada nivel del factor seal(Ross 1996).
Factores de ruido
Los factores de ruido que afectan sobre el producto o sobre el proceso se clasifican como: ruido
interno, ruido externo y de deterioro. El ruido externo se refiere al ambiente en el cual el proceso
o producto se desempea a la carga de trabajo de trabajo a la que es sometido.
Tipos de robustez
Los estudios de robustez se clasifican utilizando los criterios de tipo variable de respuesta y la
existencia o ausencia de factores de seal. Una variable de respuesta puede ser de tres
tipos(Gutirrez Pulido y Vara Salazar 2004):
Entre ms pequea mejor. Son variables o caractersticas de calidad cuya nica exigencia es que no
excedan cierto valor mximo tolerado o especificacin superior, y entre ms pequeo sea su valor
mejor. Pr ejemplo: porcentaje de impurezas en una sustancia o la cantidad de sustancias toxicas
en un producto alimenticio.
Entre ms grande mejor. Son variables o caractersticas de calidad en las que se exige que sean
mayores que un valor mnimo o que cierta especificacin inferior, y entre mas grande sea el valor
de la variable es mejor. Por ejemplo, la resistencia de una pieza de plstico inyectado o la blancura
de una tela de color blanco.
Valor nominal es mejor. Variable que debe de tener un valor especifico y que por lo tanto, no
deben de ser menores a una especificacin inferior, pero tampoco mayores que una especificacin
superior. Ejemplos de este tipo de caractersticas de calidad con doble especificacin son el
dimetro interior de una tuerca y la longitud de una pieza para ensamble.
En cuanto al factor seal se dice que el estudio es esttico si no hay factor seal y es dinmico en
el otro caso.
57

3.4 ARREGLOS ORTOGONALES
Los arreglos ortogonales son diseos propuestos por Taguchi, como su nombre lo indica, tienen la
propiedad de ortogonalidad (Taguchi, Clausing et al. 1988), una matriz de diseo ortogonal es
aquella en donde sus columnas son linealmente independientes lo cual se obtiene si la
multiplicacin de dos columnas cualesquiera es igual a cero. Esta propiedad tambin la poseen los
diseos ortogonales clsicos. Estos arreglos son diseos factoriales completas, fraccionadas o
mixtas, dependiendo del nmero de factores a estudiar en un caso particular. Por ejemplo el
arreglo ortoganonal L8 tiene ocho corridas experimentales y con l se pueden estudiar desde dos
hasta siete factores en dos niveles cada uno. Taguchi no hace nfasis en el estudio de las
interacciones, prefiere saturar lo ms posible los arreglos y analizar solo los efectos principales de
cada factor.
En la figura 3.2. Se muestra los seis arreglos ortogonales de uso ms frecuente, que son: L
4
, L
8
, L
12
,
L
16
Y L
18
, y en la parte inferior de cada uno de ellos se lista la manera de asignar los factores a las
columnas, lo cual es importante si no se van a ocupar todas, ya que una buena asignacin evita
confundir los efectos principales o incluso separar algunos efectos de interaccin, el subndice de
la notacin Li indica el numero de combinacin de niveles que conforman el arreglo. Los arreglos
L9 y L18permiten estudiar factores con tres niveles (1, 2,3).
Diseo con arreglo interno y externo
La condicin fundamental para que un diseo experimental sea de tipo robusto es que exista al
menos un factor de ruido para el cual se busca hacer que el proceso o producto sea insensible a su
efecto., sin pretender controlar dicho factor de ruido.
Un diseo experimental propuesto por Taguchi para determinar las condiciones de operacin
robustas a uno o varios factores de ruido es el diseo de arreglo interno y externo. Una vez
identificados los factores de control y los factores de ruido con los que se requiere experimentar,
se construyen dos arreglos ortogonales, uno para cada tipo de factores. Una de las desventajas del
arreglo interno y externo es que requiere una cantidad grande de corridas experimentales, aun
utilizando los arreglos ortogonales ms pequeos.
58

Figura 3.2 Arreglos ortogonales ms frecuentes
Fuente: (Gutirrez Pulido y Vara Salazar 2004)
3.5 RAZN SEAL/RUIDO
En los comienzos de la ingeniera de calidad, el objetivo era reducir la variabilidad de un producto
causada por las condiciones del entorno, el deterioro y la variabilidad pieza a pieza. Reducir la
variabilidad y ajustar la media a un valor objetivo determinado. Estos valores incluan el cero, el
infinito o valores nominales particulares, en la actualidad se denomina no dinmico. Lo no
dinmico se refiere a un objeto fijado, y estos objetivos fijados se evalan con relaciones seal-
ruido no dinmicas.
1 2 3 1 2 3 4 1 2 3 4 5 6 7
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 2 2 1 2 2 2 1 1 1 2 2 2 2
2 1 2 1 3 3 3 1 2 2 1 1 2 2
2 2 1 2 1 1 1 1 2 2 2 2 1 1
2 2 2 2 2 1 2 1 2 1 2
2 3 3 3 2 1 2 2 1 2 1
3 1 1 1 2 2 1 1 2 2 1
3 2 2 2 2 2 1 2 1 1 2
3 3 3 3
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 8
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 1 1 2 2 2 2 2 2
1 1 2 2 2 1 1 1 2 2 2 1 1 3 3 3 3 3 3
1 2 1 2 2 1 2 2 1 1 2 1 2 1 1 2 2 3 3
1 2 2 1 1 2 1 2 2 2 1 1 2 2 2 3 3 1 1
1 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 2 3 3 1 1 2 2
2 1 2 2 2 1 2 2 2 2 1 1 3 1 2 1 3 2 3
2 1 2 1 1 2 2 1 1 1 2 1 3 2 3 2 1 3 1
2 1 1 2 2 2 1 2 1 1 1 2 3 3 1 3 2 1 2
2 2 2 1 1 1 1 2 1 1 2 2 1 1 2 3 2 2 1
2 2 1 2 2 2 1 1 2 2 2 2 1 2 1 1 3 3 2
2 2 1 1 1 1 2 1 2 2 1 2 1 3 2 2 1 1 3
2 2 1 2 3 1 3 2
2 2 2 3 1 2 1 3
2 2 3 1 2 3 2 1
2 3 1 3 2 3 1 2
2 3 2 1 3 1 2 3
2 3 3 2 1 2 3 1
Arreglo L
4
(fraccin 2
3-1
)
Nmero de columna
2 factores: columna 1 y 2
3 factores: las tres columnas
Nmero de
corrida
1
Arreglo L
9
(fraccin 3
4-2
)
Nmero de columna
3 factores: columnas 1,2,3.
2 factores: columna 1 y 2.
5
6
7
Arreglo L
8
(fraccin 3
7-4
)
2 factores: columna 1 y 2.
3 factores: columnas 1,2,4.
4 factores: columnas 1,2,4,7.
5 factores: columna 1,2,4,7,6.
6 factores: columnas 1,2,4,7,6,5.
5
6
7
8
Nmero de
corrida
1
2
3
4
7 factores: las siete columnas
4 factores: columnas 1,2,3,4.
Nmero de columna
8
9
Arreglo L
11
(para K=11)
Nmero de columna
Se asigna K factores a las primeras K columnas (4<k <11)
Nmero de
corrida
1
2
3
4
5
6
7
8
2
3
4
Nmero de
corrida
1
2
Nmero de
corrida
1
2
3 3
4
12
13
14
15
9
10
11
12
Arreglo L
8
(2 X 3
7-5
)
Nmero de columna
9
10
11
4
5
6
7
8
restantes: 2,3,4,5,6,7,8
16
18
17
1 factor con dos niveles se asignan a la columna 1
Los factores con tres niveles se asignan a las columnas
59

A mediados de los aos setenta, se desarrollo la aplicacin para la evaluacin y mejora de los
sistemas de medida, aqu el objetivo no est limitado a medir la muestra teniendo solo un valor
verdadero especfico. Un sistema de medida est diseado para medir las muestras teniendo un
cierto rango de valores verdaderos. El valor debe de ser pequeo no solo para un determinado
valor, sino para todo un rango de medida. Esto condujo a desarrollar un ndice para evaluar el
error en todo un rango de medida, con este propsito naci la relacin seal-ruido dinmica.

Figura 3.3 Relacin seal-ruido
Fuente: (Riba 2002)
En los aos setenta las relaciones seal/ruido (S/R) fueron ampliamente aplicadas para la
optimizacin de productos y procesos adems de la aplicacin para medida, posteriormente,
introducidas en las reas de diseo de productos y procesos para medir la calidad de los
productos. La relacin S/R para medida y diseo, ambas se denominan relaciones S/R dinmicas,
pero especficamente, la primera se denomina pasivo, y la segunda activo. La relacin S/R para
medida se llama de tipo pasivo porque el resultado (salida)se utiliza para estimar el verdadero
valor de la muestra(entrada). En un sistema de control, por otra parte se manejan de tipo activo
porque la intencin es cambiar la salida, estos patrones pueden expresarse como se muestra en la
figura 4.1.
Para el anlisis de un diseo con arreglo interno y externo, Taguchi propone un estadstico de
desempeo, el cual se llama cociente o razn seal/ruido, que de calcula en cada combinacin de
Seal
(Entrada)
Lectura
(Salida)
Estimacin
(Entrada)
Seal
(Entrada)
Seal
(Entrada)
Sistema de medida (S/R pasiva)
Sistema de medida (S/R activa)
60

los factores controlables y se analiza como cualquier variable de respuesta. La combinacin ms
robusta de los niveles de los factores controlables es aquella que maximiza el estadstico
seal/ruido.
El hecho de que se saque logaritmo en el estadstico tiene que ver con buscar los efectos de los
factores controlables sea aditivo, es decir que se minimicen la posibilidad de efectos de
interaccin entre ellos. Se multiplican por 10 para trabajar en una escala ms grande y el signo que
los antecede se escoge de la manera que el problema siempre sea maximizar el valor estadstico
para obtener las condiciones de operacin ms robustas. En la tabla 3.1 se muestran las razones
de seal /ruido para los diferentes tipos de variable de respuesta.
Tipo de caracterstica Razn seal/ruido
Mientras ms pequea mejor

Mientras ms grande mejor

Su valor nominal es lo mejor (Tipo I)

Su valor nominal es lo mejor (Tipo II)

Proporcin de defectuosos

Tabla 3.1 Razn seal/ruido para las diferentes tipos de variables de respuesta
Fuente: (Gutirrez Pulido y Vara Salazar 2004)

2
1
1
log
n
i
i
Y
n
=
(
2
1
1 1
log
n
i
i
n Y
=
(
2
2
10log
Y
S
| |
|
|
\
( )
2
10log S
10log
1
p
p
| |
\
61

CAPITULO 4
APLICACIN DEL DISEO DE EXPERIMENTOS EN EL DESARROLLO DE UN
MTODO ANALTICO
4.1. DESARROLLO DEL EXPERIMENTO
El mtodo utilizado para la determinacin de principio activo de Dinitrato de Isorbid se muestra en
la figura 4.1, en el recuadro punteado se muestran la etapa de proceso en donde se modifican las
condiciones de cromatografa para optimizar el mtodo analtico.

Figura 4.1 Metodologa analtica para la determinacin de la concentracin de Dinitrato de
isosorbida.
En la figura 4.2 podemos observar el diagrama bsico de un sistema de HPLC el cual consta de de
un recipiente para el solvente (fase mvil), la cual nos va a permitir separar nuestro compuesto de
inters cuando entre en contacto con la (fase estacionaria), que es la columna por medio de un
sistema de bombeo. Normalmente se emplea una micro jeringa que inyecta la muestra al sistema,
La columna de cromatografa estar conectada a un detector, que medir la cantidad de cada uno
62

de los componentes (ya separados) que vayan saliendo de la columna. Los datos de este detector
suelen ser recogidos y procesados por una computadora que elaborar una grfica (un
cromatograma), cuyos picos representarn cada uno de los compuestos que han sido separados
por el HPLC. El rea bajo el pico ser proporcional a la cantidad del compuesto correspondiente.

Figura 4.2 Diagrama bsico de un sistema de HPLC.
4.2. DETERMINACIN DE FACTORES
Se propone por medio del un arreglo ortogonal el comparar diferentes factores afectan el tiempo
de retencin de dinitrato de isorbida: Fase mvil, pH e la fase mvil, Flujo y temperatura.
En el anlisis por HPLC, el tiempo en el cual el compuesto es retenido debe de ser el menor
posible ya que entre menor sea este tiempo, se entregaran resultados con mucho ms rapidez
para la liberacin del medicamento al mercado. Actualmente el tiempo de retencin del di nitrato
de isorbida es de 7.0 minutos.
63

En este caso estamos nos interesa analizar el efecto de 4 factores a dos niveles cada uno, por lo
tanto, se usar un arreglo ortogonal L8. Esto implica que se ejecutarn 8 pruebas o condiciones
experimentales.
FACTORES DESCRIPCIN NIVEL 1 NIVEL 2
A Fase mvil
Buffer:Metanol
(50:50)
Buffer:Metanol
(60:40)
B pH e la fase mvil 2 3
C Flujo 1 1.5
D Temperatura 25C 40C
Tabla 4.1 Descripcin de los factores a combinar en el experimento.
Corrida A B C D e1 e2 Fase mvil pH Flujo Tempera
tura
yi (tiempo
de
retencin)
1 1 1 1 1 1 1 (50:50) 2 1 25 2.1
2 1 1 1 2 2 2 (50:50) 2 1.5 40 1.8
3 1 2 2 1 1 2 (50:50) 3 1 25 2.2
4 1 2 2 2 2 1 (50:50) 3 1.5 40 1.9
5 2 1 2 1 2 1 (60:40) 2 1 40 2.5
6 2 1 2 2 1 2 (60:40) 2 1.5 25 3
7 2 2 1 1 2 2 (60:40) 3 1 40 2.8
8 2 2 1 2 1 1 (60:40) 3 1.5 25 2.4

64

4.3. METODOLOGA
Metodologa analtica para la valoracin de Dinitrato de isorbid tabletas 10 mg.
Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin.
Todos los solventes deben ser grado cromatogrfico
Fase mvil:
Preparar una mezcla adecuada, filtrada y desgasificada, de sulfato de amonio 0,1 M ajustando el
pH de acuerdo a la tabla 4.3 con cido sulfrico y metanol en las proporciones que indica la Tabla
4.4
FACTOR DESCRIPCIN NIVEL 1 NIVEL 2
A Fase mvil
Buffer : Metanol
(50:50)
Buffer : Metanol
(60:40)
Tabla 4.3 Factor A. pH de la solucin de sulfato de amonio
FACTOR DESCRIPCIN NIVEL 1 NIVEL 2
B pH e la fase mvil 2 3
Tabla 4.4 Factor B. pH de la solucin de sulfato de amonio
Condiciones cromatogrficas:
Las condiciones cromatogrficas a utilizar son las siguientes:
Cromatografo de Lquidos (HPLC) marca Dionex Ultimate 3000
Detector: Longitud de onda de 220 nm
Columna: Dionex C18 de 4,6 mm x 5,0 mm, o equivalente.
Volumen de inyeccin: 20 L
65

En la Tabla 4.5 se muestran los factores que cambian.
FACTORES DESCRIPCIN NIVEL 1 NIVEL 2
C Flujo 1 1.5
D Temperatura 25C 40C
Tabla 4.5 Factores C y D. Flujo de la bomba y temperatura de la columna cromatogrfica
Preparacin de la Muestra (Por sextuplicado):
Pesar exactamente 20 tabletas individualmente y sacar el peso promedio, moler finamente las
tabletas y pesar el equivalente a 10 mg de Dinitrato de isosorbida transferirlos cuantitativamente
aun matraz volumtrico de 25 mL, adicionar 15 mL de fase mvil y sonicar durante 30 min,
posteriormente llevar al aforo con fase mvil. Tomar una alcuota de 5 mL de la solucin anterior y
transferirla a un matraz volumtrico de 20 mL y llevar al aforo con fase mvil. Filtrar una porcin
de esta solucin a travs de un filtro 0,45 m tipo HV. Concentracin final 0,1 mg/mL.
En la tabla 4.5 se muestran las corridas experimentales.
Corrida A B C D e1 e2 Fase mvil pH Flujo Temperatura yi (tiempo de retencin)
1 1 1 1 1 1 1 (50:50) 2 1 25 2.1
2 1 1 1 2 2 2 (50:50) 2 1.5 40 1.8
3 1 2 2 1 1 2 (50:50) 3 1 25 2.2
4 1 2 2 2 2 1 (50:50) 3 1.5 40 1.9
5 2 1 2 1 2 1 (60:40) 2 1 40 2.5
6 2 1 2 2 1 2 (60:40) 2 1.5 25 3
7 2 2 1 1 2 2 (60:40) 3 1 40 2.8
8 2 2 1 2 1 1 (60:40) 3 1.5 25 2.4
66

Anexo 1. Desarrollo de las corridas experimentales
Corrida 1.
Cromatgrafo
Detector:
Longitud
de onda
Volumen
de
inyeccin:
Columna
Fase
mvil
pH Flujo Temperatura
Dionex
Ultimate
220 nm 20 L
Dionex
C18 de
(50:50) 2 1 25
Tabla 4.7 Condiciones experimentales de la corrida 1.
Resultados:
Figura
Figura 4.3 Cromatogramas del Corrida 1
67

El tiempo de retencin promedio del dinitrato de isorbid es de 2.1 min.
Corrida 2.
Cromatgrafo
Detector:
Longitud
Volumen
de
Columna
Fase
mvil
Dionex
Ultimate
3000
220 nm 20 L
Dionex
C18 de
4,6 mm x
(50:50) 2 1.5 40
Resultados:

68

Corrida 3.
Cromatgrafo
Detector:
Longitud de
onda de
Volumen de
inyeccin:
Columna
Fase
mvil
Dionex
Ultimate 3000
220 nm 20 L
Dionex C18 de
4,6 mm x 5,0
mm
(50:50) 3 1 25
Resultados:

69

Corrida 4.
Cromatgrafo
Detector:
Longitud de
onda de
Volumen de
inyeccin:

Columna
Fase
mvil
Dionex
Ultimate 3000
220 nm 20 L
Dionex C18 de
4,6 mm x 5,0
mm
(50:50) 3 1.5 40
Tabla 4.10 Condiciones experimentales de la corrida 4
Resultados:

70

Corrida 5.
Cromatgrafo
Detector:
Longitud de
onda de
Volumen de
inyeccin:

Columna
Fase
mvil
Dionex
Ultimate 3000
220 nm 20 L
Dionex C18 de
4,6 mm x 5,0
mm
(60:40) 2 1 40
Resultados:

71

Corrida 6.
Cromatgrafo
Detector:
Longitud de
onda de
Volumen de
inyeccin:

Columna
Fase
mvil
Dionex
Ultimate 3000
220 nm 20 L
Dionex C18 de
4,6 mm x 5,0
mm
(60:40) 2 1.5 25
Tabla 4.12 Condiciones experimentales de la corrida 6. Fuente:
Elaboracin propia
Resultados:

72

Corrida 7.
Cromatgrafo
Detector:
Longitud de
onda de
Volumen de
inyeccin:

Columna
Fase
mvil
Dionex
Ultimate 3000
220 nm 20 L
Dionex C18 de
4,6 mm x 5,0
mm
(60:40) 3 1 40
Resultados:

73

Corrida 8.
Cromatgrafo
Detector:
Longitud de
onda de
Volumen de
inyeccin:

Columna
Fase
mvil
Dionex
Ultimate 3000
220 nm 20 L
Dionex C18 de
4,6 mm x 5,0
mm
(60:40) 3 1.5 25
Resultados:

74

4.4. ANLISIS DE RESULTADOS
A1 = total de las lecturas que se tomaron con el factor A a su nivel 1
= 2.1+1.8+2.2+1.9 = 8
A2 = total de las lecturas que se tomaron con el factor A a su nivel 2
= 2.5+3+2.8+2.4 =10.7
B1= total de las lecturas que se tomaron con el factor A a su nivel 1
= 2.1+1.8+2.5+3.0 = 9.4
B2= total de las lecturas que se tomaron con el factor A a su nivel 2
= 2.2+1.9+2.8+2.4 = 9.3
C1= Total de las lecturas que se tomaron con el factor D a su nivel 1
= 2.1+1.8+2.8+2.4 = 9.1
C2= Total de las lecturas que se tomaron con el factor D a su nivel 2
= 2.2+1.9+2.5+3.0 = 9.6
D1= Total de las lecturas que se tomaron con el factor D a su nivel 1
= 2.1+2.2+2.5+2.8 = 9.6
D2= Total de las lecturas que se tomaron con el factor D a su nivel 2
= 1.8+1.9+3.0+2.4 = 9.1
e11= Total de las lecturas que se tomaron con el factor e1 a su nivel 1
= 2.1+2.2+3.0+2.4 = 9.7
e12= Total de las lecturas que se tomaron con el factor e a su nivel 2
= 1.8+1.9+2.5+2.8 = 9
e21= Total de las lecturas que se tomaron con el factor e1 a su nivel 1
= 2.1+1.9+2.5+2.4 = 8.9
e22= Total de las lecturas que se tomaron con el factor e a su nivel 2
= 1.8+2.2+3.0+2.8 = 9.8

75

En resumen se tiene:
Factor A B C D e1 e2
Nivel 1 8 9.4 9.1 9.6 9.7 8.9
Nivel 2 10.7 9.3 9.6 9.1 9 9.8

18.7 18.7 18.7 18.7 18.7 18.7
Tabla 4.15 Factores y niveles del experimento
En seguida se obtiene una cantidad que llamaremos suma de cuadrados esta se calcula como
sigue:
Suma de los cuadrados del factor x= SS X = (Total nivel 2 Total nivel 1)2/ n
Donde n representa el nmero total de lecturas que se tomaron.
n = 8
As por ejemplo, para el factor A, tendremos que dado que n=8
SSA = (A2 A1) 2/ 8 = (8-10.7) 2/ 8 = 0.91125 con 1 gl
Para el factor B se tiene
SSB = (B2 B1) 2/ 8 = (9.4-9.3) 2/ 8 = 0.00125 con 1 gl
Similarmente
SSC = (C2 C1) 2/ 8= (9.1-9.6) 2/ 8 = 0.03125 con 1 gl
SSD = (D2 D1) 2/ 8= (9.6-9.1) 2/ 8 = 0.03125 con 1 gl
SSE = (e12 e11) 2/ 8= (9.7-9.0) 2/ 8 = 0.06125 con 1 gl
SSe = (e22 e21) 2/ 8= (8.9-9.8) 2/ 8 = 0.10125 con 1 gl

76

Para la estimacin del error 1 y error 2 la suma de cuadrados es = 0.1625

FUENTE SS GL
MEDIA DE
CUADRADOS
F
A 0.91125 1 0.91125 5.607692308
B 0.00125 1 0.00125 0.007692308
C 0.03125 1 0.03125 0.192307692
D 0.03125 1 0.03125 0.192307692
Error (e1+e2) 0.1625 1 0.16250

Total 1.1375 6

Tabla 4.16 Tabla ANOVA para el experimento
Finalmente, la corrida final se realiza bajo las siguientes condiciones:
Fase mvil
Buffer pH=2:Metanol
(50:50)
pH e la fase mvil 2
Flujo 1
Temperatura 25
Tabla 4. 17 Corrida final
Los factores que resultan significativos son el A en primer lugar y posteriormente C y D, los niveles
que deben fijarse son los que minimicen la evaluacin, esto es, al nivel al que se obtenga el tiempo
de retencin menor. A a nivel 1, C a nivel 2 y D a nivel 1. El factor B no afecta la evaluacin del
mtodo, as que se utilizara el valor que menos afecte el mtodo.
En la tabla 4.17 se comparan el mtodo actual y el mtodo propuesto. Uno de los factores que
influyen en gran medida en el anlisis cromatogrfico es la columna, en los experimentos que se
realizaron, en todos ellos se utiliz una columna de longitud de 5,0 cm.
77

MTODO ACTUAL MTODO PROPUESTO
Fase mvil: Etanol:2,2,4 trimetil pentano
(15:85)
Fase mvil: Solucin de sulfato de amonio
0,1M: Metanol (50:50)
Condiciones cromatogrficas: Condiciones cromatogrficas:
Longitud de onda: 215 nm Longitud de onda: 220 nm
Columna: Dionex C18 de 4,6 mm x 25,0 cm, o
equivalente.
Columna: Dionex C18 de 4,6 mm x 5,0 cm, o
equivalente.
Volumen de inyeccin: 20 L Volumen de inyeccin: 20 L
Tamao de particula: 10 m Tamao de partcula: 5m
Flujo de solvente: 1mL/min Flujo de solvente: 1mL/min
Tabla 4.18 Comparacin del mtodo actual con el mtodo propuesto.
Se realizaron pruebas de un lote con el mtodo propuesto y se compararon los resultados
obtenidos con el mtodo actual Tabla 4.6.
MTODO ACTUAL MTODO PROPUESTO
Tiempo de retencin de di nitrato de
isosorbida
7.6 minutos 2.2 minutos
Consumo de fase mvil Etanol:2,2,4
trimetil pentano (15:85) para un lote
(12 iny)
115.2 -
Consumo de fase mvil Solucin de
sulfato de amonio 0,1M: Metanol
(50:50) para un lote (12 iny)
- 50.4
Tabla 4.19 Resultados obtenidos con el mtodo propuesto

78

CONCLUSIONES
Se realiz el diseo de experimentos para la valoracin de dinitrato de isosorbida por HPLC con el
cambio de columna cromatogrfica, se realizo el arreglo de los factores obteniendo del anlisis de
resultados por el mtodo ANOVA obteniendo que los factores que influyeron en la reduccin del
tiempo de retencin para el analito dinitrato de isosorbida es en mayor medida la composicin de
la fase mvil y en menor medida pero que tambin influyeron son el caudal de la bomba de
alimentacin y la temperatura de la columna.
El tiempo de retencin del dinitrato de isosorbida antes del cambio de factores era de 7.6 minutos,
con los cambios realizados a la tcnica analtica se logr reducir este tiempo a 2.2 minutos
correspondiente a una reduccin del 70% del tiempo inicial, esto implica un proceso mucho ms
rpido para la realizacin de esta prueba.
El tiempo que tarda el equipo en procesar un lote de dinitrato de isosorbida es de 2.4 horas y con
el cambio de columna es de 1.3 horas, el ahorro en el tiempo de uso de equipo es de una hora por
lote. Si esto lo multiplicamos por el nmero de lotes fabricados que se analizan juntos (alrededor
de 5 lotes), no da como resultado un ahorro de 5 horas de uso del equipo.
El tiempo de anlisis total se obtiene sumndole al tiempo de uso de equipo, 2 horas ms
(corresponden al tiempo que tarda es prepararse las muestras). Para la valoracin de 5 lotes de
dinitrato de isosorbida se requerira de 7 horas ms una 1 hora adicional que corresponde al
reporte de los resultados. Esto correspondera a una jornada de 8 horas de trabajo. Esto quiere
decir que el anlisis completo de esta prueba tardara un da de trabajo. En la situacin actual el
anlisis de 5 lotes de dinitrato de isosorbida se lleva a cabo en ms de un da de trabajo.
El consumo de fase mvil (disolvente) tambin se redujo en un 44% paso de 115 mL a 50 mL para
el anlisis de un lote, adems de la reduccin en el consumo de solventes, los reactivos utilizados
para preparacin de la fase mvil que se utiliza actualmente son ms caros que la fase mvil
propuesta. El precio del trimetilpentano es de $960 (garrafn de 4L), etanol es de $1,063(garrafn
de 4L), el sulfato de amonio es de $400 (1Kg) y metanol (garrafn 4L) $260 pesos.
79

La columna cromatogrfica C-18, 250mm de longitud X 4.6mm de dimetro interno que se utiliz
para en los experimentos tuvo un costo de $7,800 pesos, su precio es similar al de la columna que
se utiliza actualmente C-18, 250mm de longitud X 4.6mm de dimetro interno que es de $8,000
pesos. En este sentido el costo de la columna no impacto al momento de cambiar su longitud.
El manejo de los desechos es costoso debido a que se requiere de un tratamiento especial, debido
a sus caractersticas se trata de material peligroso ya que representan un riesgo para el medio
ambiente, en este sentido al disminuir el consumo de solventes en las tcnicas instrumentales se
estn generando menos desechos peligrosos.

80

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