Fac. Cs. Qs. Dpto. De BIOQUMICA - ALIMENTOS LABORATORIO DE BIOQUMICA I Q.F.

BENEMRITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS LICENCIATURA: QUMICO FARMACOBILOGO

REA ESPECFICA DE:

BIOQUMICA - ALIMENTOS

NOMBRE DE LA ASIGNATURA: CDIGO: FECHA DE ELABORACIN: NIVEL EN EL MAPA CURRICULAR: TIPO DE ASIGNATURA:

LABORATORIO DE BIOQUMICA II FAR 213L MARZO 2002 FORMATIVO CIENCIA DISCIPLINARIA

PROFESORES QUE PARTICIPARON EN SU ELABORACIN: M. C. Ma. Bertha Alvarado Hidalgo M. C. Rosa Ma. Dvila Mrquez M. C. Eustoquia Ramos Ramrez Q.F.B.Ins Zoraida Garca Cern M. C. Leticia Garca Albarrn HORAS DE TEORA: HORAS PRCTICA: 2 CRDITOS:

PRE-REQUISITOS: Bioqumica I (FAR 111) RECOMENDACIONES: Ninguna PRESENTACION GENERAL DEL PROGRAMA Es necesario integrar el conocimiento de las molculas presentes en los organismos con las vas metablicas de las que forman parte, por ello en este laboratorio se realizan determinaciones de molculas relacionadas con el metabolismo de carbohidratos y lpidos. Tambin se aislar DNA

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OBJETIVOS GENERALES DEL CURSO Al trmino del curso, el alumno: Relacionar al Glucgeno con la glucognesis y la glucogenlisis Detectar la presencia de Succinato deshidrogenada y la relacionar con el ciclo de Krebs y el transporte de electrones Realizar algunas reacciones de lpidos para cauterizarlos Determinar la accin de las sales biliares relacionndolas con su papel en la digestin de lpidos Determinar la presencia de cuerpos cetnicos relacionndolos con el desequilibrio entre los metabolismos de carbohidratos y lpidos Aislar DNA METODOLOGA. Todo proceso de enseanza - aprendizaje que tenga como finalidad la construccin de conocimientos significativos involucra al docente y alumnos en actividades regidas por la participacin y respeto mutuo, en donde se realizan acciones que permiten alcanzar los objetivos propuestos, por ello en el desarrollo del curso: Se considerar la asistencia y puntualidad, con la finalidad de promover en el estudiante un sentido de responsabilidad. A travs de la formacin de equipos se promover la iniciativa en la toma de decisiones, creatividad, administracin del tiempo y trabajo en equipo. A travs de la discusin de los resultados de las prcticas de laboratorio se promover el desarrollo de la capacidad de solucin a diferentes problemas que se le presenten. INSTRUMENTACIN DIDCTICA A UTILIZAR Equipamiento de laboratorio adecuado para cada prctica y pizarrn CRITERIOS DE EVALUACIN

Los alumnos debern cubrir el 100% de prcticas y reportes La calificacin mnima aprobatoria es de 7.0

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PRCTICAS DE LABORATORIO PROPUESTAS: Estn sujetas a la disponibilidad de reactivos y equipo, a continuacin se presentan las prcticas que como mnimo se realizan cada cuatrimestre. PRCTICAS DE LABORATORIO PROPUESTAS: 1. Determinacin de Glucgeno Heptico 2. Determinacin de la Actividad de la Enzima Succinato Deshidrogenasa 3. Mtodos Analticos para la Caracterizacin de Lpidos 4. Lecitinas 5. Influencia de la Bilis (sales biliares) sobre la Tensin Superficial del Agua e Hidrlisis Enzimtica de los Lpidos 6. Determinacin de Cuerpos Cetnicos 7. Aislamiento de nucleoprotenas y reconocimiento de DNA NOTA: Despus de realizada cada prctica, en la sesin siguiente se discute el procedimiento y resultados obtenidos BIBLIOGRAFA Remitirse al programa terico

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DETERMINACIN DE GLUCGENO HEPTICO

INTRODUCCIN: El glucgeno es un polisacrido el cul est presente en casi todos los rganos y tejidos. Presenta una forma globular, tiene la propiedad de ganar o perder molculas de glucosa con gran facilidad, es la forma de almacn de la glucosa en los animales. El glucgeno presenta varias unidades de -D-glucosa, las cuales estn unidas por enlaces glucosdicos ( 1-4) y ( 1-6). Es importante mencionar que el glucgeno se deposita principalmente en el hgado (2 a 5%/Kg) y en los msculos (0.5 a 2%/Kg) de donde se toma cuando es necesario (Glucogenlisis). OBJETIVO: Cuantificar el contenido del glucgeno heptico. Relacionar la presencia de glucgeno con la glucognesis y gluclisis MATERIAL: 4 tubos de ensaye 2 pipetas de 5ml 4 tapones de plstico 1 embudo Bao Mara (95C) Centrifuga Refrigerador Tijeras (deber traerlas el alumno) Papel filtro

MATERIAL BIOLGICO: Hgado de rata recin sacrificada. REACTIVOS: KOH 30 % Etanol absoluto Fenol 80 % H2SO4 Concentrado Glucgeno Solucin estndar 5, 10,20,40 mg/ 2 ml DESARROLLO: 1. Pesar 1g de hgado de rata recientemente sacrificada. 2. Colocar el hgado en un tubo de ensaye que contenga 4ml de KOH al 30%. 3. Con las tijeras cortar el tejido (dentro del tubo). 4. Tapar el tubo con un tapn de caucho e introducirlo en un bao Mara a 95C, dejar hidrolizar durante 30 min. 5. Retirar el tubo del bao y adicionar 1.2 volmenes de etanol absoluto, (aproximadamente 3ml) dejar en el refrigerador durante 20 min. 6. Retirar del refrigerador y centrifugar durante 15 min. Deseche el sobrenadante. 4

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7. Adicione 10ml de etanol, tape, agite en el vortex y guarde en el refrigerador. 8. Filtre y colecte en un tubo de ensaye limpio. 9. Coloque en dos tubos de ensaye alcuotas de 2ml del filtrado. 10.Adicione a cada tubo 0.1ml de fenol al 80% y 2ml de H2SO4 concentrado TENGA CUIDADO, esta operacin debe realizarse en no ms de 5 segundos. 11.Leer en espectrofotmetro a 490 nm.

CURVA PATRN. Se preparan 4 tubos con una solucin estndar de glucgeno como lo indica la siguiente tabla. NUMERO DE TUBO GLUCGENO 1 2 3 4 5 mg 2.0ml ------10 mg --2.0ml ----20 mg ----2.0ml --40 mg ------2.0ml Fenol 80% 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml H2SO4 2.0ml 2.0ml 2.0ml 2.0ml Leer absorbancia a 490 nm Los valores obtenidos del filtrado de hgado se interpolan en la curva patrn, la concentracin as determinada se multiplica por 12.5 que es el factor de dilucin. CUESTIONARIO: 1. 2. 3. 4. Cul es la funcin del KOH? Cul es la reaccin que se realiza en el filtrado al adicionar fenol y H2SO4? Podra detectar almidn con esta tcnica? Cmo se relaciona el glucgeno con las vas metablicas de carbohidratos?

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DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA SUCCINATO DESHIDROGENASA

INTRODUCCIN: La enzima succinato deshidrogenasa o deshidrogenasa del cido succnico es una Oxidorreductasa que cataliza la oxidacin del succinato para formar fumarato siendo la coenzima el FAD. Esta enzima se localiza en eucariotes en la membrana mitocondrial interna. El H2 cedido por el succinato puede ser transferido del FADH2 a un colorante susceptible como el azul de metileno que al cambiar su estado redox pasa de coloreado a incoloro o viceversa.
COOH I CH2 I CH2 I COOH FAD FADH2 COOH I CH

II
Succinato deshidrogenasa HC I COOH

FADH2 Succinato deshidrogenasa

FAD

Azul de metileno oxidado

Azul de metileno reducido

OBJETIVO: Que el alumno aprecie la actividad de le enzima Succinato Deshidrogenasa mediante una reaccin colorimtrica. Que el alumno relacione la presencia de esta enzima con el Ciclo de Krebs y el transporte de electrones MATERIAL: 2 tubos de ensaye 2 pipetas de 5ml REACTIVOS: NaOH al 10% cido succnico al 3% neutralizado con NaOH al 10% hasta pH=7.4 Bao Mara a 50C Pinzas para tubo de ensaye

Fenol al 90% Azul de metileno al 0.1% Aceite mineral Hgado de rata

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DESARROLLO: 1. Pesar 1gr. de hgado de rata recientemente sacrificada. 2. En el mortero molerlo con 3 4ml de cido succnico hasta obtener una masa. 3. Transferir en partes iguales a 2 tubos y proseguir segn la siguiente tabla.

Nmero de tubo Reactivo Fenol al 90% Azul de metileno Aceite mineral 1 2 1.0ml --2.0 gotas 2.0 gotas MEZCLAR CADA TUBO 0.5ml 0.5ml

4. Incube ambos tubos 10 minutos en el bao Mara a 50C 5. Observe los cambios CUESTIONARIO: 1. Cules son los colores del azul de metileno en sus estados oxidado y reducido? 2. Cul es la funcin del fenol en la reaccin? 3. En qu vas metablicas est involucrada la enzima succinato deshidrogenasa?.

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MTODOS ANALTICOS PARA LA CARACTERIZACIN DE LPIDOS

INTRODUCCIN: Las funciones que desempean los lpidos en los organismos es muy variada, por ejemplo : Como componentes estructurales de las membranas celulares, como fuentes de energa, como disolventes para sustancias orgnicas, como precursores de otros componentes celulares, etc. Histricamente la qumica de los lpidos se ocup inicialmente de las propiedades de mezclas de gran importancia comercial. Se aplicaban pruebas para establecer si los lpidos eran comestibles o si servan para preparar jabones o productos de belleza (an se realizan pruebas con estos fines) Debido a la funcin que desempean en la clula o al uso que le asigne el hombre a los lpidos, es importante saber aplicar diferentes tcnicas analticas para ellos. OBJETIVOS: 1. 2. 3. 4. Determinar el ndice de acidez del aceite de maz. Formar complejos Urea - cido graso. Determinar la presencia de insaturaciones en un cido graso. Realizar reacciones caractersticas del colesterol.

MATERIAL: 2 vasos de precipitado 200 y 50 ml 1 papel filtro Bao de hielo 5 tubos de ensaye Bao Mara a 60 C REACTIVOS: cido oleico Almidn 2 % Fenolftalena. H2SO4 concentrado NaOH 0.1 N El alumno deber traer: ceite de oliva ceite de maz

1 bureta 1 microscopio 1 probeta 1 embudo

Colesterol Etanol neutralizado cido esterico Urea en metanol

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DESARROLLO: I. INDICE DE ACIDEZ Fundamento: La acidez se debe a la hidrlisis que por diversas causas presentan los aceites (mezclas de triacil-glicridos de P.F. bajos); este factor permite cuantificar la calidad o rancidez de un aceite, valores aceptables estn dentro del siguiente rango: 1.2 a 3.5. El ndice de acidez se define como la cantidad de miligramos de KOH necesarios para neutralizar la acidez libre de 1 gramo de muestra. Se calcula:

I. a =

56 N V m

56= Peso molecular del KOH N= Normalidad de NaOH utilizado V= mls de NaOH de normalidad N utilizados m= gramos de muestra utilizados

Procedimiento: 1. Pese exactamente una muestra entre 10 y 15 gramos de aceite de maz, sobre un vaso de precipitado o un matraz previamente tarado. 2. Agregue 50 mls. de etanol neutralizado. 3. Introduzca al bao a 60 C, adicione 10 gotas de fenolftalena y titule con NaOH 0.1N hasta obtener un color rosa persistente. 4. Calcule el ndice de acidez usando la frmula. II. FORMACIN DE COMPLEJOS CIDOS GRASOS CON UREA. Fundamento: La formacin de complejos permite la obtencin de compuestos cristalinos fcilmente aislables cuyo punto de fusin y forma de cristalizacin ayudan a la identificacin del cido graso. Procedimiento: 1. Si el cido graso es slido disuelva 1 gr. en 2 ml. de metanol calentando suavemente en bao Mara, tome 1 ml. y colquelo en el vaso de precipitado de 50 ml, si el cido graso es lquido coloque directamente 1 ml. en el vaso de precipitado. 2. Agregue 5 ml. de disolucin de urea en metanol, agite intensamente y deje enfriar a 0C en un bao de hielo o en el refrigerador. 3. Filtre, seque los cristales por aereacin y observe al microscopio. Dibuje los cristales.

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III. ABSORCIN DE I2 POR CIDOS GRASOS INSATURADOS Fundamento: Los cidos grasos insaturados presentan reacciones de adicin de algenos formando derivados halogenados saturados. Cuando esta prueba es cuantitativa permite conocer adulteracin de los alimentos, as cuando el aceite de oliva tiene valores superiores de 88 probablemente est adulterado con aceite de semilla de algodn cuyo ndice de iodo es 175 - 202. Procedimiento: 1. Ponga en un tubo de ensaye 2 ml. de aceite de oliva o cido oleico, agregue 5 gotas de lugol y agite, esta mezcla debe ser rojiza, como la disolucin de iodo. 2. Caliente a la flama y observe que el color va cambiando. Cuando el color inicial ha desaparecido totalmente, deje enfriar y agregue 10 gotas de disolucin de almidn, observe e interprete sus resultados. IV. REACCIONES DEL COLESTEROL. Fundamento: El colesterol por accin de agentes deshidratantes como el cido sulfrico y anhdrido actico se transforma en colesterileno, compuesto de dobles enlaces conjugados que presenta color. PROCEDIMIENTO: 1. En un tubo de ensaye perfectamente seco, ponga 100 mg. Aproximadamente de colesterol. Agregue 3 ml. de cloroformo para disolverlo. Reparta esta disolucin en dos tubos para efectuar, con cada mitad las reacciones siguientes. a) Reaccin de SALKOVSKY. A unos de los tubos agregue 1 ml de H2SO4 concentrado, mezcle suavemente y deje separar las capas, en la capa superior que contienen cloroformo aparecer color rojo y en la inferior un color rojo amarillento con fluorescencia verde. b) Reaccin de LIEBERMAN - BURKHARDT Aadir 10 gotas de anhdrido actico y 2 gotas de H2SO4 concentrado, mezcle cuidadosamente. Observe los cambios de coloracin que se suceden. CUESTIONARIO: 1. 2. 3. 4. 5. Defina lpido. Escriba la reaccin de hidrlisis cida de los triacil glicridos. Escriba la frmula de los cidos grasos esenciales. Escriba la reaccin de un cido graso insaturado y el I2. Escriba la frmula del colesterol.

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LECITINAS
INTRODUCCIN: Los fosfolpidos forman parte de los lpidos compuestos, estn ampliamente distribuidos en los tejidos de los organismos animales; entre los fosfolpidos encontramos a las fosfatidilcolinas (lecitinas) y las fosfatodietanolaminas (cefalinas). Estos junto con las protenas son los principales componentes de las membranas de las clulas y de sus organelos. Tambin intervienen en el metabolismo. Los fosfolpidos de forraje aumentan el aprovechamiento de las sustancias nitrogenadas y el fsforo. OBJETIVOS: 1. Aislar lecitina de la yema de huevo y comprobar su presencia 2. Hidrolizar la lecitina obtenida y detectar alguno de sus componentes. MATERIAL: 1 vaso de precipitado 3 tubos de ensaye 1 agitador 1 embudo Papel filtro 2 Pipeta 10 ml. 1 Probeta 100 ml. 3 Pipetas 5 ml. Bao mara REACTIVOS: Etanol caliente Acetona Solucin saturada de Cloruro de cadmio NaOH al 10% Agua destilada Fenolftalena HCl al 50%

METODOS: I. AISLAMIENTO DE LAS LECITINAS DE LA YEMA DE HUEVO En un vaso de precipitado se pone la mitad de una yema de huevo, se le aaden 20ml de alcohol caliente y se mezcla con una varilla de vidrio. La mezcla se enfra y se filtra en un tubo de ensaye seco. II. DETECCIN DE LAS LECITINAS En un tubo de ensaye seco vierta 5ml de acetona y se le aade gota agota 1ml del filtrado obtenido en el mtodo 1. Esperara 20 minutos. La aparicin de turbidez indica la precipitacin de lecitina.

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III. REACCIN DE RECONOCIMIENTO DE LAS LECITINAS En un tubo de ensaye seco vierta 2ml de disolucin alcohlica de lecitina (filtrado obtenido en el mtodo uno) y se aade 1ml de solucin saturada de cloruro de cadmio. Espere 20 minutos. Se forma un precipitado blanco en forma de copos de un compuesto de cadmio con lecitina. IV. HIDRLISIS DE LA LECITINA En un tubo de ensaye seco vierta 5ml de disolucin de lecitina en alcohol (filtrado obtenido en el mtodo uno). Aada 3ml de NaOH 10% y ponga a hervir la mezcla durante 5 minutos en bao Mara NO AGITE. La colina que se desprende como resultado de la hidrlisis se descompone con formacin de trimetilamina. Esta ltima posee un olor caracterstico de salmuera de arenques y se reconoce fcilmente por este indicio. V. DETECCIN DE LOS CIDOS GRASOS Diluya el hidrolizado alcalino obtenido con 2ml de agua, aada 2 gotas de fenolftalena y agregue gota a gota HCl 50% hasta que vire el indicador, separe los cidos grasos que suben a la superficie por filtracin REPORTE: METODO 1.- Objetivo, observaciones, conclusin. METODO 2.- Objetivo, observaciones, conclusin. Por qu precipitan las lecitinas en presencia de acetona? METODO 3.- Objetivo, observaciones, conclusin. Por qu el cadmio precipita las fosfatidilcolinas? METODO 4.- Objetivo, observaciones, conclusin. Escribir la frmula de la trimetilamina y de la colina METODO 5.- Objetivo, observaciones, conclusin. Por qu se separan los cidos grasos? CUESTIONARIO: 1. Escriba la clasificacin de los cidos grasos. 2. Escriba la frmula de la fosfatidilcolina. 3. Escriba en qu organelos celulares se encuentran los lpidos compuestos.

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DETECCIN DE COLESTEROL EN CEREBRO

INTRODUCCION. El colesterol (cuyo nombre qumico es 3-hidroxi-5,6-colesteno) es el esteroide ms comn. Se encuentra ampliamente distribuido en todas las clulas del organismo, pero especialmente en las del tejido nervioso -cerebro y mdula espinal. Es el precursor de las sales biliares, el cual se produce en el hgado y se almacena en la vescula biliar. Tambin es el precursor de la vitamina D y de la pregnenolona, sustancia vital en la produccin de todas las hormonas sexuales humanas (andrgenos, estrgenos y progestgenos) y otras ms igualmente importantes (glucocorticoides y mineralocorticoides). En las membranas celulares de los mamferos, el colesterol forma complejos con las protenas y los fosfolpidos, y gracias a su sistema de anillos fusionados modula la fluidez de las membranas. OBJETIVO. Detectar la presencia de colesterol en clulas del Sistema Nervioso Central mediante las reacciones de Schiff y de Salkovsky. MATERIAL. 1 gradilla. 1 mortero con mango. 1 crculo de papel filtro. 1 embudo. Estufa a 40 0 C 3 tubos de ensayo de 20X15 (dos) y 15X13 (uno). 3 pipetas (1 de 5 ml y las otras de 1 2 ml). Material que debe traer el alumno: Bistur o navaja. 1 placa de vidrio de 10 por 10 cm. 1 abate lenguas o esptula metlica Yeso MATERIAL BIOLGICO El alumno deber traer 2 g de sesos de pollo (aproximadamente el de 1 cabeza). Todo el grupo puede ponerse de acuerdo y cambiar a sesos de res, el cual es mucho ms grande y puede alcanzar hasta para dos grupos.

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REACTIVOS. H2SO4 Concentrado Acido actico glacial. Cloroformo. DESARROLLO 1. Se pesan 2 g de sesos y se desmenuzan lo ms posible con la navaja en el mortero. Se aaden 4 g de yeso y se trituran con los sesos usando el mango del mortero. 2. La masa obtenida se aplica con el abate lenguas o esptula sobre la placa de vidrio formando una capa fina, luego se seca en la estufa a 40 grados centgrados por un tiempo de 30 minutos o hasta un secado completo (masa totalmente blanca). 3. Una vez seca la masa se separa de la placa con la navaja o bistur y se coloca en el mortero limpio y completamente seco para triturarla hasta obtener polvo. 4. El polvo se coloca en un tubo de ensayo y se le agregan 4 ml de cloroformo. Se agita cuidadosamente por 5 minutos. 5. Posteriormente se filtra la mezcla anterior a otro tubo de ensaye. 6. Del filtrado anterior se toma 1 ml y se le coloca en 1 tubo de ensaye limpio y seco. 7. Al tubo anterior se le agrega 1 ml de cido sulfrico concentrado deslizndolo por las paredes. Observar la aparicin de un anillo coloreado. 8. La mezcla anterior se agita cuidadosamente. Al separarse la capa superior es roja y la inferior es roja amarillenta y con fluorescencia verde. Dichos colores se observan mejor con iluminacin solar. 9. A la capa inferior aadirle 1 ml de cido actico glacial y observar el cambio de color mientras que la fluorescencia contina. Si no se observa al Sol solo se ver un color verde seco y opaco, por lo cual se debe observar a la luz solar. CUESTIONARIO: 1. 2. 3. 4. Cul es el fundamento de la coloracin obtenida por el colesterol? En qu paso ya se tiene separado al colesterol? Cul es la funcin del yeso? Cmo puede observarse la fluorescencia?

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INFLUENCIA DE LA BILIS (SALES BILIARES) SOBRE LA TENSIN SUPERFICIAL DEL AGUA

INTRODUCCIN: En la naturaleza existen sustancias capaces de disminuir la tensin superficial de los lquidos. Ellas se denominan sustancias tensoactivas. Tales sustancias presentan molculas con carcter dipolar, es decir, una parte de la molcula es hidrfila y la otra hidrfoba. Estas molculas entran en interaccin molecular con el disolvente por su extremo hidrfilo, mientras que el otro extremo tiende a alejarse del lquido. Como resultado, las sustancias tensoactivas se acumulan en la capa superficial de la disolucin. Su extremo hidrfobo estar dirigido hacia afuera de la fase. Todo esto conduce a la disminucin de la tensin superficial de la solucin. Las sustancias tensoactivas juegan un papel de gran importancia en la naturaleza, ayudando a mezclar mejor los lquidos que generalmente no se mezclan. Por ejemplo agua y grasa. Son sustancias tensoactivas los jabones, los cidos grasos, aminocidos, sales biliares, etc. OBJETIVO: Demostrar la capacidad que tienen las sales biliares para disminuir la tensin superficial del agua. MATERIAL: 1 vaso de precipitado 2 tubos de ensaye 2 varillas de vidrio REACTIVOS: Alcanfor Bilis Flor de azufre Agua destilada

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DESARROLLO: 1. .- PRUEBA DEL ALCANFOR. a).- En un vaso de precipitado se vierten 200 250ml de agua, cuidadosamente se ponen en ella varios pedacitos de alcanfor. Los pedacitos de alcanfor se mueven rpidamente en la superficie del agua. Esto se explica por el hecho de que los diferentes lados del pedacito de alcanfor se disuelven en el agua con diferente velocidad y por lo tanto al rededor del pedacito se crea una tensin superficial desigual, de manera que el pedacito se traslada hacia donde la tensin superficial es ms alta. b).- Introduzca la varilla en la bilis y despus en el vaso donde est el alcanfor. El movimiento de los pedacitos de alcanfor cesa ya que bilis disminuye la tensin superficial. 2. PRUEBA DE LA FLOR DE AZUFRE: a).- Coloque en dos tubos de ensaye 3 4ml de agua destilada, a uno de los tubos agregue de 6 a 8 gotas de bilis. b).- Sobre la superficie de ambos tubos coloque una pequea cantidad de flor de azufre. Observe la distribucin del azufre en ambos tubos. Cmo explica la diferencia entre ambos tubos? CUESTIONARIO: 1. 2. 3. 4. Defina tensin superficial. Qu es un agente tensoactivo? Escriba los nombres y frmulas de las sales biliares. Explique las funciones de las sales biliares.

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HIDRLISIS ENZIMTICA DE LOS LPIDOS

INTRODUCCIN: Las lipasas y las esterasas catalizan la hidrlisis de enlaces ster que se encuentran en un gran nmero de lpidos saponificables.
CH2 - O - CO - R R - OC - O - CH CH2 - OH R - OC - O - CH + 2 R - COOH

Lipasa
CH2 - O - CO - R CH2 - OH

Estas enzimas estn ampliamente distribuidas el la naturaleza y son especialmente importantes en el tracto gastrointestinal donde funcionan en la digestin y absorcin de grasas. Debido a que las grasas no son solubles en agua, las enzimas deben actuar en la interfase lpido-agua, lo cual trae como consecuencia una disminucin de la actividad enzimtica. Consecuentemente, ser necesario el empleo de los agentes emulsificantes tales como las sales biliares que producen a menudo una estimulacin marcada de la hidrlisis enzimtica de los lpidos, debido al incremento de la interfase lpido-agua. En la leche homogeneizada los glbulos de grasa estn en un estado muy finamente dividido y este material sirve como sustrato excelente para las lipasas. En este experimento se emplea como enzima una lipasa muy potente que se encuentra en el pncreas desecado. OBJETIVO: Demostrar la accin de la lipasa pancretica en presencia y ausencia de la bilis. MATERIAL: 8 matraces Erlen Meyer de 125 ml Pinza para bureta 1 pipeta de 10 ml 1 Pipeta de 1 ml REACTIVOS: Pancreatina al 1% en agua KOH 0.05 N El alumno deber traer: Leche homogeneizada Bilis. 1 pipeta de 5 ml 1 bureta de 25 ml 1 soporte universal termmetro y bao mara a 37 C

Etanol al 95% Fenolftalena

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MTODO: 1. Preparar una serie de matraces Erlen Meyer de acuerdo a la siguiente tabla: MATRAZ NMERO 2 3 4 5 5 5 5 5 1.5 0 0 30' 1.5 0 0 45' 1.5 0 1 15' 1.5 0 1 30'

REACTIVOS (ML) Leche homogeneizada Extracto neutro de pancreatina al 1% Extracto de pancreatina caliente a ebullicin por 3 minutos Bilis Tiempo de incubacin a 37C.

T1 5 0 1.5 0 45'

1 5 1.5 0 0 15'

6 5 1.5 0 1 45'

T2 5 0 1.5 1 45'

2. despus de que cada matraz ha cumplido su tiempo de incubacin, retirarlos del bao, adicionar 12.5 ml de alcohol al 95% y 3 gotas de fenolftalena y titular con una solucin de hidrxido de potasio 0.05 N. 3. Agitar el matraz durante la titulacin tan rigurosamente como sea posible, ya que la protena puede enmascarar los cidos grasos. 4. Titular cada matraz tan rpido como sea posible, contra un fondo blanco, debido a que la digestin por la lipasa contina durante la titulacin. RESULTADOS: a) Datos.- Restar del gasto de hidrxido de potasio de cada uno de los matraces el gasto de hidrxido de potasio del testigo. b) grficas
Gasto de KOH corregido 1,2,3. Gasto de KOH corregido 4,,5,6.

Tiempo de Hidrlisis

Tiempo de Hidrlisis

CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. 5. 6. Cul es la interpretacin de las grficas obtenidas? Cul es el objeto de agregar bilis en el experimento? Cmo se clasifican los lpidos? Cules son los cidos grasos ms importantes de la grasa humana? Cul es la importancia clnica de la lipasa en un diagnstico? Cul es la composicin y el funcionamiento del tejido adiposo?

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DETERMINACIN DE CUERPOS CETNICOS

INTRODUCCIN El hbito humano de consumir alimentos pocas veces al da (3 4) conduce a un proceso cclico de nutricin. En condiciones normales los combustibles empleados en los tejidos para obtener energa son: Glucosa, cidos grasos, cuerpos cetnicos y aminocidos. En caso de ayuno hay cambios que requieren de la adaptacin del organismo y esto trae como consecuencia modificaciones en los patrones metablicos y por lo tanto en las molculas utilizadas como combustibles. Durante las primeras etapas del ayuno se realizan cambios hormonales, se deja de liberar insulina y se aumenta la liberacin de glucagon, lo que ocasiona un aumento en la Glucogenlisis, estimulacin de la Liplisis, inhibicin de la sntesis de triacilglicridos, aumento de la Beta - oxidacin y produccin de cuerpos cetnicos (Cetognesis), si el ayuno es prolongado se presenta un desequilibrio entre el metabolismo de carbohidratos y el de lpidos lo que ocasiona que los niveles de cuerpos cetnicos se eleven en sangre y sean eliminados por orina donde son detectados fcilmente. OBJETIVO Demostrar la presencia de cuerpos cetnicos como consecuencia de un ayuno prolongado. MATERIAL: 2 Tubos de ensaye 1 Pipeta de 10 ml. 1 Pipeta de 2 5 ml MATERIAL BIOLGICO. La orina de animal en ayunas ser proporcionada por el bioterio Los alumnos debern traer orina de personas en ayuno de 8 horas (la primera del da), diabticas y normales. REACTIVOS: Reactivo de Imbert (Nitroprusiato de sodio al 5%) Amoniaco concentrado o Hidrxido de amonio concentrado

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DESARROLLO: 1. En un tubo de ensaye se colocan 2.5 ml de orina (Rata, perro o humana) y se agregan 10 gotas del reactivo de Imbert. Se mezcla. 2. Deslizando por las paredes del tubo se agrega 0.5 ml de Amoniaco o hidrxido de amonio para obtener una reaccin zonal. 3. Cuando la reaccin es positiva, en el punto de contacto aparece un anillo violeta cuya intensidad es proporcional a la cantidad de cuerpos cetnicos. CUESTIONARIO: 1. Qu nombre recibe la presencia de cuerpos cetnicos en sangre y orina cuando se encuentran en cantidades ms altas que las normales? 2. En qu condiciones metablicas se acumulan cuerpos cetnicos? 3. Cul es el fundamento de la prueba de Imbert?

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AISLAMIENTO DE RNA
INTRODUCCIN Los cidos nuclicos son polmeros de alto peso molecular, sus monmeros son nucletidos que se polimerizan al formar enlaces fosfodister 3' -- 5' Los cidos nuclicos presentes en las clulas son el cido Desoxirribonucleico (DNA) y el cido Ribonuclico (RNA) que desempean diferentes funciones, el DNA es el asiento de la informacin gentica; del RNA existen tres tipos: RNA mensajero (RNAm) que lleva la informacin del DNA a los ribosomas, RNA ribosomal (RNAr)que forma junto con las protenas a los ribosomas y RNA de transferencia (RNAt)responsable de trasladar a los aminocidos del citoplasma a los ribosomas. Cuando se trata de aislar RNA debe decidirse primero si se va a extraer RNA total o un tipo especial de RNA (RNAm, RNAr, RNAt), de esta decisin depender la tcnica a seguir. La extraccin de RNA total puede realizarse de dos formas diferentes, la primera usando NaCl, tcnica sencilla donde el RNA obtenido esta contaminado con DNA y por lo tanto no puede utilizarse para estudios que requieran precisin. La segunda tcnica es utilizando fenol, en donde el RNA que se obtiene es ms puro aunque a veces puede presentar una ligera contaminacin con polisacridos. OBJETIVO: Aislar RNA total de hgado de rata. FUNDAMENTO: TCNICA DEL FENOL.- El fenol es un agente desnaturalizante de protenas y que adems precipita al DNA dejando al RNA en la fase acuosa. REACTIVOS: fenol al 90% Etanol: agua (3:1) Acetato de potasio 20% (pH=5 ajustando con HCl) MATERIAL: Homogenizadora 12 tubos de ensaye 1 pipeta de 5 ml Centrfuga 1 embudo Etanol absoluto Hielo Eter (acetona)

2 pipetas Pasteur 1 vaso de precipitado de 250 ml Gasa 1 matraz Erlen Meyer de 125 ml Papel filtro

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El alumno deber traer: 1 rata de tamao considerable (en ayuno de 12 horas) 2 chuzos para las pipetas Pasteur. Equipo de diseccin (Pinzas, bistur, tijeras). 1recipiente pequeo (para hacer bao de hielo)

DESARROLLO: Antes de iniciar: a) . Pese el papel filtro y el vaso de precipitado. b) Ponga en el bao de hielo el vaso (pesado) y el matraz. 1. 2. 3. 4. Matar a la rata con ter Extraer rpidamente el hgado y colocarlo en el vaso de precipitado fro. Pesar exactamente el hgado. Con el vaso de precipitado dentro del bao de hielo corte con tijeras el hgado (lo

ms rpido que pueda). 5. Agregue 25 ml de agua destilada y homogeneice en el homogeneizador durante 1 minuto. 6. Filtre rpidamente sobre gasa doblada en cuatro al matraz fro. 7. Adicione 25 ml de fenol 90% y agite vigorosamente a temperatura ambiente (CUIDADO, el fenol causa graves quemaduras, en caso de que salpique lavarse con abundante agua). 8. Enfriar en el bao de hielo 5 minutos. 9. Traslade a tubos de ensaye, equilbrelos y centrifugue a 3000 r.p.m. durante 15 minutos . 10.Con ayuda de las pipetas Pasteur separe la capa superior y pngala en otro tubo, tire el precipitado. 11.Centrifugue el sobrenadante obtenido a 3000 r.p.m. durante 5 minutos. 12.Decante pasando al vaso de precipitado y mida el volumen obtenido. 13.Adicione por cada 10 ml de lquido 1 ml de acetato de potasio 20% (pH=5). 14.Enfre en el bao de hielo y agregue alcohol absoluto en relacin de 2 ml por ml medido (para precipitar el RNA). 15.Repartir en tubos de ensaye y centrifugar a 2000 r.p.m. 5 minutos (tire el sobrenadante ). 16.Resuspender el precipitado en 5 ml de una mezcla de etanol:agua (3:1) y centrifugar 5 minutos 2000 r.p.m. 17.Tire el sobrenadante y resuspenda con etanol absoluto y centrifugue 5 minutos a 2000 r.p.m. 18.Repetir el paso 17 ahora con ter (o acetona). 22

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19.Tire el sobrenadante, aada ter o acetona 1 2 ml para resuspender y vace al papel filtro (ya pesado). 20.Dejar secar al aire y pesar. 21.Calcule el rendimiento.

CUESTIONARIO: 1. 2. 3. 4. Cual es la composicin qumica del RNA?. Por qu el fenol desnaturaliza el DNA?. Cul es la funcin del acetato de potasio?. Cul es la funcin del etanol y el ter de los pasos 16 y 18?.

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AISLAMIENTO DE NUCLEOPROTENAS Y RECONOCIMIENTO DE DNA

INTRODUCCIN: Las nucleoprotenas son protenas compuestas constituidas de protenas como las histonas y protaminas conjugadas con cidos nucleicos. El DNA o cido desoxirribonucleico es un componente de los cromosomas del ncleo celular, el DNA es un polinucletido, las unidades que lo conforman, llamadas nucletidos estn constituidas por desoxirribosa, una base nitrogenada (que puede ser prica o pirimdica) y fosfato. Las nucleoprotenas de DNA son solubles en soluciones salinas concentradas, pero son insolubles en soluciones salinas diluidas. Una fuente importante de nucleoprotenas son los tejidos ricos en ncleos (leucocitos, espermatozoides, clulas hepticas, etc.). En soluciones salinas concentradas las desoxirribonucleoprotenas forman disoluciones muy viscosas y se solubilizan en soluciones salinas diluidas. Al ser precipitadas, las nucleprotenas se sedimentan en forma de hilos. Una de las tcnicas empleadas para diferenciar nucleoprotenas de DNA de las nucleoprotenas de RNA es la reaccin con difenilamina, que frente a las nucleoprotenas de DNA da una coloracin azul a diferencia del color verde que da frente a las nucleoprotenas de RNA OBJETIVOS Aislar desoxirribonucleoprotenas a partir de hgado de rata Realizar una reaccin de identificacin de DNA MATERIAL Hgado de rata Mortero con pistilo Vidrio de reloj Vaso de precipitado de 500 ml Vaso de precipitado de 250 ml Bureta Tubos para centrfuga Pinzas para tubo de ensaye Bao mara Gradilla Pipetas de 5 y 10 ml.

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REACTIVOS NaCl 1N Agua destilada Reactivo de difenilamina Na OH al 4% DESARROLLO. AISLAMIENTO DE NUCLEOPROTEINA DE DNA 1. Pese 10 gr. de hgado de rata 2. Tritrelo durante 10-15 min. en el mortero agregando poco a poco 70 ml de NaCl. 3. La disolucin viscosa obtenida transfirala a tubos para centrifuga 4. Centrifugue los tubos durante 10 min. a 2500 rpm 5. Decante el lquido sobre la probeta y mida el volumen obtenido 6. En el vaso de precipitado de 500 ml. Agregue agua destilada en una relacin de 6 ml de agua por ml de sobrenadante obtenido. 7. Vierta lentamente el sobrenadante en el agua que est en el vaso de precipitado y girando lentamente con la varilla de madera trate de enrollar los hilos de nucleoprotena de DNA que se va precipitando. REACCION DE RECONOCIMIENTO DE DNA 1. Filtre el precipitado de nucleoprotenas obtenido anteriormente 2. Tome una pequea cantidad del precipitado y disulvalo en un tubo de ensayo con 1 ml de NaOH al 4% 3. Aada 1 ml de reactivo de difenilamina y ponga el tubo durante 15 o 20 min. en bao mara hirviendo. 4. La aparicin de una coloracin azul indica la presencia de DNA CUESTIONARIO: 1. Escriba la estructura de los cuatro nucletidos que podemos encontrar en el DNA. 2. Qu funcin tienen los cromosomas? 3. Cul es la composicin de los cromosomas? 4. Qu diferencia existe entre los nucletidos de DNA y los de RNA?

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