Protena - Pgina 1

Este artculo est sobre una clase de biomolculas. Para las aplicaciones alternas, por ejemplo protena en nutricin, vea Protena (desambiguacin).

Protenas sea grande compuestos orgnicos hecho de aminocidos arreglado en una cadena linear y ensamblado junto cerca enlaces del peptide entre carboxyl y amino grupos de aminocido adyacente residuos. La secuencia de aminocidos en una protena es definida por a gene y codificado en cdigo gentico. Aunque este cdigo gentico especifica 20 los aminocidos estndares ms selenocysteine y - en cierto archaea - pyrrolysine, los residuos en una protena a veces qumicamente se alteran adentro modificacin poste-de translacin: cualquiera antes de la protena puede funcionar en clula, o como parte de mecanismos del control. Las protenas pueden tambin trabajar juntas para alcanzar una funcin particular, y se asocian a menudo para formar el establo complejos.[1]

Como otro biolgico macromolculas por ejemplo polisacridos y cidos nucleic, las protenas son partes esenciales de organismos y participan en cada proceso dentro clulas. Muchas protenas son enzimas eso catalice las reacciones bioqumicas y son vitales a metabolismo. Las protenas tambin tienen funciones estructurales o mecnicas, por ejemplo actinia y myosin en msculo y las protenas en citoesqueleto, de que forme un sistema andamio eso mantiene forma de la clula. Otras protenas son importantes adentro el sealar de la clula, inmunorespuestas, adherencia de la clula, y ciclo de la clula. Las protenas son tambin necesarias en las dietas de los animales, puesto que no pueden los animales sintetizan todos los aminocidos que necesitan y que deben obtener aminocidos esenciales del alimento. Con el proceso de digestin, los animales analizan la protena injerida en los aminocidos libres que entonces se utilizan en metabolismo.

La palabra protena viene de Griego palabra (prota), significando de importancia primaria. Las protenas primero fueron descritas y nombradas por el qumico sueco Jns Jakob Berzelius en 1838. Sin embargo, el papel central de protenas en organismos vivos no fue apreciado completamente hasta 1926, cuando James B. Sumner demostrado eso la enzima urease era una protena.[2] La primera protena que se ordenar era insulina, cerca Frederick Sanger, que gan el premio Nobel para este logro en 1958. Las primeras estructuras de la protena que se solucionarn incluidas hemoglobina y myoglobin, cerca Perutz mximo y Sir Juan Cowdery Kendrew, respectivamente, en 1958.[3][4] Las estructuras tridimensionales de ambas protenas primero fueron determinadas por anlisis de la difraccin de radiografa; Perutz y Kendrew compartieron el 1962 Premio Nobel en qumica para estos descubrimientos

Protena - Pgina 2

Las protenas son polmeros lineares construidos a partir del 20 diferente L- -aminocidos. Todos los aminocidos poseen caractersticas estructurales comunes, incluyendo carbn del a cul amino grupo, a carboxyl grupo, y una variable cadena lateral sea consolidado. Solamente el proline diferencia de esta estructura bsica mientras que contiene un anillo inusual al grupo de la amina del N-extremo, que fuerza el moiety de la amida de CO-NH en una conformacin fija.[5] Las cadenas laterales de los aminocidos estndares, detalladas en lista de aminocidos estndares, tenga diversas caractersticas qumicas que produzcan la estructura tridimensional de la protena y sean por lo tanto crticas a la funcin de la protena. Los aminocidos en una cadena del polipptido se ligan cerca enlaces del peptide formado en a reaccin de la deshidratacin. Ligado una vez en la cadena de la protena, un aminocido individual se llama a residuo, y las series ligadas de carbn, de nitrgeno, y de tomos de oxgeno se conocen como cadena principal o espina dorsal de la protena. El enlace del peptide tiene dos resonancia formas que contribuyen alguno doble-enlace el carcter e inhibe la rotacin alrededor de su eje, de modo que los carbones de la alfa estn spero coplanario. Los otros dos ngulos dihedral en el enlace del peptide determine la forma local asumida por la espina dorsal de la protena.

Debido a la estructura qumica de los aminocidos individuales, la cadena de la protena tiene direccionalidad. El extremo de la protena con un grupo carboxyl libre se conoce como C-trmino o trmino del carboxy, mientras que el extremo con un grupo amino libre se conoce como N-trmino o trmino amino.

Las palabras protena, polipptido, y peptide es un poco ambiguo y puede traslaparse en el significado. Protena se utiliza generalmente referir a la molcula biolgica completa en un establo conformacin, mientras que peptide es generalmente reservado para los oligomers de un aminocido del cortocircuito a menudo carecer una estructura tridimensional estable. Sin embargo, el lmite entre los dos no est bien definido y no miente generalmente cerca de 20-30 residuos.[6] Polipptido puede referir a cualquier sola cadena linear de aminocidos, generalmente sin importar longitud, pero implica a menudo una ausencia del definida conformacin.

Sntesis
Artculo principal: Biosntesis de la protena

Las protenas estn montadas de los aminocidos usando la informacin codificada adentro genes. Cada protena tiene su propia secuencia nica del aminocido que sea especificada por nucleotide secuencia del gene que codifica esta protena. cdigo gentico es un sistema de sistemas del tresnucleotide llamados codons y soportes para un aminocido, por ejemplo soportes de cada combinacin del tres-nucleotide de AGOSTO para methionine. Porque DNA contiene cuatro nucleotides, el nmero total de codons posibles es 64; por lo tanto, hay una cierta redundancia en

el cdigo gentico, con algunos aminocidos especificado por ms de un codon. Los genes codificados en la DNA son primeros transcrito en preRNA del mensajero (mRNA) por las protenas por ejemplo Polimerasa del RNA. La mayora de los organismos entonces procesan el pre-mRNA (tambin conocido como a transcripcin primaria) usando varias formas de modificacin del postetranscriptional para formar el mRNA maduro, que entonces es utilizado como plantilla para la sntesis de la protena por ribosome. En prokaryotes el mRNA se puede cualquiera utilizar tan pronto como se produzca, o limitar por un ribosome que se mueve despus lejos de nucleoid. En cambio, eukaryotes haga el mRNA en ncleo de la clula y entonces desplcelo a travs de membrana nuclear en citoplasma, donde sntesis de la protena entonces ocurre. El ndice de la sntesis de la protena es ms alto en prokaryotes que eukaryotes y puede alcanzar hasta 20 aminocidos por segundo.[7]

El proceso de sintetizar una protena de una plantilla del mRNA se conoce como traduccin. El mRNA se carga sobre el ribosome y es ledo tres nucleotides a la vez emparejando cada codon a su apareamiento bajo anticodon localizado en a RNA de la transferencia la molcula, que lleva el aminocido que corresponde al codon l reconoce. La enzima synthetase del tRNA del aminoacyl carga las molculas del tRNA con los aminocidos correctos. El polipptido creciente a menudo se llama cadena naciente. Las protenas son biosynthesized siempre de N-trmino a C-trmino.

El tamao de una protena sintetizada se puede medir por el nmero de aminocidos que contiene y por su total masa molecular, de que se divulga normalmente en unidades daltons (sinnimo con unidades de masa atmica), o el kilodalton derivado de la unidad (kDa). Levadura las protenas estn en el kDa 466 largos y 53 los aminocidos del promedio en masa.[6] Las protenas mayor conocidas son titins, un componente del msculo sarcomere, con una masa molecular del kDa casi 3.000 y una longitud total de casi 27.000 aminocidos.[8]

Sntesis qumica
Las protenas cortas se pueden tambin sintetizar qumicamente por una familia de los mtodos conocidos como sntesis del peptide, que confan encendido sntesis orgnica tcnicas por ejemplo ligadura qumica para producir los peptides en la alta produccin.[9] La sntesis qumica permite la introduccin de aminocidos no-naturales en cadenas del polipptido, tales como accesorio de fluorescente puntas de prueba a las cadenas laterales del aminocido.[10] Estos mtodos son tiles en laboratorio bioqumica y biologa de la clula, aunque generalmente no para los usos comerciales. La sntesis qumica es ineficaz para los polipptidos ms de largo que cerca de 300 aminocidos, y las protenas sintetizadas pueden no asumir fcilmente a su natural estructura terciaria. La mayora de los mtodos qumicos de la sntesis proceden de C-trmino al N-trmino, enfrente de la reaccin biolgica.

Estructura de protenas
Artculo principal: Estructura de la protena

La mayora de las protenas doblez en las estructuras de 3 dimensiones nicas. La forma en la cual una protena dobla naturalmente se conoce como su estado nativo. Aunque muchas protenas pueden doblar sin ayuda, simplemente a travs de las caractersticas qumicas de sus aminocidos, otros requiera la ayuda de molecular chaperones para doblar en sus estados nativos. Los bioqumicos refieren a menudo a cuatro aspectos distintos de la estructura de una protena:

Estructura primaria: secuencia del aminocido

Estructura secundaria: regularmente la repeticin de las estructuras locales se estabiliz cerca enlaces del hidrgeno. Los ejemplos mas comunes son hlice de la alfa y hoja beta.
[11]

Porque las estructuras secundarias son locales, muchas regiones de diversa estructura secundaria pueden estar presentes en la misma molcula de la protena.

Estructura terciaria: la forma total de una sola molcula de la protena; la relacin

espacial de las estructuras secundarias a una otra. La estructura terciaria es estabilizada generalmente por las interacciones nonlocal, lo ms comnmente posible la formacin de a base hidrofbica, pero tambin a travs puentes de la sal, enlaces del hidrgeno, enlaces de disulfuro, e iguale modificaciones poste-de translacin. El trmino estructura terciaria es de uso frecuente como sinnimo con el trmino doblez.

Estructura cuaternario: la forma o la estructura esa resulta de interaccin de ms de una molcula de la protena, llamado generalmente subunidades de la protena en este contexto, que funcionan como parte de la asamblea ms grande o complejo de la protena.

Las protenas no son molculas enteramente rgidas. Adems de estos niveles de la estructura, las protenas pueden cambiar de puesto entre varias estructuras relacionadas mientras que realizan su funcin biolgica. En el contexto de estos cambios funcionales, estas estructuras terciarias o cuaternarios se refieren generalmente como conformations, y las transiciones entre ellos se llaman cambios del conformational. Tales cambios son inducidos a menudo por el atascamiento de a substrato molcula a una enzima sitio activo, o la regin fsica de la protena que participa en catlisis qumica. En la solucin todas las protenas tambin experimentan la variacin en estructura con la vibracin termal y la colisin con otras molculas, considera la animacin a la derecha.

Protena - Pgina 4

Las protenas se pueden dividir informal en tres clases principales, que correlacionan con las estructuras terciarias tpicas: protenas globulares, protenas fibrosas, y protenas de la membrana. Casi todas las protenas globulares son soluble y muchas son enzimas. Las protenas fibrosas son a menudo estructurales; de la membrana de las protenas servicio a menudo como receptores o proporcione los canales para las molculas polares o cargadas para pasar a travs de la membrana de la clula.

Una caja especial de hidrgeno intramolecular enlaza dentro de las protenas, blindadas mal de ataque del agua y por lo tanto de promover sus el propios deshidratacin, se llaman dehydrons.

Determinacin de la estructura
Descubriendo la estructura terciaria de una protena, o la estructura cuaternario de sus complejos, puede proporcionar pistas importantes sobre cmo la protena realiza su funcin. Los mtodos experimentales comunes de determinacin de la estructura incluyen Cristalografa de la radiografa y Espectroscopia NMR, en que puede producir la informacin atmico resolucin. Microscopia de Cryoelectron se utiliza producir la informacin estructural de la bajo-resolucin sobre complejos muy grandes de la protena, incluyendo montado virus;[11] una variante conocida como cristalografa del electrn la poder tambin produce la informacin de alta resolucin en algunos casos, especialmente para los cristales de dos dimensiones de las protenas de la membrana.[12] Las estructuras solucionadas se depositan generalmente en Banco de datos de la protena (PDB), un recurso libremente disponible bajo la forma de de el cual los datos estructurales sobre millares de protenas se pueden obtener Coordenadas cartesianos para cada tomo en la protena.

Muchas ms secuencias del gene se saben que las estructuras de la protena. Adems, el sistema de estructuras solucionadas es en polarizacin negativa hacia las protenas que se pueden sujetar fcilmente a las condiciones requeridas adentro Cristalografa de la radiografa, uno de los mtodos principales de la determinacin de la estructura. Particularmente, las protenas globulares son comparativamente fciles a cristalcese con objeto de la cristalografa de la radiografa. Las protenas de la membrana, por el contrario, son difciles de cristalizarse y son underrepresented en el PDB.[13] Genomics estructural las iniciativas han procurado remediar estas deficiencias sistemticamente solucionando las estructuras representativas de las clases importantes del doblez. Prediccin de la estructura de la protena los mtodos procuran proporcionar medios de generar una estructura plausible para las protenas que estructuras no se han determinado experimental.

Funciones celulares Protena - Pgina 5

Las protenas son los principales agentes dentro de la clula, dicha para realizar los deberes especificados por la informacin codificada en genes.[6] A excepcin de ciertos tipos de RNA, la mayora de las otras molculas biolgicas son los elementos relativamente inertes sobre los cuales las protenas actan. Las protenas componen mitad del peso seco de Escherichia coli clula, mientras que otras macromolculas tales como DNA y RNA componen el solamente 3% y el 20%, respectivamente.[14] El sistema de protenas expresadas en una clula o un tipo particular de la clula se conoce como su proteome.

El jefe caracterstico de protenas que permite su sistema diverso de funciones es su capacidad de atar otras molculas especficamente y firmemente. La regin de la protena responsable de atar otra molcula se conoce como sitio obligatorio y est a menudo una depresin o un bolsillo en la superficie molecular. Esta capacidad obligatoria es mediada por la estructura terciaria de la protena, que define el bolsillo del sitio obligatorio, y por las caractersticas qumicas de las cadenas laterales de los aminocidos circundantes. El atascamiento de la protena puede ser extraordinario apretado y especfico; por ejemplo, inhibidor del ribonuclease lazos de la protena al ser humano angiogenin con un secundario-femtomolar constante de la disociacin (<10-15 M) pero no ata en todos a su homolog del anfibio onconase (>1 M). Los cambios qumicos extremadamente de menor importancia tales como la adicin de un solo grupo metlico a un socio obligatorio pueden ser suficientes a veces eliminar casi el atascamiento; por ejemplo, synthetase del tRNA del aminoacyl especfico al aminocido valine discrimina contra la cadena lateral muy similar del aminocido isoleucine.

Las protenas pueden atar a otras protenas as como a los substratos de la pequeo-molcula. Cuando las protenas atan especficamente a otras copias de la misma molcula, pueden oligomerize a las fibrillas de la forma; este proceso ocurre a menudo en las protenas estructurales que consisten en los monomers globulares que uno mismo-se asocian para formar fibras rgidas. interacciones de la Protena-protena tambin regule la actividad enzimtica, controlan la progresin con ciclo de la clula, y permita el montaje de grande complejos de la protena eso realiza muchas reacciones de cerca relacionadas con una funcin biolgica comn. Las protenas pueden tambin atar, o an se integren en, a las membranas de la clula. La capacidad de socios obligatorios de inducir cambios del conformational en protenas permite la construccin enormemente del complejo el sealar redes.

Enzimas
Artculo principal: Enzima

El papel ms conocido de protenas de la clula es su deber como enzimas, que catalice reacciones qumicas. Las enzimas son generalmente los catalizadores altamente especficos que aceleran

solamente uno o algunas reacciones qumicas. Las enzimas realizan la mayor parte de las reacciones implicadas adentro metabolismo y catabolismo, as como Rplica de la DNA, Reparacin de la DNA, y Sntesis del RNA. Algunas enzimas actan en otras protenas para agregar o para quitar a grupos qumicos en un proceso conocido como modificacin poste-de translacin. Cerca de 4.000 reacciones se saben para ser catalizadas por las enzimas.[15] La aceleracin de la tarifa confiri por catlisis enzimtica es a menudo enorme - tanto como 1017- doble el aumento en el excedente de la tarifa uncatalyzed la reaccin en el caso de decarboxylase del orotate (78 millones de aos sin la enzima, 18 milisegundos con la enzima).[16]

Las molculas limitadas y actuadas sobre por las enzimas se conocen como substratos. Aunque las enzimas pueden consistir en centenares de aminocidos, es generalmente solamente una fraccin pequea de los residuos que entran en contacto con el substrato, y una fraccin incluso ms pequea - 3-4 residuos en promedio que estn implicados directamente en catlisis.[17] La regin de la enzima que ata el substrato y contiene los residuos catalticos se conoce como sitio activo.

Protena - Pgina 6
El sealar de la clula y transporte del ligand
Muchas protenas estn implicadas en curso de el sealar de la clula y transduction de la seal. Algunas protenas, por ejemplo insulina, son las protenas extracelulares que transmiten una seal de la clula en la cual fueron sintetizados a otras clulas en distante tejidos finos. Otros son protenas de la membrana ese acto como receptores de quin funcin principal es atar una molcula que seala e induzca una respuesta bioqumica en la clula. Muchos receptores tienen un sitio obligatorio expuesto en la superficie de la clula y un dominio effector dentro de la clula, que puede tener actividad enzimtica o puede experimentar a cambio del conformational detectado por otras protenas dentro de la clula.

Anticuerpos son los componentes de protena de sistema inmune adaptante de quin funcin principal es atar antgenos, o las sustancias extranjeras en el cuerpo, y los apuntan para la destruccin. Los anticuerpos pueden ser secretado en el ambiente extracelular o anclado en las membranas de especializado Clulas de B conocido como clulas del plasma. Mientras que las enzimas son limitadas en su afinidad obligatoria para sus substratos por la necesidad de conducir su reaccin, los anticuerpos no tienen ningn tal apremio. La afinidad obligatoria de un anticuerpo a su blanco es extraordinario alta.

Muchas protenas del transporte del ligand atan biomolculas pequeas particulares y las transportan a otras localizaciones en el cuerpo de un organismo multicelular. Estas protenas deben tener una alta afinidad obligatoria cuando su ligand est presente en altas concentraciones, pero debe tambin lanzar el ligand cuando est presente en las concentraciones bajas en los

tejidos finos de la blanco. El ejemplo cannico de una protena ligand-que ata es hemoglobina, que transporta oxgeno de pulmones a otros rganos y tejidos finos en todos vertebrados y tiene cercano homologs en cada biolgico reino.

Protenas del Transmembrane la poder tambin sirve como protenas del transporte del ligand que alteren permeabilidad de la membrana de la clula a las molculas y a los iones pequeos. La membrana solamente tiene a hidrofbico base con la cual polar o las molculas cargadas no pueden difuso. Las protenas de la membrana contienen los canales internos que permiten que tales molculas incorporen y salgan de la clula. Muchos canal del ion las protenas se especializan para seleccionar para solamente un ion particular; por ejemplo, potasio y sodio los canales discriminan a menudo para solamente uno de los dos iones.

Protenas estructurales
Las protenas estructurales confieren tiesura y rigidez a los componentes biolgicos del si nolquido. La mayora de las protenas estructurales son protenas fibrosas; por ejemplo, actinia y tubulin es globulares y el soluble como monomers, pero polimercese para formar las fibras largas, tiesas que abarcan citoesqueleto, que permite que la clula mantenga su forma y tamao. Colgeno y elastin son los componentes crticos de tejido fino conectivo por ejemplo cartlago, y queratina se encuentra en estructuras duras o filamentosas por ejemplo pelo, clavos, plumas, enganches, y algunos cscaras animales.

Protena - Pgina 7

Otras protenas que sirven funciones estructurales son protenas del motor por ejemplo myosin, kinesin, y dynein, que son capaces de generar fuerzas mecnicas. Estas protenas son cruciales para celular motility de solo celled organismos y esperma de muchos organismos multicelulares sexual de reproduccin. Tambin generan las fuerzas ejercidas contrayendo msculos.

Mtodos de estudio
Artculo principal: Mtodos de la protena

Como algunas de las molculas biolgicas lo ms comnmente posible estudiadas, las actividades y las estructuras de protenas son ambos examinados in vitro y in vivo. In vitro los estudios de protenas purificadas en ambientes controlados son tiles para aprender cmo una protena realiza su funcin: por ejemplo, cintica de la enzima los estudios exploran mecanismo qumico de la actividad cataltica y de su afinidad relativa de una enzima para las varias molculas posibles del substrato. Por el contrario, in vivo los experimentos en las actividades de las protenas dentro de

las clulas o an dentro de organismos enteros pueden proporcionar la informacin complementaria sobre donde funciona una protena y cmo se regula.

Purificacin de la protena
Artculo principal: Purificacin de la protena

Para realizarse in vitro el anlisis, una protena se debe purificar lejos de otros componentes celulares. Este proceso comienza generalmente con lysis de la clula, en que se interrumpe la membrana de una clula y su contenido interno se lanza en una solucin conocida como a lysate crudo. La mezcla que resulta puede ser el usar purificado ultracentrifugacin, que fracciona los varios componentes celulares en las fracciones que contienen las protenas solubles; membrana lpidos y protenas; celular organelles, y cidos nucleic. Precipitacin por un mtodo conocido como salazn puede concentrar las protenas de este lysate. Varios tipos de cromatografa entonces se utilizan aislar la protena o las protenas del inters basadas en caractersticas tales como peso molecular, carga neta y afinidad obligatoria. El nivel de la purificacin se puede supervisar usando varios tipos de electrophoresis del gel si el peso molecular de la protena deseada y punto isoelctrico se saben, cerca espectroscopia si la protena tiene caractersticas espectroscpicas distinguibles, o cerca anlisis de enzima si la protena tiene actividad enzimtica. Adems, las protenas se pueden aislar acordando su carga[18] el usar electrofocusing.

Para las protenas naturales, una serie de pasos de la purificacin puede ser necesaria obtener la protena suficientemente pura para los usos del laboratorio. Para simplificar este proceso, ingeniera gentica es de uso frecuente agregar caractersticas qumicas a las protenas que las hacen ms fciles purificar sin afectar su estructura o actividad. Aqu, una etiqueta que consiste en una secuencia especfica del aminocido, a menudo una serie de histidine residuos (Suetiqueta), se une a un trmino de la protena. Consecuentemente, cuando el lysate se pasa sobre contener de la columna de la cromatografa nquel, los residuos del histidine ligan el nquel y lo unen a la columna mientras que untagged los componentes del paso del lysate sin obstculo.

Protena - Pgina 8
Localizacin celular
El estudio de protenas in vivo se trata a menudo a la sntesis y a la localizacin de la protena dentro de la clula. Aunque muchas protenas intracelulares se sintetizan en citoplasma y membrana-limite o secret las protenas en retculo endoplasmic, los especficos de cmo son las protenas apuntado a los organelles especficos o a las estructuras celulares es a menudo confuso. Una tcnica til para determinar la localizacin celular utiliza la ingeniera gentica para expresar

en una clula a protena de la fusin o quimera consistir en la protena natural del inters se lig a reporteropor ejemplo protena fluorescente verde (GFP). La posicin de la protena fundida dentro de la clula puede ser el usar limpio y eficientemente visualizado microscopia, segn las indicaciones de la figura enfrente de. En estos casos, las protenas quimricas fluorescentes adicionales se requieren generalmente para probar la localizacin deducida.

Otros mtodos para aclarar la localizacin celular de protenas requieren el uso de los marcadores de compartimiento sabidos para las regiones tales como ER, el Golgi, los lysosomes/las vacuolas, los mitochondria, los cloroplastos, la membrana del plasma, el etc. Con el uso de versiones fluorescently-marcadas con etiqueta de estos marcadores o de los marcadores sabidos de los anticuerpos, llega a ser mucho ms simple identificar la localizacin de una protena del inters. Por ejemplo, la inmunofluorescencia indirecta permitir el colocalization de la fluorescencia y la demostracin de la localizacin. Los tintes fluorescentes se utilizan para etiquetar los compartimientos celulares para un propsito similar.

Otras posibilidades existen, tambin. Por ejemplo, immunohistochemistry utiliza generalmente un anticuerpo a unas o ms protenas del inters que se conjuguen a las enzimas que rinden las seales luminiscentes o chromogenic que se pueden comparar entre las muestras, teniendo en cuenta la informacin de la localizacin.

Otra tcnica aplicable es cofractionation al usar de los gradientes de la sucrosa (o el otro material) centrifugacin isopycnic. Mientras que esta tcnica no prueba el colocalization de un compartimiento de la densidad sabida y de la protena del inters, aumenta la probabilidad, y es ms favorable a los estudios en grande.

Finalmente, el mtodo oro-estndar de localizacin celular es microscopia del immunoelectron. Esta tcnica tambin utiliza un anticuerpo a la protena del inters, junto con tcnicas clsicas de la microscopia electrnica. La muestra est preparada para la examinacin de microscopio electrnico normal, y despus tratada con un anticuerpo a la protena del inters que se conjuga a un material extremadamente electro-denso, generalmente oro. Esto permite la localizacin de ambos detalles ultraestructurales as como la protena del inters.

Con otro uso de la ingeniera gentica conocido como mutagnesis sitio-dirigida, los investigadores pueden alterar la secuencia de la protena y por lo tanto su estructura, localizacin celular, y susceptibilidad a la regulacin, que puede ser seguida in vivo por GFP que marca con etiqueta o in vitro por cintica de la enzima y estudios que atan.

Protena - Pgina 9

Proteomics y bioinformatics
Artculos principales: Proteomics y Bioinformatics

El complemento total de las protenas presentes a la vez en una clula o un tipo de la clula se conoce como su proteome, y el estudio de tales modems en grande define el campo de proteomics, nombrado por analoga al campo relacionado de genomics. Las tcnicas experimentales dominantes en proteomics incluyen 2.o electrophoresis, que permite la separacin de una gran cantidad de protenas, spectrometry total, que permite la identificacin rpida del alto-rendimiento de procesamiento de protenas y ordenar de peptides (lo ms a menudo posible despus digestin del en-gel), microarrays de la protena, que permiten la deteccin de los niveles relativos de una gran cantidad de protenas presentes en una clula, y investigacin del doshbrido, de que permite la exploracin sistemtica interacciones de la protena-protena. El complemento total de biolgico posible tales interacciones se conoce como interactome. Se conoce una tentativa sistemtica de determinar las estructuras de las protenas que representan cada doblez posible como genomics estructural.

La cantidad grande de datos genomic y proteomic disponibles para una variedad de organismos, incluyendo genoma humano, permite que los investigadores identifiquen eficientemente homlogo protenas en organismos distante relacionados cerca alineacin de la secuencia. Secuencia que perfila las herramientas puede realizar manipulaciones ms especficas de la secuencia por ejemplo enzima de la restriccin mapas, abra el marco de la lectura anlisis para nucleotide secuencias, y estructura secundaria prediccin. De estos datos rboles phylogenetic puede ser construido y evolutivo las hiptesis desarrolladas usando software especial tienen gusto ClustalW con respecto a la ascendencia de organismos modernos y de los genes expresan. El campo de bioinformatics las bsquedas a montar, anotan, y analizan los datos genomic y proteomic, aplicndose de cmputo tcnicas a los problemas biolgicos por ejemplo el encontrar del gene y cladistics.

Prediccin y simulacin de la estructura

Complementario al campo del genomics estructural, prediccin de la estructura de la protena intenta desarrollar maneras eficientes de proporcionar los modelos plausibles para las protenas que estructuras todava no se han determinado experimental. El tipo ms acertado de prediccin de la estructura, conocido como el modelar de la homologa, confa en la existencia de una estructura de la plantilla con semejanza de la secuencia a la protena que es modelada; la meta de los genomics estructurales es proporcionar la suficiente representacin en estructuras solucionadas para modelar la mayor parte de los que permanezcan. Aunque se ha sugerido producir modelos exactos sigue siendo un desafo cuando solamente las estructuras distante relacionadas de la plantilla estn disponibles, l que la alineacin de la secuencia es el

embotellamiento en este proceso, pues los modelos absolutamente exactos pueden ser producidos si se sabe una alineacin perfecta de la secuencia.[19] Muchos estructuran mtodos de la prediccin han servido para informar al campo que emerge ingeniera de la protena, en que la protena de la novela dobla se han diseado ya.[20] Un problema de cmputo ms complejo es la prediccin de interacciones intermoleculares, tales como adentro muelle molecular y prediccin de la interaccin de la protena-protena.

Los procesos del plegamiento y del atascamiento de la protena se pueden simular usando las tcnicas derivadas de dinmica molecular, que se aprovechan cada vez ms el computar distribuido como en Folding@Home proyecto. El plegamiento de los dominios alfa-helicoidales pequeos de la protena tales como bandido casco[21] y VIH protena accesoria[22] se han simulado con xito en silico, y mtodos hbridos con los cuales combine la dinmica molecular estndar mecnicos del quntum los clculos han permitido la exploracin de los estados electrnicos de rhodopsins.[23]

Protena - Pgina 10 Nutricin

Informacin adicional: Protena en nutricin

La mayora microorganismos y las plantas pueden biosynthesize el estndar 20 aminocidos, mientras que los animales, (seres humanos incluyendo) deben obtener algunos de los aminocidos del dieta.[14] Enzimas dominantes en los caminos biosintticos tales como los cuales sintetice ciertos aminocidos - aspartokinase, de que cataliza el primer paso en la sntesis lysine, methionine, y threonine de aspartate - no est presente en animales. Se refieren los aminocidos que no puede un organismo sintetizan en sus los propios como aminocidos esenciales. Si los aminocidos estn presentes en el ambiente, los microorganismos pueden conservar energa tomando los aminocidos de sus alrededores y downregulating sus caminos biosintticos.

En animales, los aminocidos se obtienen a travs de la consumicin de los alimentos que contienen la protena. Las protenas injeridas se analizan a travs digestin, que implica tpicamente desnaturalizacin de la protena con la exposicin a cido y hidrlisis por las enzimas llamadas proteases. Algunos aminocidos injeridos se utilizan para la biosntesis de la protena, mientras que otros se convierten a glucosa por gluconeognesis, o alimentado en ciclo del cido ctrico. Este uso de la protena como combustible es particularmente inferior importante hambre las condiciones como permite que propias protenas del cuerpo sean utilizadas para apoyar vida, particularmente sas encontraron adentro msculo.[24] Los aminocidos son tambin una fuente diettica importante de nitrgeno.

Historia
Informacin adicional: Historia de la biologa molecular

Las protenas fueron reconocidas como clase distinta de molculas biolgicas en el dcimo octavo siglo cerca Antoine Fourcroy y otros, distinguido por la capacidad de las molculas a coagule o flocule bajo tratamientos con calor o cido. Albmina incluida conocida de los ejemplos en ese entonces de blancos del huevo, sangre, albmina del suero, fibrin, y trigo gluten. Qumico holands Gerhardus Johannes Mulder realizado anlisis elemental de protenas comunes y encontrado que casi todas las protenas tenan igual frmula emprico. El trmino protena para describir estas molculas fue propuesto en 1838 por el asociado de Mulder Jns Jakob Berzelius. Mulder se encendi identificar los productos de la degradacin de la protena tales como aminocido leucine para cul l encontr el peso molecular de a (casi correcta) de 131 Da.

La dificultad en protenas de la purificacin en cantidades grandes las hizo muy difciles para que los bioqumicos tempranos de la protena estudien. Por lo tanto, los estudios tempranos se centraron en las protenas de las cuales podra ser purificado en las cantidades grandes, e.g., las sangre, clara de huevo, vario toxinas, y enzimas digestivas/metablicas obtenidas de mataderos. En los ltimos aos 50, Perro caliente Co. de la armadura purificado 1 kilogramo (= un milln miligramos) de bvidos puros de pancretico ribonuclease A y hecho le libremente disponible para los cientficos alrededor del mundo.

Protena - Pgina 11
Linus Pauling se acredita con la prediccin acertada de la protena regular estructuras secundarias basado encendido vinculacin del hidrgeno, una idea primero puesta adelante cerca Guillermo Astbury en 1933. Un trabajo ms ltimo cerca Walter Kauzmann en desnaturalizacin, basado en parte en estudios anteriores cerca Kaj Linderstrm-Lang, contribuido una comprensin de plegamiento de la protena y la estructura medi cerca interacciones hidrofbicas. En 1949 Fred Sanger determin correctamente la secuencia del aminocido de insulina, as concluyente demostrar que las protenas consistieron en los polmeros lineares de aminocidos ms bien que ramific las cadenas, coloides, o cyclols. Las primeras estructuras de la atmico-resolucin de protenas fueron solucionadas cerca Cristalografa de la radiografa en los aos 60 y cerca NMR en los aos 80. En fecha 2006, Banco de datos de la protena tiene casi 40.000 estructuras de la atmico-resolucin de protenas. En pocas ms recientes, microscopia del cryo-electrn de asambleas macromoleculares grandes y de cmputo prediccin de la estructura de la protena de la protena pequea dominios son dos mtodos que acercan a la resolucin atmica.

Referencias
1.
^ Maton, Anthea; Jean Hopkins, Charles Guillermo McLaughlin, Susan Johnson, Maryanna Quon Warner, David LaHart, Jill D. Wright (1993). Biologa y salud humanas. Acantilados de Englewood, New Jersey, los E.E.U.U.: Prentice Pasillo. ISBN 0-13-981176-1.

2. 3.

^ Sumner, JB (1926). "El aislamiento y la cristalizacin del Urease de la enzima. Papel preliminar". Biol Chem de J 69: 435-41. ^ Muirhead H, Perutz M (1963). Estructura de la hemoglobina. Una sntesis tridimensional de fourier de la hemoglobina humana reducida en 5.5 resoluciones de A ". Naturaleza 199 (4894): 633-8. PMID 14074546.

4.

^ Kendrew J, Bodo G, Dintzis H, Parrish R, Wyckoff H, D Phillips (1958). Un modelo tridimensional de la molcula del myoglobin obtenida por anlisis de la radiografa. Naturaleza 181 (4610): 662-6. doi:10.1038/181662a0. PMID 13517261.

5. 6. 7.

^ Nelson, D. L. y $cox, M. M. (2005) Principios de Lehninger de la bioqumica, 4ta edicin, W. H. Freeman y Company, Nueva York. ^
a b c

Lodish H, Berk A, Matsudaira P, Kaiser CA, Krieger M, P.M. de Scott, Zipurksy SL, Darnell J.

(2004). Biologa molecular de la clula 5to ed. WH Freeman y Company: Nueva York, NY. ^ Dobson CM. (2000). La naturaleza y la significacin del plegamiento de la protena. En Mecanismos del plegamiento de la protena 2do ed. Ed. Dolor el derecho. Fronteras en biologa molecular serie. Prensa de la universidad de Oxford: Nueva York, NY.

8. 9.

^ Fulton A, Isaacs W (1991). Titin, una protena sarcomeric enorme, elstico con un papel probable en morphogenesis. Bioessays 13 (4): 157-61. doi:10.1002/bies.950130403. PMID 1859393. ^ Bruckdorfer T, Marder O, Albericio F (2004). De la produccin de peptides en miligramo asciende para la investigacin a las cantidades de las multi-toneladas para las drogas del futuro. Curr Pharm Biotechnol 5 (1): 2943. doi:10.2174/1389201043489620. PMID 14965208.

10. ^ Schwarzer D, Cole P (2005). Semisynthesis de la protena y ligadura expresada de la protena:

persiguiendo la cola de una protena ". Biol de Curr Opin Chem 9 (6): 561-9. doi:10.1016/j.cbpa.2005.09.018. PMID 16226484.

11. ^

a b

Branden C, Tooze J. (1999). Introduccin a la estructura de la protena 2do ed. El publicar del Garland: Nueva York, NY

12. ^ Gonen T, Cheng Y, Sliz P, Hiroaki Y, Fujiyoshi Y, SC de Harrison, Walz T. (2005). Interacciones
lipidoprotenas en los cristales de dos dimensiones doble-acodados AQP0. Naturaleza 438 (7068): 633-8.

13. ^ Walian P, TA cruzada, Jap BK. (2004). Genomics estructural de las protenas de la membrana Biol
del genoma 5(4): 215.

14. ^

a b

Voet D, Voet JG. (2004). Bioqumica Vol. 1 3ro ed. Wiley: Hoboken, NJ.

15. ^ Bairoch A. (2000). "La base de datos de la ENZIMA en 2000". cidos Nucleic Res 28: 304305.
doi:10.1093/nar/28.1.304. PMID 10592255.

16. ^ Radzicka A, Wolfenden R. (1995). Una enzima perita.. Ciencia 6 (267): 90-3. PMID 7809611. 17. ^ El atlas cataltico del sitio en el instituto europeo de Bioinformatics 18. ^ Carga calculadora de la protena (punto isoelctrico) 19. ^ Zhang Y, Skolnick J. (2005). El problema de la prediccin de la estructura de la protena se poda
solucionar usando la biblioteca actual de PDB. Proc Acad nacional Sci los E.E.U.U. 102 (4): 1029-34.

20. ^ Kuhlman B, Dantas G, CROMATOGRAFA GASEOSA de Ireton, Varani G, Stoddard BL, panadero D.
(2003). Diseo de un doblez globular de la protena de la novela con exactitud del atmico-nivel. Ciencia 302 (5649): 1364-8.

21. ^ Zagrovic B, CD de la nieve, SR. de las camisas, Pande CONTRA (2002). Simulacin del plegamiento
de una protena alfa-helicoidal pequea en el detalle atomistic que usa computar mundial-distribuido. De Biol de J Mol 323 (5): 927-37.

22. ^ Herges T, Wenzel W. (2005). En el plegamiento del silico de una protena de tres hlices y de una
caracterizacin de su libre-energa ajardine en un campo de la fuerza del todo-tomo. Las revoluciones de Phys dejaron 94 (1): 018101.

23. ^ Hoffmann M, Wanko M, Strodel P, Konig pH, Frauenheim T, Schulten K, Thiel W, Tajkhorshid E,
Elstner M. (2006). Color que templa en rhodopsins: el mecanismo para la cambio espectral entre el bacteriorhodopsin y el rhodopsin sensorial II. J Chem Soc 128 (33): 10808-18.

24. ^ Brosnan J (2003). "Transporte del aminocido de Interorgan y su regulacin". J Nutr 133 (6 Suppl
1): 2068S-72S. PMID 12771367.

Acoplamientos externos

Protenas (el diario), tambin llamado protenas: Estructura, funcin, y Bioinformatics " y previamente protenas: Estructura, funcin, y gentica " (1986-1995).

Bases de datos y proyectos

Mquina segador de Bioinformatic Un Search Engine del Meta (29 bases de datos) para la informacin del gene y de la protena. El banco de datos de la protena (vase tambin Molcula de PDB del mes, presentando cuentas cortas en las protenas seleccionadas del PDB) Proteopedia - vida en 3D: modelo rotativo, zoomable 3D con las anotaciones del wiki para cada estructura molecular sabida de la protena.

UniProt el recurso universal de la protena

Atlas humano de la protena

iHOP - protenas excesivas de Hyperlinked de la informacin

Laboratorio del MIT para el Uno mismo-Montaje molecular de la protena

Base de datos de la protena de NCBI Entrez

Base de datos de la estructura de la protena de NCBI

Base de datos humana de la referencia de la protena

Proteinpedia humano

Folding@Home (universidad de Stanford)

Clases particulares y Web site educativos

Protenas: Biognesis a la degradacin - la biblioteca virtual de la biologa de la bioqumica y de la clula

v d e

Metabolismo del aminocido

Libro de datos de molculas - Home Page para aprender qumica ambiental

Protenas

Biosntesis de la protena - Modificacin de Posttranslational - Plegamiento de la protena Estructura de la protena - Dominios estructurales de la protena - El apuntar de la protena Proteome - Mtodos de la protena - Proteasome - Lista de tipos de protenas - Lista de protenas Protena de la membrana - Protena globular - Protena fibrosa
v

Protenas: llave mtodos del estudio

Purificacin de la protena - Protena fluorescente verde - Mancha blanca Experimental /negra occidental - Protena immunostaining - El ordenar de la protena Electrophoresis del gel/Electrophoresis de la protena - Inmunoprecipitacin de la protena - Huella dactilar total del Peptide

Prediccin de la estructura de la protena - muelle de la Protena-protena Bioinformatics Alineacin estructural de la protena - Ontology de la protena - prediccin de la interaccin de la Protena-protena

Anlisis
v

Anlisis de enzima - Anlisis de la protena - Anlisis de la secrecin

Protenas: enzimas

Asuntos

Sitio activo - Regulacin de Allosteric - Sitio obligatorio - Enzima cataltico perfecta Coenzima - Cofactor - Cooperativity - Nmero de la EC Catlisis de la enzima - Inhibidor enzimtico - Cintica de la enzima - Diagrama de

Lineweaver-Burk - Cintica de Michaelis-Menten - Lista de enzimas

Tipos

EC1 Oxidoreductases/lista - EC2 Transferases/lista - EC3 Hydrolases/lista EC4 Lyases/lista - EC5 Isomerases/lista - EC6 Ligases/lista

Protenas de citoesqueleto

Actinias - protenas Actinia-que atan - Actinin - Complejo Arp2/3 Microfilamentos Cofilin - Destrin - Gelsolin - Myosins - Profilin - Tropomodulin Troponin (T, C, I) - Tropomyosin - Protena del sndrome de Wiskott-Aldrich

tipo 1 y 2 (Cytokeratin, mecanografe I, tipo II) - tipo 3 (Desmin, Filamentos intermedios GFAP, Peripherin, Vimentin) - tipo 4 (Internexin, Nestin, Neurofilament, Synemin, Syncoilin) - tipo 5 (Lamin A, B)

Microtubules

Dyneins - Kinesins - Mapas (Protena de Tau, Dynamin) - Tubulins - Stathmin - Tektin

Catenins

Catenin de la alfa - Catenin beta - Plakoglobin (catenin gamma) Catenin del delta

Nonhuman

Protenas importantes de la esperma - Citoesqueleto de Prokaryotic (Crescentin, FtsZ, MreB)

Otro

APC - Dystrophin (Dystroglycan) - plakin (Desmoplakin, Plectin) Spectrin - Talin - Utrophin - Vinculin

Protenas: coagulacin

Factores de coagulacin

hemostasis primario: vWF

camino intrnseco: HMWK/Bradykinin - Kallikrein - Hageman/FXII - FXI - ARREGLO - FVIII

camino extrnseco: Factor/FIII del tejido fino - FVII

camino comn: FX - FV - (Favorable) trombina/FII, Fibrin/FI FXIII

Antithrombin (inhibe II, IX, X, XI, XII) - Protena C (inhibe V, Inhibidores VIII)/Protena S (cofactor para la protena C) - Protena Z (inhibe X) - ZPI (inhibe X, XI) - TFPI (inhibe III)

Fibrinolysis

Plasmin - tPA/urokinase - PAI-1/2 - 2-AP - 2-macroglobulin TAFI

Protena - Pgina 13
v

Protenas: sistema del complemento (C, L, A)

Activadores

CLA: C3-convertase - C5-convertase - MAC (C6, C7, C8, C9) - L: lectin Mannan-que ata - A: Factor P/Properdin

C: C1Q/C1R/C1S - C4 (C4a) - C2 - CLA: C3 (C3a, C3b/iC3b) Enzimas - C5 (C5a) - L: MASP1 - MASP2 - A: Factor B del complemento - Factor D

Inhibidores

CLA: C1-inhibitor - Factor de aceleracin del decaimiento Factor I - CL: C4BP - A: Factor H

Receptores del complemento

v

CR1 - CR2 - CR3 - CR4 - CD11b/CD11c/CD18 Anaphylatoxin (C3a, C5a)

Protenas: protenas del portador

Follistatin - Protena obligatoria de la hormona del crecimiento - Insulinacomo la protena obligatoria del factor del crecimiento - Neurophysins Hormona (Neurophysin I, II) Globulina obligatoria de la hormona del sexo/Protena obligatoria del andrgeno - Transcortin - globulina Thyroxine-que ata - Transthyretin

calcio (protena Calcio-que ata, protenas Calmodulin-que atan) - cobre Metal/elemento (Ceruloplasmin) - hierro (protenas Hierro-que atan, Receptor del Transferrin)

Vitamina

Protena obligatoria del retinol (4) - Transcobalamin

Protena del portador del Acyl - Protena del adaptador - Protena de la Otro transferencia de Cholesterylester - protena de la F-caja - protena GTPque ata - Protena obligatoria TGF-beta latente - Luz-cosechar el complejo - Protena del transporte de la membrana
v

Qumica alimenticia

Aadidos Carbohidratos Colorante Enzimas cidos grasos esenciales Sabores Lpidos Minerales Protenas Vitaminas Agua
v

Protena metabolismo: metabolismo de la protena

Sntesis de la protena - Sntesis del aminocido - Catabolismo Metabolismo del Nucleotide: Metabolismo del Purine - Salvamento del Nucleotide - Metabolismo del Pyrimidine

Purificacin de la protena - Pgina 1

Purificacin de la protena es una serie de procesos previstos para aislar un solo tipo de protena de una mezcla compleja. La purificacin de la protena es vital para la caracterizacin de la funcin, de la estructura y de las interacciones de la protena del inters. El material que comienza es generalmente a tejido fino biolgico o una cultura microbiana. Los varios pasos en el proceso de la purificacin pueden liberar la protena de una matriz que los lmites l, separen la protena y las partes sin protenas de la mezcla, y finalmente separen la protena deseada de el resto de las protenas. La separacin de una protena de todos los otras es tpicamente el aspecto ms laborioso de la purificacin de la protena. Los pasos de la separacin explotan diferencias de tamao de la protena, caractersticas fisicoqumicas y afinidad obligatoria.

Contenido

1 Propsito 2 Estrategias

3 Produccin de evaluacin de la purificacin

4 Purificacin de una protena marcada con etiqueta 5 Mtodos de purificacin de la protena

o o o

6 Extraccin

7 Precipitacin y solubilidad del diferencial 8 Ultracentrifugacin 9 Mtodos cromatogrficos

9.1 Cromatografa de la exclusin del tamao 9.2 Separacin basada en carga o hydrophobicity 9.3 Cromatografa de intercambio de ion

9.4 Cromatografa de la afinidad

9.4.1 Atascamiento del metal

9.4.2 Cromatografa de Immunoaffinity

o o o o o

9.5 HPLC

10 Concentracin de la protena purificada 10.1 Liofilizacin 10.2 Ultrafiltracin 11 Analtico

11.1 Electrophoresis de la Desnaturalizar-Condicin 11.2 Electrophoresis de la No-Desnaturalizar-Condicin

12 Referencias

13 Acoplamientos externos

Propsito
La purificacin puede ser preparatorio o analtico. Las purificaciones preparatorias apuntan producir una cantidad relativamente grande de protenas purificadas para el uso subsecuente. Los ejemplos incluyen la preparacin de productos comerciales por ejemplo enzimas (e.g. lactasa), protenas alimenticias (e.g. protena de soja aislante), y seguro biopharmaceuticals (e.g. insulina). La purificacin analtica produce una cantidad relativamente pequea de protena para una variedad de investigacin o de propsitos analticos, incluyendo la identificacin, la cuantificacin, y estudios del estructura de la protena, modificaciones poste-de translacin y funcin. Entre las primeras protenas purificadas estaban urease y Concanavalin A.

http://worldlingo.com/ma/enwiki/es/Protein_purification

Purificacin de la protena - Pgina 2 Estrategias

La opcin de un material que comienza es dominante al diseo de un proceso de la purificacin. En una planta o un animal, una protena particular no se distribuye generalmente homogneo a travs del cuerpo; los diversos rganos o tejidos finos tienen concentraciones ms altas o ms bajas de la protena. El uso solamente de los tejidos finos o de los rganos con la concentracin ms alta disminuye los volmenes necesitados para producir una cantidad dada de protena purificada. Si la protena est presente en abundancia baja, o si tiene un de alto valor, los cientficos pueden utilizar DNA recombinant la tecnologa para desarrollar las clulas que producirn cantidades grandes de la protena deseada (esto se conoce como sistema de la expresin). La expresin Recombinant permite que la protena sea marcada con etiqueta, e.g. por a Su-etiqueta, para facilitar la purificacin, que significa que la purificacin se puede hacer en pocos pasos. Adems, la expresin recombinant comienza generalmente con una fraccin ms alta de la protena deseada que presente en una fuente natural.

Una purificacin analtica utiliza generalmente tres caractersticas para separar las protenas. Primero, las protenas se pueden purificar segn sus puntos isolectric funcionndolos a travs de un gel calificado pH o de una columna del intercambio de ion. En segundo lugar, las protenas se pueden separar segn su tamao o peso molecular va la cromatografa de la exclusin del tamao o cerca SDS-PAGE (anlisis del sulfato-polyacrylamide del sodio del electrophoresis dodecyl del gel). Las protenas son purificadas a menudo usando 2D-PAGE y entonces se analizan cerca huella dactilar total del peptide para establecer la identidad de la protena. Esto es muy til para los propsitos cientficos y los lmites de deteccin para la protena son hoy en da mismo punto bajo y las cantidades del nanogram de protena son suficientes para su anlisis.

Produccin de evaluacin de la purificacin

El mtodo ms general para supervisar el proceso de la purificacin est funcionando a SDS-PAGE de los diversos pasos. Este mtodo da solamente una medida spera de las cantidades de diversas protenas en la mezcla, y no puede distinguir entre las protenas con similar peso molecular.

Si la protena tiene distinguir espectroscpico caracterstica o actividad enzimtica, esta caracterstica se puede utilizar para detectar y para cuantificar la protena especfica, y para seleccionar as las fracciones de la separacin, que contiene la protena. Si los anticuerpos contra

la protena entonces estn disponibles el borrar occidental y ELISA la poder detect y cuantifica especficamente la cantidad de protena deseada. Funcin de algunas protenas como receptores y puede ser detectado durante pasos de la purificacin por a atascamiento del ligand anlisis, usando a menudo a ligand radiactivo.

Para evaluar el proceso de la purificacin multistep, la cantidad de la protena especfica tiene que ser comparada a la cantidad de protena total. El ltimo se puede determinar por Anlisis de la protena total de Bradford o por la absorbencia de la luz en 280 nanmetro, no obstante algunos reactivo usados durante el proceso de la purificacin pueden interferir con la cuantificacin. Por ejemplo, imidazole (de uso general para la purificacin de protenas recombinant polyhistidinemarcadas con etiqueta) es un aminocido anlogo y en las concentraciones bajas interferir con el anlisis cido bicinchoninic (BCA) para la cuantificacin de la protena total. Las impurezas en imidazole de calidad inferior tambin absorbern en 280 nanmetro, dando por resultado una lectura inexacta de la concentracin de la protena de la absorbencia UV.

Purificacin de la protena - Pgina 3 Purificacin de una protena marcada con etiqueta

Adicin de una etiqueta a la protena por ejemplo RuBPS da a protena una afinidad obligatoria que no tendra de otra manera. La protena recombinant es generalmente la nica protena en la mezcla con esta afinidad, que ayuda en la separacin. La etiqueta ms comn es Histidineetiqueta (Su-etiqueta), eso tiene afinidad hacia nquel o cobalto iones. As por los iones de inmovilizacin del nquel o del cobalto en una resina, una ayuda de la afinidad que ata especficamente a las protenas histidine-marcadas con etiqueta puede ser creada. Puesto que la protena es el nico componente con una Su-etiqueta, el resto de las protenas pasarn a travs de la columna, y salen de la protena Su-marcada con etiqueta limitada a la resina. La protena se lanza de la columna en un elution llamado de proceso, que en este caso implica el agregar del imidazole, para competir con las Su-etiquetas para el atascamiento del nquel, pues tiene una estructura del anillo similar al histidine. La protena del inters ahora es el componente de protena principal en la mezcla enjuagada, y se puede separar fcilmente de cualquier contaminante indeseado de menor importancia por un segundo paso de la purificacin, por ejemplo cromatografa de la exclusin del tamao o RP-HPLC.

Otra manera de marcar las protenas con etiqueta es agregar antgeno el peptide a la protena, y entonces purifica la protena en contener de la columna inmovilizado anticuerpo. Esto genera una interaccin muy especfica que ata generalmente solamente la protena deseada.

Cuando las etiquetas no se necesitan ms, pueden ser hendidas apagado por un protease. Esto implica a menudo el dirigir de a protease sitio de la hendidura entre la etiqueta y la protena.

Mtodos de purificacin de la protena

Los mtodos usados en la purificacin de la protena, se pueden dividir spero en mtodos analticos y preparatorios. La distincin no es exacta, pero el factor que decide es la cantidad de protena, que se puede purificar prcticamente con ese mtodo. Los mtodos analticos apuntan detectar e identificar una protena en una mezcla, tales como donde como mtodos preparatorios apuntan producir las cantidades grandes de la protena para otros propsitos, biologa estructural o uso industrial. Los mtodos preparatorios se pueden utilizar generalmente en los usos analticos, pero no la otra manera alrededor.

Purificacin de la protena - Pgina 4 Extraccin

Dependiendo de la fuente, la protena tiene que ser trada en la solucin rompiendo el tejido fino o las clulas que la contienen. Hay varios mtodos para alcanzar esto: El congelar repetido y el deshelar, sonication, homogeneizacin por alta presin o el permeabilization por los solventes orgnicos. El mtodo de opcin depende de cmo es frgil es la protena y de cmo es robusto son las clulas. Despus de este proceso de la extraccin las protenas solubles estarn en el solvente, y se pueden separar de las membranas de la clula, DNA etc. por la centrifugacin. De la extraccin del proceso los extractos tambin proteases, que comenzar a digerir las protenas en la solucin. Si la protena es sensible al proteolysis, es generalmente deseable proceder rpidamente, y mantiene el extracto refrescado, para retrasar proteolysis.

Precipitacin y solubilidad del diferencial

En la purificacin a granel de la protena, un primer paso comn a las protenas del aislante est precipitacin con sulfato del amonio (NH4)2TAN4. Esto es realizada agregando cantidades de aumento de sulfato del amonio y recogiendo las diversas fracciones de la protena del precipitado. Una ventaja de este mtodo es que puede ser realizada econmicamente con los volmenes muy grandes.

Las primeras protenas que se purificarn son protenas solubles en agua. Purificacin de protenas integrales de la membrana requiere la interrupcin del membrana de la clula para aislar cualquier una protena particular de otras que estn en el mismo compartimiento de la membrana. Una

fraccin particular de la membrana se puede aislar a veces primero, por ejemplo aislar mitochondria de las clulas antes de purificar una protena situada en una membrana mitochondrial. A detergente por ejemplo sulfato dodecyl de sodio (SDS) puede ser utilizado disolver las membranas de la clula y mantener las protenas de la membrana la solucin durante la purificacin; sin embargo, porque causas del SDS desnaturalizacin, detergentes ms suaves por ejemplo Tritn X-100 o GRIETAS puede ser utilizado conservar la conformacin nativa de la protena durante la purificacin completa.

Purificacin de la protena - Pgina 5 Ultracentrifugacin

Artculo principal: Ultracentrifugadora

Centrifugacin es un proceso que utiliza fuerza centrfuga separar mezclas de las partculas de masas o de densidades que variaban suspendi en un lquido. Cuando un recipiente (tpicamente un tubo o una botella) que contiene una mezcla de las protenas o de la otra materia de partculas, tal como clulas bacterianas, se rota a las altas velocidades, el mpetu angular rinde una fuerza exterior a cada partcula que sea proporcional a su masa. La tendencia de una partcula dada al movimiento a travs del lquido debido a esta fuerza es compensada por la resistencia que el lquido ejerce en la partcula. El efecto neto de hacer girar la muestra en una centrifugadora es que las partculas masivas, pequeas, y densas se mueven hacia fuera ms rpidamente las partculas que menos masivas o las partculas con ms arrastran en el lquido. Cuando las suspensiones de partculas se hacen girar en una centrifugadora, una pelotilla puede formar en el fondo del recipiente que se enriquece para las partculas ms masivas con la friccin baja en el lquido. Las partculas restantes, no-condensadas todava restantes sobre todo en el lquido se llaman el flotante y se pueden quitar del recipiente para separar el supernatant de la pelotilla. El ndice de la centrifugacin es especificado por el angular aceleracin aplicado a la muestra, medida tpicamente con respecto a g. Si las muestras se centrifugan bastante tiempo, las partculas en el recipiente alcanzarn equilibrio en donde las partculas acumulan especficamente en un punto en el recipiente donde su densidad boyante se balancea con la fuerza centrfuga. Tal centrifugacin del equilibrio puede permitir la purificacin extensa de una partcula dada.

Centrifugacin del gradiente de la sucrosa - un gradiente linear de la concentracin del azcar (tpicamente sucrosa, glicerol, o medios basados silicona de un gradiente de densidad, como Percoll) se genera en un tubo tales que la concentracin ms alta est en el fondo y el ms bajo en tapa. Percoll es una marca registrada poseda por las compaas de GE Healthcare. Una muestra de la protena despus se acoda encima del gradiente y se hace girar a las altas

velocidades en ultracentrifugadora. Esto hace las macromolculas pesadas emigrar hacia el fondo del material que ms ligero del tubo ms rpidamente. Durante la centrifugacin en ausencia de la sucrosa, como partculas muvase ms lejos y ms lejos del centro de la rotacin, experimentan la fuerza cada vez ms centrfuga (cuanto ms lejos se mueven, ms rpidamente se mueven). El problema con esto es que la gama til de la separacin dentro del recipiente est restringida a una ventana observable pequea. Hacer girar una muestra no significa dos veces tan de largo que ir la partcula del inters dos veces tan lejos, de hecho, l ir perceptiblemente ms futura. Sin embargo, cuando las protenas se estn moviendo con un gradiente de la sucrosa, encuentran el lquido de la densidad y de la viscosidad de aumento. Un gradiente correctamente diseado de la sucrosa contrariar la fuerza centrfuga de aumento as que las partculas se mueven en la proporcin cercana al tiempo que han estado en el campo centrfugo. Las muestras se separaron por estos gradientes se refieren como centrifugaciones zonales de la tarifa. Despus de separar la protena/las partculas, el gradiente despus se fracciona y se recoge.

Mtodos cromatogrficos
Un protocolo de la purificacin de la protena contiene generalmente unos o ms pasos cromatogrficos. El procedimiento bsico en cromatografa es fluir la solucin que contiene la protena a travs de una columna embalada con los varios materiales. Diversas protenas obran recprocamente diferentemente con el material de la columna, y pueden ser separadas as para el momento en que estn requeridas para pasar la columna, o las condiciones requeridas enjuagar la protena de la columna. Las protenas se detectan generalmente mientras que estn saliendo la columna por su absorbencia en 280 nanmetro. Muchos diversos mtodos cromatogrficos existen:

Cromatografa de la exclusin del tamao

Artculo principal: Cromatografa de la impregnacin del gel

Purificacin de la protena - Pgina 6

Cromatografa puede ser utilizado separar la protena en la solucin o desnaturalizar condiciones usando los geles porosos. Se conoce esta tcnica como cromatografa de la exclusin del tamao. El principio es que molculas ms pequeas tienen que atravesar un volumen ms grande en una matriz porosa. Consequentially, protenas de cierta gama de tamao requerir un volumen variable del eluant (solvente) antes de ser recogido en el otro extremo de la columna del gel.

En el contexto de la purificacin de la protena, el eluant se rene generalmente en diversos tubos de prueba. Todos los tubos de prueba que no contienen ningn rastro mensurable de la protena

para purificar se desechan. La solucin restante se hace as de la protena para purificar y de cualquier otra protena similar-clasificada.

Separacin basada en carga o hydrophobicity Cromatografa de intercambio de ion

Artculo principal: Cromatografa de intercambio de ion

La cromatografa de intercambio de ion separa compuestos segn la naturaleza y el grado de su carga inica. La columna que se utilizar se selecciona segn su tipo y fuerza de la carga. Las resinas del intercambio de aniones tienen una carga positiva y se utilizan conservar y separar compuestos negativamente cargados, mientras que las resinas del intercambio catinico tienen una carga negativa y se utilizan separar las molculas positivamente cargadas.

Antes de que la separacin comience un almacenador intermediario se bombea a travs de la columna para equilibrear los iones cargados de oposicin. Sobre la inyeccin de la muestra, las molculas del solute intercambiarn por los iones del almacenador intermediario como cada uno compite para los sitios obligatorios en la resina. La longitud de la retencin para cada solute depende de la fuerza de su carga. Los compuestos lo ms dbil posible cargados se enjuagarn primero, seguido por sos con cargas sucesivamente ms fuertes. Becauses de la naturaleza del mecanismo de separacin, el pH, el tipo del almacenador intermediario, la concentracin del almacenador intermediario, y la temperatura toda desempean papeles importantes en controlar la separacin.

Purificacin de la protena - Pgina 7

La cromatografa de intercambio de ion es una herramienta muy de gran alcance para el uso en la purificacin de la protena y se utiliza con frecuencia en separaciones analticas y preparatorias.

Cromatografa de la afinidad
Artculo principal: Cromatografa de la afinidad

La cromatografa de la afinidad es una tcnica de la separacin basada sobre la conformacin molecular, que utiliza con frecuencia las resinas del especfico del uso. Estas resinas tienen ligands unidos a sus superficies que sean especficas para que los compuestos sean separados. Lo ms frecuentemente, estos ligands funcionan en una manera similar a la de las interacciones del anticuerpo-antgeno. Esta cerradura y llave cupo entre el ligand y su compuesto de la blanco le

hace altamente el especfico, generando con frecuencia un solo pico, mientras que es todo en la muestra unretained.

Muchas protenas de la membrana son glicoprotenas y puede ser purificado cerca lectin cromatografa de la afinidad. las protenas Detergente-solubilized se pueden permitir atar a la cromatografa una resina que se ha modificado para tener un lectin covalente unido. Las protenas que no atan al lectin se lavan lejos y despus limitan especficamente las glicoprotenas pueden ser enjuagadas agregando una alta concentracin de un azcar que compita con las glicoprotenas encuadernadas en el sitio obligatorio del lectin. Algunos lectins tienen alta afinidad el atar a oligosaccharides de glicoprotenas que es duro de competir con las azcares, y limite las glicoprotenas necesitan ser lanzados desnaturalizando el lectin.

Atascamiento del metal

Artculo principal: Polyhistidine-etiqueta

Una tcnica comn implica el dirigir de una secuencia de 6 a 8 histidines en C-terminal de la protena. Los lazos del polyhistidine fuertemente a bivalente metal iones por ejemplo nquel y cobalto. La protena se puede pasar a travs de una columna que contiene los iones inmovilizados del nquel, que ata la etiqueta del polyhistidine. Todos untagged el paso de las protenas a travs de la columna. La protena se puede enjuagar con imidazole, que compite con la etiqueta del polyhistidine para atar a la columna, o por una disminucin del pH (tpicamente a 4.5), que disminuye la afinidad de la etiqueta para la resina. Mientras que este procedimiento se utiliza generalmente para la purificacin de protenas recombinant con una etiqueta dirigida de la afinidad (tal como una etiqueta 6xHis o etiqueta del SOMBRERO de Clontech), puede tambin ser utilizado para las protenas naturales con una afinidad inherente para los cationes bivalentes.

Purificacin de la protena - Pgina 8

Cromatografa de Immunoaffinity
Artculo principal: Cromatografa de Immunoaffinity

La cromatografa de Immunoaffinity utiliza el atascamiento especfico del anticuerpo a la protena de la blanco para purificar selectivamente la protena. El procedimiento implica el inmovilizar de un anticuerpo a un material de la columna, que entonces ata selectivamente la protena, mientras que todo atraviesa. La protena puede ser enjuagada cambiando pH o salinidad. Porque este mtodo no implica la ingeniera en una etiqueta, puede ser utilizado para las protenas de fuentes naturales.[1]

HPLC
Artculo principal: Cromatografa lquida del alto rendimiento

La cromatografa lquida del alto rendimiento o la cromatografa lquida de alta presin es una forma de cromatografa que aplica alta presin para conducir los solutes a travs de la columna ms rpidamente. Esto significa que la difusin es limitada y la resolucin est mejorada. La forma ms comn es hplc inverso, donde est el material de la columna hidrofbico. Las protenas son enjuagadas por a gradiente de cantidades de aumento de solvente orgnico, por ejemplo el acetonitrile. Las protenas se enjuagan segn su hydrophobicity. Despus de purificacin de HPLC la protena est en una solucin que contenga solamente voltil los compuestos, y pueden ser liofilizados fcilmente.[2] La purificacin del HPLC da lugar a la desnaturalizacin de las protenas purificadas y no es con frecuencia as aplicable a las protenas que no lo hacen espontneamente refold.

Concentracin de la protena purificada Purificacin de la protena - Pgina 9

En el final de una purificacin de la protena, la protena tiene que ser concentrada a menudo. Diversos mtodos existen.

Liofilizacin
Si la solucin no contiene ningn otro componente soluble que la protena en la pregunta la protena puede ser liofilizado (secado). Esto se hace comnmente despus de que un funcionamiento del HPLC. Esto quita simplemente todo el componente voltil que sale de las protenas detrs.

Ultrafiltracin
La ultrafiltracin concentra una solucin de la protena usando las membranas permeables selectivas. La funcin de la membrana es dej el agua y las molculas pequeas pasar a travs mientras que conserva la protena. La solucin es forzada contra la membrana por la presin mecnica de la bomba o de gas o la centrifugacin.

Purificacin de la protena - Pgina 10

Analtico
Electrophoresis de la Desnaturalizar-Condicin
Electrophoresis del gel es una tcnica de laboratorio comn que puede ser uso como mtodo preparatorio y analtico. El principio de electrophoresis confa en el movimiento de un ion cargado en un campo elctrico. En la prctica, las protenas se desnaturalizan en una solucin que contiene un detergente (SDS). En estas condiciones, las protenas se revelan y estn cubiertas con las molculas detergentes negativamente cargadas. Las protenas adentro SDS-PAGE se separan sobre la base nica de su tamao.

En mtodos analticos, la protena emigra como vendas basadas en tamao. Cada venda se puede detectar el usar de manchas por ejemplo Coomassie tinte azul o mancha de plata. Los mtodos preparatorios para purificar cantidades grandes de protena, requieren la extraccin de la protena del gel electrophoretic. Esta extraccin puede implicar la supresin del gel que contiene una venda, o enjuagando la venda directamente del gel mientras que escurr el extremo del gel.

En el contexto de una estrategia de la purificacin, desnaturalizar electrophoresis de la condicin proporciona una resolucin mejorada sobre la cromatografa de la exclusin del tamao, pero no la escala a la cantidad grande de protenas en una muestra as como el atrasado columnas de la cromatografa.

Electrophoresis de la No-Desnaturalizar-Condicin

Purificacin de la protena - Pgina 11

Un procedimiento electrophoretic no-que desnaturaliza importante para aislar metalloproteins bioactive en mezclas complejas de la protena se llama 'electrophoresis continuo nativo cuantitativo del gel de polyacrylamide (QPNC-PAGE).

Referencias
1. 2.
^ Cromatografa de Immunoaffinity de enzimas Ehle H, cuerno A. Bioseparation. 1990; 1 (2): 97-110. ^ Cromatografa lquida de alto rendimiento de biopolmeros Ciencia del FE de Regnier. 21 Oct 1983; 222 (4621): 245-52

Acoplamientos externos

Purificacin de la protena: Cromatografa de columna - intercambio de ion; Dilisis y concentracin

Expresin Recombinant de la protena Purificacin de la protena en un da Facilidad de la purificacin de la protena

Inmunoprecipitacin - Pgina 1
Inmunoprecipitacin (IP) es la tcnica de precipitacin antgeno fuera de usar de la solucin anticuerpo especfico a ese antgeno. Este proceso se puede utilizar para enriquecer una protena dada a un cierto grado de pureza o para concentrar una protena de la bajo-abundancia. Coinmunoprecipitacin puede identificar protenas que obran recprocamente o complejos de la protena presentes en extractos de la clula.

Selectivamente apuntando una protena sabida que se cree para ser miembro de un complejo ms grande de protenas, un tirn de la poder (en principio) el complejo entero de la protena fuera de la solucin. Este concepto de tirar de los complejos de protenas que obran recprocamente mltiples fuera de la solucin immunoprecipitating a un solo miembro del complejo de la protena se refiere simplemente regularmente como pull-down. En prctica real, uno no espera poder a pull-down e identificar realmente apenas a todos los miembros de un complejo en un solo pulldown. Una estrategia tpica sera realizar el pull-down, identifica a nuevos miembros del complejo y despus realiza una nueva serie de inmunoprecipitaciones en donde apuntan a los miembros nuevamente identificados para la inmunoprecipitacin. Esta estrategia dar lugar a menudo al descubrimiento de an ms miembros del complejo tan bien como resultado en el redescubrimiento de la protena originalmente apuntada, un vaildation importante que usted est trabajando con el complejo correcto.

Los complejos de la protena, limitados una vez al anticuerpo especfico, son quitados de la solucin a granel por captura con una protena anticuerpo-que ata unida a una ayuda slida. La ayuda slida ha sido histricamente alto-porosa microscpico agarose granos (mezclas). Ms recientemente, monosized granos superparamagnetic han estado disponible como material de ayuda que ofrece ciertas ventajas nicas sobre los granos porosos del agarose tales como la capacidad de atar complejos ms grandes (todo el atascamiento ocurre en la superficie del grano), una cintica obligatoria ms rpida (los complejos de la protena no tienen que penetrar en una superficie porosa) as como el fondo disminuido (pocos positivos falsos).

Hay dos estrategias generales disponibles para la inmunoprecipitacin real. Los anticuerpos que atan a la protena que se precipitar pueden cualquiera ser i) agregado directamente a la solucin que contiene la mezcla o ii de la protena) incubado con los granos y permitido para atar

a los granos siguieron por la incubacin con los granos encuadernados del anticuerpo con la solucin de protenas. En el primer panorama una vez que los anticuerpos se hayan dado suficiente hora de atar a sus protenas de la blanco, los granos se agregan a la solucin y los anticuerpos entonces adherirn a los granos. En el segundo panorama, los granos con los anticuerpos encuadernados se agregan a la muestra y se incuban para permitir atar de la protena o de los complejos de protenas a los anticuerpos inmovilizados. El panorama da el mismo resultado final con la protena o los complejos de la protena limitados a los anticuerpos que ellos mismos se inmovilizan en los granos de la opcin (sean agarose o monodisperse del sepharose superparamagnetic). Las protenas anticuerpo-que atan (Protena A, Protena G, Protena L) fueron aislados de bacterias y reconocen inicialmente una variedad amplia de anticuerpos, aunque cada uno tiene su propia especificidad.

Despus de la captura inicial de una protena o de un complejo de la protena, la ayuda slida se lava varias veces en un intento por quitar cualquier protena no especficamente y limitar firmemente a la ayuda a travs del anticuerpo. Despus de lavarse, se enjuagan las protenas precipitadas y el usar analizado electrophoresis del gel, spectrometry total, el borrar occidental, o cualquier nmero de otros mtodos para identificar componentes en el complejo. As, la coinmunoprecipitacin es un mtodo estndar para determinar interacciones de la protena-protena.

La inmunoprecipitacin es muy til adentro inmunoprecipitacin del chromatin, de que permite anlisis DNA secuencias limitadas a histonas u otro chromatin componentes.

Inmunoprecipitacin - Pgina 2 Pasos

1. 2. Lyse las clulas y prepare la muestra para la inmunoprecipitacin. el Pre-claro la muestra que usa el suero de la especie animal en la cual el anticuerpo primario fue levantado (esto disminuye el fondo y las protenas no especficas). 3. Incube la solucin con el anticuerpo contra la protena del inters (el anticuerpo se puede unir a la ayuda slida antes o despus de este paso) y permita la formacin del complejo del anticuerpo-antgeno. 4. 5. Precipite el complejo del inters, quitndolo de la solucin a granel.

Complejo precipitado colada varias veces. Haga girar cada vez entre las coladas y quite el supernatant. Despus de que sea final lave, quite tanto el supernatant como sea posible (este paso es el ms eficiente cuando est realizado usar las columnas de la vuelta as que el volumen entero del almacenador intermediario se puede quitar en cada paso de la colada).

6.

Enjuague las protenas de la ayuda slida (generalmente con el almacenador intermediario low-pH o del SDS de la muestra del cargamento).

7.

Analice los complejos o los antgenos del inters. Esto se puede hacer en una variedad de maneras:

1.
2.

SDS-PAGE (electrophoresis dodecyl del gel del sulfato-polyacrylamide del sodio); exponga la pelcula si usted utiliz radiactividad. Transferencia y mancha blanca /negra occidental usando otro anticuerpo para las protenas que obraban recprocamente con el antgeno. 3. Otros mtodos moleculares.

Acoplamientos externos

Anlisis de protenas usando la inmunoprecipitacin en ufl.edu

Acoplamiento Inmunoprecipitacin

Protena fluorescente verde - Pgina 1

EGFP vuelve a dirigir aqu. EGFP puede tambin referir al cdigo del aeropuerto de ICAO para Aeropuerto de Pembrey .

protena fluorescente verde (GFP) es a protena, integrado por 238 aminocidos (26.9 kDa), aislado originalmente de medusas Aequorea victoria/Aequorea de Aequorea/Forskalea de Aequorea eso despide luz fluorescente pngase verde cuando est expuesto a la luz azul.[1][2] El GFP de A. victoria tiene un pico importante de la excitacin en a longitud de onda de 395 nanmetro y de menor importancia en 475 nanmetro. Su pico de la emisin est en 509 nanmetro que est en la porcin verde ms baja de espectro visible. El GFP del pensamiento del mar (Reniformis de Renilla) tiene un solo pico importante de la excitacin en 498 nanmetro. En clula y biologa molecular, el GFP gene se utiliza con frecuencia como a reportero de la expresin.
[3]

En formas modificadas se ha utilizado para hacer biosensores, y se han creado muchos

animales que GFP expreso como prueba-de-concepto que un gene se puede expresar a travs de un organismo dado. El gene de GFP se puede introducir en organismos y mantener en su genoma con la crianza, o la inyeccin local con a vector viral puede ser utilizado introducir el gene. Hasta la fecha, se han creado muchas bacterias, la levadura y otras clulas fungicidas, planta, mosca, y clulas mamferas, incluyendo ser humano, usando GFP como marcador.

Contenido

1 Estructura 2 Historia

2.1 Salvaje-tipo GFP (wtGFP)

o o

2.2 Derivados de GFP 3 Utilizacin 4 GFP en arte fino 5 Notas 6 Referencias 6.1 Lectura adicional

7 Acoplamientos externos

Estructura
GFP tiene una estructura beta tpica del barril, consistiendo en una -hoja con contener de las hlices de la alfa fluorophore funcionamiento a travs del centro.[4][5] Mientras que la cscara firmemente embalada del barril protege el fluorophore contra el apagar por el microambiente circundante, los sidechains internos de los revestimientos del barril inducen las reacciones especficas de la ciclizacin en el tripeptide Ser65-Tyr66-Gly67 que conducen a la formacin del fluorophore. Esto ocurre en una serie de pasos discretos con las caractersticas distintas de la excitacin y de la emisin. Se refiere este proceso como maduracin.

Protena fluorescente verde - Pgina 2 Historia

Salvaje-tipo GFP (wtGFP)
En los aos 60 y el 70s GFP, junto con la protena luminiscente separada aequorin, primero fue purificado de A. victoria y sus caractersticas estudiaron por Osamu Shimomura.[6] En A. victoria, La fluorescencia de GFP ocurre cuando aequorin obra recprocamente con CA2+ iones, induciendo un resplandor azul. Algo de esta energa luminiscente se transfiere al GFP, cambiando de puesto el color total hacia verde.[7] Sin embargo, su utilidad como herramienta para los bilogos moleculares no fue observada hasta 1992 en que Douglas Prasher divulg la secuencia de la reproduccin y del nucleotide del wtGFP adentro Gene.[8] El financiamiento para este proyecto haba funcionado hacia fuera, as que Prasher envi cDNA muestras a varios laboratorios. El laboratorio de Martin Chalfie expres la secuencia de codificacin de GFP fluorescente en clulas heterlogas de E. coli y C. elegans, publicando los resultados adentro Ciencia en 1994.[9] El laboratorio de Frederick Tsuji independientemente divulg a expresin de la protena recombinant un mes ms adelante.[10] Notable, la molcula de GFP doblada y era fluorescente en la temperatura ambiente, sin la

necesidad de los cofactores exgenos especficos a las medusas. Aunque este wtGFP era fluorescente, tena varias desventajas, incluyendo espectros enarbolados duales de la excitacin, photostability pobre y plegamiento pobre en 37C.

La estructura cristalina primero divulgada de un GFP era la del mutante de S65T del grupo de Remington adentro Ciencia en 1996.[4] Un mes ms adelante, el grupo Phillips divulg independientemente el tipo salvaje estructura de GFP adentro Naturaleza Biotech.[5] Estas estructuras cristalinas proporcionaron el fondo vital encendido chromophore formacin e interacciones vecinas del residuo. Los investigadores han modificado estos residuos por mutagnesis ordenada y al azar para producir la variedad amplia de derivaties de GFP funcionando hoy.

Derivados de GFP
Debido al potencial para el uso extenso y a las necesidades de desarrollo de investigadores, muchos diversos mutantes de GFP se han dirigido.[11] La primera mejora principal era una sola mutacin del punto (S65T) divulgada en 1995 adentro Naturaleza por Roger Tsien.[12] Esta mutacin mejor dramticamente las caractersticas espectrales de GFP, dando por resultado fluorescencia creciente, photostablility y una cambio del pico principal de la excitacin a 488nm con la emisin mxima guardada en 509 nanmetro. Esto emparej las caractersticas espectrales de comnmente disponible FITC el filtro fija, aumentando el sentido prctico del uso en el investigador general. La adicin de la eficacia que dobla 37C (F64L) seala el mutante a este andamio rendido GFP realzado (EGFP). EGFP tiene un coeficiente de la extincin ( denotado), tambin conocido como su seccin representativa ptica de 9.1310-21 /molecule de m, tambin cotizado como 55.000 l (molcentmetro).[13] Superfolder GFP, una serie de mutaciones que permiten que GFP doble rpidamente y madurarse aun cuando se fundi a los peptides mal que doblaban, fue divulgado en 2006.[14]

Protena fluorescente verde - Pgina 3

Muchas otras mutaciones se han hecho, incluyendo mutantes del color; particularmente protena fluorescente azul (EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1), protena fluorescente cinica (ECFP, Cerulean, CyPet) y protena fluorescente amarilla derivados (YFP, Citrine, Venus, YPet). Los derivados de BFP (excepto mKalama1) contienen la substitucin de Y66H. La mutacin crtica en derivados cinicos es la substitucin de Y66W, que causa el chromophore a la forma con un componente del indol ms bien que del fenol. Varias mutaciones compensatorias adicionales en el barril circundante se requieren para restaurar brillo a este chromophore modificado debido al bulto creciente del grupo del indol. La longitud de onda rojo-cambiada de puesto de los derivados de

YFP es lograda por la mutacin de T203Y y es debido al -electrn que apila interacciones entre el residuo substituido del tyrosine y el chromophore.[2] Estas dos clases de variantes espectrales se emplean a menudo para transferencia de energa de la resonancia de la fluorescencia Experimentos (del TRASTE). los reporteros Gentico-codificados del TRASTE sensibles a la clula que seala las molculas, tales como calcio o glutamato, estado del phosphorylation de la protena, complementacin de la protena, dimerizacin del receptor y otros procesos proporcionan lecturas pticas altamente especficas de la actividad de la clula en tiempo real.

La mutagnesis de Semirational de un nmero de residuos condujo a los mutantes pH-sensitve conocidos como pHluorins, y a pHluorins ms ltimos de la estupendo-eclptica. Explotando el cambio rpido en el pH sobre la fusin sinptica de la vescula, los pHluorins marcaron con etiqueta a synaptobrevin se han utilizado visualizar actividad sinptica en neuronas.[15]

La nomenclatura de GFPs modificado es a menudo confusin debido a traz traslapado de varias versiones de GFP sobre un solo nombre. Por ejemplo, mGFP refiere a menudo a un GFP con un Nterminal palmitoylation ese hace el GFP atar a membranas de la clula. Sin embargo, el mismo trmino tambin se utiliza para referirse monomeric GFP, que es alcanzado a menudo por el interfaz del dimer que rompe la mutacin de A206K. el Salvaje-tipo GFP tiene un dbil dimerizacin tendencia en las concentraciones sobre 5 mg/ml. el mGFP tambin est parado para GFP modificado que se ha optimizado con el intercambio del aminocido para la expresin estable en clulas de la planta.

Utilizacin
La disponibilidad de GFP y de sus derivados ha redefinido a fondo microscopia de la fluorescencia y la manera se utiliza en biologa de la clula y otras disciplinas biolgicas.[16] Mientras que la mayora de las molculas fluorescentes pequeas por ejemplo FITC (isotiocianato del fluorescein) est fuertemente phototoxic cuando estn utilizadas en clulas vivas, las protenas fluorescentes tales como GFP son generalmente mucho menos daosas cuando estn iluminadas en clulas vivas. Esto ha accionado el desarrollo de los sistemas vivos altamente automatizados de la microscopia de la fluorescencia de la clula que se pueden utilizar para observar las clulas en un cierto plazo que expresa unas o ms protenas marcadas con etiqueta con las protenas fluorescentes. El anlisis de tales pelculas del lapso de tiempo ha redefinido la comprensin de muchos procesos biolgicos incluyendo el plegamiento de la protena, el transporte de la protena, y las dinmicas del RNA, que en el pasado haban sido el usar estudiado fijado (es decir. ) material muerto.

Otro uso de gran alcance de GFP es expresar la protena en los sistemas pequeos de clulas especficas. Esto permite que los investigadores pticamente detecten tipos especficos de clulas in vitro (en un plato), o an in vivo (en el organismo vivo).[17]

Protena fluorescente verde - Pgina 4 GFP en arte fino

Alba, un conejito fluorescente, fue comisionado cerca Eduardo Kac usar GFP con objeto de arte y comentario social [1].

Voss-Andreae Julian, artista Alemn-llevado que se especializa en esculturas de la protena,[18] esculturas creadas basadas en la estructura de GFP, incluyendo los 5 ' 6 " (1.70 m) protena fluorescente verde alta (2004)[19] y los 4 ' 7 " (1.40) medusas de acero altas (2006). La ltima escultura es situada actualmente en el lugar del descubrimiento de GFP por Shimomura en 1962, la universidad de los laboratorios del puerto de viernes de Washington.Escultura Julian de VossAndreae. Recuperado encendido 2007-06-14.

Notas
Cerdos verdes fluorescentes primero fueron criados por un grupo de investigadores conducidos por Wu Shinn-Chih en el departamento de la ciencia animal y la tecnologa en Universidad nacional de Taiwn, anunciando los resultados del experimento en enero 2006.

transgenic los cerdos fueron creados agregando DNA codificacin para protena fluorescente verde de medusas fluorescentes a los embriones del cerdo que entonces fueron implantados en el utereus de cerdos femeninos. El verde del resplandor de los cerdos en la obscuridad, y verde-ha teido claramente la piel y ojos en luz del da.

Mancha blanca /negra occidental Pgina 1

mancha blanca /negra occidental (alternativamente, immunoblot) es un mtodo para detectar un especfico protena en una muestra dada del homogenate o del extracto del tejido fino. Utiliza electrophoresis del gel para separar las protenas nativas o desnaturalizadas por la longitud del polipptido (que desnaturaliza las condiciones) (cuadro 1) o por la estructura tridimensional de la protena (condiciones no-que desnaturalizan del natural). Las protenas entonces se transfieren

a una membrana (tpicamente nitrocelulosa o PVDF), donde estn el usar (detectado) sondado anticuerpos especfico a la protena de la blanco. Ahora hay muchas compaas el reactivo que se especializan en el abastecimiento de los anticuerpos (ambos monoclonal y polyclonal anticuerpos) contra muchos millares de diversas protenas. Los anticuerpos comerciales pueden ser costosos, aunque el anticuerpo desatado se puede reutilizar entre los experimentos. Este mtodo se utiliza en los campos de biologa molecular, bioqumica, immunogenetics y otras disciplinas moleculares de la biologa.

Otras tcnicas relacionadas incluyen con los anticuerpos para detectar las protenas en tejidos finos y clulas cerca el immunostaining y anlisis enzima-ligado del immunosorbent (ELISA).

El mtodo origin del laboratorio de George rgido en Stanford. El nombre mancha blanca /negra occidental fue dado a la tcnica por el W. Neal Burnette[1] y es un juego en el nombre Mancha blanca /negra meridional, una tcnica para DNA la deteccin se convirti anterior cerca Edwin meridional. La deteccin del RNA se llama el borrar norteo.

Contenido

1 Pasos en una mancha blanca /negra occidental

o o

1.1 Preparacin del tejido fino 1.2 Electrophoresis del gel

o o o

1.3 Transferencia 1.4 Bloqueo 1.5 Deteccin 1.5.1 De dos etapas

o o

1.5.2 Un paso 1.6 Anlisis

1.6.1 Deteccin colorimtrica 1.6.2 Quimioluminescencia 1.6.3 Deteccin radiactiva 1.6.4 Deteccin fluorescente 1.7 El sondar secundario

2 2.o Electrophoresis del gel 3 Usos de diagnstico mdicos

4 Protocolos 5 Referencias 6 Vea tambin

6.1 Acoplamientos relacionados

Pasos en una mancha blanca /negra occidental Mancha blanca /negra occidental Pgina 2
Preparacin del tejido fino
Las muestras se pueden tomar de tejido fino entero o de cultura de clula. En la mayora de los casos, los tejidos finos slidos son primera a mecnicamente que usa analizada mezclador (para volmenes de muestra ms grandes), con a homogeneizador (volmenes ms pequeos), o cerca sonication. Las clulas pueden tambin estar quebradas se abren por uno de los mtodos mecnicos antedichos. Sin embargo, debe ser observado que las bacterias, el virus o las muestras ambientales pueden ser la fuente de la protena y el borrar occidental no est restringido as a los estudios celulares solamente.

Clasificado detergentes, sales, y almacenadores intermediarios puede ser empleado para animar lysis de clulas y solubilizar las protenas. Protease y phosphatase los inhibidores son agregados a menudo para prevenir la digestin de la muestra por sus propias enzimas.

Una combinacin de tcnicas bioqumicas y mecnicas - incluyendo varios tipos de filtracin y centrifugacin - puede ser utilizado separar diversos compartimientos de la clula y organelles.

Electrophoresis del gel

Artculo principal: Electrophoresis del gel

Las protenas de la muestra son el usar separado electrophoresis del gel. La separacin de protenas puede estar cerca punto isoelctrico (pi), peso molecular, carga elctrica, o una combinacin de estos factores. La naturaleza de la separacin depende del tratamiento de la muestra y de la naturaleza del gel.

Mancha blanca /negra occidental Pgina 3

En gran medida el tipo ms comn de electrophoresis del gel emplea polyacrylamide los geles y los almacenadores intermediarios cargaron con sulfato dodecyl de sodio (SDS). SDS-PAGE

(Electrophoresis del gel de polyacrylamide del SDS) mantiene los polipptidos en un estado desnaturalizado una vez que se hayan tratado con los agentes de reduccin fuertes para quitar la estructura secundaria y terciaria (e.g. Los enlaces de disulfuro de los S-S a SH y a SH) y permiten as la separacin de protenas por su peso molecular. Las protenas muestreadas se cubren en el SDS negativamente cargado y se mueven al electrodo positivamente cargado con acrilamida acoplamiento del gel. Protenas ms pequeas emigran ms rpidamente a travs de este acoplamiento y las protenas se separan as segn el tamao (medido generalmente en el kilo Daltons, el kD). La concentracin de la acrilamida determina la resolucin del gel - mayor es la concentracin de la acrilamida mejor es la resolucin de protenas ms bajas del peso molecular. Ms baja es la concentracin de la acrilamida mejor es la resolucin de protenas ms altas del peso molecular. Las protenas viajan solamente en una dimensin a lo largo del gel para la mayora de las manchas blancas /negras.

Las muestras se cargan en pozos en el gel. Un carril es generalmente reservado para a marcador o escala, una mezcla disponible en el comercio de las protenas que definen pesos moleculares, manchada tpicamente para formar vendas visibles, coloreadas. Un ejemplo de una escala es la escala del peso molecular de la gama completa de GE (cuadro 1). Cuando voltaje se aplica a lo largo del gel, protenas emigran en l a diversas velocidades. Estos diversos ndices del adelanto (diferente mobilities electrophoretic) seprese en vendas dentro de cada uno carril.

Es tambin posible al uso a (2.o) gel de dos dimensiones cul separa las protenas de una sola muestra hacia fuera en dos dimensiones. Las protenas se separan segn el punto isoelctrico (el pH en el cual ellas tiene carga neta neutral) en la primera dimensin, y segn su peso molecular en la segunda dimensin.

Transferencia
Para hacer las protenas accesibles a la deteccin del anticuerpo, se mueven desde dentro del gel sobre una membrana hecha de la nitrocelulosa o de PVDF. La membrana se coloca encima del gel, y de un apilado de papeles de tejido fino colocados encima de se. El apilado entero se coloca en una solucin tapn que levante el papel por la accin capilar, trayendo las protenas con l. Otro mtodo para transferir las protenas se llama el electroblotting y aplicaciones una corriente elctrica de tirar de las protenas del gel en la membrana de PVDF o de la nitrocelulosa. Las protenas se mueven desde dentro del gel sobre la membrana mientras que mantienen la organizacin que tenan dentro del gel. Como resultado de esto el proceso que borra, las protenas se expone en una capa superficial fina para la deteccin (vase abajo). Ambas variedades de membrana se eligen para sus caractersticas obligatorias de la protena no especfica (es decir. ata todo el pozo de las protenas igualmente). El atascamiento de la protena se basa sobre interacciones hidrofbicas, as como interacciones cargadas entre la membrana y la

protena. Las membranas de la nitrocelulosa son ms baratas que PVDF, pero son ms frgiles lejano y no estn paradas para arriba bien a los probings repetidos.

La uniformidad y la eficacia total de la transferencia de la protena del gel a la membrana pueden ser comprobadas manchando la membrana con Coomassie o Ponceau S tintes. Coomassie es el ms sensible de los dos, aunque la solubilidad de agua del s de Ponceau hace ms fcil posteriormente al destain y sonda la membrana como descrita ms abajo.

Mancha blanca /negra occidental Pgina 4

Bloqueo
Puesto que la membrana se ha elegido para que su capacidad ate la protena, y los anticuerpos y la blanco son protenas, las medidas se deben tomar para prevenir interacciones entre la membrana y el anticuerpo usados para la deteccin de la protena de la blanco. El bloqueo del atascamiento no especfico es alcanzado colocando la membrana en una solucin diluida de la protena - tpicamente Albmina del suero vacuno (BSA) o leche seca sin materias grasas (ambos son baratos), con un porcentaje minucioso del detergente por ejemplo Tween 20. La protena en las fijaciones de la solucin diluida a la membrana en todos los lugares en donde las protenas de la blanco no han unido. As, cuando se agrega el anticuerpo, no hay sitio en la membrana para que una con excepcin en de los sitios obligatorios de la protena especfica de la blanco. Esto reduce ruido en el producto final de la mancha blanca /negra occidental, conduciendo a resultados ms claros, y elimina positivos falsos.

Deteccin
Durante el proceso de la deteccin la membrana se sonda para la protena del inters con un anticuerpo modificado que se ligue a una enzima del reportero, que cuando est expuesta a un substrato apropiado conduce una reaccin colourimetric y produce un color. Para una variedad de razones, esto ocurre tradicionalmente en un proceso de dos etapas, aunque ahora hay mtodos de deteccin de un solo paso disponibles para ciertos usos.

De dos etapas

Anticuerpo primario

Se generan los anticuerpos cuando una especie del anfitrin o una cultura de clula inmune se expone a la protena del inters (o de una pieza de eso). Normalmente, ste es parte de la

inmunorespuesta, mientras que aqu se cosechan y se utilizan pues las herramientas sensibles y especficas de la deteccin que atan la protena directamente.

Mancha blanca /negra occidental Pgina 5

Despus de bloquear, una solucin diluida del anticuerpo primario (generalmente entre 0.5 y 5 micrograms/ml) se incuba con la membrana bajo agitacin apacible. Tpicamente, la solucin se compone de la solucin salina protegida con un porcentaje pequeo del detergente, y a veces con leche pulverizada o BSA. La solucin del anticuerpo y la membrana se pueden sellar e incubar juntas para dondequiera a partir de 30 minutos a durante la noche. Puede tambin ser incubado en diversas temperaturas, con temperaturas ms calientes que son asociadas a ms atascamiento, especfico (a la protena de la blanco, a la seal) y no especfico (ruido).

Anticuerpo secundario

Despus de aclarar la membrana para quitar el anticuerpo primario desatado, la membrana se expone a otro anticuerpo, dirigido en una porcin species-specific del anticuerpo primario. Esto se conoce como anticuerpo secundario, y debido a sus caractersticas que apuntan, tiende para ser referido como contra-ratn, contra-cabra, etc. Los anticuerpos vienen de las fuentes animales (o de animal sourced hybridoma culturas); un lazo secundario de la voluntad del contra-ratn a apenas sobre cualquier anticuerpo primario del ratn-sourced. Esto permite algunos ahorros de coste permitiendo que un laboratorio entero comparta una sola fuente del anticuerpo producido en serie, y proporciona resultados lejos ms constantes. El anticuerpo secundario se liga generalmente a biotin o a un reportero enzima por ejemplo phosphatase alcalino o peroxidase del rbano picante. Esto significa que varios anticuerpos secundarios atarn a un anticuerpo primario y realza la seal.

Lo ms comnmente posible, a peroxidase del rbano picante- secundario ligada se utiliza conjuntamente con un agente quimioluminescente, y el producto de la reaccin produce luminescencia en proporcin con la cantidad de protena. Una hoja sensible de la pelcula fotogrfica se coloca contra la membrana, y la exposicin a la luz de la reaccin crea una imagen de los anticuerpos limitados a la mancha blanca /negra.

Como con ELISPOT y ELISA los procedimientos, la enzima se pueden proporcionar una molcula del substrato que sea convertida por la enzima a un producto coloreado de la reaccin que sea visible en la membrana (vase la figura abajo con las vendas azules).

Un tercer alternativa es utilizar una etiqueta radiactiva ms bien que una enzima juntadas al anticuerpo secundario, tal como etiquetado de una protena anticuerpo-que ata como Estafilococo Protena A con un istopo radiactivo del yodo. Puesto que otros mtodos son ms seguros, ms aprisa y ms barato este mtodo ahora se utiliza raramente.

Un paso

Mancha blanca /negra occidental Pgina 6

Histricamente, el proceso que sondaba fue realizado en dos pasos debido a la facilidad relativa de producir los anticuerpos primarios y secundarios en procesos separados. Esto da investigadores y las corporaciones las ventajas enormes en trminos de flexibilidad, y agrega un paso de la amplificacin al proceso de la deteccin. Dado el advenimiento del anlisis de la protena del altorendimiento de procesamiento y lmites ms bajos de la deteccin, sin embargo, ha habido inters en desarrollar los sistemas que sondaban de un solo paso que permitiran que el proceso ocurriera ms rpidamente y con menos materiales consumibles. Esto requiere un anticuerpo que reconozca la protena del inters y contenga una etiqueta perceptible, las puntas de prueba de la punta de prueba que estn a menudo disponibles para sabido etiquetas de la protena. La punta de prueba primaria se incuba con la membrana de una forma similar a sa para el anticuerpo primario en un proceso de dos etapas, y despus es lista para la deteccin directa despus de una serie de pasos de la colada.

Anlisis
Despus de que las puntas de prueba desatadas se laven lejos, la mancha blanca /negra occidental es lista para la deteccin de las puntas de prueba que se etiquetan y estn limitadas a la protena del inters. En trminos prcticos, no todo el Westerns revela la protena solamente en una venda en una membrana. Las aproximaciones del tamao son tomadas comparando las vendas manchadas a la del marcador o de la escala cargada durante electrophoresis. El proceso se repite para una protena estructural, tal como actinia o tubulin, que no deben cambiar entre las muestras. La cantidad de protena de la blanco se pone en un ndice a la protena estructural para controlar entre los grupos. Esta prctica asegura la correccin para la cantidad de protena total en la membrana en caso de errores o de transferencias incompletas.

Deteccin colorimtrica
El mtodo de deteccin colorimtrico depende de la incubacin de la mancha blanca /negra occidental con un substrato que reaccione con la enzima del reportero (por ejemplo peroxidase)

que est limitado al anticuerpo secundario. Esto convierte el tinte soluble en una forma insoluble de un diverso color que se precipite al lado de la enzima y de tal modo manche la membrana. El desarrollo de la mancha blanca /negra entonces es parado lavando lejos el tinte soluble. Los niveles de la protena se evalan a travs densitometra (cmo es intenso es la mancha) o spectrophotometry.

Mancha blanca /negra occidental Pgina 7

Quimioluminescencia
Quimioluminescente los mtodos de deteccin dependen de la incubacin de la mancha blanca /negra occidental con un substrato que luminesce cuando est expuesto al reportero en el anticuerpo secundario. La luz entonces es detectada por la pelcula fotogrfica, y ms recientemente por las cmaras fotogrficas del CCD que captura una imagen digital de la mancha blanca /negra occidental. La imagen es analizada por la densitometra, que evala la cantidad relativa de protena que se mancha y cuantifica los resultados en trminos de densidad ptica. Un ms nuevo software permite anlisis de datos adicional tal como anlisis del peso molecular si se utilizan los estndares apropiados. La deteccin quimioluminescente realzada supuesta (ECL) se considera estar entre los mtodos de deteccin ms sensibles para borrar anlisis.

Deteccin radiactiva
Las etiquetas radiactivas no requieren los substratos de la enzima, sino permiten algo la colocacin de la pelcula de radiografa mdica directamente contra la mancha blanca /negra occidental que desarrolla como se expone a la etiqueta y crea las regiones oscuras que corresponden a las vendas de la protena del inters (vase la imagen a la derecha). La importancia de los mtodos de detecciones radiactivos est declinando[citacin necesitada], porque es muy costoso, los riesgos de salud y de seguridad son altas y el ECL proporciona un alternativa til.

Deteccin fluorescente
La punta de prueba fluorescently etiquetada es excitada por la luz y la emisin de la excitacin entonces es detectada por un fotosensor tal como cmara fotogrfica del CCD equipada de los filtros apropiados de la emisin qu capturas una imagen digital de la mancha blanca /negra occidental y no prohibe a anlisis de datos adicional tal como anlisis del peso molecular y un anlisis occidental cuantitativo de la mancha blanca /negra. La fluorescencia se considera estar entre los mtodos de deteccin ms sensibles para borrar anlisis.

Mancha blanca /negra occidental Pgina 8

El sondar secundario
Una diferencia importante entre la nitrocelulosa y las membranas de PVDF se relaciona con la capacidad de cada uno con los anticuerpos que pelan de la ayuda apagado y reusing la membrana para el anticuerpo subsecuente sonda. Mientras que hay protocolos establecidos disponibles para pelar las membranas de la nitrocelulosa, el PVDF ms robusto permite pelar ms fcil, y para ms reutilizacin antes del ruido de fondo los lmites experimentan. Otra diferencia es que, desemejante de la nitrocelulosa, PVDF se debe empapar en etanol, isopropanol o metanol del 95% antes de usar. Las membranas de PVDF tambin tienden para ser ms gruesas y ms resistentes al dao durante uso.

2.o Electrophoresis del gel

SDS-PAGE de 2 dimensiones utiliza los principios y las tcnicas contorneados arriba. 2.o SDSPAGE, como el nombre sugiere, implica la migracin de polipptidos en 2 dimensiones. Por ejemplo, en la primera dimensin los polipptidos se separan segn punto isoelctrico, mientras que en la segunda dimensin los polipptidos se separan segn su peso molecular. El punto isoelctrico de una protena dada es determinado por el nmero relativo de positivamente (e.g. lysine y arginine) y negativamente (e.g. aminocidos cargados del glutamato y del aspartate), con los aminocidos negativamente cargados que contribuyen a un alto punto isoelctrico y los aminocidos positivamente cargados contribuyendo a un punto isoelctrico bajo. Las muestras se podran tambin separar primero bajo condiciones no reductoras usando SDS-PAGE y bajo reduccin de condiciones en la segunda dimensin, que rompe los enlaces de disulfuro separados que llevan a cabo subunidades juntas. SDS-PAGE se pudo tambin juntar con la urea-PGINA para un gel de 2 dimensiones.

En principio, este mtodo permite la separacin de todas las protenas celulares en un solo gel grande. Una ventaja importante de este mtodo es que distingue a menudo entre diferente isoforms de una protena particular - e.g. una protena que ha sido phosphorylated (por la adicin de un grupo negativamente cargado). Las protenas se han separado que se pueden cortar del gel y despus analizar cerca spectrometry total, que identifica la protena.

Refiera por favor a los artculos de la referencia por ejemplos de el uso de la 2.a PGINA del SDS.

Mancha blanca /negra occidental Pgina 9 Usos de diagnstico mdicos

El confirmativo Prueba del VIH emplea una mancha blanca /negra occidental para detectar el anticuerpo contra-VIH en un ser humano suero muestra. Protenas de sabido VIH- las clulas infectadas se separan y se borran en una membrana como arriba. Entonces, el suero que se probar se aplica en el paso primario de la incubacin del anticuerpo; el anticuerpo libre se lava lejos, y un anticuerpo contra-humano secundario ligado a una seal de la enzima se agrega. Las vendas manchadas entonces indican las protenas a las cuales el suero del paciente contiene el anticuerpo.

Una mancha blanca /negra occidental tambin se utiliza como la prueba definitiva para Encefalopata del spongiform de los bvidos (BSE, designado comnmente enfermedad enojada de la vaca).

Algunas formas de Enfermedad de Lyme la prueba emplea borrar occidental.

Protocolos

El Dr. Marque el protocolo franco del laboratorio de Barton

Protocolo que borra occidental de Kamps

Referencias
1.
^ W. Neal Burnette (el abril de 1981). "El borrar occidental: la transferencia electrophoretic de las protenas del sulfato dodecyl de sodio - geles de polyacrylamide a la nitrocelulosa sin modificar y deteccin radiogrfica con el anticuerpo y radioiodinated la protena A". Bioqumica analtica 112 (2): 195-203. Estados Unidos: Presin acadmica. doi:0.1016/0003-2697 (81) 90281-5. ISSN 0003-2697. PMID 6266278.

Renart J, Li R, GR rgido. Transferencia de protenas de los geles al

diazobenzyloxymethyl-papel y de la deteccin con los antisueros: un mtodo para estudiar especificidad del anticuerpo y la estructura del antgeno ", Proc Acad nacional Sci los E.E.U.U., el 1979 de julio; 76 (7): 3116-20. PMID: 91164 extracto

Towbin H, Au J, Gordon J. La transferencia Electrophoretic de protenas de los geles de polyacrylamide a la nitrocelulosa cubre: procedimiento y algunos usos " Proc Acad nacional Sci los E.E.U.U., el 1979 de sept; 76 (9): 4350-4. PMID: 388439 extracto

Obra clsica de la citacin: Burnette

Vea tambin

Mancha blanca /negra de Extremo Oriente

SDS-pgina

Immunostaining - Pgina 1
Immunostaining est un trmino general adentro bioqumica eso se aplica a cualquier uso del anticuerpo- mtodo basado para detectar un especfico protena en una muestra. El trmino immunostaining fue utilizado originalmente para referir a el mancharse immunohistochemical de las secciones del tejido fino, segn lo primero descrito por Albert Coons en 1941.[1] Ahora sin embargo, el immunostaining abarca una amplia gama de las tcnicas usadas adentro histologa, biologa de la clula, y biologa molecular eso utiliza anticuerpo-basado manchando mtodos.

Contenido

1 Tcnicas de Immunostaining

o o o o

1.1 Immunohistochemistry

1.2 Flujo cytometry 1.3 El borrar occidental

1.4 anlisis Enzima-ligado del immunosorbent 1.5 microscopia del Immuno-electrn 2 Descripcin metodolgica 3 Usos de Immunostaining

4 Referencias

Tcnicas de Immunostaining
Immunohistochemistry
Artculo principal: Immunohistochemistry

Immunostaining - Pgina 2
El mancharse de Immunohistochemistry o de IHC de clulas o tejido fino las secciones son quizs la tcnica immunostaining lo ms comnmente posible aplicada.
[2]

Mientras que los primeros

casos de IHC que se mancha usado fluorescente tintes (vase inmunofluorescencia), el otro usar

no fluorescente de los mtodos enzimas por ejemplo peroxidase (vase el mancharse del immunoperoxidase) y phosphatase alcalino ahora se utilizan. Estas enzimas son capaces de catalizar las reacciones que dan un producto coloreado que sea fcilmente perceptible por la luz microscopia. Alternativomente, radiactivo elementos puede ser utilizado como etiquetas, y el immunoreaction se puede visualizar cerca autoradiografa.[3]

Preparacin del tejido fino o fijacin es esencial para la preservacin de la morfologa de la clula y de la arquitectura del tejido fino. La fijacin inadecuada o prolongada puede disminuir perceptiblemente la capacidad obligatoria del anticuerpo. Muchos antgenos se pueden demostrar con xito adentro formalina- fijo parafina- secciones encajadas del tejido fino. Sin embargo, algunos antgenos no sobrevivirn incluso las cantidades moderadas de fijacin del aldehino. Bajo estas condiciones, los tejidos finos deben estar rpidamente frescos congelados adentro nitrgeno lquido y corte con un criosttico. Las desventajas de secciones congeladas incluyen morfologa pobre, la resolucin pobre en ampliaciones ms altas, la dificultad en cortar secciones excesivas de la parafina, y la necesidad del almacenamiento en congelador. Alternativomente, las secciones del vibratome no requieren el tejido fino para ser procesadas a travs de los solventes orgnicos o de alta temperatura, que pueden destruir el antigenicity, o para ser interrumpidas por la helada que deshiela. La desventaja de las secciones del vibratome es que el proceso que secciona es lento y difcil con suavidad y los tejidos finos mal fijos, y que las marcas de charla o las lneas del vibratome son a menudo evidentes en las secciones.

La deteccin de muchos antgenos se puede mejorar dramticamente cerca recuperacin del antgeno los mtodos que actan rompiendo algunas de las reticulaciones de la protena formaron por la fijacin para destapar sitios antigenic ocultados. Esto puede ser lograda calentando para las longitudes que varan de pocas (recuperacin provocada por el calor del epitope o HIER) o usando la digestin de la enzima (recuperacin inducida proteolytic o EMBARCADERO del epitope).

Una de las dificultades principales con IHC que se mancha est superando el fondo especfico o no especfico. La optimizacin de los mtodos y de las pocas, pre-tratamiento de la fijacin con los agentes de bloqueo, anticuerpos de la incubacin con los tiempos es todos de la alta colada de la sal, y de la optimizacin los almacenadores intermediarios de la colada del poste-anticuerpo e importante para obtener la alta calidad immunostaining. Adems, la presencia del positivo y de la negativa controles para mancharse sea esencial para determinar especificidad.

Flujo cytometry
Artculo principal: flujo cytometry

A cytometer del flujo se puede utilizar para el anlisis directo de clulas expresar unas o ms protenas especficas. Las clulas son immunostained en la solucin usando los mtodos similares a utilizado para la inmunofluorescencia, y despus a analizado por el flujo cytometry.

El flujo cytometry tiene varias ventajas sobre IHC incluyendo: la capacidad de definir las poblaciones distintas de la clula es definida por su tamao y granularity; la capacidad de bloquear hacia fuera las clulas muertas; sensibilidad mejorada; y anlisis multicolor para medir varios antgenos simultneamente. Sin embargo, el flujo cytometry puede ser menos eficaz en la deteccin de las poblaciones extremadamente raras de la clula, y hay una prdida de relaciones arquitectnicas en ausencia de una seccin del tejido fino.[4] El flujo cytometry tambin tiene un alto coste de capital asociado a la compra de un cytometer del flujo.

Immunostaining - Pgina 3
El borrar occidental
Artculo principal: mancha blanca /negra occidental

El borrar occidental permite la deteccin de protenas especficas de los extractos hechos de las clulas o de los tejidos finos, antes o despus de cualesquiera purificacin pasos. Las protenas son separadas generalmente usando del tamao electrophoresis del gel antes de ser transferida a a sinttico membrana va seco, semi-dry, o moje los mtodos que borran. La membrana se puede entonces sondar usando los anticuerpos usando los mtodos similares a immunohistochemistry, pero sin una necesidad de la fijacin. La deteccin es el usar tpicamente realizado peroxidase anticuerpos ligados para catalizar a quimioluminescente reaccin.

El borrar occidental es un mtodo molecular rutinario de la biologa que se puede utilizar para comparar semi-quantitatively niveles de la protena entre los extractos. La separacin del tamao antes de borrar permite la protena peso molecular ser calibrado con respecto a marcadores sabidos del peso molecular.

anlisis Enzima-ligado del immunosorbent

Artculo principal: ELISA

El anlisis del immunosorbent o el ELISA enzima-ligado es un mtodo de diagnstico para cuantitativo o semi-quantitatively determinando concentraciones de la protena de plasma de sangre, suero o los extractos de la clula/del tejido fino en una placa del multi-well ajustaron a formato (generalmente 96 pozos por la placa). Ampliamente, las protenas en la solucin se fijan

por adsorcin a las placas de ELISA. Los anticuerpos especficos para la protena del inters se utilizan para sondar la placa. El fondo es reducido al mnimo optimizando mtodos de bloqueo y que se lavan (en cuanto a IHC), y la especificidad se asegura va la presencia de controles positivos y negativos. Los mtodos de deteccin son generalmente colorimtricos o quimioluminescencia basados.

Immunostaining - Pgina 4
microscopia del Immuno-electrn
Microscopia electrnica o el EM se puede utilizar para estudiar el microarchitecture detallado de tejidos finos o de clulas. El Immuno-EM permite la deteccin de protenas especficas en secciones ultrafinas del tejido fino. Anticuerpos etiquetados con las partculas del metal pesado (e.g. el oro) puede ser el usar directamente visualizado microscopia electrnica de la transmisin. Mientras que es de gran alcance en la deteccin de la localizacin subcelular de una protena, immuno-EM puede ser tcnico desafiador, costoso, y requiere la optimizacin rigurosa de los mtodos de la fijacin y de proceso del tejido fino.

Descripcin metodolgica
En los mtodos immunostaining, anticuerpo se utiliza detectar un especfico protena epitope. Estos anticuerpos pueden ser monoclonal o polyclonal. Deteccin de este primera o anticuerpo primario puede ser logrado de maneras mltiples.

El anticuerpo primario se puede etiquetar directamente el usar enzima o fluorophore. El anticuerpo primario se puede etiquetar usando una molcula pequea que obre recprocamente con un socio obligatorio de la alta afinidad que pueda ser ligado a una enzima o a un fluorophore. biotin- el strepavidin es una alta interaccin de uso general de la afinidad.

El anticuerpo primario se puede sondar para usar un species-specific ms amplio anticuerpo secundario se etiqueta eso usando una enzima, o el fluorophore.

En el caso de microscopia electrnica, los anticuerpos se ligan a un metal pesado tomo.

Segn lo descrito previamente, enzimas por ejemplo rbano picante peroxidase o phosphatase alcalino sea de uso general catalizar las reacciones que dan haber coloreado o quimioluminescente producto. Fluorescente las molculas pueden ser el usar visualizado microscopia del fluoresence o microscopia confocal.

Immunostaining - Pgina 5 Usos de Immunostaining

Los usos de immunostaining son numerosos, pero se utilizan lo ms tpicamente posible adentro diagnstico clnico y investigacin del laboratorio.

Clnico, IHC se utiliza adentro histopatologa para la diagnosis de tipos especficos de cnceres basados en marcadores moleculares.

En ciencia del laboratorio, el immunostaining se puede utilizar para una variedad de usos basados en investigar la presencia o la ausencia de una protena, de su distribucin del tejido fino, de su localizacin subcelular, y o de cambios en la expresin o la degradacin de la protena.

Referencias
1. 2.
^ Coons, Albert (1941). Caractersticas inmunolgicas de un anticuerpo que contiene a un grupo fluorescente. Biol Med de Proc Soc Exp 47: 200-202. ^ Ramos-Vara, JA (2005). Aspectos de Techical de Immunohistochemistry. Veterinario Pathol 42: 405-426.

3. 4.

^ Introduccin de Immunohistochemistry

^ Cherie, H (2004). Usos del flujo Cytometry e Immunohistochemistry a Hematopathology de diagnstico. Archivos de la patologa y de la medicina del laboratorio 128 (9): 1004-1022.

El ordenar de la protena - Pgina 1

Protenas se encuentran en cada clula y sea esencial para cada proceso biolgico, estructura de la protena es muy complejo: la determinacin de la estructura de una protena implica primero el ordenar de la protena - determinacin aminocido secuencias de su componente peptides; y tambin determinndose qu conformacin l adopta y si es complexed con algunas molculas del no-peptide. Descubrir las estructuras y las funciones de protenas en organismos vivos es una herramienta importante para entender procesos celulares, y permite las drogas que apuntan especfico caminos metablicos ser inventado ms fcilmente.

Los dos mtodos directos del comandante de ordenar de la protena son spectrometry total y Degradacin de Edman reaccin. Es tambin posible generar una secuencia del aminocido del DNA o mRNA ordene la codificacin de la protena, si se sabe esto. Sin embargo, hay un nmero de otras reacciones que se pueden utilizar para ganar una informacin ms limitada sobre

secuencias de la protena y pueden ser utilizadas como preliminares a los mtodos ya mencionados de ordenar o superar insuficiencias especficas dentro de ellas.

Contenido

1 Determinacin de la composicin de aminocido

o o o o

1.1 Hidrlisis 1.2 Separacin

1.3 Anlisis cuantitativo

2 anlisis del aminocido del N-terminal 3 anlisis del aminocido del C-terminal

4 Degradacin de Edman

5 La reaccin de la degradacin de Edman 5.1 Limitaciones de la degradacin de Edman

6 Spectrometry total

7 Secuencia de la protena que predice de secuencias de DNA/RNA

8 Referencias

Determinacin de la composicin de aminocido

Es a menudo deseable saber la composicin de aminocido desordenada de una protena antes de procurar encontrar la secuencia pedida, pues este conocimiento se puede utilizar para facilitar el descubrimiento de errores en el proceso que ordena o para distinguir entre los resultados ambiguos. El conocimiento de la frecuencia de ciertos aminocidos se puede tambin utilizar para elegir que protease para utilizar para la digestin de la protena. Un mtodo generalizado para hacer esto es como sigue:

El ordenar de la protena - Pgina 2

1. Hydrolyse una cantidad sabida de protena en sus aminocidos constitutivos. 2. 3. Separe los aminocidos de cierta manera.

Determine las cantidades respectivas de los aminocidos.

Hidrlisis

La hidrlisis es hecha calentando una muestra de la protena en la muela 6 cido hidroclrico a 100-110 grados por 24 horas o ms de largo de centgrado. Protenas con muchos abultados hidrofbico los grupos pueden requerir perodos ms largos de la calefaccin. Sin embargo, estas condiciones son tan vigorosas que algunos aminocidos (serine, threonine, tyrosine, tryptophan, glutamine y cystine) se degradan. Para evitar este problema, la bioqumica en lnea sugiere las muestras separadas de la calefaccin por diversas pocas, analizando cada solucin que resulta, y extrapolando de nuevo al tiempo cero de la hidrlisis. Rastall sugiere una variedad de reactivo para prevenir o para reducir la degradacin - thiol reactivo o fenol para proteger el tryptophan y el tyrosine contra ataque la clorina, y pre-oxidando cysteine. l tambin sugiere medir la cantidad de amonaco desarrollado para determinar el grado de hidrlisis de la amida.

Separacin
Los aminocidos se pueden separar cerca Cromatografa de intercambio inico o cromatografa hidrofbica de la interaccin. Un ejemplo del anterior es dado por usar de NTRC sulfonated el poliestireno como matriz, agregando los aminocidos en la solucin cida y pasando un almacenador intermediario constantemente del aumento pH a travs de la columna. Los aminocidos sern enjuagados cuando el pH alcanza su respectivo puntos isoelctricos. La ltima tcnica se puede emplear con el uso de la cromatografa inversa. Mucho C8 y C18 disponibles en el comercio columnas de la silicona han demostrado la separacin acertada de aminocidos en la solucin en menos de 40 minutos con el uso del optimizado elution gradiente.

El ordenar de la protena - Pgina 3

Anlisis cuantitativo
Una vez que se hayan separado los aminocidos, sus cantidades respectivas son determinadas agregando un reactivo que forme un derivado coloreado. Si las cantidades de aminocidos estn superior al nmol 10, ninhydrin puede ser utilizado para esto - da un color amarillo cuando est reaccionada con el proline, y un azul vivo con otros aminocidos. La concentracin del aminocido es proporcional a la absorbencia de la solucin que resulta. Con cantidades muy pequeas, abajo 10 al pmol, fluorescamine puede ser utilizado como marcador: esto forma un derivado fluorescente en reaccionar con un aminocido.

anlisis del aminocido del N-terminal

Determinndose qu aminocido forma N-trmino de a peptide la cadena es til por dos razones: para ayudar a ordenar de las secuencias de los fragmentos individuales del peptide en una cadena entera, y porque el primer redondo de Degradacin de Edman es contaminado a menudo por las

impurezas y por lo tanto no da una determinacin exacta del aminocido del N-terminal. Un mtodo generalizado para el anlisis del aminocido del N-terminal sigue:

1.

Reaccione el peptide con un reactivo que etiquete selectivamente el aminocido terminal. 2. 3. Hydrolyse la protena.

Determine el aminocido por cromatografa y la comparacin con estndares.

Hay muchos diversos reactivo que se pueden utilizar para etiquetar los aminocidos terminales. Todos reaccionan con los grupos de la amina y por lo tanto tambin atarn a los grupos de la amina en las cadenas laterales de aminocidos tales como lysine - que esta razn es necesario tenga cuidado en interpretar cromatgramas para asegurarse de que el punto derecho est elegido. Dos de los reactivo mas comunes son Reactivo de Sanger (1 fluoro-2,4-dinitrobenzene) y derivados dansyl por ejemplo cloruro dansyl. Phenylisothiocyanate, el reactivo para la degradacin de Edman, puede tambin ser utilizado. Las mismas preguntas se aplican aqu como en la determinacin de la composicin de aminocido, con excepcin del hecho que no hay mancha necesaria, pues los reactivo producen derivados coloreados y solamente se requiere el anlisis cualitativo, as que el aminocido no tiene que ser enjuagado de la columna de la cromatografa, apenas comparada con un estndar. Otra consideracin a considerar es que, puesto que cualquier grupo de la amina habr reaccionado con el reactivo de etiquetado, la cromatografa de intercambio de ion no puede ser utilizada, y cromatografa de capa delgada o cromatografa lquida de alta presin debe ser utilizado en lugar de otro.

El ordenar de la protena - Pgina 4 anlisis del aminocido del C-terminal

El nmero de los mtodos disponibles para C-terminal el anlisis del aminocido es mucho ms pequeo que el nmero de mtodos disponibles de anlisis del N-terminal. El mtodo ms comn es agregar carboxypeptidases a una solucin de la protena, las muestras de la toma en los intervalos regulares, y determinan el aminocido terminal analizando un diagrama de las concentraciones del aminocido contra tiempo.

Degradacin de Edman
Degradacin de Edman es una reaccin muy importante para la protena que ordena, porque permite que la composicin de aminocido pedida de una protena sea descubierta. Los secuenciadores automatizados de Edman pueden en uso extenso, y son ahora ordenar los peptides hasta aproximadamente 50 aminocidos de largo. Un esquema de la reaccin para

ordenar una protena por la degradacin de Edman sigue - algunos de los pasos se elaboran encendido posteriormente.

1.
2.

Rompa cualesquiera puentes del disulfuro en la protena cerca el oxidar con el cido performic. Separe y purifique las cadenas individuales del complejo de la protena, si hay ms de uno. 3. 4. 5. Determine la composicin de aminocido de cada cadena. Determine los aminocidos terminales de cada cadena.

Rompa cada cadena en fragmentos debajo de 50 aminocidos de largo. 6. 7. 8. Separe y purifique los fragmentos.

Determine la secuencia de cada fragmento.

Repeticin con un diverso patrn de la hendidura. 9. Construya la secuencia de la protena total.

La digestin en el peptide hace fragmentos de los Peptides ms de largo que cerca de 50-70 aminocidos no se pueden ordenar de largo confiablemente por la degradacin de Edman. Debido a esto, las cadenas largas de la protena necesitan estar rotas para arriba en los fragmentos pequeos que se pueden entonces ordenar individualmente. La digestin se hace cualquiera cerca endopeptidases por ejemplo trypsin o pepsina o por los reactivo qumicos tales como bromuro de ciangeno. Diversas enzimas dan diversos patrones de la hendidura, y el traslapo entre los fragmentos se puede utilizar para construir una secuencia total.

El ordenar de la protena - Pgina 5 La reaccin de la degradacin de Edman

El peptide que se ordenar es fijado por adsorcin sobre una superficie slida - un campo comn substrato es la fibra de vidrio cubierta con polybrene, un polmero catinico. El reactivo de Edman, phenylisothiocyanate (PTC), se agrega al peptide fijado por adsorcin, junto con un suavemente bsico solucin tapn de el 12% trimethylamine. Esto reacciona con el grupo de la amina del aminocido del N-terminal.

El derivado terminal del aminocido se puede entonces separar selectivamente por la adicin de anhidro cido. El derivado entonces isomeriza dar un phenylthiohydantoin substituido que se pueda lavar apagado e identificar por la cromatografa, y el ciclo puede ser repetido. La eficacia de cada paso es el cerca de 98%, que permite que cerca de 50 aminocidos sean determinados confiablemente.

Limitaciones de la degradacin de Edman

Porque la degradacin de Edman procede del N-trmino de la protena, no trabajar si el aminocido del N-terminal qumicamente se ha modificado o si se encubre dentro del cuerpo de la protena. Tambin requiere el uso del guesswork o de un procedimiento separado de determinar las posiciones de los puentes del disulfuro.

Spectrometry total El ordenar de la protena - Pgina 6

El otro mtodo directo principal por el cual la secuencia de una protena puede ser determinada es spectrometry total. Este mtodo ha estado ganando renombre estos ltimos aos mientras que las nuevas tcnicas y la energa que computaba de aumento lo han facilitado. El spectrometry total puede, en principio, ordenar cualquier tamao de la protena, pero el problema llega a ser de cmputo ms difcil mientras que el tamao aumenta. Los Peptides son tambin ms fciles de prepararse para el spectrometry total que las protenas enteras, porque son ms solubles. Un mtodo de entregar los peptides al espectrmetro es ionizacin electrospray, que gan Premio Nobel en qumica en 2002. La protena es digerida por un endoprotease, y la solucin que resulta se pasa a travs de una columna de alta presin de la cromatografa lquida. En el extremo de esta columna, la solucin se roca de un inyector estrecho cargado a un alto potencial positivo en el espectrmetro total. La carga en las gotitas las causa al fragmento hasta que solamente permanecen los solos iones. Los peptides entonces se hacen fragmentos y masa-cargue los cocientes de los fragmentos medidos. (Es posible detectar qu picos corresponden para multiplicarse cargado hace fragmentos, porque stos tendrn picos auxiliares el corresponder a otros istopos - la distancia entre estos otros picos es inverso proporcional a la carga en el fragmento). El espectro total es analizado por la computadora y comparado a menudo contra una base de datos de protenas previamente ordenadas para determinar las secuencias de los fragmentos. Este proceso entonces se repite con una diversa enzima de la digestin, y los traslapos en las secuencias usadas para construir una secuencia para la protena.

Secuencia de la protena que predice de secuencias de DNA/RNA

La secuencia del aminocido de una protena se puede tambin determinar indirectamente de mRNA o, en los organismos que no tienen introns (e.g. prokaryotes), DNA eso cdigos para la protena. Si la secuencia del gene se sabe ya, entonces ste es todo muy fcil. Sin embargo, es raro que la secuencia de la DNA de una protena nuevamente aislada ser sabida, y tan si se va

este mtodo a ser utilizado, tiene que ser encontrado de cierta manera. Una forma que esto puede ser hecha es ordenar una seccin corta, quizs 15 aminocidos de largo, de la protena por uno de los mtodos antedichos, y despus utiliza esta secuencia para generar un marcador complementario para el RNA de la protena. Esto se puede entonces utilizar para aislar la codificacin del mRNA para la protena, que se puede entonces replegar en a reaccin en cadena de la polimerasa para rendir una cantidad significativa de DNA, que se puede entonces ordenar relativamente fcilmente. La secuencia del aminocido de la protena se puede entonces deducir de esto. Sin embargo, es necesario considerar la posibilidad de aminocidos que son quitados despus de que haya sido el mRNA traducido.

Referencias

El ordenar de la composicin y de la protena de aminocido.[1]

Henrio Jakubowski. Bioqumica en lnea, captulo 2 B.[2]

Hanno Steen y Matthias Mann. Los ABC (y xyz) de ordenar del peptide. La naturaleza repasa la biologa molecular de la clula, 5:699 - 711, 2004.

Sergio Marchesini Michael W. Rey. Anlisis de la protena.[3] R un Rastall. Estructura y funcin de la protena que investigan.[4]

Rebuzno Johnson Lewis Raff Roberts y Walter de Alberts. 1998. Biologa esencial de la clula: Una introduccin a la biologa molecular de la clula. Garland que publica, Nueva York.

Electrophoresis del gel - Pgina 1

Electrophoresis del gel

Aparato del electrophoresis del gel - Un gel del agarose se coloca en esta caja almacenador-llenada y la corriente elctrica se aplica va la fuente de alimentacin a la parte posterior. El terminal negativo est en el extremo lejano (alambre negro), as que la DNA emigra hacia la cmara fotogrfica.

Clasificacin

Electrophoresis

Otras tcnicas

Relacionado

Electrophoresis capilar

SDS-PAGE Electrophoresis de dos dimensiones del gel Electrophoresis del gel del gradiente de la temperatura

Esta caja: visin

charla

corrija

Electrophoresis del gel es una tcnica usada para la separacin de cido deoxyribonucleic, cido ribonucleico, o protena molculas usar una corriente elctrica se aplic a una matriz del gel.[1] Se realiza generalmente para los propsitos analticos, pero puede ser utilizado como tcnica preparatoria antes del uso de otros mtodos por ejemplo spectrometry total, RFLP, PCR, reproduccin, El ordenar de la DNA, o El borrar meridional para la caracterizacin adicional.

Contenido
o o
1 Separacin 2 Visualizacin

3 Usos 3.1 cidos Nucleic 3.2 Protenas 4 Historia

5 Vea tambin 6 Referencias

7 Acoplamientos externos

Separacin
El trmino gelen este caso refiere a la matriz usada para contener, despus separa las molculas de la blanco. En la mayora de los casos el gel es a polmero reticulado se elige de quin composicin y porosidad bas en el peso y la composicin especficos de la blanco que se analizar. Al separarse protenas o pequeo cidos nucleic (DNA, RNA, o oligonucleotides) el gel se compone generalmente de diversas concentraciones de acrilamida y a cross-linker, produciendo diversas redes clasificadas del acoplamiento de polyacrylamide. Al separar cidos nucleic ms grandes (mayor que algunos cientos bases), se purifica la matriz preferida agarose. En ambos casos, el gel forma un slido, con todo la matriz porosa. Acrilamida, en contraste con polyacrylamide, es a neurotoxina y debe ser el usar manejado Buenas prcticas del laboratorio para evitar de envenenar.

Electrophoresis del gel - Pgina 2

"Electrophoresisrefiere a fuerza electromotriz (EMF) que se utiliza para mover las molculas a travs de la matriz del gel. Colocando las molculas en pozos en el gel y aplicando una corriente elctrica, las molculas se movern a travs de la matriz en diversas tarifas, determinadas generalmente por la masa, hacia el positivo nodo si est cargado negativamente o hacia la negativa ctodo si est cargado positivamente
[2]

Visualizacin
Despus de que el electrophoresis sea completo, las molculas en el gel pueden ser manchado para hacerlos visibles. Bromuro de Ethidium, plata, o coomassie el tinte azul se puede utilizar para este proceso. Otros mtodos se pueden tambin utilizar para visualizar la separacin de los componentes de la mezcla en el gel. Si las molculas del analyte despida luz fluorescente debajo ultravioleta luz, a fotografa puede ser tomado del gel bajo condiciones ultravioletas de la iluminacin. Si las molculas que se separarn contienen radiactividad agregado para la visibilidad, autoradiogram puede ser registrado del gel.

Si varias mezclas se han inyectado inicialmente al lado de uno a, funcionarn paralelo en carriles individuales. Dependiendo del nmero de diversas molculas, cada carril demuestra la separacin de los componentes de la mezcla original como unas o ms vendas distintas, una venda por componente. La separacin incompleta de los componentes puede conducir a las vendas traslapadas, o a los borrones de transferencia indistinguibles que representan componentes sin resolver mltiples.

Las vendas en diversos carriles que terminen para arriba en la misma distancia de la tapa contienen las molculas que pasaron a travs del gel con la misma velocidad, que los medios ellos son generalmente aproximadamente del mismo taman-o. Hay marcadores del tamao del peso molecular disponible que contiene una mezcla de las molculas de tamaos sabidos. Si tal marcador fue funcionado en un carril en el gel paralelo a las muestras desconocidas, las vendas observadas se pueden comparar a los del desconocido para determinar su tamao. La distancia que viaja una venda es aproximadamente inverso proporcional al logaritmo del tamao de la molcula.

Usos Electrophoresis del gel - Pgina 3

El electrophoresis del gel se utiliza adentro forensics, biologa molecular, gentica, microbiologa y bioqumica. Los resultados pueden ser analizados cuantitativo visualizando el gel con la luz UV y un dispositivo de la proyeccin de imagen del gel. La imagen se registra con una cmara fotogrfica por el computador, y la intensidad de la venda o del punto del inters se mide y se compara contra el estndar o los marcadores cargados en el mismo gel. La medida y el anlisis se hacen sobre todo con software especializado.

Dependiendo del tipo de anlisis que es realizado, otras tcnicas se ponen en ejecucin a menudo conjuntamente con los resultados del electrophoresis del gel, proporcionando una amplia gama de usos campo-especficos.

cidos Nucleic
En el caso de los cidos nucleic, la direccin de la migracin, de negativo a los electrodos positivos, es debido a la carga negativa natural llevada por su azcar-fosfato espina dorsal.[3]

Los fragmentos Double-stranded de la DNA se comportan naturalmente como barras largas, as que su migracin a travs del gel est concerniente a su radio del giro, o, para los fragmentos sin ciclos, tamao. la DNA o el RNA Solo-trenzada tiende para doblar para arriba en las molculas con formas complejas y para emigrar a travs del gel de una manera complicada basada en su estructura terciaria. Por lo tanto, agentes que interrumpen enlaces del hidrgeno, por ejemplo hidrxido del sodio o formamide, se utilizan desnaturalizar los cidos nucleic y hacerlos comportarse como barras largas otra vez.[4]

Electrophoresis del gel de grande DNA o RNA se hace generalmente cerca electrophoresis del gel del agarose. Vea Mtodo de cadena de la terminacinpgina por un ejemplo de a polyacrylamide DNA que ordena el gel.

Electrophoresis del gel - Pgina 4

Protenas
Las protenas, desemejante de los cidos nucleic, pueden tener cargas y formas del complejo que varan, por lo tanto pueden no emigrar en el gel en las tarifas similares, o en todos, al poner una negativa a EMF positivo en la muestra. Las protenas por lo tanto, estn generalmente desnaturalizado en presencia de a detergente por ejemplo sulfato dodecyl de sodioel fosfato dodecyl de /sodium (SDS/SDP) ese cubre las protenas con una carga negativa.[1] Generalmente, la cantidad de lmite del SDS est concerniente al tamao de la protena (generalmente 1.4g SDS por el gramo de protena), de modo que las protenas desnaturalizadas que resultan tengan una

carga negativa total, y todas las protenas tengan una carga similar para formar cociente. Desde las protenas desnaturalizadas acte como las barras largas en vez de tener una forma terciaria compleja, la tarifa en la cual el SDS que resultaba cubri las protenas emigra en el gel es relativa solamente a su tamao y no su carga o forma.[1]

Protenas son analizados generalmente por electrophoresis del gel de polyacrylamide del sulfato dodecyl de sodio (SDS-PAGE), cerca electrophoresis nativo del gel, por electrophoresis continuo nativo preparatorio cuantitativo del gel de polyacrylamide (QPNC-PAGE), o cerca 2.o electrophoresis.

Historia

los aos 30 - primeros informes del uso de sucrosa para el electrophoresis del gel

1955 - introduccin de almidn geles, separacin mediocre

1959 - introduccin de acrilamida geles (Raymond y Weintraub); control exacto de parmetros tales como tamao y estabilidad del poro

1964 - electrophoresis del gel del disco (Ornstein y Davis)

1969 - introduccin de el desnaturalizar agentes especialmente SDS separacin de protena subunidad (Beber y Osborn) 1970 - Laemmli separ 28 componentes de Phage T4 usar un gel y un SDS que apilan

1975 - geles de 2 dimensiones (O' Farrell); el enfocarse isoelctrico entonces electrophoresis del gel del SDS

1977 - el ordenar geles

tarde los aos 70 - agarose geles

1983 - electrophoresis pulsado del gel del campo permite la separacin de los moleucles grandes de la DNA

1983 - introduccin de electrophoresis capilar

Un libro 1959 en electrophoresis por el Bier de Milano cita referencias del 1800s.[5] Sin embargo, Herreras de Oliver contribuciones significativas hechas. Estados del Bier: El mtodo de herreras est encontrando el uso amplio debido a su energa separatory nica. Tomado en el contexto, Bier implica claramente que el mtodo de las herreras es una mejora.

Vea tambin

Electrophoresis de la DNA

Electrofocusing Aislamiento del gel El borrar norteo

Electrophoresis de la protena

El borrar meridional El borrar occidental

Zymography

Electrophoresis nativo del gel

Electrophoresis del gel - Pgina 5 Referencias

1. 2. 3. 4.
^
a b c

Berg JM, Tymoczko JL Stryer L (2002). Biologa molecular de la clula, 5to ed., Freeman de WH. ISBN 0-7167-4955-6.

^ Robyt, Juan F. (1990). Teora y prctica bioqumicas de las tcnicas. Presin de Waveland. ISBN 088133-556-8. ^ Lodish H, Berk A, Matsudaira P, y otros (2004). Biologa molecular de la clula, 5to ed., Freeman de WH: Nueva York, NY. ISBN 978-0716743668. ^ Electrophoresis de localizacin de averas del gel del agarose de la DNA. Foco 19:3 p.66 (1997).

5.

^ Bier de Milano (ed.) (1959). Electrophoresis. Teora, mtodos y usos, 3ro impresin, prensa acadmica, 225. LCC 59-7676. OCLC 1175404.

Acoplamientos externos

Demostracin del electrophoresis del laboratorio de Biotechniques, de la universidad del centro que aprende de la ciencia gentica de Utah

Electrophoresis nativo discontinuo del gel de protena

Huella dactilar total del Peptide - Pgina 1

Huella dactilar total del Peptide (PMF) (tambin conocido como huella dactilar de la protena) es una tcnica analtica para protena identificacin que fue desarrollada en 1993 por varios grupos independientemente.[1]
[2] [3] [4] [5]

En este mtodo, la protena desconocida del

inters primero se hiende en ms pequeo peptides, que masas absolutas se pueden medir exactamente con a espectrmetro total por ejemplo MALDI-TOF o ESI-TOF.[6] Estas masas entonces estn en silico comparado o a una base de datos que contiene secuencias sabidas de la protena o an al genoma. Esto es alcanzada usando los programas de computadora que traducen el genoma sabido del organismo a las protenas, despus cortan tericamente las protenas en los peptides, y calculan las masas absolutas de los peptides de cada protena. Entonces comparan las masas de los peptides de la protena desconocida a las masas tericas del peptide de cada

protena codificada en el genoma. Los resultados se analizan estadstico para encontrar el mejor fsforo. La ventaja de este mtodo es que solamente las masas de los peptides tienen que ser sabidas y como tal, de novo el ordenar del peptide no es necesario que puede ser desperdiciador de tiempo. Una desventaja es que la secuencia de la protena tiene que estar presente en la base de datos del inters. La mayora de los algoritmos de PMF asumen adems que los peptides vienen de una sola protena.[7] La presencia de una mezcla puede complicar perceptiblemente el anlisis y potencialmente comprometer los resultados. Tpico para la identificacin basada PMF de la protena es el requisito para una protena aislada. Las mezclas que exceden un nmero de 2-3 protenas requieren tpicamente el uso adicional de MS/MS identificacin basada de la protena para alcanzar la suficiente especificidad de la identificacin (6). Por lo tanto, las muestras tpicas de PMF son protenas aisladas de Electrophoresis de dos dimensiones del gel (2.os geles) o aislado SDS-PAGE vendas. Anlisis adicionales cerca MS/MS la poder cualquiera sea directa, e.g., anlisis de MALDI-TOF/TOF o anlisis en sentido descendiente de nanoLC-ESI-MS/MS de los eluates del punto del gel.[7][8][9]

Contenido

1 Preparacin de la muestra 2 Anlisis spectrometric total 3 Anlisis de cmputo

4 Vea tambin 5 Referencias

6 Acoplamientos externos

Preparacin de la muestra
Las muestras de la protena se pueden derivar de SDS-PAGE[7] y est entonces conforme a algunas modificaciones qumicas. Los puentes del disulfuro en protenas se reducen y los aminocidos del cysteine son carboxymethylated qumicamente o acrylamidated durante el electrophoresis del gel.

Entonces las protenas se cortan en varios fragmentos usando las enzimas proteolytic por ejemplo trypsin, chymotrypsin o Glu-C. Una muestra tpica: protease cociente es 50:1. El proteolysis se realiza tpicamente durante la noche y los peptides que resultan se extraen con acetonitrile y secado bajo vaco. Los peptides despus se disuelven en una cantidad pequea de agua destilada y son listos para el anlisis spectrometric total.

Huella dactilar total del Peptide Pgina 2 Anlisis spectrometric total

La protena digerida se puede analizar con diversos tipos de espectrmetros totales tales como ESI-TOF o MALDI-TOF. MALDI-TOF es a menudo el instrumento preferido porque permite un alto rendimiento de procesamiento de la muestra y varias protenas se pueden analizar en un solo experimento - si estn complementadas cerca MS/MS anlisis.

Una fraccin pequea del peptide (generalmente 1 microlitro o menos) es medido con una pipeta sobre una blanco de MALDI y un producto qumico llam a matriz se agrega a la mezcla del peptide. Las molculas de la matriz se requieren para desorcin de las molculas del peptide. Las molculas de la matriz y del peptide co-se cristalizan en la blanco de MALDI y son listas ser analizado.

La blanco se inserta en el compartimiento del vaco del espectrmetro total y el anlisis de las masas del peptide es iniciado por un rayo laser pulsado que transfiera altas cantidades de energa en las molculas de la matriz. La transferencia de energa es suficiente promover la transicin de las molculas y de los peptides de la matriz del de estado slido en el estado del gas. Despus las molculas se aceleran en el campo elctrico del espectrmetro total y vuelan hacia un detector del ion donde su llegada se detecta como seal elctrica. Su masa es proporcional a su poca del vuelo (TOF) en el tubo de la deriva y puede ser calculado por consiguiente.

Anlisis de cmputo
El anlisis spectrometrical total produce una lista de pesos moleculares que a menudo se llame lista mxima. Las masas del peptide ahora se comparan a las bases de datos enormes por ejemplo Swissprot, Genbank cules contienen la informacin de la secuencia de la protena. Programas del software (vase los recursos y las referencias de la tela en Hufnagel, 2006[9]) cortado todas estas protenas en los peptides con la misma enzima usada en la hendidura qumica (por ejemplo trypsin). La masa absoluta de todos estos peptides entonces se calcula tericamente. Una comparacin se hace entre la lista mxima de las masas medidas del peptide y todas las masas de los peptides calculados. Los resultados se analizan estadstico y los fsforos posibles se vuelven en una tabla de los resultados.

Huella dactilar total del Peptide Pgina 3

Vea tambin

Spectrometry total de la protena

Proteomics de la escopeta

Proteomics de arriba hacia abajo Proteomics Bottom-up

Referencias
1. 2.
^ Pappin DJ, Hojrup P, Bleasby AJ (1993). Identificacin rpida de protenas por huella dactilar de la peptide-masa. Curr. Biol. 3 (6): 32732. doi:10.1016/0960-9822 (93) 90195-T. PMID 15335725. ^ Henzel WJ, Billeci TM, Stults JT, SC de Wong, Grimley C, Watanabe C (1993). Identificando las protenas de los geles de dos dimensiones por buscar total molecular de los fragmentos del peptide en bases de datos de la secuencia de la protena. Proc. Nacional. Acad. Sci. LOS E.E.U.U. 90 (11): 50115. doi:10.1073/pnas.90.11.5011. PMID 8506346.

3.

^ Mann M, Hjrup P, Roepstorff P (1993). Uso de la informacin spectrometric total del peso

molecular de identificar bases de datos de las protenas en orden. Biol. Spectrom total. 22 (6): 338 45. doi:10.1002/bms.1200220605. PMID 8329463.

4.

^ James P, Quadroni M, Carafoli E, Gonnet G (1993). Identificacin de la protena por huella dactilar total del perfil. Bioqumica. Biophys. Res. Commun. 195 (1): 5864. doi:10.1006/bbrc.1993.2009. PMID 8363627.

5.

^ Yates JR, Speicher S, banda del Griffin, Hunkapiller T (1993). Mapas totales del Peptide: un acercamiento altamente informativo a la identificacin de la protena ". Anal. Bioqumica. 214 (2): 397408. doi:10.1006/abio.1993.1514. PMID 8109726.

6.

^ KR de Clauser, panadero P, Burlingame AL (1999). Papel de la medida total exacta (+/- 10 PPM) en las estrategias de la identificacin de la protena que emplean a MS o MS/MS y base de datos que busca. Anal. Qum. 71 (14): 287182. doi:10.1021/ac9810516. PMID 10424174.

7.

a b c

Shevchenko A, Jensen ENCENDIDO, Podtelejnikov sistema de pesos americano, Sagliocco F,

Wilm M, Vorm O, Mortensen P, Shevchenko A, Boucherie H, Mann M (1996). Ligando genoma y el proteome por spectrometry total: identificacin en grande de las protenas de la levadura de los geles de dos dimensiones ". Proc. Nacional. Acad. Sci. LOS E.E.U.U. 93 (25): 144405. doi:10.1073/pnas.93.25.14440. PMID 8962070.

8.

^ Wang W, sol J, Nimtz M, Deckwer WD, Zeng AP (2003). La identificacin de la protena del anlisis de dos dimensiones del electrophoresis del gel de los pneumoniae del Klebsiella por uso combinado de los datos del spectrometry total y del genoma crudo ordena. Ciencia de Proteome 1 (1): 6. doi:10.1186/1477-5956-1-6. PMID 14653859.

9.

a b

Hufnagel P, Rabus R (2006). La identificacin spectrometric total de protenas en poste-genomic complejo proyecta. Protenas solubles del SP metablico verstil, de desnitrificacin de Aromatoleum. tensin EbN1 ". J. Mol. Microbiologa. Biotechnol. 11 (1-2): 5381. doi:10.1159/000092819. PMID 16825790.

Acoplamientos externos

Clase particular de PMF

Electrophoresis de la protena - Pgina 1

En qumica y medicina, electrophoresis de la protena (a.k.a. Inmunoelectroforesis ) es un mtodo de analizar una mezcla de protenas por medio de electrophoresis del gel, principalmente adentro sangre suero (plasma de sangre no es conveniente). Antes del uso extenso de los geles del electrophoresis, el electrophoresis de la protena fue realizado en el papel (a veces conjuntamente con el chromotography de papel).

Interpretacin
Hay dos clases de sangre protenas: albmina del suero y globulina. Son generalmente iguales en la proporcin, pero albmina es mucho ms pequeo y cargado ligeramente negativamente, conduciendo a una acumulacin de la albmina en el gel electrophoretic. Una venda pequea antes de la albmina representa transthyretin (tambin nombrado prealbumin). Algunas formas de productos qumicos de la medicacin o del cuerpo pueden causar su propia venda, generalmente pequea. Las vendas anormales (puntos) se ven adentro gammopathy monoclonal de la significacin indeterminada y myeloma mltiple, y sea til en la diagnosis de estas condiciones.

globulinas son clasificados por su patrn de bandas (con sus representantes principales):

alfa la venda (del ) consiste en dos partes, 1 y 2:

1 - 1- antitrypsin, 1- glicoprotena cida.

2 - haptoglobin, 2- macroglobulina, 2- antiplasmin, ceruloplasmin. beta venda (del ) - transferrin, LDL, complemento

gamma venda (del ) - inmunoglobulina (IgA, IgD, IgE, IgG e IgM). Paraproteins (en myeloma mltiple) aparezca en esta venda.

Prediccin de la estructura de la protena - Pgina 1

Estructura de la protena prediccin es una de las metas ms importantes perseguidas cerca bioinformatics y qumica terica. Su puntera es la prediccin de la estructura tridimensional de protenas de su aminocido secuencias, a veces incluyendo la informacin relevante adicional tal como las estructuras de protenas relacionadas. Es decir se ocupa de la prediccin de una protena estructura terciaria de su estructura primaria. La prediccin de la estructura de la protena es de alta importancia adentro medicina (por ejemplo, adentro diseo de la droga) y biotecnologa (por ejemplo, en el diseo de la novela enzimas). Cada dos aos, el funcionamiento de mtodos actuales se determina en CASP experimento.

El papel prctico de la prediccin de la estructura de la protena es ms importante ahora que siempre. Las cantidades masivas de datos de la secuencia de la protena son producidas por en grande moderno DNA ordenar esfuerzos tales como Proyecto humano del genoma. A pesar de esfuerzos a nivel comunitario adentro genomics estructural, la salida de las estructuras experimental resueltas de la protena - tpicamente por desperdiciador de tiempo y relativamente costoso Cristalografa de la radiografa o Espectroscopia NMR - se est retrasando lejos detrs de la salida de las secuencias de la protena.

Un nmero de factores existen que hacen prediccin de la estructura de la protena una tarea muy difcil. Los dos problemas principales son que el nmero de las estructuras posibles de la protena es extremadamente grande, y que la base fsica de la estabilidad estructural de la protena no est entendida completamente. Consecuentemente, cualquier mtodo de la prediccin de la estructura de la protena necesita una manera de explorar el espacio de estructuras posibles eficientemente (una estrategia de la bsqueda), y una manera de identificar la estructura ms plausible ( energa funcin).

En prediccin comparativa de la estructura, el espacio de la bsqueda es podado por la asuncin que la protena en la pregunta adopta una estructura que est razonablemente cerca de la estructura por lo menos de una protena sabida. En de novo o ab initio estructure la prediccin, ninguna tal asuncin se hace, que da lugar a un problema mucho ms duro de la bsqueda. En ambos casos, una funcin de la energa es necesaria reconocer la estructura nativa, y dirigir la bsqueda para la estructura nativa. Desafortunadamente, la construccin de tal funcin de la energa es en gran parte un problema abierto.

Simulacin directa de plegamiento de la protena en detalle atmico, va mtodos por ejemplo dinmica molecular con una funcin conveniente de la energa, no est tpicamente manejable debido al alto coste de cmputo, a pesar de los esfuerzos de proyectos que computan distribuidos por ejemplo Folding@home. Por lo tanto, la mayora de los mtodos de la prediccin de la estructura de de novo confan en representaciones simplificadas de la estructura atmica de protenas.

Las ediciones antedichas se aplican a todas las protenas, incluyendo bien-comportarse, pequeo, monomeric protenas. Adems, para las protenas especficas (como por ejemplo protenas multimeric y las protenas desordenadas), las ediciones siguientes tambin se presentan:

Prediccin de la estructura de la protena Pgina 2

Algunas protenas requieren la estabilizacin de dominios adicionales o de socios obligatorios adoptar su estructura nativa. Este requisito es tpicamente desconocido por adelantado y difcil de dirigir por un mtodo de la prediccin.

La estructura terciaria de una protena nativa no se puede formar fcilmente sin la ayuda de agentes adicionales. Por ejemplo, protenas conocidas como chaperones se requieren para algunas protenas para doblar correctamente. Otras protenas no pueden doblar correctamente sin modificaciones por ejemplo glycosylation.

Una protena particular puede poder asumir conformations mltiples dependiendo de su ambiente qumico. La conformacin biolgicamente activa puede no ser la la mayora termodinmico favorable.

Debido al aumento en energa de computadora, y especialmente a los nuevos algoritmos, mucho progreso se est haciendo para superar estos problemas. Sin embargo, la prediccin de routine de novo de las estructuras de la protena, incluso para las protenas pequeas, todava no se alcanza.

Contenido

1 Ab initio el modelar de la protena 2 El modelar comparativo de la protena

3 Prediccin de la geometra de la cadena lateral

4 Software

5 complejos de la Protena-protena 6 Vea tambin

7 Referencias

8 Acoplamientos externos

Ab initio el modelar de la protena

Ab initio- o de novo- la protena que modela bsqueda de los mtodos para construir la protena tridimensional modela del rasguo, es decir, basado en principios fsicos ms bien que (directamente) en las estructuras previamente solucionadas. Hay muchos procedimientos posibles esa cualquier tentativa de mmico plegamiento de la protena o aplique alguno estocstico mtodo para buscar soluciones posibles (es decir, optimizacin global de una funcin conveniente de la energa). Estos procedimientos tienden para requerir recursos de cmputo extensos, y se han realizado as solamente para las protenas minsculas. Para predecir la estructura de la protena de novo para protenas ms grandes requerir algoritmos mejores y recursos de cmputo ms grandes como sos producidos por o los superordenadores de gran alcance (por ejemplo Gene azul o MDGRAPE-3) o el computar distribuido (por ejemplo Folding@home, Proyecto que dobla humano de Proteome y Rosetta@Home). Aunque estas barreras de cmputo son extensas, las ventajas potenciales del genomics estructural (por mtodos predichos o experimentales) hacen ab initio prediccin de la estructura un campo activo de la investigacin.

Prediccin de la estructura de la protena - Pgina 3 El modelar comparativo de la protena

La protena comparativa que modelaba aplicaciones solucion previamente las estructuras como puntos de partida, o plantillas. Esto es eficaz porque aparece que aunque el nmero de protenas reales es extenso, hay un sistema limitado de terciario adornos estructurales pertenecen a qu la mayora de las protenas. Se ha sugerido que hay solamente alrededor 2000 dobleces distintos de la protena en naturaleza, aunque hay muchos millones de diversas protenas.

Estos mtodos se pueden tambin partir en dos grupos:

El modelar de la homologa se basa en la asuncin razonable que dos homlogo las protenas compartirn las estructuras muy similares. Porque el doblez de una protena ms evolutionarily se conserva que su secuencia del aminocido, una secuencia de la blanco se puede modelar con exactitud razonable en una plantilla muy distante relacionada, a condicin de que la relacin entre la blanco y la plantilla se puede discernir

a travs alineacin de la secuencia. Se ha sugerido que el embotellamiento primario en modelar comparativo se presenta de las dificultades alineadas ms bien que de errores en la prediccin de la estructura dada una saber-buena alineacin.[1] Unsurprisingly, el modelar de la homologa es el ms exacto cuando la blanco y la plantilla tienen secuencias similares.

El roscar de la protena[2] explora la secuencia del aminocido de una estructura desconocida contra una base de datos de estructuras solucionadas. En cada caso, una funcin que anota se utiliza para determinar la compatibilidad de la secuencia a la

estructura, as rindiendo modelos tridimensionales posibles. Este tipo de mtodo tambin se conoce como reconocimiento del doblez 3D-1D debido a su anlisis de la compatibilidad entre las estructuras tridimensionales y las secuencias lineares de la protena. Este mtodo tambin ha dado lugar a ejecucin de los mtodos bsqueda inversa del plegamiento evaluando la compatibilidad de una estructura dada con una base de datos grande de secuencias, as prediciendo qu secuencias tienen el potencial de producir un doblez dado.

Prediccin de la geometra de la cadena lateral

Incluso estructure los mtodos de la prediccin que son razonablemente exactos para la espina dorsal del peptide consiguen a menudo la orientacin y el embalaje del aminocido cadenas laterales mal. Los mtodos que tratan especficamente el problema de predecir geometra de la cadena lateral incluyen eliminacin del punto muerto y campo malo self-consistent mtodo. Ambos individualizan continuamente variar ngulos dihedral eso determina una orientacin de la cadena lateral concerniente a la espina dorsal en un sistema de rotamers con ngulos dihedral fijos. Los mtodos entonces procuran identificar el sistema de los rotamers que reducen al mnimo la energa total del modelo. Rotamers es los conformations de la cadena lateral con de poca energa. Tales mtodos son los ms tiles para analizar la protena hidrofbico base, donde las cadenas laterales se embalan ms de cerca; tienen ms dificultad que tratan los apremios ms flojos y la flexibilidad ms alta de los residuos superficiales.[3]

Prediccin de la estructura de la protena - Pgina 4 Software

MODELADOR es una herramienta popular del software para producir modelos de la homologa usando la metodologa derivada de Espectroscopia NMR de proceso de datos. SwissModel proporciona un web server automatizado para modelar bsico de la homologa. Las herramientas comunes del software para roscar de la protena son HHpred, bioinfo.pl, Robetta, y 3D-PSSM. El algoritmo bsico para roscar se describe adentro[2] y es bastante directo poner en ejecucin.

TIP es un knowledgebase de STRUCTFAST[4] los modelos y precomputed relaciones de la semejanza entre las secuencias, las estructuras, y los sitios obligatorios.

Una revisin muy reciente del software actualmente popular para la prediccin de la estructura se puede encontrar en.[5] Una lista parcial de los servidores de la tela y de las herramientas disponibles se mantiene aqu.

Varios el computar distribuido los proyectos referentes a la prediccin de la estructura de la protena tambin se han puesto en ejecucin, por ejemplo Folding@home, Rosetta@home, Proyecto que dobla humano de Proteome, Predictor@home y TANPAKU.

Foldit el programa intenta investigar el pattern-recognition y las capacidades el rompecabezassolucionar inherentes a la mente humana para crear un software ms acertado de la prediccin de la estructura de la protena de la computadora.

complejos de la Protena-protena Prediccin de la estructura de la protena - Pgina 5

En el caso de complejos de dos o ms protenas, donde las estructuras de las protenas se saben o se pueden predecir con alta exactitud, muelle de la protena-protena los mtodos se pueden utilizar para predecir la estructura del complejo. La informacin del efecto de mutaciones en los sitios especficos en la afinidad del complejo ayuda a entender la estructura compleja y a dirigir mtodos del muelle.

Vea tambin

Software de la prediccin de la estructura de la protena prediccin de la interaccin de la Protena-protena

Software que modela molecular

Referencias

1.

^ Zhang Y y Skolnick J (2005). El problema de la prediccin de la estructura de la

protena se poda solucionar usando la biblioteca actual de PDB. Proc Acad nacional Sci los E.E.U.U. 102 (4): 1029-1034. doi:10.1073/pnas.0407152101. Entrez PubMed 15653774.

2.

a b

Bowie JU, Luthy R, Eisenberg D (1991). Un mtodo para identificar las secuencias

de la protena que doblan en una estructura tridimensional sabida. Ciencia 253 (5016): 164-170. doi:10.1126/science.1853201. Entrez PubMed 1853201.

3.

^ Voigt CA, DB de Gordon, Mayo SL (2000). Exactitud que negocia para la velocidad: Una comparacin cuantitativa de los algoritmos de la bsqueda en diseo de la secuencia de la protena ". De Biol de J Mol 299 (3): 789-803. doi:10.1006/jmbi.2000.3758. Entrez PubMed 10835284.

4.

^ Debe DA, Danzer JF, Goddard WA, Poleksic A (2006). STRUCTFAST: Deteccin y alineacin usando la programacin dinmica de la novela y perfil-perfil alejados de la homologa de la secuencia de la protena que anota ". Protenas 64: 960-967. doi:10.1002/prot.21049. Entrez PubMed 16786595.

5.

^ Nayeem A, Sitkoff D, Krystek S Jr (2006). Un estudio comparativo del software

disponible para modelar high-accuracy de la homologa: De alineaciones de la secuencia a los modelos estructurales ". Protena Sci 15: 808-824. doi:10.1110/ps.051892906. Entrez PubMed 16600967.

Acoplamientos externos

v d e

CASP experimenta Home Page

Organigrama de la prediccin de la estructura (un mapa clickable)

Mtodos de la determinacin de la estructura de la protena

De alta resolucin

Cristalografa de la radiografa | NMR | Cristalografa del electrn

Resolucin media

microscopia del Cryo-electrn | Difraccin de la fibra | Spectrometry total | SAXS

Espectroscpico

NMR | Dicrosmo circular | Absorbencia | Fluorescencia | Anisotropy de la fluorescencia

Difusin de translacin

Ultracentrifugacin analtica | Cromatografa de la exclusin del tamao | Dispersin ligera | NMR

Difusin rotatoria

Anisotropy de la fluorescencia | Birrefringencia del flujo | Relajacin dielctrica | NMR

Producto qumico

intercambio del Hidrgeno-deuterio | mutagnesis Sitio-dirigida | Modificacin qumica

Termodinmico

Unfolding del equilibrio

De cmputo

Prediccin de la estructura de la protena | Muelle molecular

estructura Tertiary Structure cuaternario

muelle de la Protena-protena - Pgina 1

muelle de la Protena-protena es la determinacin de la estructura molecular de complejos formado por dos o ms protenas sin la necesidad de experimental medida. El estudio del muelle de la protena-protena fue alzado por el aumento rpido en las estructuras disponibles de la protena de los aos 90, y ahora ha estado bajo investigacin intensiva por sobre una dcada. Muchas protenas que siguen siendo relativamente rgidas sobre el complexation pueden ahora ser atracadas con xito. Los mtodos estn en el desarrollo para manejar los casos donde la conformacin interna de uno o ms de los socios cambia substancialmente.

el muelle de la Protena-protena no refiere generalmente a describir la trayectoria tomada por los componentes durante el complexation; el nico objeto del muelle es el estado complexed final. Puesto que el uso natural del muelle sugiere la direccin a lo largo de una trayectoria, el muelle de la protena-protena se puede mirar como misnomer.

Contenido
o o o o
1 Introduccin 1.1 muelle del Rgido-cuerpo contra muelle flexible 2 Mtodos

2.1 Mtodos recprocos del espacio 2.2 Mtodos de Monte Carlo

2.3 Seleccionar la estructura compleja atracada

2.4 Prueba patrn

2.5 El gravamen de CAPRI

3 Decidiendo si un complejo ocurre realmente en naturaleza y medir su afinidad 4 muelle de la Protena-protena y muelle molecular

5 Referencias

Introduccin
Para la mayor parte de las protenas sabidas a la ciencia, su biolgico papel, segn lo caracterizado por con cul obran recprocamente otras protenas ellas, incompleto se entienden. Incluso protenas que participan en un proceso biolgico bien-entendido (e. g. Ciclo de Krebs) puede tener los socios o funciones de la interaccin que estn sin relacin a ese proceso. Por otra parte, los nmeros extensos de protenas hipotticas fueron descubiertos en genomic revolucin de los ltimos aos 90, sobre los cuales no sigue siendo informacin en todos, aparte de su secuencia del aminocido.

muelle de la Protena-protena - Pgina 2

En los casos de las interacciones sabidas de la protena-protena, otras preguntas se presentan. Enfermedades genticas se saben para ser causados cerca misfolded o transformado protenas (e. g. fibrosis enquistada), y hay un deseo de entender lo que, si cualesquiera, interacciones anmalas de la protena-protena que una mutacin dada puede causar. En un futuro lejano, las protenas se pueden disear para realizar funciones biolgicas, y una determinacin de las interacciones potenciales de tales protenas ser esencial.

Para el sistema dado de protenas, las preguntas siguientes pueden presentarse:

Haga el lazo de las protenas in vivo?

Si atan,

Cul es la configuracin espacial que l adopta en su estado encuadernado?

Cmo es fuerte o dbil es su interaccin?

Si no atan, pueden ser hechos para atar induciendo una mutacin?

el muelle de la Protena-protena se propone para tener el ltimo potencial de tratar todas estas ediciones comprensivo. Adems, puesto que atracar mtodos se puede basar encendido puramente fsico los principios, las protenas uniformes de la funcin desconocida (o que se han estudiado relativamente poco) pueden ser atracados. El nico requisito previo es que su estructura molecular se ha determinado experimental, o puede ser estimado por una cierta tcnica terica (vase prediccin de la estructura de la protena).

muelle del Rgido-cuerpo contra. muelle flexible

Si ngulos en enlace, longitudes en enlace y ngulos de la torsin de los componentes no se modifican en ninguna etapa de la generacin compleja, l se conoce como muelle rgido del cuerpo. Un tema de la especulacin es si o no el muelle del rgido-cuerpo es suficientemente bueno para la mayora del muelle. Cuando el cambio substancial del conformational ocurre dentro de los componentes a la hora de la formacin compleja, el muelle del rgido-cuerpo es inadecuado. Sin embargo, anotar todos los cambios posibles del conformational es prohibitivo costoso en tiempo de computadora. Procedimientos del muelle que permiten el cambio del conformational, o muelle flexible los procedimientos, subconjunto pequeo selecto de la necesidad de conformational posible cambian inteligente para la consideracin.

muelle de la Protena-protena - Pgina 3 Mtodos

El muelle acertado requiere dos criterios:

Generando configuraciones de un sistema que incluye confiablemente por lo menos un uno casi correcto.

Confiablemente distinguir configuraciones casi correctas de las otras.

Para muchas interacciones, el sitio obligatorio se conoce en una o ms de las protenas que se atracarn. ste es el caso para anticuerpos y para inhibidores competitivos. En otros casos, un sitio obligatorio se puede sugerir fuertemente cerca mutgeno o phylogenetic evidencia. Las configuraciones donde las protenas interpenetraron seriamente pueden tambin ser eliminadas a priori.

Despus de hacer las exclusiones basadas en conocimiento anterior o stereochemical clash, el espacio restante de estructuras complexed posibles debe ser muestreado exhaustivo, uniformemente y con una suficiente cobertura para garantizar un golpe cercano. Cada

configuracin se debe anotar con una medida que sea capaz de alinear una estructura casi correcta sobre por lo menos 100.000 alternativas. Esto es una tarea de cmputo intensiva, y una variedad de estrategias se ha desarrollado.

Mtodos recprocos del espacio

Cada uno de las protenas se puede representar como enrejado cbico simple. Entonces, para la clase de las cuentas que son discretas circunvoluciones, las configuraciones relacionadas el uno al otro por la traduccin de una protena por un vector exacto del enrejado se pueden todos anotar casi simultneamente aplicndose teorema de la circunvolucin.[1] Es posible construir razonable, si es aproximado, circunvolucin-como anotar funciona representando aptitud stereochemical y electrosttica.

muelle de la Protena-protena - Pgina 4

Los mtodos recprocos del espacio se han utilizado extensivamente para su capacidad de evaluar nmeros enormes de configuraciones. Pierden su ventaja de la velocidad si se introducen los cambios torsionales. Otra desventaja es que es imposible hacer uso eficiente de conocimiento anterior. La pregunta tambin sigue siendo si las circunvoluciones tambin estn limitadas una clase de la funcin que anota para identificar el mejor complejo confiablemente.

Mtodos de Monte Carlo

En Monte Carlo, una configuracin inicial es refinada tomando las medidas al azar se aceptan o se rechazan que basado en su mejora inducida en cuenta (vase Criterio de la metrpoli), hasta que se han intentado algunos pasos. La asuncin es de que la convergencia a la mejor estructura ocurra de una clase grande de las configuraciones iniciales, slo una de las cuales necesita ser considerado. Las configuraciones iniciales se pueden muestrear grueso, y mucha hora del cmputo puede ser ahorrada. Debido a la dificultad de encontrar una funcin que anotaba que est discriminando altamente para la configuracin correcta y tambin converge a la configuracin correcta de una distancia, el uso de dos niveles de refinamiento, con diversas funciones que anotaban, se ha propuesto.[2] La torsin se puede introducir naturalmente a Monte Carlo como caracterstica adicional de cada movimiento al azar.

Los mtodos de Monte Carlo no estn garantizados para buscar exhaustivo, para poder faltar la mejor configuracin incluso usando una funcin que anota cul en teora la identificara. Cmo es severo un problema esto est para el muelle no se ha establecido firmemente.

Seleccionar la estructura compleja atracada

Para encontrar una cuenta que forme una base constante para seleccionar la mejor configuracin, los estudios se realizan en una prueba patrn estndar (vase abajo) de los casos de la interaccin de la protena-protena. Las funciones que anotan se determinan en la fila que asignan a la mejor estructura (la mejor estructura se debe alinear idealmente 1), y en su cobertura (la proporcin de los casos de la prueba patrn para los cuales alcanzan un resultado aceptable). Los tipos de cuentas estudiadas incluyen:

muelle de la Protena-protena - Pgina 5

Heurstico cuentas basadas encendido residuo contactos. Complementariedad de la forma de superficies moleculares (stereochemistry). Energas libres, estimadas usando parmetros de mecnicos moleculares campos de la fuerza por ejemplo CHARMM o AMBARINO.

Deseabilidad Phylogenetic de las regiones que obran recprocamente.

Coeficientes que arraciman.

Es generalmente crear cuentas hbridas combinando unas o ms categoras arriba en una suma cargada que pesos se optimicen en casos de la prueba patrn. Para evitar al sesgo, los casos de la prueba patrn usados para optimizar los pesos no deben traslaparse con los casos usados para hacer la prueba final de la cuenta.

Prueba patrn
Una prueba patrn de 84 interacciones de la protena-protena con las estructuras complexed sabidas se ha desarrollado para los mtodos de prueba del muelle.[3] El sistema se elige para cubrir una amplia gama de los tipos de la interaccin, y evitar repiti caractersticas, tales como el perfil de las familias estructurales de los interactors segn SCOP base de datos. Los elementos de la prueba patrn se clasifican en tres niveles de dificultad (el ms difcil conteniendo el cambio ms grande de la conformacin de la espina dorsal). La prueba patrn del muelle de la protenaprotena contiene ejemplos del enzima-inhibidor, del antgeno-anticuerpo y de complejos homomultimeric.

El gravamen de CAPRI
Gravamen crtico de la prediccin de interacciones[4] es una serie en curso de acontecimientos en los cuales los investigadores a travs del intento de la comunidad para atracar las mismas

protenas, en la manera prevista por los asesores. Los redondos ocurren aproximadamente cada 6 meses. Cada uno redondo contiene entre un y seis complejos de la protena-protena de la blanco que estructuras se han determinado recientemente experimental. Los coordenadas y son llevados a cabo privado por los asesores, con la cooperacin del bilogos estructurales quin los determin. El gravamen de sumisiones es persiana doble.

muelle de la Protena-protena - Pgina 6

CAPRI atrae un de alto nivel de la participacin (37 grupos participaron por todo el mundo en siete redondos) y un de alto nivel del inters de la comunidad biolgica en general. Aunque los resultados de CAPRI estn de poca significacin estadstica debido al nmero pequeo de blancos en cada uno redondo, el papel de CAPRI en discurso que estimula es significativo. ( CASP el gravamen es un ejercicio similar en el campo de la prediccin de la estructura de la protena).

Decidiendo si un complejo ocurre realmente en naturaleza y medir su afinidad

Un mtodo de confianza para la prediccin de la afinidad tiene el potencial de transformar biologa de la bioqumica y de la clula. Aunque una perspectiva distante, prediccin de la afinidad se puede considerar como el ltimo logro en el muelle de la protena-protena.

muelle de la Protena-protena y muelle molecular

El campo del muelle de la protena-protena se orienta altamente de cmputo, y comparte acercamientos con muelle molecular. El muelle molecular se refiere a veces como muelle de la pequeo-molcula, para distinguirlo del muelle de la protena-protena. Protenas complexed con polynucleotide las molculas se estudian extensamente usando acercamientos similares o idnticos al muelle de la protena-protena, aunque si nucleotide la molcula es bastante pequea, el caso se puede enmarcar como a muelle molecular problema.

muelle de la Protena-protena - Pgina 7

Referencias
1.
^ Katchalski-Katzir E, Shariv I, Eisenstein M, Friesem AA, Aflalo C, Vakser IA (1992). Reconocimiento superficial molecular: determinacin del ajuste geomtrico entre las protenas y sus ligands por tcnicas de la correlacin ". Proc. Nacional. Acad. Sci. LOS E.E.U.U. 89 (6): 21959. doi:10.1073/pnas.89.6.2195. PMID 1549581.

2.

^ JJ gris, Moughon S, Wang C, Schueler-Furman O, Kuhlman B, Rohl CA, panadero D (2003). muelle de la Protena-protena con la optimizacin simultnea de los conformations de la dislocacin y del side-chain del rgido-cuerpo. J. Mol. Biol. 331 (1): 28199. doi:10.1016/S0022-2836 (03) 00670-3. PMID 12875852.

3.

^ Mintseris J, Wiehe K, perfora B, Anderson R, Chen R, Janin J, Weng Z (2005). Prueba patrn 2.0 del muelle de la Protena-Protena: una actualizacin ". Protenas 60 (2): 2146. doi:10.1002/prot.20560. PMID 15981264.

4.

^ Janin J, Henrick K, muda J, TENIENTE de Eyck, Sternberg MJ, Vajda S, Vakser I, Wodak SJ (2003). CAPRI: un gravamen crtico de interacciones predichas ". Protenas 52 (1): 29. doi:10.1002/prot.10381. PMID 12784359.

Anlisis de la protena de Bradford Pgina 1

Este artculo est sobre un procedimiento cientfico. Vea Bradford (desambiguacin) para otras entradas sobre Bradford.

Anlisis de la protena de Bradford es a espectroscpico el procedimiento analtico meda la concentracin de protena en una solucin. Es subjetivo, es decir. dependiente en la composicin de aminocido de la protena medida.

Contenido

1 Principio 2 Desventajas

3 Procedimiento modificado de Bradford 4 Anlisis alternativos

5 Referencias

6 Acoplamientos externos

Principio

El anlisis de Bradford, a colorimtrico el anlisis de la protena, se basa en absorbencia cambie de puesto en el tinte Coomassie cuando el reactivo previamente rojo del coomassie de la forma cambi y se estabiliz en azul del coomassie por el atascamiento de la protena. Dos tipos de interaccin en enlace ocurren aqu, la forma roja de tinte del coomassie primero dona su protn libre a los grupos ionizables en la protena, que causa una interrupcin del estado nativo de la protena, y por lo tanto expone sus bolsillos hidrofbicos. Los bolsillos hidrofbicos expuestos en la cadena de la protena atarn non-covalently a la regin no polar del tinte va la fuerza de van der Waals, ste colocar los grupos positivos de la amina a la proximidad con la carga negativa de tinte, y el enlace es consolidado ms a fondo por la interaccin inica entre los dos. El atar de la protena stablized la forma azul de tinte del coomassie, y la cantidad del presente complejo en la solucin es una medida para la concentracin de la protena por medio de la lectura de la absorbencia.

(Limite) la forma del tinte tiene espectro de absorcin el mximo sostuvo histricamente para estar en 595 nanmetro. catinico las formas (desatadas) son verdes o rojo mientras que el atar del tinte a la protena estabiliza el azul aninico forma del tinte. El aumento de la absorbencia en 595 nanmetro es proporcional a la cantidad de tinte encuadernado, y as a la cantidad (concentracin) de protena presente en la muestra.

Anlisis de la protena de Bradford Pgina 2

Desemejante de la otra protena anlisis, el anlisis de la protena de Bradford es menos susceptible a interferencia por los varios productos qumicos que pueden estar presentes en muestras de la protena. Una excepcin de la nota es concentraciones elevadas de detergente. El detergente comn tal como SDS, se podra encontrar en extractos de la protena porque es utilizado en lysing las clulas interrumpiendo su bilayer del lpido de la membrana. Mientras que otros detergentes interfieren con el anlisis en la alta concentracin, interferencia causada por el SDS est de dos diversos modos, y cada uno ocurri en una diversa concentracin; para la concentracin del SDS debajo de la concentracin crtica de la micela (conocida como CMC, 0.00333%W/V a 0.0667%) en una solucin del tinte del coomassie, tiende para atar bien con la protena y la apropiacin de los sitios obligatorios de la protena para el reactivo del tinte, que caus una subestimacin de la concentracin de la protena en la solucin. Para la concentracin del SDS sobre CMC, se asoci fuertemente a la forma verde de tinte del coomassie, y hace el equilibrio cambiar de puesto en producir ms de la forma verde, que aumentar la absorbencia en la independiente 595nm de la presencia de la protena. La otra interferencia puede venir del almacenador intermediario usado al preparar la muestra de la protena. La alta concentracin del almacenador intermediario causar una concentracin sobrestimada de la protena debido al

agotamiento de protones libres de la solucin por la base conyugal del almacenador intermediario. Esto no ser un problema si la concentracin baja de la protena (posteriormente el almacenador intermediario) se utiliza.

Desventajas
El anlisis de Bradford es linear sobre un shortrange, tpicamente a partir 2 g/ml a 120 g/ml, haciendo a menudo dilusiones de una muestra del tejido fino necesaria antes de anlisis.

Porque el anlisis de Bradford esencialmente mide la cantidad de arginine y de residuos hidrofbicos del aminocido, la composicin de aminocido puede alterar la curva de la concentracin-absorbencia dependiendo del porcentaje del arginine o de los aminocidos hidrofbicos en cada protena. Es por lo tanto necesario utilizar un estndar (e.g. BSA-- La albmina del suero vacuno) de quin protena empareja de cerca la protena medida en la composicin, solamente el error sistemtico (diversa composicin de aminocido para todas las protenas) debe considerado al realizar el anlisis.

Procedimiento modificado de Bradford

Mucha no de las linearidades proviene el equilibrio entre dos diversas formas del tinte que es perturbado agregando la protena. La aplicacin del nonlinearity el anlisis de Bradford puede ser solucionada midiendo el cociente del OD en 595 a 450 nanmetro. Este anlisis modificado de Bradford es aproximadamente 10 veces ms sensible y establo que el convencional.

Anlisis de la protena de Bradford Pgina 3 Anlisis alternativos

Los anlisis alternativos de la protena incluyen

UV espectroscopia

Anlisis de la protena del Biuret Anlisis de la protena de Lowry

Anlisis cido de la protena de Bicinchoninic Anlisis de la protena del mido-negro anlisis de la protena del o-phthalaldehyde

El kit del anlisis proporcionado por SIGMA es linear para las concentraciones hasta 1.4 mg/ml

Referencias

Bradford, M. M. (1976) Un mtodo rpido y sensible para la cuantificacin de las cantidades del microgramo de protena que utilizan el principio de Protena-Tee el atascamiento. Anal. Bioqumica. 72:248-254.

Zor, T. y Selinger, Z (1995) La linearizacin del anlisis de la protena de Bradford

aumenta su sensibilidad: estudios tericos y experimentales. Anal. Bioqumica. 236:302-8

Gene Ontology - Pgina 1

Gene Ontology proyecto, o VAYA, proporciona a vocabulario controlado para describir gene y producto del gene cualidades en cualesquiera organismo. Puede estar partido ampliamente en dos porciones. El primer es ontology s mismo--realmente tres ontologies, cada uno que representa un concepto dominante adentro Biologa molecular: funcin molecular de los productos del gene; su papel en multi-step procesos biolgicos; y su localizacin a componentes celulares. El ontolog (ies) es continuamente versiones actualizadas, y nuevas se hace disponible en una base mensual.

La segunda parte es la anotacin, la caracterizacin de los productos del gene usando trminos del ontology. Los miembros del consorcio del IR someten sus datos y se hace pblico disponible con el Web site del IR.

El IR es tambin parte de un esfuerzo ms grande de la clasificacin, Abra Ontologies biomdico (OBO).

Contenido

1 Historia 2 Trminos de Ontology del gene 3 Asociaciones de Ontology del gene

4 Vea tambin

5 Acoplamientos externos

Historia Gene Ontology - Pgina 2

El gene Ontology era originalmente en 1998 de un consorcio de investigadores el estudiar construido genoma de tres organismos modelo: Melanogaster del Drosophila (mosca de fruta), Musculus de Mus (ratn), y Saccharomyces cerevisiae (cerveceros o levadura de los panaderos). Muchas otras bases de datos modelo del organismo han ensamblado el consorcio de Ontology del gene, contribuyendo ambas anotaciones para los genes de unos o ms organismos y tambin contribuyendo al desarrollo de los ontologies. En el da enero de 2008, VAYA contiene sobre 24.500 trminos aplicables a una variedad amplia de organismos biolgicos. Hay un cuerpo significativo de la literatura en el desarrollo y el uso de VA, y se ha convertido en una herramienta estndar en bioinformatics arsenal.

Trminos de Ontology del gene

Cada uno VA trmino consiste en un identificador alfanumrico nico, un nombre comn, sinnimos (si fuera aplicable), y una definicin. Cuando un trmino tiene significados mltiples dependiendo de especies, el IR utiliza sensumarque con etiqueta para distinguir entre ellos. Los trminos se clasifican en solamente uno de los tres ontologies, que cada uno se estructuran como a grfico acclico dirigido.

Los nuevos trminos y anotaciones son sugeridos por los miembros de las comunidades de la investigacin y de la anotacin. Una vez que estn sometidos, a los miembros del consorcio del IR los repasen para determinar su aplicabilidad.

Si se decide que un trmino en el ontology no es apropiado, se desaprueba, o est marcado como haga anticuado. Esto puede suceder por un nmero de razones, tales como estar fuera del alcance del ontology o misleadingly que es nombrado o definido.

El archivo del ontology est libremente disponible de VA el Web site; los trminos se pueden buscar y hojear en lnea usando el browser del IR AmiGO. El proyecto de Ontology del gene tambin proporciona los mappings de sus trminos a otros sistemas de clasificacin que cubren las mismas reas de la biologa.

Gene Ontology - Pgina 3 Asociaciones de Ontology del gene

Un nmero de organizaciones, incluyendo las bases de datos modelo del organismo y las bases de datos grandes de la protena de los multispecies, realizan anlisis de las secuencias de la protena y publican las tablas de asociaciones entre los productos supuestos del gene y VAN los trminos.

stos estn libremente disponibles del Web site del IR y pueden ser descargado individualmente o en lnea el usar visto AmiGO.

En muchas ms viejas bases de datos genticas de la secuencia, las anotaciones llevan poco o nada de indicacin de su procedencia de modo que un usuario no pueda comprobar fcilmente la naturaleza y la fuerza de la evidencia detrs de ellas, que conduce a qu se sabe en el campo como el problema transitivo de la anotacin. Algn gene es caracterizado por real laboratorio mojado experimentos, y su secuencia depositada en una base de datos pblica importante con la anotacin de esos experimentos. Otras secuencias se anotan que no se han caracterizado en el laboratorio basaron en su semejanza de la secuencia sta, y estas otras secuencias alternadamente forman la base para con todo ms anotaciones, y as sucesivamente. As un usuario no puede saber cuntos pasos de la semejanza de la secuencia estn parados entre la anotacin para una cierta secuencia gentica y cualquier dato real del mojado-laboratorio.

Una asociacin del IR tiene indicar de los meta datos:

Quin hizo la asercin a que VA sta trmino se aplica al producto supuesto de esta secuencia de la protena

Cuando esta asercin fue hecha

Uno o ms tres-letra Cdigos de la evidencia denotando el tipo de evidencia en el cual se basa esta asercin.

Cualquier programa automtico hizo salir que no haya sido curated por un humano consigue el cdigo de la evidencia IEA significado Deducido de la anotacin electrnica. El uso de un cdigo con excepcin del IEA implica que un guardin humano ha comprobado esta anotacin. Por ejemplo TAS para Declaracin detectable del autor significa que un guardin ha ledo un de papel cientfico publicada y los meta datos para los osos de esa asociacin una citacin a ese papel. Por otra parte, ISS para Deducido de semejanza de la secuencia significa que un guardin humano ha repasado la salida de una bsqueda de la semejanza de la secuencia y verificada que es biolgico significativa.

Vea tambin
GOCat - un automtico VA Categorizer/Browser para ayudar a la anotacin funcional de los textos biomdicos [1] GoPubMed - Explore PubMed/MEDLINE con el gene Ontology Base de datos comparativa de Toxicogenomics - CTD integra los trminos de Ontology del gene

con datos toxicogenomic y de la enfermedad Proyecto de Ontology de la protena - Proporciona el acceso a la protena Ontology (PO) y a los documentos de la referencia que describen el PO y sus aplicaciones. EAGLi - Terminologa-accionado (gene Ontology, Suizo-Prot palabras claves) motor que contesta de la pregunta biomdica para MEDLINE [2] PAMGO, el gene Planta-Asociado Ontology del microbio Bioinformatics de DAVID - Los recursos en lnea libres de un bioinformatics proporcionan la interpretacin funcional de listas grandes de los genes derivados de estudios genomic

Acoplamientos externos

Consorcio de Ontology del gene - Proporciona el acceso a los ontologies, a las herramientas del software, a las listas anotadas del producto del gene, y a los documentos de la referencia que describen el IR y sus aplicaciones.

Centro nacional para Ontology biomdico

Abra Ontologies biomdico (OBO)

WikiProfessional - Desambiguacin, generacin del conocimiento e inteligencia de colaboracin - genes y protenas. Biblioteca de la fundicin de OBO de los ontologies interoperable de la referencia del patrn oro

GONUTS Wiki - Los terceros VAN documentacin del trmino, incluyendo los

acoplamientos A IR las anotaciones en muchos comandante organismo modelo bases de datos.

Neurotransmisor
De Wikipedia, la enciclopedia libre
Saltar a navegacin, bsqueda

La sinapsis permite a las neuronas comunicarse entre s, transformando una seal elctrica en otra qumica Un neurotransmisor es una biomolcula, sintetizada generalmente por las neuronas, que se vierte, a partir de vesculas existentes en la neurona presinptica, hacia la brecha sinptica y produce un cambio en el potencial de accin de la neurona postsinptica. Los neurotransmisores son, por tanto, las principales sustancias de las sinapsis ABC (con muchos rganos).

[editar] Procesos bioqumicos

Los procesos bioqumicos asociados con la neurotransmisin son:

Sntesis del neurotransmisor por las neuronas presinpticas. A veces participan las clulas gliales. Segn la naturaleza del neurotransmisor, ste se puede sintetizar en el soma neuronal o en las terminaciones nerviosas. Algunos neurotransmisores se sintetizan directamente en las terminaciones nerviosas gracias a enzimas que se han sintetizado en el soma y se han transportado a estas terminaciones. A travs del interior del axn fluye una corriente de sustancias libres o encerradas en vesculas, que pueden ser precursores tanto de los neurotransmisores o sus enzimas, llamada flujo axnico. Almacenamiento del neurotransmisor en vesculas sinpticas. por el vehculo primero

y cuarto

Liberacin del neurotransmisor por exocitosis, que es calciodependiente. Cuando llega un impulso nervioso a la neurona presinptica, sta abre los canales de calcio, entrando el ion en la neurona y liberndose el neurotransmisor en el espacio sinptico. El calcio adems de iniciar la exocitosis, activa el traslado de las vesculas a los lugares de su liberacin con la ayuda de protenas de membrana plasmtica y de la membrana vesicular. Cuando entra el calcio en la neurona, se activa una enzima llamada calmodulina que es una proteinquinasa, encargada de fosforilar a la sinapsina I, situada en la membrana de las vesculas y que las une a los filamentos de actina. Cuando la sinapsina I es fosforilada, las vesculas

sinpticas se despegan de la actina y se movilizan hacia los sitios donde deban vaciarse. La fusin de la membrana vesicular con la membrana plasmtica es un proceso complejo en el que intervienen varias protenas como la sinaptobrevina, sinaptotagmina, rab-3 (de la membrana vesicular) sintaxina, SNAP-25, n-sec 1 (de la membrana plasmtica) y factor sensible a n-etilmaleimida (NSF) con actividad ATP-asa. Este conjunto de protenas, forman el complejo SNARE que forma un poro en la membrana plasmtica y permite la fusin de ambas membranas y la salida del contenido vesicular al espacio sinptico.

Activacin del receptor del neurotransmisor situado en la membrana plasmtica de la neurona postsinptica. El receptor postsinptico es una estructura proteica que desencadena una respuesta. Los neurorreceptores pueden ser: Receptores ionotrpicos: Producen una respuesta rpida al abrir o cerrar canales inicos, que producen despolarizaciones o generando potenciales de accin o respuestas excitatorias o producen hiperpolarizaciones o respuestas inhibitorias. En el primer caso, actan canales de cationes monoinicos como los de Sodio y Potasio, mientras que en el segundo caso, son los canales de Cloruro los que se activan. Receptores metabotrpicos: Liberan mensajeros intracelulares, como AMP cclico, Calcio, y fosfolpidos por el mecanismo de transduccin de seales. Estos segundos mensajeros activan protenas quinasas, las cuales, fosforilan activando o desactivando canales al interior de la clula. En el caso de una despolarizacin, son los canales de Potasio que se cierran, en caso de hiperpolarizacin, los mismos canales son abiertos produciendo el aumento de cationes intracelulares.

Iniciacin de las acciones del segundo mensajero. Inactivacin del neurotransmisor, ya sea por degradacin qumica o por reabsorcin en las membranas. En el espacio sinptico, existen enzimas especficas que inactivan al neurotransmisor. Adems, las neuronas presinpticas tienen receptores para el neurotransmisor que lo recaptan introducindolo y almacenndolo de nuevo en vesculas para su posterior vertido.

Existen Superfamilas de receptores para cada uno de los diferentes tipos de neurotransmisores. Las drogas de accin cerebral actan en alguna o algunas de estas etapa/s. Los neurotransmisores ms conocidos son la acetilcolina, la norepinefrina, la dopamina y la serotonina. El gas xido ntrico es tambin un neurotransmisor, con un especial mecanismo de accin que no cumple todas las caractersticas de los neurotransmisores.

[editar] Neurotransmisores

Monoaminas o aminas bigenas: o Catecolaminas: dopamina (DA), noradrenalina (NE) y adrenalina (Epi) o Indolaminas: triptamina, serotonina (5-HT), melatonina (Mel) y bufotenina

Tironaminas: 3-iodotironamina Tiramina -feniletilamina Octopamina Histamina (H) steres: o Acetilcolina (Ach) Aminocidos: o cido gamma-aminobutrico (GABA) o Glicina (Gly) o Taurina o cido glutmico (Glu) o cido asprtico Purinas o Adenosina o ATP o GTP Prostaglandinas: o Protaglandina E (PGE) o Prostaglandina F (PGF) Neuropptidos: o Angiotensina II o Bombesina o Neurotensina o Neuromedina B o Galanina o Carnosina o Calcitonina o Pptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) o FMRFamida o Pptidos relacionados con la gastrina: colecistoquinina (CCK), gastrina,pptido liberador de gastrina (GRP) o Pptidos de la familia de la secretina: pptido intestinal vasoactivo (VIP), secretina, motilina y glucagn o Pptidos relacionados con el polipptido pancretico: neuropptido Y (NPY), pptido YY (PYY) y polipptido pancretico (PP) o Pptidos hipotalmicos: vasopresina (ADH), oxitocina, neurofisinas, orexinas, hormona liberadora de hormona del crecimiento (GHRH), somatostatina, hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH), hormona liberadora de tirotropina (TRH) y hormona liberadora de corticotropina (CRH). o Pptidos derivados de la POMC: corticotropina (ACTH), hormona estimulante de melanocitos (MSH) y lipotropina (LPH) o Opiceos endgenos: dinorfinas, encefalinas y endorfinas o Bradiquinina o Taquiquininas: sustancia P, kassinina, neuroquinina A y neuroquinina B Gases: o xido ntrico o Monxido de carbono.
o o o o o

2.2.1. Protenas G Recomendar esta ficha a un amigo 2. NEUROPPTIDOS >> 2.2. PROTENAS DE ACOPLAMIENTO >> 2.2.1. Protenas G Existen mltiples formas de las protenas G en el sistema nervioso, cada protena G es un heterodmero compuesto de subunidades a, b y g simples. La actividad funcional de las protenas G implica su disociacin y reasociacin en respuesta a seales extracelulares. Las protenas G unen directamente algunos receptores neurotransmisores con canales inicos y regulan niveles intracelulares de segundos mensajeros. A finales de los 50 cuando Sutherland y sus colegas demostraron que la adrenalina induce glucogenolisis en el hgado estimulando la sntesis de un segundo mensajero, adenosn 3, 5monofosfato cclico (AMP o AMPc). Desde aquella poca, el AMPc y otras pequeas molculas (ej. GMPc, NO y los metabolitos y fosfatidilinositol y del cido araquidnico). Estos mensajeros median muchas de las acciones de hormonas y neurotransmisores sobre diversos aspectos del funcionamiento neuronal. En la actualidad la atencin se ha centrado tambin en una clase de protenas unidas al nucletido guanina, llamadas protenas G como los factores que tpicamente se acoplan a los receptores de membrana para la generacin de segundos mensajeros intracelulares. Con la excepcin de la transmisin sinptica mediada va receptores que forma canales inicos, la familia de protenas G parece estar implicada en todas las seales de transmembrana en el sistema nervioso. Las protenas G, identificadas y caracterizadas por Rodbell, Gilman y otros, son llamadas as a causa de la capacidad para unir los nucletidos de guanina, guanosina trifosfato (GTP) y difosfato guanosina (GDP), tambin poseen una actividad GTPasa intrnseca. Muchos tipos de protenas efectoras estn influidas por las protenas G; estas incluyen en canales inicos, adenil ciclasa, fosfolipasa C (que cataliza la hidrlisis de fosfatidilinositol), fosfolipasa A2 (que catalizas la hidrlisis del cido araquidnico), y fosfodiesterasa (PDE) (en segmentos exteriores de bastoncillos). Fueron identificadas tres formas de protena G en estudios tempranos. Gt, denominada transducina, fue identificada como la protena G que se une a la rodopsina para la regulacin del funcionamiento de clulas fotorreceptoras, y Gs y Gi fueron identificados como las protenas G que se unen a los receptores de membrana para la estimulacin e inhibicin, respectivamente, de la adenil ciclasa, la enzima que cataliza la sntesis de AMPc. Adems de Gt, Gs y Gi, los otros tipos principales de protena G en el cerebro son designados Go, Golf, Ggust, Gz, Gq y G11-16. Los diferentes tipos de protenas G contienen distintas subunidades a, que son responsables por su actividad funcional especfica. Los tipos de subunidades a de protenas G que se saben que existen estn listados en siguiente tabla.

Tabla 2: alfa-subunidades de protena G heterotrimricas en el cerebro. (Tomado de Basic Neurochemistry, Siegel, G (Ed)) La actividad funcional de las protenas G implica su disociacin y reasociacin en respuesta a seales extracelulares. En estado de reposo, las protenas G funcionan como heterodmeros que estn unidos a GDP y no estn asociados con receptores extracelulares o con protenas efectoras intracelulares. Cuando un ligando se une a (y activa) un receptor, da lugar a un cambio conformacional en el receptor, lo que provoca que se asocie a la subunidad a de la protena G al receptor, esto altera la conformacin de la subunidad a y conduce (1) al desplazamiento del GDP por el GTP unido a la subunidad a, (2) a la separacin de las subunidades bg desde la protena G, y (3) a la liberacin de la unin receptor-protena G. Este proceso genera una subunidad a unida a GTP, que es biolgicamente activa y que puede regular la actividad funcional de las protenas efectoras dentro de la clula. El sistema vuelve a su estado de reposo cuando el ligando es liberado desde el receptor y la actividad de la Gtpasa que hidroliza al GTP que estaba unido a la subunidad a en GDP. La accin posterior conduce a la reasociacin de las subunidades a libres con las subunidades bg compuestas para restaurar el heterodmero original, que es la protena G. Se ha dicho que las protenas G provocan la fosforilacin por medio de protenas quinasas dependientes de AMPc y calcio-dependientes y por medio de protenas quinasas tirosina. Las protenas G asocian algunos receptores de neurotransmisores directamente a los canales inicos. En la mayora de los casos, la subunidad a liberada desde la interaccin receptor-protena G directamente abre o cierra un canal inico especfico. Uno de los ejemplos mejor establecidos de este tipo de mecanismos en el cerebro es la asociacin de receptores opiceos, a2-adrenrgicos, D2 dopaminrgicos, muscarnicos colinrgicos, serotoninrgicos 5-HT1A y GABAB. Algunos de estos mismos receptores de neurotransmisores se han demostrado que se asocian de la misma manera a canales Ca2+ dependientes del voltaje va los mismos tipos de protenas G, aunque los canales son inhibidos por esta interaccin. Las protenas G controlan los niveles de AMPc intracelular mediando la capacidad de los neurotransmisores para activar o inhibir la adenil ciclasa (siguiente tabla).

Tabla 3: Ejemplos de la regulacin de neurotransmisores por medio de la adenil ciclasa. (Tomado de Basic Neurochemistry, Siegel, G (Ed)) El mecanismo por medio del cual los neurotransmisores estimulan la adenil ciclasa est bien establecido. La activacin de estos receptores de neurotransmisores que se asocian a Gs resulta en la generacin de subunidades Gas que se unen a y activan directamente la adenil ciclasa. La familia transducin de protenas G media la transduccin de la seal en el sistema visual regulando las formas especficas de PDE, una enzima que cataliza el metabolismo de los nucletidos cclicos. Gat activa a PDE va la unin directa al enzima. La capacidad de los receptores de neurotransmisores para estimular la va de segundo mensajero fosfatidilinositol est mediada por la activacin de la fosfolipasa C, que cataliza la hidrlisis del fosfatidilinositol en los segundos mensajeros inositol trifosfato y diaciglicerol. Ahora parece que la activacin inducida por los neurotransmisores de la fosfolipasa C est mediada va protenas G. En la mayora de los casos, Gq est implicada, y se piensa que Gaq se une a y directamente activa ciertas formas de fosfolipasa C. El mecanismo por el que las protenas G median la regulacin neurotransmisora del metabolismo del cido araquidnico, va la activacin o inhibicin de la fosfolipasa A2, est menos comprendida, pero puede tambin implicar a los subtipos Gi y Go. Un rasgo que unifica a las diferentes clases de protenas G es que la unin a GTP incrementa la afinidad de las protenas por algunas molculas objetivos, mientras que la unin de GDP reduce esta afinidad. Una clase principal de protena G, denominada protenas G pequeas, es la familia ras, que fueron inicialmente identificadas como los productos de oncogenes de virus de sarcoma de rata. Homlogos celulares normales de oncogenes son a menudo referidos como proto-oncogenes.

Patologas relacionadas con la protena G

Se ha demostrado que las protenas G estn implicadas en la etiologa de varios estados de enfermedad. Algunos de los adenomas de la pituitaria estn provocados por mutaciones en Gas que alteran su actividad funcional. Diferentes tipos de mutaciones en Gas son responsables de pseudohipoparatiroidismo, una enfermedad hereditaria rara en la que los tejidos diana son resistentes a las acciones fisiolgicas de la hormona paratiroide a pesar de la existencia de un nmero normal de receptores de hormona activos funcionalmente.

Recientemente, la neurofibromatosis tipo 1, un trastorno familiar caracterizado por tumores benignos mltiples en ciertas clulas gliales, se demostr que era debido a una mutacin en los genes que codifican la protena de activacin GTPasa, o GAP. La GAP funciona estimulando la actividad intrnseca a la GTPasa en la familia ras de protenas G Mr pequea. Esto distingue a ras de las subunidades a de las protenas G heterodimricas cuya actividad GTPasa no es dependiente de una protena activadora. La mutacin en GAP que conduce a la fibromatosis vuelve a GAP incapaz de activar la actividad GTPasa de ras. Esto significa que la forma de unin de GTP de ras permanece activa durante periodos anormales de tiempo y conduce, a travs de un mecanismo todava desconocido, al crecimiento anormal de la clula. La importancia crtica de las protenas G Mr pequea en el crecimiento y diferenciacin celular es destacada por la consideracin de que varias formas de estas protenas son proto-oncogenes. Esto significa que las mutaciones en estas protenas que resulta en alteraciones de las propiedades reguladoras pueden conducir a la oncognesis. Ras en particular ha sido implicado en varios tipos de cncer en humanos. Adems de su implicacin en diferentes estados de enfermedad, los niveles de subunidades de protena G heterodimrica se ha demostrado que se alteran en regiones especficas del sistema nervioso central en respuesta a la exposicin crnica a muchos tipos de drogas psicoactivas. Esto ha sido demostrado en drogas antidepresivas, litio (utilizado en el tratamiento de la mana y la depresin), opiceos, cocana y alcohol. Se ha presentado evidencia para sugerir que las alteraciones inducidas por las drogas en los niveles de protenas G contribuyen en las acciones teraputica o adictiva de estas drogas en el cerebro.