BID2
BID2
BID2
www.pdfmailer.com
PDFMAILER.COM
free of charge www.pdfmailer.com
DIRECT BILIRUBIN
INTENDED USE SPECIMEN COLLECTION AND HANDLING EXPECTED VALUES6
This reagent is intended for the in vitro quantitative determination of direct bilirubin in 1. The best specimen is un-hemolyzed serum. Adults and infants over 1 month old 0.0 - 0.2 mg/dL.
human serum. 2. Specimens should be protected from bright light as bilirubin is photolabile.
Specimens may be stored refrigerated for 3 days.6 It is recommended each laboratory verify this range or derives a reference interval for the
CLINICAL SIGNIFICANCE population that it serves. 7
Red blood cells at the end of their circulating life are broken down in the reticulo- INTERFERENCE
endothelial system, mainly the spleen. The resulting haem, once the iron is removed, is 1. Studies to determine the level of interference for hemoglobin, and lipemia were PERFORMANCE *
then converted to bilirubin. This process accounts for about 80 percent of the 300 mg of carried out, the following results were obtained: Linearity:
bilirubin formed daily. Other sources of bilirubin include the breakdown of myoglobin Hemoglobin: No significant interference (± 10%) from hemoglobin up to 100 mg/dL. When run as recommended the assay is linear from 0 to 20.0 mg/dL.
and cytochromes and the catabolism of immature red blood cells in the bone marrow. Lipemia: No significant interference (± 10%) from lipemia up to 202 mg/dL
measured as triglycerides. Method Comparison:
Once formed, bilirubin is transported to the liver bound to albumin as it is water 2. Young DS5 has published a comprehensive list of drugs and substances which may Studies performed between this procedure and a similar Direct Bilirubin Reagent yielded
insoluble. This fraction of bilirubin is referred to as indirect or un-conjugated bilirubin. In interfere with the Direct Bilirubin assay. the following results:
the liver bilirubin is conjugated to glucoronic acid (mono and di glucuronides) to form
conjugated bilirubin by the enzyme uridyl diphosphate gulcuronyl transferase. ADDITIONAL EQUIPMENT REQUIRED BUT NOT PROVIDED Number of sample pairs: 57
Conjugated bilirubin or direct bilirubin is excreted via the bilary system into the intestine 1. A clinical chemistry analyzer capable maintaining constant temperature (37°C) and Range of samples: 0.10 –20.3 (mg/dL)
where it is metabolized by bacteria to a group of products known collectively as measuring absorbance at 550 nm. Correlation Coefficient: 0.999
stercobilinogen. Elimination of is almost complete and plasma levels are normally 2. Deionized water and related equipment, e.g.: pipettes Slope: 0.928
negligible. 3. Analyzer specific consumables, e.g.: sample cups Intercept: 0.06 (mg/dL)
4. Control and Calibrator materials such as those provided by JAS Diagnostics.
Total Bilirubin is the sum of the un-conjugated and conjugated fractions. Total bilirubin Precision:
is elevated in conditions causing obstruction of the bile duct, hepatitis, cirrhosis, in ASSAY PROCEDURE Within Run Level 1 Level 2 Level 3
hemolytic disorders and several inherited enzyme deficiencies. Indirect bilirubin is These instructions are to be used as a general guideline for adapting to select automated n=40
elevated by pre-hepatic causes such as hemolytic disorders or liver diseases resulting in instruments. Refer to your specific JAS instrument application instructions available Mean (mg/dL) 0.19 1.67 4.05
impaired entry, transport or conjugation within the liver. upon request. S.D. (mg/dL) 0.02 0.04 0.07
C.V. (%) 11.8 2.1 1.7
Monitoring of bilirubin in the newborn, particularly if premature is of particular It is recommended that a sample blank be performed on each sample. A sample blank can
importance. Since the hepatic handling of bilirubin in such cases is often immature, be obtained by simply using Direct Bilirubin Reagent as supplied without the addition of Total Level 1 Level 2 Level 3
jaundice due to a rise in un-conjugated bilirubin is common. Un-conjugated bilirubin if Sodium Nitrite. n=40 (10 days / 2 runs per day / 2 replicates per run)
not bound to albumin is able to cross the blood brain barrier more easily, increasing the Mean (mg/dL) 0.19 1.67 4.05
danger of cerebral damage.1 SYSTEM PARAMETERS S.D. (mg/dL) 0.03 0.08 0.19
Temperature: 37°C C.V. (%) 16.2 4.6 4.7
METHODOLOGY Wavelength: 550 nm
Most methods currently used for assaying bilirubin are based on the reaction between Assay Type: Endpoint Sensitivity:
bilirubin and diazotized sulphanilic acid solutions. In aqueous solution only the direct Direction: Increase A calibration factor of approximately 27.3 was obtained, which is equivalent to a
(conjugated) bilirubin will react in this manner. The JAS Direct Bilirubin reagent uses an Sample/ Rgt. Ratio: 1: 20 sensitivity of 0.0366 D Abs per mg/dL.
acid diazo method. Conjugated bilirubin reacts with diazotized sulphanilic acid to e.g. Sample Vol. 0.05 mL (50mL)
produce an acid azobilirubin, the absorbance of which is proportional to the concentration Reagent Vol. 1.0 mL * NOTE: Performance established on the Chiron 550 Express.
of direct bilirubin in the sample and can be measured at 550 nm. For bichromatic Incubation Time: 10 Min
analyzers the blank reading should be taken at 660 nm. REFERENCES
PROCEDURE NOTES 1. Zilva JF, Pannall PR. “Liver Disease and Gall Stones” in Clinical Chemistry in
REAGENT COMPOSITION 1. The reagent and sample volumes may be altered proportionally to accommodate Diagnosis and Treatment”. Lloyd-Luke 1979; Chap XIII; 286-8.
Active Ingredients Concentration various instrument requirements. 2. Malloy HT, Evelyn KA. J Biol Chem 1937; 119:481-90.
HCI 103 mM 2. Samples with values above 20 mg/dL should be diluted 1:1 with water, rerun,and 3. Jendrassik L, Grof B. Biochem Zeit 1938; 297:81-9.
Sulphanilic acid 9.8 mM results multiplied by 2. 4. Pearlman FC, Lee RT. Clin Chem 1974; 20:447-53.
Sodium Nitrite 145 mM 5. Young DS. Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests, Third Edition. AACC
CALCULATIONS Press, 1990.
PRECAUTIONS Abs. = Absorbance 6. Tietz Textbook of Clinical Chemistry, Second Edition. Burtis CS and Ashwood
This reagent is for in vitro diagnostic use only. ER (Eds), WB Saunders Company, 1994.
DO NOT pipette by mouth. If spilt, thoroughly wash affected areas with water. Abs. Sample Test –Abs Sample Blank x Concentration of STD = Concentration BID2 7. Watchel M et al, Creation and Verification of Reference Intervals. Laboratory
Abs. STD Test –Abs STD Blank (mg/dL) (mg/dL) Medicine, 1995; 26: 593-7.
REAGENT PREPARATION
1. Test Reagent: Add Sodium Nitrite Reagent to Direct Bilirubin Reagent in the ratio of Sample calculation:
1:100. For example, to 10 mL of Direct Bilirubin Reagent add 0.1 mL of Sodium Abs. Sample Test = 0.350 JAS Diagnostics, Inc.
Nitrite (This is approximately equal to 3 drops but it is recommended that this be Abs. Sample Blank = 0.010 7220 NW 58th St., Miami Florida 33166
verified by the operator). Abs. Standard Test = 0.250 Tel. 305.418.2320 Fax. 305.418.2321
2. Blank Reagent: Use Direct Bilirubin Reagent as supplied. Abs. Standard Blank = 0.010 www.jasdiagnostics.com
Concentration of Standard = 4.0 mg/dL
REAGENT STORAGE Obelis (O.E.A.R.C.) “European Authorized Representative”
1. Store reagent between 2-25°C. The reagent is stable until the expiry date stated on the 0.350 - 0.010 x 4.0 = 5.7 mg/dL Direct Bilirubin Avenue de Tervuren, 34 box 44 1040 Brussels
bottle and kit box label. 0.250 - 0.010 Tel.: +32.2.732.59.54 Fax: +32.2.732.60.03
2. Working reagent is stable for at least 21 days at 2-8°C. Email: mail@obelis.net
NOTE: To obtain values in mmol/L, multiply mg/dL x 17.10 = mmol/L
REAGENT DETERIORATION:
Do not use the reagent if: CALIBRATION
1. Turbid An appropriate serum calibrator can be used such as JAS Chemistry Calibrator P/N
2. Reagent absorbance > 0.1 AU at 550 nm. CAL1-5.
3. The reagent fails to meet stated parameters of performance.
QUALITY CONTROL
The integrity of the reaction should be monitored by use of a two level control with
known Direct Bilirubin values.
BILIRUBINA DIRECTA
Lipemia: No interferencia significativa (+ 10%) hasta 202 mg/dL medida como valores conocidos de Bilirubina Directa.
USO trigliceridos.
Este reactivo es utilizado para la determinación cuantitativa in vitro de Bilirubina Directa en 2. Young, D.S. 5 ha publicado un listado de drogas y sustancias que pueden interferir con el VALORES ESPERADOS 6
suero humano. ensayo de Bilirubina Directa. Adultos e infantes mayores de 1 mes 0.0-0.2 mg/dL
Se recomienda que cada laboratorio verifique este rango o establezca su propio rango normal.7
SIGNIFICADO CLINICO EQUIPO ADICIONAL REQUERIDO NO INCLUIDO
Los glóbulos rojos, al final de su vida circulante, son destruidos en el sistema retículo endotelial, 1. Analizador de química clínica capaz de mantener temperatura de 37°C constante y medir DESEMPEÑO
principalmente en el bazo. El grupo hemo resultante, una vez separado del hierro, se convierte en absorbancia a 550nm. Linealidad:
bilirubina. Este proceso es responsable de aproximadamente un 80% de los 300 mg de bilirubina 2. Agua deionizada y equipo relacionado,ej. Pipetas Cuando es evaluado como recomendado el ensayo es linear de 0 hasta 20 mg/dL.
que se forman al día. Otras fuentes de bilirubina son la destrucción de mioglobina y citocromos y 3. Consumibles específicos para el analizador ej. Copas de Muestras
el catabolismo de glóbulos rojos inmaduros en la medula ósea. 4. Material control como los suplidos por JAS Diagnostics. Comparación del Método:
Los siguientes resultados fueron obtenidos mediante estudios realizados entre este procedimiento
Una vez formada, la bilirubina es transportada al hígado unido a la albúmina ya que es insoluble PROCEDIMIENTO MANUAL y uno similar:
en agua. Esta fracción de bilirrubina se conoce como bilirrubina indirecta o no conjugada. En el Test Blank Pares de Muestra 57
hígado la bilirrubina se conjuga con ácido glucuronico (mono y diglucuronidos) para formar la Reactivo de Trabajo (ml) 1.0 ------ Rango de Muestras 0.10 –20.3 mg/dL
bilirrubina conjugada por acción de enzima uridil di fosfato glucuronil transferasa. Esta Reactivo Bilirubina Directa (ml) ------ 1.0 Coeficiente de Correlación 0.999
bilirrubina conjugada o bilirrubina directa es excretada, vía estercobilinogeno por el intestino. La Muestra (ml) 0.10 0.10 Pendiente 0.928
eliminación es casi completa y los niveles en plasma son normalmente despreciables. Intercepto 0.06 mg/dL
1. Identifique lus tubos de ensayo “blanco”, “control”, “paciente”, etc. Cada tubo require un
La bilirrubina total es la suma de las fracciones conjugada y no conjugada. La bilirrubina total tubo de blanco. Precisión:
esta elevada en condiciones que causan obstrucción del conducto biliar, hepatitis, cirrosis, 2. Añada 1.0mL de bilirrubina directa a todos los tubos de blanco. N=40
enfermedades hemolíticas y varias deficiencias enzimáticos heredadas. La bilirrubina indirecta 3. Prepare un reactivo de trabajo. Vea la sección de Preparación del Reactivo en el inserto. Entre Corridas Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3
esta elevada por causas pre-hepáticas tales como desordenes hemolíticos o enfermedades 4. Añada 1.0mL del reactivo de trabajo a todos los tubos de ensayo. Promedio (mg/dL) 0.19 1.67 4.05
hepáticas que dan como resultado alteraciones en la entrada, transporte y conjugación en el 5. Pre-caliente los tubos por aproximadamente 5 minutos a 37ºC. S.D. (mg/dL) 0.02 0.04 0.07
hígado. 6. A intervalos de tiempo añada 0.10mL (100µL) de muestra a los tubos correspondientes. C.V.(%) 11.8 2.1 1.7
Mezcle.
El monitoreo de la bilirubina en el recién nacido, particularmente si es prematuro, es de gran 7. Deje descansar los tubos por 5 minutos a 37ºC. Entre Corridas Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3
importancia. Puesto que el metabolismo hepático de la bilirubina en tales casos es inmaduro, es 8. Lleve el espectrofotómetro a cero con el reactivo blanco a 550nm (540-560nm). N=40 (10 días, 2 corridas por día, 2 replicas por corrida)
común la ictericia en el recién nacido, debida a un aumento de la bilirrubina no conjugada o 9. Lea y registre la absorbancia de todos los tubos. Promedio (mg/dL) 0.19 1.67 4.05
indirecta. La bilirrubina no conjugada, si no esta unida a albumina, es capaz de atravesar la 10. Vea la sección de cálculos en el inserto para obtener los resultados. S.D. (mg/dL) 0.03 0.08 0.19
barrera hematoencefalica mas fácilmente, aumentando el peligro de daño cerebral.1 C.V.(%) 16.2 4.6 4.7
NOTA: El color continuara aumentando debido a la presencia de la fracción indirecta. El tiempo
METODO debe ser exacto para la medida precisa de la fracción directa. Sensitividad:
La mayoría de métodos actuales son basados en la reacción entre bilirubina y soluciones de ácido Un factor de calibración de aproximadamente 27.3 fue obtenido, el cual es equivalente a una
sulfanilico diazotados. En solución acuosa solo la bilirubina directa (conjugada) reaccionara de PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO sensitividad de 0.0366 D Abs por mg/dL.
esta manera. Este reactivo de bilirubina directa usa el método de ácido diazo. Bilirubina Estas instrucciones son para ser utilizadas como una guía general para la adaptación al
Conjugada reacciona con ácido sulfanilico diazotado para producir un ácido azobilirubina, la instrumento automatizado seleccionado por el usuario. Es recomendable que un blanco de * NOTA: Desempeño establecido en Chiron 550 Express.
absorbancia la cual es proporcional a la concentración de bilirubina directa en la muestra, puede muestra sea ensayado con cada muestra. Un blanco de muestra puede ser obtenido usando el
ser medida a 550nm. Para analizadores bicromaticos la lectura del blanco debe ser tomada a reactivo de Bilirubina Directa como viene sin añadir el Nitrito de Sodio REFERENCIAS
660nm. 1. Zilva JF, Pannall PR. “Liver Disease and Gall Stones”in Clinical Chemistry in Diagnosis
PARAMETROS and Treatment”. Lloyd-Luke 1979; Chap XIII; 286-8
COMPOSICION DEL REACTIVO Temperatura: 37°C 2. Malloy HT, Evelyn KA. J Biol chem 1937; 119-481-90.
Ingredientes Activos Concentracion Largo de Onda 550nm 3. Jendrassik L, Grof B. Biochem Zeit 1938; 297;81-9
HCI 103mM Tipo de Ensayo: Punto Final 4. Pearlman FC, Lee RT. Clin Chem 1974; 20:447-53
Acido sulphanilic 9.8mM Dirección: Aumentativo 5. Young DS, Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests. Thirrd Edition. AACC Press
Nitrito de Sodio 145mM Ratio: Muestra/Reactivo 1:20 1990
Volumen de Muestra 0.05mL (50mL) 6. Tietz. N. , Textbook of Clinical Chemistry, 2nd Edition. Burtis CS and Ashwood ER (Eds)
PRECAUCIONES Volumen de Reactivo 1.0 mL W.B. Saunders, 1995
Este reactivo es solo para uso de diagnostico in vitro. Tiempo de incubación: 10 minutos 7. Watchel M et al, Creation and Verification of Reference Intervals. Laboratory Medicine,
No utilice la boca. Si algún derrame ocurre, lave las áreas afectadas con agua. 1995;26:593-7
NOTAS DEL PROCEDIMIENTO
PREPARACION DEL REACTIVO 1. Los volúmenes de Muestra y Reactivo pueden ser alterados proporcionalmente para JAS Diagnostics, Inc.
1. Reactivo de prueba: Añadir el reactivo de Nitrito de Sodio al reactivo de Bilirubina Directa adaptarlos a los requisitos de varios instrumentos. 7220 NW 58th St., Miami Florida 33166
en proporción de 1:100. Por ejemplo, a 10mL de Reactivo de Bilirubina Directa, añadir 2. Muestras con valores mayores de 20mg/dL deben ser diluidas 1:1 con agua, y el resultado Tel. 305.418.2320 Fax. 305.418.2321
0.1mL de Nitrito de Sodio ( esto es aproximadamente 3 gotas de nitrito por cada 10mL de multiplicado por 2. www.jasdiagnostics.com
Reactivo de Bilirubina Directa)
2. Reactivo Blanco: Use el reactivo de Bilirubina Directa como se suple. CALCULOS Obelis (O.E.A.R.C.) “European Authorized Representative”
Abs. Muestra - Abs. Blanco de muestra x Concentración Calibrador = BID2 Avenue de Tervuren, 34 box 44 1040 Brussels
ALMACENAJE DEL REACTIVO Abs. Calibrador - Abs. Blanco del Calibrador (mg/dL) (mg/dL) Tel.: +32.2.732.59.54 Fax: +32.2.732.60.03
1. Almacenar el reactivo a temperatura de 2-25°C El reactivo es estable hasta la fecha de Email: mail@obelis.net
expiración. Ejemplo:
2. El Reactivo de Trabajo es estable por lo menos 21 días almacenado de 2-8°C. Absorbancia de la muestra = 0.350
Absorbancia Blanco muestra = 0.010
DETERIORO DEL REACTIVO Absorbancia del Calibrador = 0.250
No utilice el reactivo si: Absorbancia Blanco Calibrador = 0.010
1. Esta turbio Concentración del Calibrador = 4.0 mg/dL
2. La absorbancia es >0.1AU a 550nm
3. El reactivo falla en cumplir los parámetros de desempeño establecidos. 0.350 –0.010 x 4 = 5.7 mg/dL BID2
0.25 –0.010
COLECCIÓN Y ALMACENAJE DE LA MUESTRA
1. Debe usarse muestras no hemolizadas. Nota: Para obtener valores en mmol/L multiplique mg/dL x 17.10 = mmol/L
2. Muestras deben ser protegidas de la luz brillante. Pueden ser almacenadas de 2-8°C por 3
dias. 6 CALIBRACION
Se requiere calibración. Este ensayo requiere el uso de un calibrador suero apropiado con valores
INTERFERENCIA conocidos de Bilirubina Directa, tal como el JAS Diagnostics Calibrator.
1. Estudios para determinar el nivel de interferencia para hemoglobina y lipemia fueron
realizados, se obtuvieron los siguientes resultados: CONTROL DE CALIDAD
Hemoglobina: No interferencia significativa (+ 10%) hasta 100mg/dL La integridad de la reacción debe ser monitoreada con el uso de dos niveles de control con
PI: BID2.05 REV: 04/27/06