UNIVERSIDA

D VIZCAYA
DE LAS
Departamento
AMERICAS
de Ciencias
de la Salud
Manual de
Prácticas del
Laboratorio de
Microbiología
Licenciatura:
Médico
Cirujano
Dentista
Docente: M.C.
María Elena
Anguiano
Lizárraga

Hermosillo, Sonora

1
Contenido
INTRODUCCIÓN.............................................................................................................................3
NORMAS GENERALES PARA EL TRABAJO EN LABORATORIO.....................................4
Procedimientos Generales en el Trabajo de Laboratorio................................................5
Materiales Indispensables para cada Práctica...................................................................5
PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA.......................................................6
PRÁCTICA 1: Equipamiento Y Bioseguridad En El Laboratorio De Microbiología...6
PRÁCTICA 2: Uso Del Microscopio Óptico Y Su Importancia........................................8
PRACTICA 3 TINCIÓN GIEMSA............................................................................................11
PRÁCTICA 4: PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO..............................................15
Práctica 5 Sembrado De Cultivo Bacteriano En Placa..................................................20
Práctica 6 Tinción Gram........................................................................................................23
BIBLIOGRAFÍA.............................................................................................................................27

2
 INTRODUCCIÓN

La microbiología es la ciencia que estudia a los organismos microscópicos. Esta

ciencia experimental tiene como objetivo el estudio de los microorganismos,
dichos seres vivos se encuentran en la escala de micras (µm) abarcando un
margen de estudio enorme, debido a la heterogeneidad de estructurales,
funcionales y taxonómicos: desde partículas no celulares como los virus, viroides y
priones, hasta organismos celulares como las bacterias, los protozoos y parte de
las algas y de los hongos.

Los microorganismos están presentes por todas partes a nuestro alrededor y, a

pesar de sus aspectos más negativos, son absolutamente necesarios para el
desarrollo de la vida en nuestro planeta.

El estudio de los microorganismos comprende el conocimiento de su forma,

estructura, reproducción, fisiología, metabolismo e identificación. Al igual que su
distribución en la naturaleza, y el impacto que poseen en el hombre y medio
ambiente.

El siguiente manual de prácticas de Microbiología pretende de manera general,

introducir al estudiante en el estudio de los microorganismos, donde el alumno

será capaz de identificar y describir las características estructurales, tintoriales,

nutricionales, metabólicas, de patogenicidad y virulencia. Además el estudiante
podrá identificar e interpretar los métodos y técnicas para el diagnóstico de las
enfermedades infecciosas, igualmente será capaz de analizar y describir los
géneros bacterianos, micóticos y grupos virales de importancia para el cirujano
dentista, complementando así los temas comprendidos en las sesiones teóricas.

3
 NORMAS GENERALES PARA EL TRABAJO EN
LABORATORIO

Para el trabajo en laboratorio es necesario cumplir con las siguientes normas

básicas:

1. Indispensable el uso de bata (cerrada) quitarse antes de salir del laboratorio.

2. Lavarse las manos con agua y jabón al inicio y al final de cada práctica y cada
vez que se sospeche el contacto con material contaminado, usar guantes,
cubrebocas.

3. Prohibido, comer, beber, fumar, almacenar alimentos, aplicarse cosméticos,

cambiarse lentes de contacto y uso del celular.

4. Trabajar con el cabello recogido cuando éste sea largo.

5. No pipetear con la boca, usar bombilla o pipeteador automático.

6. No deben dejarse mecheros encendidos si no se está trabajando con ellos.

Asimismo, debe evitarse la proximidad del mechero a sustancias inflamables, tales
como alcohol, éter, entre otras.

7. Minimice la generación de aerosoles.

8. En caso de accidente (ruptura de material contaminado, derramamiento de

microorganismos) se comunicará inmediatamente al docente o al responsable del
laboratorio.

9. Observe las medidas de seguridad establecidas en el laboratorio.

10. No se admitirán visitas personales que distraigan y pongan en riesgo la

seguridad en el trabajo que se realiza.

4
 Procedimientos Generales en el Trabajo de Laboratorio

1. Mantener la disciplina dentro del laboratorio, hablando lo necesario sin levantar

la voz, manteniendo siempre el orden y evitando cualquier escándalo.

2. Desinfectar el área de trabajo antes y después de trabajar, mantener ordenado

y limpio su espacio.

3. Siempre deberá dejar perfectamente limpios todos los equipos utilizados

(microscopios, autoclave, balanza analítica, etc.)

4. Al concluir cada práctica el estudiante deberá asegurarse de que los materiales

de desecho u objetos contaminados sean colocados en recipientes específicos
para ello, colocarlos en lugares apropiados, que les indicará el profesor.

5. Por ningún motivo se podrá sustraer el material y/o equipo sin la autorización
del maestro responsable del laboratorio.

6. Abstenerse de intentar reparar equipo por iniciativa propia y/o manipular equipo
del cual se desconoce su operación.

7. Libros, mochilas, carpetas y cualquier otro material que no se utilice en la

realización de la práctica deben ser apartados del lugar de trabajo.

8. Las siembras y resiembras deberán realizarse siempre en el área de esterilidad

del mechero Bunsen (aproximadamente 15 cm). Se deben evitar los
desplazamientos innecesarios por el laboratorio, ya que crean corrientes de aire
que originan contaminaciones o pueden ser causa de accidentes.

Materiales Indispensables para cada Práctica

1. Bata de laboratorio limpia, manga larga y con sistema de apertura rápido.

2. Protocolo (diagrama de flujo) de la práctica y bitácora de laboratorio.

3. Marcador indeleble, tijeras, cerillos u encendedor, masking tape.

5
 PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

PRÁCTICA 1: Equipamiento Y Bioseguridad En El Laboratorio De

Microbiología

OBJETIVO:
El alumno se familiarizará con las instalaciones y equipamiento del laboratorio de
ciencias, además de analizar y comprender la importancia de la bioseguridad
dentro de laboratorio. Al igual se analizara la norma de manejo de residuos
biológico-infeccioso Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002.

INTRODUCCIÓN

El trabajo en laboratorio con lleva una serie de riesgos los cuales implica la
probabilidad de que ocurra un daño, lesión o enfermedad; relacionados con las
instalaciones, reactivos, equipos, materiales y muestras (origen biológico) con las
que se trabaja. Por lo cual, la prevención de los riesgos en laboratorio es de gran
importancia. (Richmond, J. Y., et al. 2002)

La mejor manera de gestionar un buen uso del laboratorio, al igual que una buena
práctica, es teniendo el conocimiento previo sobre los equipos, instalaciones,
áreas de evacuación, materiales y muestras con las que trabajamos, además de
una buena organización a la hora de realizar nuestro trabajo en laboratorio.

La bioseguridad es un concepto amplio que implica una serie de medidas

orientadas a proteger al personal que trabaja en el laboratorio, y al medio
ambiente que pueden verse afectados como resultado de las actividades en el
laboratorio. (Richmond, J. Y., et al. 2002)

En el contexto de los laboratorios de microbiología, la evaluación del riesgo se

concentra principalmente en la prevención de infecciones de laboratorio, cuando
se trate de actividades de laboratorio que involucren material infeccioso o

6
potencialmente infeccioso, la determinación del riesgo representa un ejercicio
crítico y productivo. Ayuda a asignar los niveles de bioseguridad (instalaciones,
equipo y prácticas) que reducen al mínimo el riesgo de exposición del trabajador o
del ambiente a un agente (OMS, 2005).

Los factores de interés en la evaluación del riesgo incluyen: La patogenicidad del

agente infeccioso, la ruta de transmisión, la estabilidad del agente, la dosis
infecciosa del agente, la concentración, el origen del material potencialmente
infeccioso. Otro de los factores esenciales a ser considerados es la disponibilidad
de una profilaxis eficaz o la intervención terapéutica (Chosewood y Wilson, 2009).

MATERIAL:
- Instalaciones del Laboratorio de Ciencias.

- Equipos del Laboratorio de Ciencias

- Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002. (Otorgada por el

docente).

-bitácora

PROCEDIMIENTO A REALIZAR:

- Se presentarán y analizarán los equipos con los que se cuenta en el

Laboratorio de Ciencias y se analizará la nom-087.

ACTIVIDAD DE LA PRÁCTICA:
- Se realizara un reporte donde se contenga la descripción, definiciones,
conceptos y funciones de los equipos e instalaciones del Laboratorio de
Ciencias.
- Se realizara un resumen de la nom-087.

7
PRÁCTICA 2: Uso Del Microscopio Óptico Y Su Importancia

OBJETIVO:
El alumno identificará cada una de las partes del microscopio compuesto y lo
manejará correctamente, observando la presencia de microorganismos en
muestras biológicas a través de preparaciones húmedas.

MATERIALES:
-Microscopio óptico
-Muestra (orina, agua estancada, etc.)
-Porta objeto
-Cubre objeto
-Centrifuga
-Tubos de 13x100
-Pipeta Pasteur 1 mL
-Aceite de inmersión
-Papel absorbente

INTRODUCCIÓN

El microscopio es el instrumento más utilizado y el más útil en un laboratorio de

microbiología, ya que nos proporciona la amplificación o agrandamiento que nos
permite ver organismos y estructuras invisibles a simple vista. Los microscopios
permiten una amplia gama de amplificaciones, desde cien veces a cientos de miles de
veces. Con el microscopio podemos observar forma, tamaño, características
tintoriales y ciertas estructuras presentes en los microrganismos (Becker, y col.,
2007).

El examen directo de microorganismos vivos puede tener gran utilidad para

determinar relaciones de tamaño, forma y movilidad. Puede ser preparación en

8
fresco y gota suspendida. La ventaja de esta última técnica, es que la preparación
permanece húmeda y puede ser observada durante un tiempo más largo. Ambos
métodos preservan la forma natural de los microorganismos y reducen los efectos
de distorsión que suelen ocurrir cuando los especímenes se secan y fijan. Las
preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos
principalmente parásitos en heces (Versalovic, 2011).

PROCEDIMIENTO A REALIZAR:

Manejo y Uso del Microscopio Óptico

1. Colocar el microscopio sobre una superficie plana, limpia y libre de objetos o

material que pudiera entorpecer la labor.

2. Si es necesario mover el microscopio hacerlo con una mano en el brazo y otra

debajo de la base. Acomodar el microscopio con los oculares y platina frente al
observador en una posición cómoda frente a Usted.

3. Colocar el portaobjetos con la preparación sobre la platina sujetándola con las

pinzas metálicas.

4. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de uso y hacer descender la

platina con el tornillo macrométrico

5. Iniciar la observación con el objetivo de 4 aumentos (4X) o colocar el de 10

aumentos (10 X) si la preparación es de bacterias.

6. Para realizar el enfoque:

a) Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, haciendo subir la

platina con el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando

9
 directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar
el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos.

b) Una vez logrado el mayor acercamiento entre la preparación y el objetivo,

observar a través de los oculares y hacer descender lentamente la platina
con los tornillos macrométrico y micrométrico hasta lograr un enfoque del
material presente en la preparación.

7. Luego mover el revólver y colocar el siguiente objetivo de mayor aumento la

imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el
tornillo micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió
por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y
repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca
distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances:
1) incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y 2)
mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se
enfocó con el objetivo de inmersión.

8. Girar el objetivo seco fuerte, fuera de la trayectoria de observación. Adicionar

una gota de aceite de inmersión sobre el área del portaobjetos, ajuste el objetivo
de inmersión (100X) en posición y enfoque la preparación con el tornillo
micrométrico. Registrar sus observaciones.

9. Cuando haya finalizado su observación, girar el revólver para colocarlo en el

objetivo de menor aumento (posición inicial). Nunca hacer girar el objetivo seco
fuerte (40X) sobre el aceite de inmersión.

10. Limpiar cada uno de los objetivos con papel y solución para lentes (el exceso
de aceite del portaobjetos, primero elimínelo mediante el uso de un trozo de papel
absorbente, sin tallar y el resto con un trozo de papel especial para lentes o de un
pañuelo desechable).

10
11. Cubrir el microscopio sin desconectarlo.

Preparación Directa o en Fresco ("entre porta y cubre")

Muestra:

1. Centrifugar aproximadamente 5 mL de muestra a 2,500 rpm durante 5 minutos.

2. Desechar el líquido sobrenadante en el lavabo y proceder a mezclar el

sedimento.

3. Con la ayuda de una pipeta Pasteur colocar una gota del sedimento mezclado
en el centro de un portaobjetos limpio y seco.

4. Colocar encima un cubreobjetos y observar con el objetivo débil, seco-fuerte y si

es necesario aplicar una gota de aceite de inmersión y observaron el objetivo de
mayor aumento (100X). Registrar sus observaciones.

ACTIVIDAD A REALIZAR:

-Reporte de laboratorio donde se describa lo observado y contestara las siguientes

preguntas:
1. ¿Cuál es el principio de funcionamiento del microscopio óptico?
2. ¿Qué se puede observar en un microscopio óptico?
3. ¿Qué es resolución? ¿Cuál es la máxima resolución de un microscopio
óptico?
4. ¿Qué otros microscopios existen? ¿En qué se fundamenta su principio de
funcionamiento?

PRACTICA 3 TINCIÓN GIEMSA

11
OBJETIVO:

El estudiante identificara y describirá los diferentes elementos celulares (tamaño,

forma, estructura) de frotis de sangre periférica, mediante el uso de tinciones,
comprenderá la importancia de estas técnicas, además de reforzar el aprendizaje
del uso del microscopio.

MATERIALES:

- Kit de extracción sanguínea

- Tubos con EDTA
- Portaobjetos
- Metanol
- Agua destilada
- Colorante Giemsa
- Aceite de inmersión
- Papel absorbente
- Microscopio óptico

INTRODUCCIÓN

Las células sanguíneas se clasifican en tres tipo; glóbulos rojos también

conocidos como eritrocitos, son las células encargadas del transporte y
distribución del oxígeno, ya que cuentan con una proteína transportadora de este
elemento llamada hemoglobina, dicha proteína globular se encuentra unida a una
molécula de hierro ferroso (Fe2+), lo cual permite la unión de O2, esto le brinda el
color característico a la sangre, ese rojo intenso. (Rodak, B. F. 2005). 

Otra de los tipos de células, que podremos observar en la sangre son los glóbulos
blancos, que son aquellas células que conforman el sistema inmunológico, de los
cuales podremos encontrar neutrófilos, linfocitos, eosinofilos, basófilos y
monocitos (macrófagos), su principal función es proteger al organismo de agentes
patógenos. (Abbas A. K., et al. 2022)

12
Además de estos dos tipos de células, en sangre periférica también podemos
encontrar las plaquetas o trombocitos, que son fragmentos de la célula
megacariocito que se encuentra en medula ósea. La principal función de las
plaquetas es la intervención en procesos de coagulación, siendo fundamentales
para la formación de coágulos o trombos. (Rodak, B. F. 2005). 

En ciertas enfermedades o infecciones, la concentración como la morfología de las

células sanguíneas se ven alteradas, por lo cual, el estudio e interpretación del
análisis de un frotis de sangre periférica como parte del hemograma, es
sumamente importante y considerado como uno de los estudios de rutina dentro
de un laboratorio de análisis clínicos. Con la ayuda de ciertos procesos, como las
tinciones se puede llegar observar e identificar cada una de las células sanguíneas
y sus características, permitiendo así identificar cuando hay algún cambio en ellas.
(Grinspan, S. 1985).

Usada en hematología, la tinción de Giemsa permite la diferenciación de las

distintas células sanguíneas. La solución de Giemsa colorea y revela eritrocitos,
basófilos, eosinófilos, polimorfonucleares, linfocitos, plaquetas y la cromatina de
los núcleos. Es una solución de metanol (fijador de la muestra), eosina (colorante
ácido) y azul de metileno (colorante básico), los que son muy sensibles a las
variaciones de pH de las estructuras. Esta tinción es de tipo Romanowsky, es
decir, que utiliza azul de metileno y sus productos de oxidación (azur A, B y C)
como colorante básico y se combina con eosina, como colorante ácido.
(Retamales Castelletto, E. et al. 2015).

METODOLOGÍA

Procedimiento a realizar: Preparación de frotis

1. Se colocara una pequeña gota de sangre periférica, en uno de los extremos

del portaobjeto.
2. Colocando cuidadosamente y con ayuda de otro porta objetos, se distribuirá
la muestra a lo largo del cristal.

13
 3. El frotis deberá ser de un grosor fino y con distribución homogénea, como
se muestra en las siguientes imágenes.

Imagen 1. Técnica de preparación de frotis de sangre.

Imagen 2. Ejemplos de frotis que se pueden obtener, y erros al realizarlos.

Procedimiento a realizar: preparación de la tinción

1. Obtenido el frotis, y previamente secado, se pasará a realizar la fijación de
la muestra, cubriendo en su totalidad la muestra de metanol por 5 minutos.
2. Pasado el tiempo retiraremos el metanol, y agregaremos el colorante
giemsa, el cual dejaremos interactuando con la muestra por 8 a 10 minutos.
3. Retiraremos el colorante y se realizara un lavado con agua destilada.
4. Se realizara un segundo lavado con agua destilada

14
 5. Se dejara reposar hasta que seque en un soporte.
6. Secada la muestra se observara en microscopio.

Actividad a realizar
- Se realizara una descripción de lo observado en microscopio.
- Investigar el fundamento de la tinción Giemsa
- Investigar principales enfermedades relacionadas con cambios
morfológicos en células sanguíneas (al menos 2 ejemplos de estas).

15
PRÁCTICA 4: PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

OBJETIVO:

El alumno aprenderá a preparar medios de cultivos, identificará y diferenciará la

diferencia entre el uso de cada medio, utilizados para el crecimiento de bacterias.
Además de aprender técnicas de esterilización de dichos medios.

MATERIALES:
-Matraz Erlenmeyer -Placas Petri
-Mechero bunsen -Agua peptonada
-Tripie -Agar Mc Conkey
-Tela de asbesto -Agar Sal manitol
-Probeta -Pipeta serológica de 10 ml
-Tubo de ensaye con tapón 13 x 100 -Perilla para pipeta
-Gradilla

INTRODUCCIÓN

Para lograr un crecimiento bacteriano in vitro optimo en laboratorio, es importante

contar con ciertos factores favorables para las bacterias; como la temperatura,
humedad, concentración de CO2 y medios de cultivos enriquecidos con nutrientes,
es decir, otorgar a la bacteria todo lo que necesita para su crecimiento.

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros

componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los
microorganismos. Los medios de cultivo pueden ser clasificados teniendo en
cuenta criterios muy diversos, por la naturaleza de sus nutrientes, por la

16
selectividad de crecimientos de ciertos microorganismos, entre otros. (Rodríguez,
C., et al 2018)

Los tipos de medios de cultivos que existen pueden ser:

A. MEDIOS GENERALES: Son aquellos que permiten el crecimiento de una

gran variedad de microorganismos.
B. MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO: Son aquellos que favorecen el
crecimiento de u determinado tipo de microorganismo sin llegar a inhibir
totalmente el crecimiento de los demás.
C. MEDIOS SELECTIVOS: Son aquellos que permiten el crecimiento de un
tipo de microorganismos determinado, inhibiendo el desarrollo de los
demás.
D. MEDIOS DIFERENCIALES: Son aquellos en los que se pone de manifiesto
propiedades que un determinado tipo de microorganismos posee.

El tipo de medio a utilizar, será seleccionado dependiendo de las necesidades

nutricionales de la bacteria de interés (Sanz, S et al 2011).

La utilización de estos reactivos en laboratorio de microbiología, son de gran

importancia para facilitar el crecimiento de las bacterias, partiendo de una muestra
clínica, de alimentos o ambientales.

METODOLOGÍA

1. Se prepararán 150 ml de cada uno de los medios (agar sal manitol y agar
Mc conkey)
2. En el caso del agua peptonada se preparan 100 ml
3. Se disolverán los medios en agua destilada, la concentración a disolver se
especificará por el fabricante según el medio de cultivo.

17
 4. La solución del medio de cultivo, se someterá a un calentamiento a punto de
ebullición para su homogenización. (evitar la formación de espuma)
5. Obtenida la solución ya disuelta, se someterá a una esterilización en
autoclave a 121°C por 15 min.
6. En el caso, del agua peptonada antes de esterilizar, se verterá 5 ml de agua
peptonada en tubos de ensaye con tapón 13 x 100.
7. Una vez esterilizados los medios se dejarán enfriar, a una temperatura de
40°C (antes de solidificar) se verterá el contenido en placas Petri estériles.
8. Se almacenarán en refrigerador a 4 °C previamente etiquetados.

Obtención de cultivo bacteriano

A. En el caso del agua peptonada, se inoculará una muestra de exudado

faríngeo.
B. Se incubará a 37°C de 24 a 48 hr.

18
Actividad a realizar
-En el reporte se deberán especificar los nutrientes y funciones de cada medio
utilizado en las prácticas.
-Determinar los tipos de medios cultivos
-La importancia del proceso de esterilización

19
 Práctica 5 Sembrado De Cultivo Bacteriano En Placa

OBJETIVO:

El estudiante aprenderá a realizar un sembrado mediante estrías cruzadas en

placas de agar diferencial, aprenderá la importancia de la técnica, al igual
comprenderá la importancia de la realización de cultivos bacterianos partiendo de
muestras de pacientes, para observar la formación de las colonias bacterianas,
comprender su morfología y características de estas.

MATERIALES

-Mechero bunsen

-Asa bacteriológica punta redonda

-Placas Petri (previamente realizadas)

-Cultivo bacteriano en agua peptonada (previamente obtenido)

INTRODUCCIÓN

20
En la naturaleza, al igual que en el organismo, las bacterias se encuentran
conformando poblaciones mixtas, esto se refiere que encontraremos mezclas de
especies bacterianas. Sin embargo para los estudios de estos microorganismos,
es importante poder aislarlas dentro de laboratorio, para realizar una identificación
y caracterización de dichas bacterias.

La identificación de una bacteria sospechosa de ser la causa de una infección es

uno de los instrumentos principales del diagnóstico y tratamiento de las
enfermedades infecciosas. Uno de los factores clave para identificar a las
bacterias como agentes patógenos depende de su aislamiento en cultivo puro.
Una colonia en cultivo puro está compuesta por un solo tipo de microorganismo y
procede de una sola célula original. Para obtener cultivos puros a partir de una
población microbiana mixta, se utilizan las denominadas técnicas de aislamiento
(Bou, G.et al 2011)

Existen diversos tipos de técnicas, entre ellas se encuentra el sembrar o inocular

una muestra en un medio de cultivo solidos selectivo o diferencial, los cuales se
caracterizan por contener elementos nutricionales selectivos que no todas las
bacterias pueden metabolizar, al igual de poseer inhibidores que impiden el
crecimiento de bacterias contaminantes. Esta técnica en conjunto de otras
pruebas como la producción de catalasas, diferentes tipos de tinciones, y/o
pruebas bioquímicas nos permiten la identificación correcta de la bacteria en
cuestión (López-Hontangas, J. et al. 2006)

METODOLOGÍA
1. Se prepara el área, previamente limpia y esterilizada; se colocara mechero.
2. Deberemos tener a la mano, tanto el cultivo previamente obtenido de la
muestra de exudado laríngeo y las placas Petri donde sembraremos o
inocularemos a la muestra.
3. Se esterilizara el Asa bacteriológica en el fuego del mechero.
4. Previamente esterilizada dejaremos enfriar por 5 segundos antes de
introducirla al tubo de cultivo, evitando en todo momento tocar los bordes

21
 de la boquilla del tubo
5. Realizaremos un sembrado por estría cruzada (como se observa en la
imagen 1)
6. Después de cada sembrado se esterilizara nuevamente el Asa y se repite
proceso en nuestra segunda placa.
7. Al finalizar el sembrado en ambas placas Petri, esterilizaremos nuevamente
el Asa exponiéndola al fuego.
8. Las placas previamente sembradas, serán incubadas a una temperatura de
37°C en la incubadora.

Imagen 1 Técnica de sembrado en estría cruzada en placa

22
Imagen 2 ejemplo de cultivo obtenido mediante la técnica de sembrado por estría
cruzada

Actividad a realizar
-Importancia del sembrado en placa Petri.
-Técnicas de aislamiento de bacterias.
-Técnica de sembrado por estría cruzada y otros tipos de sembrado, y sus
funciones.

Práctica 6 Tinción Gram

OBJETIVO

El alumno realizara una de las tinciones más importantes, utilizadas en

identificación bacteriana, tinción Gram, aprenderá la técnica y la importancia de
ella, al igual observara a microscopio la diferencia entre bacterias Gram positivas y
Gram negativas.

MATERIALES

-Cultivos bacterianos -Safranina

-Portaobjetos -Asa bacteriológica punta redonda

-Solución salina -Mechero de bunsen

-Cristal violeta -Microscopio óptico

-Alcohol etílico -Aceite de inmersión

-Lugol/yodo

INTRODUCCIÓN

23
En el año 1884 el bacteriólogo danés Hans Christian Gram, desarrollo una técnica
que permitía identificar la presencia de bacterias, por lo cual esta técnica lleva su
nombre. La tinción Gram es un tipo de tinción diferencial utilizado ampliamente en
laboratorio, mediante la cual se puede diferenciar de manera rápida y fácil las
bacterias según sus características morfológicas (Rodríguez, P, et al 2018).

Dicha técnica se basa en las características de la pared celular de las bacterias, y

su capacidad de retener dentro de ellas el cristal violeta. La bacteria al contar con
una pared celular “fuerte” permitirá retener en su interior este reactivo, a pesar de
los lavados con alcohol, a estas bacterias le denominaremos Gram positivas. En el
caso que las bacterias cuenten con una pared celular “débil” no podrán retener
dicho reactivo después de los lavados, dentro del método de tinción utilizaremos la
safranina, que brinda un color rosa/rojo, y las bacterias que adopten esta
coloración se les clasificara como Gram negativas (López-Jácome, L. et al 2014).

En muchos de los casos, el informe de la tinción Gram brinda información

relevante para la aplicación de un mejor tratamiento médico frente a un proceso
infeccioso. Por ejemplo: las infecciones causadas por bacterias Gram positivas
pueden ser tratadas con antibióticos del tipo de las penicilinas, en cambio las
infecciones causadas por bacterias Gram negativas pueden requerir la aplicación
de cefalosporinas o aminoglucósidos (Koneman y col., 2008).

METODOLOGÍA

Preparación de frotis

1. En caso de que el cultivo bacteriano se encuentre en placa, deberemos de

agregar una gota de solución salina en el centro de nuestro portaobjeto.
2. Con el Asa punta redonda previamente esterilizada en el fuego, tomaremos
una de las colonias de nuestra placa.
3. Se agregara la muestra obtenida en la gota de solución salina y será
dispersada con sutileza dejando aproximadamente un frotis de un tamaño
de 1cm2.

24
 4. Dejar secar al aire, sin soplar ni exponiéndolo a corrientes para evitar la
generación de aerosoles.
5. Una vez seco nuestro frotis, realizaremos una fijación de la muestra, con
calor suave, pasándola rápidamente sobre el mechero, sin que se caliente
alrededor de unas 5 veces.
6. La extensión deberá ser fina y uniforme, deberá permitir el paso de la luz.
7. Obtenido el frotis pasaremos a teñirlo con tinción Gram.

Tinción Gram

1. Se cubrirá el frotis con cristal violeta y se dejara actuar el colorante por 1

minuto.
2. Se realizara un lavado bajo el chorro de agua con poca presión (evitando el
barrido de la muestra).
3. Se cubrirá el frotis con una solución de lugol/yodo y se dejara actuar por 1
minuto. Una vez pasado el tiempo se repetirá el paso 2.
4. Se realizara la decoloración con alcohol, en el cual inclinaremos el
portaobjeto y agregaremos gota a gota el alcohol, hasta que deje de salir
colorante.
5. Nuevamente se repetirá el paso 2 donde se realizara un lavado a la
muestra.
6. Una vez lavada la muestra, agregaremos safranina y la dejaremos
interactuar con la muestra por 1 minuto, al finalizar volveremos hacer un
lavado como en el paso 2.
7. Se dejara secar la muestra y después la observaremos a microscopio.

25
 Imagen 1 Preparación de frotis

Imagen 2 Fijación del frotis por calor

1 2 3 4 1-Cristal
violeta
2-Lugol/yodo
3-Alcohol
etílico
4- Safranina

26
 Imagen 3 Orden de los reactivos a utilizar en la tinción Gram.

Actividad a realizar
1. Investigar cada uno de los reactivos a utilizar en tinción Gram y su
importancia en la técnica.
2. Fundamentos de la tinción Gram.

BIBLIOGRAFÍA

1. Richmond, J. Y., & McKinney, R. W. (2002). Bioseguridad en laboratorios

de microbiología y biomedicina.
2. OMS. 2005. Manual de Bioseguridad en el Laboratorio. Tercera Edición.
3. Chosewood LC, and Wilson DE. 2009. Biosafety in Microbiological and
Biomedical Laboratories, 5th Edition, CDC, U.S. Department of Health and
Human Services.
4. Becker WM, Kleinsmith LJ, Hardin J. 2006. El mundo de la célula. 6ª Ed.,
Editorial Pearson Educación. Madrid, España.
5. Versalovic J. (Editor). 2011. Manual of Clinical Microbiology. 10th Ed. ASM
Press, Washington, D.C.
6. Grinspan, S. (1985). El estudio del frotis de sangre periférica. Educación
Médica Contínua.
7. CARRASCO CARRASCO, et. Al. (2004). Fundamentos y Técnicas Análisis
Hematológicos y Citológicos. Editorial Paraninfo.

27
8. Rodak, B. F. (2005). Hematología. Fundamentos y Aplicaciones Clínicas.
Ed. Médica Panamericana.
9. Abbas, A. K., Lichtman, A. H., & Pillai, S. (2022). Inmunología celular y
molecular. Elsevier Health Sciences.
10. Retamales Castelletto, E., & Manzo Garay, V. (2015). Recomendaciones
para la tinción de frotis sanguíneos para la lectura del hemograma. Instituto
de Salud Pública departamento Laboratorio Biomédico Nacional y de
Referencia. Instituto de Salud Pública de Chile.(Chile).
11. Rodríguez, C., Zhurbenko, R., et al. (2018). Manual BioCen de medios de
cultivo. Cuarta edición, república de Cuba.
12. Sanz, S et. Al (2011) Prácticas de Microbiología. Segunda edición.
Universidad de la Rioja, Servicio de Publicaciones, España.
13. López-Hontangas, J. L., Castillo, F. J., & Salavert, M. (2006). Técnicas de
identificación. Microbiología aplicada al paciente crítico. Bogotá: Distribuna,
27-41.
14. Bou, G., Fernández-Olmos, A., García, C., Sáez-Nieto, J. A., & Valdezate,
S. (2011). Métodos de identificación bacteriana en el laboratorio de
microbiología. Enfermedades infecciosas y microbiología clínica, 29(8), 601-
608.
15. Rodríguez, P. A., & Arenas, R. (2018). Hans Christian Gram y su
tinción. Dermatología Cosmética, Médica y Quirúrgica, 16(2), 166-167.
16. López-Jácome, L. E., Hernández-Durán, M., Colín-Castro, C. A., Ortega-
Peña, S., Cerón-González, G., & Franco-Cendejas, R. (2014). Las tinciones
básicas en el laboratorio de microbiología. Investigación en
discapacidad, 3(1), 10-18.
17. Koneman, E. W., Allen, S.D., Dowuel .R. y Somers, H.M. (ed.). 2008.
Diagnóstico Microbiológico, 6a Ed. Editorial Médica Panamericana. Buenos
aires Argentina.

28