Rev Peru Med Exp Salud Publica 22(3), 2005

Cabezas C.

ARTCULO REVISIN
DENGUE EN EL PER: APORTES PARA SU DIAGNSTICO Y CONTROL
Csar Cabezas S1, 2,,Grupo de trabajo de dengue*
RESUMEN El dengue es la arbovirosis ms importante en salud pblica; reingres al Per en 1990 y se encuentra presente en la Amazona y costa norte, incluyendo, recientemente a Lima. En este artculo se abordan aspectos sobre la historia, fisiopatologa, entomologa, vigilancia y control, enfatizando en los aportes del Instituto Nacional de Salud (INS), para el control del dengue en el Per, entidad que ha cumplido un papel importante en el esfuerzo por controlar al dengue, a travs de investigaciones e incorporando progresivamente en la Red Nacional de Laboratorios, tcnicas de diagnstico desde el ELISA para la deteccin de anticuerpos, el aislamiento viral y ltimamente el RT-PCR y la genotipificacin, as tambin en el rea entomolgica, para la verificacin de la presencia del Aedes aegypti, su susceptibilidad a los insecticidas y nuevas tcnicas para este propsito. Palabras clave: Dengue; /prevencin & control; /diagnstico; Sistema de vigilancia sanitaria; Aedes aegypti; Per (fuente: DeCS BIREME).

ABSTRACT Dengue is the most important arbovirosis in public health; in 1990 its reappearance in Peru and it is present in the Amazon region and North Coast of the country, including, recently Lima. In this article aspects are approached on the history, physiopathology, entomology, surveillance and control, emphasizing the contributions of the Instituto Nacional de Salud (INS), for the control of the dengue in Peru, entity that has fulfilled an important role in the effort for controlling to dengue, across researches and incorporating progressively in the national net of laboratories, techniques of diagnosis from the ELISA for the detection of antibodies, the viral isolation and lately the RT-PCR and the genotyping, this way also in the entomological area, for the monitoring of the presence of the Aedes aegypti, its susceptibility to insecticide and new techniques for this intention. Key words: Dengue; /prevention & control; /diagnosis; Health surveillance system; Aedes aegypti; Per (source: DeCS BIREME).

INTRODUCCIN
Las enfermedades infecciosas constituyen la primera causa de muerte en el mundo, tanto en adultos como en nios. Ms de 13 millones de personas mueren anualmente por enfermedades infecciosas emergentes y reemergentes, tales como la malaria, la tuberculosis, el sndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA), la fiebre hemorrgica producida por el virus bola, el sndrome respiratorio agudo grave (SARS), la infeccin por el virus del Nilo occidental y el dengue1.

En este contexto, el dengue es un problema creciente para la salud pblica en las reas tropicales del mundo. En la regin de las Amricas el patrn es similar a la situacin que se observ en Asia hace 30 aos, siendo actualmente el dengue la enfermedad viral transmitida por mosquitos, ms importante que afecta a los seres humanos. El Aedes aegypti, el vector del virus dengue, se encuentra en casi cien pases tropicales y se calcula que 2,5 billones de personas habitan en reas donde existe el riesgo de transmisin de la epidemia2.

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Instituto Nacional de Salud. Lima, Per. Instituto de Medicina Tropical Daniel A Carrin, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima, Per. Grupo de trabajo de dengue INS: Virologa. Victoria Gutirrez, Maria P. Garca, Enrique Mamani, Miguel Cobos, Omar Cceres, Miguel Farfn. Entomologa . Rosario Balta, Miriam Palomino, Rosa Casternoque, Norma Garca, Pablo Villaseca.

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Diagnstico y control del dengue

El Aedes aegyti fue eliminado del Per en 1956, pero reingres en 1984 trayendo consigo al dengue, cuya manifestacin mxima ocurri en forma explosiva en 1990 al presentarse el dengue clsico, debido al serotipo 1 del virus dengue, en las principales ciudades de nuestra Amazona3. A partir de entonces, somos testigos de su inexorable expansin por las ciudades de la costa norte y de la Amazona, en las cuales han circulado en los ltimos aos, los cuatro serotipos del virus, y han aparecido en ambas regiones, casos de dengue hemorrgico. Complicando este escenario, el Aedes aegypti reapareci el ao 2000 en Lima4, pues tambin estuvo desde la Colonia hasta el siglo XIX y fue el transmisor de la fiebre amarilla urbana5, producto de factores como la intensa migracin interna desde reas endmicas de dengue tanto de la costa norte como de reas de selva, temperatura ambiental cada vez mayor no slo debida a cambios estacionales, as como las deficientes condiciones de saneamiento y disponibilidad de agua potable que obliga a los pobladores a almacenarla. Estando el vector Aedes aegypti en Lima y existiendo entre los inmigrantes, personas infectadas por el virus del dengue en etapa de viremia, era previsible la infeccin del vector y su transmisin a pobladores residentes en Lima, lo cual ocurri entre marzo y abril de 2005 en Comas, un distrito densamente poblado,al norte de esta metrpoli que es Lima (Figura 1)6. Desde que el dengue ingres al Per, se han desarrollado e implementado diferentes estrategias para su control, sin embargo, factores como la intensa migra-

cin interna de reas endmicas hacia reas libres del vector y del dengue mismo, as como los cambios climticos, hacen que su real control sea un reto y que siempre exista el riesgo de su expansin a nuevas reas, como se ha venido dando en casi todas las ciudades grandes y pequeas de la Amazona y de la costa norte de Tumbes a Lima.

HISTORIA
Entre 1779 y 1780 se describi en Asia, frica y Amrica del Norte una epidemia, debida a una enfermedad con manifestaciones parecidas al dengue; sin embargo, cuadros clnicos semejantes a los de dengue se encuentran reportados en la Enciclopedia China de la Dinasta Chin (265-420 A. E. C.). Los antiguos chinos ya suponan que la enfermedad estaba relacionada con insectos voladores asociados al agua7. El trmino dengue se origin en Amrica entre 1827 y 1828, a raz de una epidemia en el Caribe que cursaba con fiebre, artralgias y exantema. Los esclavos provenientes de frica identificaron a esta entidad patolgica como dinga o dyenga, homnimo del Swahili Ki denga pepo, que significa ataque repentino (calambre o estremecimiento) provocado por un espritu malo 7,8. Hay reportes clnicos de dengue entre 1779 y 1780, aunque las primeras epidemias compatibles con dengue clsico en Latinoamrica y el Caribe se dieron en las Antillas Francesas en 1635 y en Panam en 16997,9. Por otro lado el primer reporte de fiebre hemorrgica del dengue/sndrome de choque por dengue que se definieron como tales, se describieron en una epidemia ocurrida en 1954 en Filipinas10,11. La primera epidemia de dengue clsico, del siglo XX, en Amrica, comprobada por laboratorio, ocurri en la regin del Caribe y en Venezuela en los aos 1963-64, donde el virus dengue 3 fue el serotipo circulante. Aos antes, entre 1953-54, en situacin no epidmica, se haba descrito en Trinidad. Entre los aos 1968-69 otra epidemia afect algunas islas del Caribe, aislndose los serotipos de dengue 2 y 3. En 1977 el serotipo Den-1 fue introducido en Amrica a travs de Jamaica, el que se disemin por la mayora de las islas del Caribe causando epidemias y tambin afect a algunos pases centroamericanos (Belice, Honduras, El Salvador, Guatemala, Mxico) y sudamericanos (Colombia, Venezuela, Guyana, Suriname), abarcando incluso a Texas en EEUU12.

Figura 1. Reingreso del Aedes aegyti en el ao 2000 y del dengue en Lima el ao 2005. Crnica de una emergencia anunciada, parafraseando al gran Gabriel Garca Mrquez .

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En la dcada de 1980 la magnitud del dengue se increment, llegando en 1982 al norte de Brasil con los serotipos 1 y 4; en 1986 afect Ro de Janeiro con el serotipo 1, posteriormente, se presentaron brotes en Bolivia (1987) Paraguay (1988), Ecuador (1988) y el Per (1990) en todas con el serotipo 112,13. Si bien hubo una comunicacin de serotipo 4 en el brote del Per (NAMRID), este hallazgo no fue confirmado posteriormente y el serotipo que circul en 1990 en Iquitos y otras ciudades de la Amazonia correspondieron al serotipo 1 (Comunicacin personal, Watts Douglas). El serotipo Den-4 fue introducido en 1981 y desde entonces los tipos 1, 2 y 4 han sido transmitidos simultneamente en muchos pases de las Amricas donde Aedes aegypti estaba presente. El serotipo 3 reaparece desde 1994 en Nicaragua, este serotipo constituye un riesgo importante ya que prototipos de este han sido asociadas con la forma hemorrgica de la enfermedad 14. En 1981 el brote de dengue hemorrgico (DH) ocurrido en Cuba estuvo asociado al serotipo 2, y produjo 158 defunciones, de los cuales 101 fueron nios. Posteriormente, entre 1989 y 1990 ocurri otro brote de DH en Venezuela, luego aparecieron casos de DH en pases de centro y Sudamrica que previamente haban tenido casos de dengue clsico. En Ro de Janeiro, luego de la introduccin del serotipo 2, se notificaron casos de DH en 1990 y 1991, en esos mismos aos se reportaron en Colombia12. En el Per, los primeros reportes de brotes de un sndrome febril compatible con dengue clsico, fueron descritos en 1700, 1818,1850 y 1876, aunque no se tuvo confirmacin laboratorial16,17. La introduccin del dengue en el Per en el siglo XX est ligado a la reintroduccin del Aedes aegypti. Este vector, luego de su eliminacin en el Per en 1956 reingres en 1984, siendo inminente el ingreso del dengue. En 1990 ocurri un explosiva epidemia de dengue clsico debido al serotipo 1 del virus dengue, en las principales ciudades de nuestra Amazona y posteriormente se extendi a las ciudades de la costa norte del pais3,13. Como mencionamos al introducir esta revisin, para complicar este escenario el Aedes aegypti reapareci el ao 2000 en Lima4, y como era de esperar el dengue ingres a Lima el 2005 con una epidemia al norte de esta metrpoli, en el distrito de Comas. Debemos anotar que en Lima no hay precipitaciones pluviales

importantes, y la presencia del Aedes esta ligado a la falta de disponibilidad del agua en populosos distritos perifricos17.

AGENTE ETIOLGICO
El virus del dengue es un arbovirus (arbo acrnimo del ingls arthropod-borne , transportado por artropodos) y pertenece al gnero de Flavivirus familia Flaviviridae un grupo de ms de 68 agentes virales agrupados por su relacin serolgica y por la determinacin de secuencias genmicas; al menos 30 de estos virus causan enfermedad en los humanos 18,19 . La familia Flaviviridae agrupa virus ARN de cadena simple en sentido positivo que se multiplican en clulas de vertebrados y de insectos vectores. Esta familia esta representada por tres gneros: Flavivirus (lt flavus, amarillo), Pestivirus (lt pestis, peste, plaga) y virus hepatitis C (gr hepato, hgado; tambin conocidos como hepatacivirus) (Rice, 1996). El gnero Flavivirus rene en su mayora (55%) a virus asociados con enfermedades humanas y algunos patgenos de animales domsticos o de inters econmico. Adems, consta de ms de 70 virus clasificados en diez grupos (o especies), entre ellos el virus dengue20. La partcula viral del dengue es de forma esfrica y mide entre 40 y 60 nm de dimetro. Tiene una envoltura formada por protenas [protena E (principalmente), y protena M] que cubre completamente la superficie del virus (Figura 2). El material gentico se encuentra protegido por una nucleocpside circular de simetra polidrica; el dimetro del ncleo es de 25-30 nm. Entre la envoltura y la nucleocpside se encuentra una bicapa lipdica, cuyos lpidos se derivan de la membrana celular del hospedero. El genoma est compuesto por una sola molcula de RNA de cadena sencilla lineal, de sentido positivo, de 10703 nucletidos y de alta variabilidad genmica. El grupo virus dengue esta representado por cuatro serotipos (o subespecies): virus dengue 1, virus dengue 2, virus dengue 3 y virus dengue 4; los cuales tienen caractersticas antignicas y serolgicas diferentes, adems pueden presentar variantes genticas (genotipos y topotipos) dentro de un mismo serotipo, relacionadas con la virulencia y la procedencia geogrfica de la cepa21,22. Se ha descrito una homologa de secuencia de aproximadamente 70% entre los diferentes serotipos de dengue, siendo dicha homologa

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Diagnstico y control del dengue

Protena de envoltura E Protena de membrana M Protena de cpside C ARN de monocadena positiva

de lpidos20. El genoma tiene una longitud de 9500 a 12500 nucletidos, y da lugar a tres protenas estructurales: la protena E de envoltura, la protena M de membrana y la protena C de cpside y a siete protenas no estructurales (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b y NS5), como se muestra en la figura 3. El ciclo replicativo est marcado por la traslacin del ARN genmico del virus al citoplasma celular del husped, sntesis de cadenas negativas y positivas de ARN, y ensamblaje con liberacin de partculas virales maduras23. La glicoprotena E cumple un papel importante durante la penetracin del virus en la clula y en la respuesta inmunitaria24. De otro lado, la protena no estructural NS1 participa en la maduracin viral25. Tambin se ha demostrado la presencia de varias poblaciones virales en un mismo hospedero26 y puede darse recombinacin entre cepas, probablemente en razn a la circulacin simultnea de genotipos diferentes de un serotipo en un mismo hospedero27,28, esto puede hacer pensar que la diversidad gentica de este virus del dengue puede inducir a la aparicin de cepas que puede replicarse mas rpidamente o ser ms patgenas.

Figura 2. Esquema de la estructura del virus dengue.

mayor entre los serotipos 1, 2, y 322. Tanto la presentacin clnica de dengue clsico como el dengue hemorrgico y el sndrome de choque por dengue son causados por el virus del dengue. El virin es infeccioso y est compuesto por 6% de ARN, 66% de protenas, 9% de carbohidratos y 17%
A) RNA del Flavivirus
5-NTR ORF

3-NTR

CA

(+) RNA de una sola hebra (~11kb)

B) Poliprotena del Flavivirus: protena-funcin

estructural no estructural

C prM

2A 2B

4A

4B

core protenas de cubierta

replicacin, patogenicidad

cofactor NS3

resistencia IFN (?) RdRp, metil transferasa, guanil transferasa

resistencia IFN (?)

proteasa, helicasa, trifosfatasa de RNA

C) Poliprotena del Flavivirus: Topologa (Putativa) de la membrana

citoplasma

ER lumen = proteasa viral (NS2B-3) = furina = proteasa desconocida = signalasa del husped

Figura 3. RNA de un flavivirus y representacin de los genes que traducen protenas estructurales y no estructurales del virus dengue. Modificado de Dengue virus. Genome organization & viral protein expression. Molecular Virology. University of Heidelberg.

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Tabla 1. Serotipos de dengue aislados en el Instituto Nacional de Salud, Per 1990 - 2005.
Serotipo D1 D2 D3 D4 1991-92 1 0 0 0 1994 8 0 0 0 1996 4 13 0 0 1997 22 0 0 0 1998 3 2 0 0 1999 3 2 0 0 2000 41 18 0 0 2001 132 47 21 1 2002 160 91 0 2 2003 8 2 79 0 2004 28 0 213 0 2005* 3 0 189 0 Total 413 175 502 3 * Muestras recibidas hasta el 6 de julio del 2005. Ao Total 1 8 17 22 5 5 59 201 253 89 241 192 1093

En el ao 2005 usando la tcnica RSS-PCR (diagnstico y genotipificacin) se determin que el brote ocurrido en Lima correspondi al serotipo 3, el cual tuvo concordancia con los aislamientos virales 32 ; adicionalmente, el anlisis filogentico del virus dengue 3 aislado en Lima mostr 98% de similaridad en la secuencia gentica con el dengue 3 genotipo III aislado en Sullana-Piura y tambin con el aislamiento hecho en Ucayali, lo cual concuerda con la migracin de personas infectadas de estas reas hacia Lima, sugiriendo que esta fue la va de entrada del virus33.

ASPECTOS ENTOMOLGICOS
El Aedes aegypti, originario de frica, es el vector transmisor del dengue, pero tambin de la fiebre amarilla urbana (FAU). En 1881 Carlos Finlay propuso la teora de que Ae. aegypti transmita la FAU34. En las Amricas durante 1920 se lleg a controlar; en el ao 1965, 17 de 49 naciones lo erradicaron, pero en 1980 Bolivia se reinfest, en 1981 Paraguay y en 1984 la regin amaznica del Per35. El Aedes aegypti, se encuentra distribuido en las principales ciudades de la Amazona y la costa norte del Per, desde Tumbes hasta Lima36. CICLO BIOLGICO El huevo. Mide aproximadamente 1 mm, es ovalado, blanco y luego se torna a negro al desarrollar el embrin. Es depositado individualmente en diferentes recipientes por encima del nivel del agua. El ciclo desde la postura a la eclosin en condiciones ptimas de humedad y temperatura dura 48 horas, pero puede prolongarse hasta cinco das. La hembra puede ovipositar de 100-200 huevos por postura, pudiendo resistir las sequas hasta un ao (Figura 5A)37. La larva. Tiene tres fases: Fase acutica, de alimentacin y de crecimiento. Se divide en cabeza, trax y nueve segmentos abdominales; el segmento posterior y anal tienen cuatro branquias lobuladas; un sifn respiratorio corto por el cual respira y se mantiene en la superficie casi vertical. Poseen cuatro espinas torcicas, dos a cada lado. El octavo segmento con una hilera de siete a doce dientes formando el peine y sifn con el pecten. Tiene un movimiento serpenteante y fotofobia. La fase completa demora entre ocho a doce das (Figura 5B)37.

Es importante destacar las variaciones genotpicas en los diferentes serotipos de dengue, que puedan tener una mayor influencia en el desarrollo del dengue hemorrgico o del sndrome de choque por dengue, como es el caso del serotipo 2 genotipo americano, que no indujo al dengue hemorrgico en el Per, a diferencia del genotipo asitico del mismo serotipo 2 que s desarroll dengue hemorrgico en personas con infeccin previa por dengue por otros serotipos como el 129,30. El virus de dengue serotipo 1 fue el primero que reingres al Per en 1990, desde ese ao, han circulado los cuatro serotipos ya sea por separado o de manera conjunta, en los ltimos aos ha predominado la infeccin por el serotipo 3 (Tabla 1), la distribucin de serotipos a su vez es variada en las diferentes regiones del pas (figura 4)31.

D3 (2005)

Figura 4. Aislamientos y serotipos de dengue circulantes desde su ingreso al Per en 1990 al 2005.

La pupa. En esta fase no se alimenta y su funcin es la metamorfosis de larva a adulto. Se mueve rpidamente ante un estmulo y cuando estn inactivas flotan en la superficie. Trompeta respiratoria corta y con un

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Diagnstico y control del dengue

Figura 6. En una regin lluviosa como la Amazona, los criaderos son muy variados (cortesa de la Dra. Amy Morrison).

Figura 5. Estadios del ciclo biolgico del Aedes aeypti: a: Huevo; b: Larva; c: Pupa; d: Adulto.

solo pelo en el borde de la paleta natatoria. En la base del abdomen tiene un par de aletas o remos que le sirven para nadar. Este estadio dura de dos a tres das (Figura 5C)37. El adulto. Es la fase reproductora del Aedes aegypti. Las hembras se distinguen de los anofelinos por tener palpos ms cortos y por adoptar una posicin horizontal durante el reposo. Se caracteriza por tener un abdomen agudo. Es de color negro con manchas blancas y plateadas en diferentes partes del cuerpo. En el trax (mesonoto) tiene un dibujo caracterstico con franjas claras a manera de lira (Figura 5D)37. CRIADEROS El Aedes aegypti es un mosquito que se cra en recipientes sombreados y con agua, en los cuales las hembras depositan sus huevos por encima del nivel del lquido, en las paredes de dichos recipientes.

En lugares lluviosos, como la selva, los recipientes predilectos son los objetos desechados como llantas, latas, botellas o floreros (Figura 6)38,39; en lugares no lluviosos como la costa, son los recipientes caseros para almacenar agua como barriles, tanques bajos y altos, tinajas y baldes (Figura 7)17,40,41. ECOLOGA DEL ADULTO Emergencia. Luego de emerger de la pupa, el insecto se posa sobre las paredes del recipiente durante varias horas hasta el endurecimiento de sus alas y su exoesqueleto. Apareamiento. Dentro de las 24 horas, despus de la emergencia, puede ocurrir el apareamiento. El macho es atrado por el sonido emitido por el batir de las alas de la hembra durante el vuelo. Alimentacin. Las hembras se alimentan de la mayora de vertebrados, pero prefieren a los humanos, vuelan en sentido contrario al viento y son atradas por los olores y gases del hombre. La sangre sirve para el desarrollo de los huevos.

Figura 7. Floreros en el cementerio y tanques bajos, criaderos ms frecuentes de Aedes aegypti en Comas (Lima Norte - 2005).

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Ciclo gonadotrfico. Despus de cada alimentacin se desarrolla un lote de huevos. Si la hembra completa su alimentacin sangunea (2-3 mg) desarrollar y pondr 100-200 huevos, el intervalo dura de dos a tres das. La hembra grvida buscar recipientes oscuros o sombreados para depositar sus huevos, prefiriendo aguas limpias y claras. Rango de vuelo. La hembra no sobrepasa los 50-100 m durante su vida (puede permanecer en la misma casa donde emergi). Si no hay recipientes, una hembra grvida puede volar tres kilmetros para poner sus huevos. Los machos se dispersan menos que las hembras. Conducta de reposo. Descansan en lugares sombreados como alcobas, baos, patios o cocinas. Se les captura sobre ropas colgadas, debajo de muebles, toallas, cortinas y mosquiteros. Longevidad. Los adultos pueden permanecer vivos en el laboratorio durante meses y en la naturaleza pocas semanas. Con una mortalidad diaria de 10%, la mitad de los mosquitos morirn durante la primera semana y 95 % en el primer mes.
Figura 9. Distribucin del Aedes aegpypti en el Per, segn ao de reporte, 1984-2000. Fuente: CNSP, INS.

VIGILANCIA Y CONTROL VECTORIAL

El Aedes aegypti, pese a los esfuerzos para su control, ha ido dispersndose por los pases de Amrica, (Figura 8); as mismo, desde su reingreso al Per en 1984, se ha dispersado, a travs de los aos, al resto de pas como en la Amazonia y la costa norte hasta Lima (Figura 9). En reas infestadas es necesario determinar la distribucin, densidad y efectos de medidas de control. En reas no infestadas establecer un programa de vigilancia para detectar la introduccin del mosquito42. En Lima se encontr al A. aegypti en el ao 20004. En el 2004 se evalu su distribucin en el cono norte, habindose inspeccionado 47 localidades en cuatro distritos de nivel socio-econmico D (Independencia, Comas, Carabayllo y Puente Piedra), con poblacin de un milln de habitantes. Una de cada 25 viviendas fue escogida aleatoriamente y los recipientes de esta fueron inspeccionados por tcnicos/ promotores de salud para evaluar la presencia de larvas/pupas de Aedes . La especie de Aedes fue confirmada en laboratorio. Se calcularon los ndices de viviendas (viviendas positivas / total inspeccionadas) para cada localidad. De agosto a octubre de 2004, se evaluaron 21 500 viviendas. La temperatura promedio fue de 18 C. En cuatro distritos hubo presencia de Aedes aegypti; la positividad se dio en 30/47 localidades. Los ndices de vivienda distritales fueron de 3,18 para Independencia; 1,77para Comas; 0,17para Carabayllo y 0,04para Puente Piedra. En Comas e Independencia, ms de la mitad de localidades mostraron ndices de vivienda > 2. Entre 70 - 80% de los recipientes positivos fueron tanques y cilindros llenados manualmente17.

Figura 9. Evolucin de la distribucin del Aedes aegpypti en las Amricas. Fuente: OPS/OMS.

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Diagnstico y control del dengue

Dada la gran variabilidad en los ndices de vivienda entre localidades, incluso dentro del mismo distrito, era conveniente dirigir actividades de control hacia localidades ms afectadas antes que distritos enteros. El tipo de contenedores con mayor frecuencia positivos (tanques y cilindros) sugieren que el control qumico con larvicidas y campaas de participacin comunitaria para control fsico ayudaran a reducir estos niveles de infestacin. Este hallazgo ya prevea el ingreso del dengue a Lima17. Uno de los larvicidas ms usados en el control del vector del dengue es el temephos, por lo que era importante evaluar la susceptibilidad del A. aegypti a este insecticida. Los diferentes estudios hechos en el Per muestran que este larvicida mantiene una eficacia adecuada43,44, un ltimo estudio fue hecho en San Juan de Lurigancho, en Lima, en el que el temephos mostr una mortalidad de la larva a las 24 horas, de 99,7 %. No existiendo evidencia, en condiciones de campo, de disminucin de la eficacia residual a las nueve semanas45. Para la determinacin de la susceptibilidad de vectores a insecticidas se usa el papel impregnado recomendado por la OMS46 , y en los ltimos aos se viene implementando el uso de la tcnica de la botella propiciada por el CDC47,48(Figura 10); al respecto, es necesario concluir los estudios comparativos entre estos dos mtodos para ser usados en el pas, mientras tanto, se ha considerado el uso de la tcnica de la botella como una prueba de tamizaje, para su confirmacin posterior por el papel impregnado48.

Figura 10. Pruebas de susceptibilidad de Aedes aegypti a insecticidas, efectuados en el INS. A.- Prueba del papel impregnado (OMS) B.- Prueba de la botella (CDC).

La asociacin de epidemias y mayor gravedad de la enfermedad del dengue en ciertas reas geogrficas, con las variaciones genotpicas y la virulencia de la cepa, fue descrita en 1977 por Rosen 51, esto probablemente debido a la introduccin de genotipos ms virulentos procedentes de regiones endmicas hacia regiones donde la enfermedad no ocurra antes, teniendo como resultado epidemias con ms casos de FHD y la persistencia de estas cepas en estas reas geogrficas 19,21,52. Halstead observ que personas con infecciones secundarias o lactantes con presencia de anticuerpos maternos circulantes eran ms propensos a desarrollar cuadros de FHD / SSD y estableci que infecciones sucesivas por diferentes serotipos de virus dengue estn asociados con estas formas graves de la enfermedad. Segn esta teora, cantidades subneutralizantes de inmunoglobulinas especficas del tipo IgG, no protegen frente a un segundo serotipo distinto al de la primera infeccin, y por el contrario al reaccionar con el segundo serotipo forman complejos virus-anticuerpo que facilitan la entrada del virus a clula del linaje fagocito mononuclear a travs de la unin del fragmento Fc de la inmunoglobulina y el FcR de la clula diana50,53,54. Hay factores de riesgo para tener DH, siendo el ms importante el de tener una segunda infeccin por un serotipo diferente al que caus la infeccin primaria en el mismo individuo 54-56; igualmente, tener menos de 15 aos de edad, ser de raza blanca, tener enfermedades crnicas como el asma, diabetes o anemia por clulas falciformes son factores de riesgo55-57.

RESPUESTA INMUNE Y PATOGENIA

La respuesta inmunolgica a la infeccin por el virus del dengue tiene un patrn diferente al comn de los producidos por otros virus, dada su variabilidad genotpica la respuesta inmune en el dengue, en lugar de desarrollar una efectiva proteccin para infecciones futuras puede ser contraproducente para el husped 49. Los mecanismos que permiten la recuperacin de un individuo con infeccin por virus dengue o el consecuente desarrollo de fiebre hemorrgica por dengue/ sndrome de choque por dengue, no se conocen con precisin; sin embargo, la patognesis del dengue puede estar relacionada con algunos factores como la virulencia del virus, la edad y el estado nutricional, gentico e inmunolgico del hospedero, y la presencia de otras infecciones recurrentes y concomitantes50.

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Durante la infeccin primaria, el virus ingresa a la clula diana a travs de su unin con un receptor celular produciendo anticuerpos neutralizantes capaces de proteger por largo tiempo contra la reinfeccin con ese mismo serotipo. Estos anticuerpos pueden neutralizar a otros serotipos slo durante dos a tres meses; sin embargo, en una infeccin secundaria con un serotipo diferente, se forman complejos virusanticuerpos que ingresan a las clulas del sistema fagoctico mononuclear (monocitos y macrfagos) a travs de la unin del fragmento constante de la inmunoglobulina con los receptores celulares del tipo gamma. Como resultado de este fenmeno se infectan un mayor nmero de clulas y por tanto hay una mayor diseminacin viral, conocido como amplificacin dependiente de anticuerpos59,59. Se ha encontrado que clulas asesinas naturales (NK, natural killer ) presentes en poblaciones de clulas mononucleares de sangre perifrica de individuos infectados con virus dengue, lisan mayor nmero de clulas infectadas que clulas no infectadas60,61. En infecciones secundarias, la presencia de anticuerpos antidengue aumenta la lisis celular por clulas NK a travs del mecanismo conocido como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos62. La respuesta celular especfica frente al virus dengue se inicia con la activacin de LT CD4+ durante la viremia y posteriormente con la activacin de LT CD8+. En individuos con FHD por infecciones secundarias, se ha demostrado la presencia de LT CD4+/CD8+ de memoria y LT CD4+/CD8+ citotxicos 63,64 , por lo que la activacin de los linfocitos T y tambin la produccin de citocinas son factores importantes en la patogenia del DH65,66. Adems de la respuesta inmune celular en los casos de DH se exacerba la activacin y liberacin de citocinas, lo que se relaciona con la mayor gravedad del cuadro clnico. Tambin en el DH se ha demostrado la activacin del sistema del complemento, pudindose detectar en los casos graves concentraciones elevadas de las protenas C3 y C1q, plantendose como una explicacin, que los complejos virusanticuerpos circulantes serian los que activan la reaccin en cascada del complemento49,67-69. Igualmente, existe la posibilidad que en el DH se presenten reacciones autoinmunes, que pueden estar dadas por la presencia de anticuerpos contra las protenas virales que presenten reactividad cruzada contra plaquetas y factores de coagulacin49,70. Algunas protenas no estructurales como NS1, NS2 y NS3 pa-

recen tener cierta homologa estructural con factores de coagulacin, plaquetas, integrinas y adhesinas de clulas endoteliales humanas, permitiendo la activacin de clonas LT autorreactivas que participan en la patologa del dengue70-75. Adems, la activacin de linfocitos de reactividad cruzada o serotipo-especficos pueden llevar a la consecuente formacin de anticuerpos de reactividad cruzada, inespecficos y autorreactivos involucrados con la gravedad de la enfermedad71,74. Es importante destacar la hiptesis integral planteada por Kouri, que a diferencia de lo mencionado por Halstead y Rosen, que planteaban que el dengue hemorrgico se produca como resultado de una infeccin secundaria o por la virulencia del virus respectivamente, plantea que ambos factores aunados a las caractersticas del husped muestran la causa multifactorial del DH56. Dentro de esta propuesta es necesario mencionar el papel del virus del dengue en la presentacin del DH, as tenemos la asociacin de algunos genotipos con el desarrollo de epidemias de DH o de mayor gravedad, como son las variantes genotpicas asiticas del serotipo 2 de dengue y tambin la procedencia asitica del serotipo 329,76, y de otro lado la mayor carga viral en los casos de DH en comparacin con los casos de dengue clsico77. Estudios realizados a partir de cepas de virus de dengue de Per, Mxico y Venezuela han mostrado la presencia de componentes determinantes de virulencia en la protena E y en el extremo 3 del genoma viral73.

DIAGNSTICO LABORATORIAL
Como en la mayora de enfermedades de etiologa viral, es necesaria la confirmacin en el laboratorio, cuando se sospecha de infeccin por el virus dengue; para ese fin se cuenta con pruebas que pueden detectar la presencia del virus, como es el aislamiento viral y pruebas moleculares o la determinacin de anticuerpos a travs de pruebas serolgicas, que a continuacin se describen. AISLAMIENTO VIRAL Para este efecto se usan diferentes sistemas, entre ellos hay cuatro mtodos de aislamiento viral usados rutinariamente: inoculacin intracerebral de ratones recin nacidos, inoculacin en cultivos celulares de mamferos, inoculacin intratorcica de mosquitos

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adultos, e inoculacin en cultivos celulares de mosquito. Despus de la inoculacin de la muestra sospechosa, se obtienen evidencias de replicacin viral alrededor del da cinco o siete de haber inoculado la muestra en el medio de cultivo. Al aislarse una muestra se identifica al virus del dengue usando anticuerpos monoclonales o alternativamente mediante pruebas de fijacin de complemento. Inoculacin intracerebral en ratones. Aunque inicialmente los cuatro serotipos fueron aislados por inoculacin intracerebral de los ratones, esta tcnica tiene varias desventajas, incluyendo alto costo, el tiempo largo para el aislamiento, y su baja sensibilidad, por lo que se recurre a otros mtodos. Cultivos celulares de mamferos. Presentan las mismas desventajas que la inoculacin intracerebral, pues los virus requieren con frecuencia pasos mltiples antes de inducir efectos citopticos en las clulas infectadas, no siendo recomendado actualmente78. Inoculacin en mosquitos. La inoculacin en mosquitos es el mtodo ms sensible, sin embargo, es el menos usado para el aislamiento del virus del dengue79. Se han utilizado cuatro especies del mosquito: Aegypti aegypti , A. albopictus , Toxorhynchities amboinensis y T. splendens. Los mosquitos de ambos sexos son susceptibles y se obtienen ttulos altos en periodos de cuatro a cinco das, dependiendo de la temperatura de la incubacin. La deteccin final del virus se hace mediante inmunofluorescencia indirecta (IFA) de los tejidos del mosquito, generalmente cerebro o glndulas salivales. Una de las desventajas es que es muy trabajoso y la necesidad de que los insectarios produzcan una gran cantidad de mosquitos para la inoculacin, adems de las precauciones del aislamiento y el riesgo de la liberacin de mosquitos infectados80-82. Cutivo en clulas de mosquito. Los cultivos en clulas de mosquito han sido recientemente desarrollados y existen tres lneas de clulas con sensibilidad comparable; sin embargo, las ms difundidas y utilizadas son las C6/36 que han sido elaboradas a partir de clulas de Aedes albopictus83-86. El uso de esta lnea celular ha proporcionado un mtodo rpido, sensible y econmico para el aislamiento del virus del dengue. Los antgenos del dengue se pueden detectar en los cultivos celulares infectados mediante IFA. Esta tcnica es menos sensible que la inoculacin intratorcica de los mosquitos del adulto, pero debido a su capacidad de procesar varias mues-

Figura 11. Linea celular C6 36 (glandula salival de A. Albopictus), usados en el Laboratorio de Arbovirus del INS. a: Cultivo normal b: Efecto citoptico.

tras en el mismo tiempo, se ha convertido en la tcnica estndar para el aislamiento del virus del dengue. Las ventajas de las clulas del mosquito son: una sensibilidad ms alta que la lnea de clula de vertebrado para la recuperacin de los virus del dengue, son relativamente fciles de mantener y de crecer en la temperatura ambiente y es posible mantener los cultivos hasta por 14 das sin cambiar el medio84,85. Aunque se describe un efecto citoptico con presencia de clulas gigantes multinucleadas, este efecto puede ser difcil de detectar y ser variable. El efecto citoptico se considera generalmente cuando estas clulas se cultivan en tubos (Figura 11)86. Durante la epidemia de dengue ocurrida en Lima se logr mostrar una tcnica de aislamiento rpido del virus dengue 3 por el mtodo de shell vial, los resultados mostraron que al quinto da de la cosecha 48,7% (57/117) de los sueros resultaron positivos para el virus DEN-3, y de los 22 sueros positivos al tercer da se obtuvo ms de 80% (18/22) de aislamientos. Estos resultados sugieren que la tcnica de shell vial por el menor tiempo de aislamiento y costo comparado con el mtodo tradicional, puede ser implementada como mtodo de diagnstico y usada en la vigilancia epidemiolgica del virus dengue87.

DIAGNSTICO MOLECULAR
El los ltimos aos, varias nuevas tcnicas de diagnstico molecular se han desarrollado y se ha probado su utilidad para el diagnostico del dengue. Estos mtodos pueden detectar fcilmente los virus del dengue principalmente durante la fase aguda de la enfermedad 88,89.

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Hibridacin del cido nucleico. Se realiza a partir del RNA extrado del virus del dengue procedente de los sobrenadantes de cultivos celulares o de grupos de mosquitos como Aedes albopictus. Se usa para estudios epidemiolgicos y tambin se puede utilizar para diagnstico viral a partir de tejidos obtenidos de autopsias, sin embargo, no se ha utilizado para identificacin viral directa en muestras90. La hibridacin de RNA-RNA es una tcnica sensible que se puede aplicar directamente en muestras frescas o en anlisis retrospectivos de muestras fijadas91. Debido a las dificultades en el trabajo con RNA, como el de contar con tcnicos experimentados que se requieren para obtener resultados reproductivos, este mtodo se ha usado ms a menudo como herramienta de la investigacin que como un mtodo de diagnstico rutinario92,93. Transcripcin reversa de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (RT- PCR). Se ha desarrollado para el diagnstico de varias enfermedades, y en los ltimos aos ha evolucionando hacia el diagnstico laboratorial de enfermedades infecciosas. Este mtodo es rpido, sensible, simple, y si est estandardizado correctamente, puede ser usado para la deteccin del genoma en las muestras clnicas humanas, las biopsias, los tejidos de autopsias y de mosquitos94. Se han divulgado varios procedimientos de RT-PCR que detectan e identifican serotipos de dengue a partir de especmenes clnicos95,96. Estos mtodos de PCR varan algo en trminos de las regiones amplificadas del gen del genoma, de las maneras como se detectan los productos del RT-PCR, y de los mtodos como se tipifican los virus. Segn la Organizacin Mundial de la Salud (OMS), el PCR es un mtodo de gran alcance para el diagnstico del dengue, sin embargo, es an necesaria una mejor estandardizacin. Un gran problema para el diagnstico del dengue ha sido la confirmacin etiolgica de casos fatales. Con frecuencia, solamente se obtiene una sola muestra del suero, y la prueba serolgica se encuentra en el valor lmite. En estos casos, es posible ahora detectar los antgenos en una gran variedad de muestras fijas con los nuevos mtodos immunohistoqumicos 97,98. Otra caracterstica importante de PCR es su capacidad de identificar el serotipo del dengue responsable de la enfermedad en curso99. Adems de anlisis enzimticos especficos de la amplificacin y de la restriccin, otros estudios han demostrado que el ordenar los nucletidos de los frag-

mentos amplificados del gen por RT-PCR se puede usar como mtodo rpido de clasificacin gentica de los serotipos del virus del dengue100,101. En nuestro pas tenemos disponibles pruebas de biologa molecular, que han permitido el diagnstico oportuno de epidemias como la ocurrida en Lima el 2005, donde se us las tcnicas de RT-PCR y RSS-PCR. Durante dicha epidemia, fueron colectadas veinte muestras de suero del primer da del brote en pacientes febriles, las que fueron procesadas mediante trascripcin reversa-reaccin en cadena de la polimerasa (RT-PCR) por electroforesis en gel de agarosa 1,5% para determinar el serotipo del virus dengue circulante, esta tcnica se realiz en un solo paso y se us un set de cinco primers32. La identificacin del genotipo circulante del virus dengue se realiz por la tcnica de sitios especficos de restriccin- reaccin en cadena de la polimerasa (RSSPCR), descrita por Harris et al.102. Adicionalmente, se realizaron aislamientos en lneas celulares C6/36 del serotipo DEN-3, tipificadas por IFI y secuenciadas genticamente para confirmar los resultados de las pruebas anteriores. El anlisis del producto de RTPCR del ARN extrado de las muestras present un producto amplificado de 290pb que corresponde al serotipo del virus DEN-3. El anlisis de los productos de RSS-PCR por electroforesis del ARN extrado a partir de aislamientos de dengue serotipo DEN - 3 correspondieron al Patrn C, el cual est incluido en el genotipo III32. Los aislamientos del serotipo DEN-3 en lneas celulares, tipificadas por IFI y el secuenciamiento gentico confirmaron los resultados obtenidos. La aplicacin del RT-PCR en un solo paso permiti determinar en un tiempo corto (ocho horas) al virus dengue 3 como agente causal del brote. El RSS-PCR es una buena opcin de genotipificacin del virus Den-3, porque no requiere de equipos sofisticados y es de bajo costo, es un aporte de INS a la deteccin temprana de epidemias que pueden tener una gran magnitud y orientar las medidas de control32. DETERMINACIN DE ANTICUERPOS CONTRA DENGUE Existen cinco pruebas serolgicas usadas para el diagnstico de infeccin por el virus del dengue: Inhibicin de la hemaglutinacion (HI), fijacin de complemento (FC), prueba de neutralizacin (TN), ELISA de captura de IgM, y ELISA indirecta para determinacin de anticuerpos IgG. La prueba de ELISA se ha considera-

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do la ms til para el diagnstico del dengue, debido a su alta sensibilidad y a la facilidad de su empleo. Inhibicin de la Hemoaglutinacin (IH). Esta prueba por muchos aos constituy el mtodo estndar para el diagnostico de dengue debido a su alto grado de sensibilidad y su ejecucin relativamente fcil. Este mtodo ha tenido y tiene utilidad para la deteccin de anticuerpos contra dengue, siendo de gran valor para estudios seroepidemiolgicos y para distinguir infecciones primarias de secundarias. En las infecciones primarias, los anticuerpos en la fase aguda se detectan al quinto o sexto da de inicio de los sntomas, generalmente cuando los ttulos del anticuerpo estn sobre 1:10. Los ttulos de anticuerpos en la fase de convalecencia estn generalmente por debajo de 1:640 en infecciones primarias. Por otra parte, en infecciones secundarias o terciarias los anticuerpos contra dengue se detectan fcilmente, y hay un aumento rpido del ttulo durante los primeros das de la infeccin, generalmente a un ttulo por encima de 1:120. As, un ttulo de 1:1,280 o mayor en las muestras recogidas durante la fase aguda o al principio de la fase convaleciente de la enfermedad es una indicacin de una infeccin secundaria por el virus del dengue. Los altos niveles de anticuerpos siguen siendo constantes por dos a tres meses en algunos pacientes, periodo luego del cual el ttulo de anticuerpos comienza a bajar. Las desventajas principales de la prueba del HI son su carencia de la especificidad, la necesidad de muestras pareadas, y la imposibilidad de identificar el serotipo del virus dengue infectante103. Fijacin de Complemento (FC). Esta prueba no se usa generalmente para el diagnstico rutinario del dengue, por lo difcil de su ejecucin y el requerimiento de personal altamente calificado y entrenado para obtener buenos resultados. La prueba se basa en el principio que el complemento ser consumido durante la reaccin antgeno anticuerpo. Los anticuerpos detectados por la FC aparecen generalmente despus que los anticuerpos detectados por IH y persisten por perodos cortos, teniendo un valor limitado para estudios seroepidemiolgicos. Son muy especficos en las infecciones primarias, y contribuyen a la determinacin de serotipo infectante, segn lo demostrado por las respuestas monotpicas observadas en las infecciones primarias103. Prueba de Neutralizacin (PN). Es la prueba serolgica ms sensible y ms especfica para la diagnstico de la infeccin por el virus del dengue, y se detecta por un perodo largo. Debido a su alta especificidad, esta prueba de puede usar para identificar el

serotipo en infecciones primarias del dengue, puesto que una respuesta relativamente monotpica se observa en el suero de los pacientes durante la fase convaleciente. En infecciones secundarias y terciarias, la determinacin del serotipo de infeccin mediante la PN, no es siempre confiable. Las desventajas de este mtodo son su elevado costo, el tiempo prolongado que es necesario para realizarla, y las dificultades tcnicas asociadas 78. Debemos considerar que la produccin de IgM vara considerablemente entre los pacientes. Algunos pacientes tendrn IgM perceptible entre el segundo al cuarto da despus del principio de los sntomas, mientras que otros no desarrollan IgM perceptible hasta el octavo da despus del inicio de la enfermedad. En el caso del Per se ha mostrado que la prueba de ELISA puede ser positiva incluso antes de los cinco das de iniciados los sntomas, lo cual fue probado en el brote de dengue en Lima en el ao 2005. En efecto, con el fin de determinar la presencia de anticuerpos contra IgM del virus dengue segn el tiempo de enfermedad en un rea con primoinfeccin por el serotipo DEN-3, se evaluaron 135 sueros colectados de otras tantas personas del brote de dengue ocurrido el 2005 debido al serotipo DEN-3 en el distrito de Comas, Lima. Las muestras fueron distribuidas en seis grupos segn el nmero de das de enfermedad: grupo A con uno a dos das (44 sueros), grupo B con tres a cuatro (38 sueros), grupo C con cinco a seis das (23 sueros), grupo D con siete a ocho das (13 sueros), grupo E con nueve a diez das (7 sueros) y grupo F con once a ms das (12 sueros). Estas muestras fueron procesadas por la tcnica de ELISA IgM de captura, usando un pool de antgenos de dengue. Habindose encontrado para cada grupo lo siguiente: A seis positivas (13,64%), B doce positivas (30,77%), C doce 12 positivas (47,83%), D trece positivas (100%), E siete positivas (100%) y F doce positivas (100%). Este estudio concluye que hay 44% de positividad en sueros de pacientes con un tiempo de enfermedad menor a los cinco das, porcentaje significativo como para considerar la necesidad de buscar anticuerpos IgM, an en este perodo de la enfermedad 104. Los ttulos del anticuerpo de IgM en infecciones primarias son perceptiblemente ms altos que en infecciones secundarias, aunque la deteccin de ttulos de 1:320 en algunos casos no es infrecuente103. La produccin de IgM es mucho ms baja y transitoria en las infecciones secundarias y terciarias105.

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Cabezas C.

Bagua Chachapoyas Tumbes Cajamarca

Iquitos

Piura Tarapoto Chiclayo Pucallpa La Libertad Tingo Maria Lima La Merced Puerto Maldonado

Como mencionamos antes, la determinacin de anticuerpos IgM especficos contra dengue, por mtodos serolgicos como el IgM-ELISA, contribuyen al diagnstico presuntivo rpido a partir de una muestra de suero, la cual debe ser obtenida a partir del quinto da de enfermedad. La presencia de anticuerpos IgM indica infeccin actual o una memoria reciente (dos a tres meses), por ello es importante contar con una historia clnica adecuada y completa para una interpretacin tambin adecuada de los resultados de laboratorio. Particularmente es importante la determinacin de la fecha de inicio de los sntomas y la fecha de obtencin de la muestra sangunea, datos que deben figurar en la ficha de envo de muestras. En caso de tener una muestra de antes del quinto da, es probable que los resultados para IgM antidengue sean negativas, pero si se trata de la enfermedad no la descarta y es necesario obtener una segunda muestra a las dos o tres semanas despus para hacer la titulacin de anticuerpos. Un incremento de los ttulos de anticuerpos en cuatro veces el titulo inicial, tambin confirma el diagnstico. En el Per se han ido implementando estas tcnicas de diagnstico de manera progresiva a medida que el dengue se fue dispersando, actualmente tenemos disponibles las tcnicas para diagnostico de IgM de captura e IgG antidengue, en los diferentes laboratorios de referencia regional, donde el dengue es endmico (Figura 12).

1 Lab. de Referencia Nacional 24 Lab. de Referencia Regional 04 Disas en Lima

Figura 12. Laboratorios de la red nacional que realizan diagnostico serolgico de dengue.

Un porcentaje pequeo de pacientes con infeccin secundaria, cursa con anticuerpos de IgM indetectables. En este tipo de situaciones, se ha encontrado que MAC-ELISA puede ser menos sensible que la prueba de hemoaglutinacin indirecta en las muestras pareadas del suero recogidas durante la fase aguda de la enfermedad89. Considerando que el tiempo de procesamiento de los mtodos de ELISA en el diagnstico serolgico del dengue demora como mnimo cinco horas, se realiz un estudio en el INS para evaluar la concordancia de de dos mtodos de ELISA-IgM para el diagnstico serolgico de dengue. Se evaluaron 148 sueros, 63 positivos a dengue y 85 negativos, analizados por la prueba de ELISA IgM de captura con pool de antgeno (cinco horas de duracin) como mtodo de referencia, las mismas muestras fueron analizadas por IgM dengue PANBIO (kit comercial-2,5 h) y ELISA IgM de captura (2,5 h). Se demostr una buena concordancia para ambos mtodos frente al mtodo de referencia, sin embargo, el kit comercial presenta un valor inferior de concordancia (kappa: 0,92 para el PANBIO y de 1,0 para ELISA IgM de captura)106. La limitacin de estas tcnicas son las reacciones cruzadas observadas, por lo que se requiere de un pool de antgenos que incluyan los cuatro serotipos de dengue adems de otros flavivirus (fiebre amarilla, virus de encefalitis japonesa, San Luis) y en algunas reas como en la Amazona otros virus que causan similares manifestaciones clnicas al dengue como Oropouche, Mayaro o Chikungunya78,88,89.

AGRADECIMIENTOS
A todo el personal profesional y tcnico de que ha contribuido con su esfuerzo al desarrollo del diagnstico e investigacin en dengue en el Instituto Nacional de Salud y de la Red Nacional de Laboratorios en el Per.

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