CHE- DIBUCAINE

Cholinesterase - Dibucaine
Ancillary reagent. Dibucaine inhibition

Quantitative determination of cholinesterase with 25 - 30ºC 37ºC

dibucaine inhibición Without inhibitor WR (mL) 1.5 1.5
IVD With inhibitor WR-I (mL) 1.5 1.5
Sample ( L) 10 --
Store at 2-8ºC Sample diluted 1/2 with NaCl 9 g/L ( L) -- 10

PRINCIPLE OF THE METHOD 4. Mix. Read initial absorbance (A) of the sample, start the stopwatch and
Butyrylthiocholine kinetic method using dibucaine as inhibitor. read absorbances at 30 seconds intervals thereafter for 1.5 minutes.
Cholinesterase hydrolysed butyrylthiocholine to butyrate and 5. Calculate the difference between absorbances and the average
thiocholine. Thiocholine reacts with 5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid absorbance differences per 30 seconds ( A/30 s).
(DTNB) to form 5-mercapto-2-nitrobenzoic acid (5-MNBA), according
CALCULATIONS
the following reactions:
Tv= Total volumen in mL
Cholineste rase 25º- 30ºC A / 30 s x 22537* = U/L DTNB = 13.5 at 405 nm
Butyrylthiocholine + H2O Butyrate + Thiocholine * T v x 1000
x LP x Sv LP= Light path
37ºC A / 30 s x 45074* = U/L Sv= Sample volum in mL
Thiocholine + DTNB 5-MNBA
The rate of 5-MNBA formation, measured photometrically, is Activity with inhibitor (U / L)
Percent inhibition (%): 100- x100
proportional to the enzymatic activity of cholinesterase in the Activity without inhibitor (U / L)
1,2
sample . Units: One international unit (IU) is the amount of enzyme that transforms 1 mol of
substrate per minute, in standard conditions. The concentration is expressed in units
CLINICAL SIGNIFICANCE per litre of sample (U/L).
Cholinesterase is an enzyme present in plasma and synthesized by
the liver. Its true physiological function is unknown, so its function may QUALITY CONTROL
be to hydrolyze choline in plasma. Cholinesterase activity is usually Control sera are recommended to monitor the performance of assay procedures:
measured for liver function, is a sensitive test of exposure to SPINTROL H Normal and Pathologic (Ref. 1002120 and 1002210).
pesticides organophosphorus and identification of patients with the If control values are found outside the defined range, check the instrument,
atypical form of enzyme whose presents high sensitivity to succinyl- reagents and technique for problems.
Each laboratory should establish its own Quality Control scheme and corrective
choline.
actions if controls do not meet the acceptable tolerances.
The dibucaine percent inhibition is determined in addition to total
activity cholinesterase to detect the presence of an abnormal genetic REFERENCE VALUES1,2
1,5,6
variant of cholinesterase . Percent inhibition of cholinesterase activity by dibucaine:
Clinical diagnosis should not be made on a single test result; it should Normal 70-90% Heterozygotes 30-70% Homozygotes 0-20%
integrate clinical and other laboratory data.
These values are for orientation purpose; each laboratory should establish its
REAGENTS own reference range.
CHOLINESTERASE Ref: 1001100
PERFORMANCE CHARACTERISTICS
R1 50 mmol/L
Phophate pH 7.7 Measuring range: Up to linearity limit of 0.250 A/30 s.
Buffer
If the results obtained were greater than linearity limit, dilute the sample 1/2 with
R2 5,5-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (5,5 DTNB) 0.25 mmol/L NaCl 9 g/L and multiply the result by 2.
Substrate Butyrylthiocholine 7 mmol/L Accuracy: Results obtained using SPINREACT reagents (y) did not show
systematic differences when compared with other commercial reagents (x).
CHE-DIBUCAINE The results of the performance characteristics depend on the analyzer used.
R3
Dibucain Chlorhidrate 2.6 mmol/L INTERFERENCES
Inhibitor
Moderate hemolytic will not interfere in the results1,2. A list of drugs and other
PREPARATION interfering substances with cholinesterase determination has been reported by
Working reagent (WR): Young et. al3,4.
Dissolve ( ) one tablet of R 2 Substrate in one vial of R 1.
Cap vial and mix gently to dissolve contents. NOTES
Inhibition (WR-I): 1. Use glass containers only. Inhibitors may be extracted from some plastics.
2. SPINREACT has instruction sheets for several automatic analyzers.
Add 300 L of R 3 Inhibitor to working reagent (WR).
Instructions for many of them are available on request.
Stability: 2 hours at 2-8ºC.
BIBLIOGRAPHY
STORAGE AND STABILITY 1. King M. Cholinesterase. Kaplan A et al. Clin Chem The C.V. Mosby Co. St Louis.
All the components of the kit are stable until the expiration date on the Toronto. Princeton 1984; 1108-1111.
label when stored tightly closed at 2-8ºC, protected from light and 2. Whittaker M. et al. Comparasion of a Commercially Available Assay System with
contaminations prevented during their use. Two Reference Methods for the Determination of Plasma Cholinesterase
Do not use the tablets if appears broken. Variants..Clin. Chem 1983;(29/10); 1746-1760.
Do not use reagents over the expiration date. 3. Young DS. Effects of drugs on Clinical Lab. Tests, 4th ed AACC Press, 1995.
Signs of reagent deterioration: 4. Young DS. Effects of disease on Clinical Lab. Tests, 4th ed AACC 2001.
- Presence of particles and turbidity. 5. Burtis A et al. Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3rd ed AACC 1999.
- Blank absorbance (A) at 405 nm 0.70. 6. Tietz N W et al. Clinical Guide to Laboratory Tests, 3rd ed AACC 1995.

ADDITIONAL EQUIPMENT PACKAGING

- Spectrophotometer or colorimeter measuring at 405 nm. Cont.
Ref: 1001101 R3: 1 x 5 mL
- Thermostatic bath at 25ºC, 30ºC o 37ºC ( 0.1ºC)
- Matched cuvettes 1.0 cm light path.
- General laboratory equipment (Note 1).
SAMPLES
Serum or heparinized plasma1: Stability 7 days at 2-8ºC.
PROCEDURE
1. Assay conditions:
Wavelength: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 405 nm
Cuvette: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . .1 cm light path
Constant temperature . . . . . . . . . . .. . . . .25ºC /30ºC / 37ºC
2. Adjust the instrument to zero with distilled water or air.
3. Pipette into a cuvette:
BEIS21-I 27/06/11 SPINREACT,S.A./S.A.U. Ctra.Santa Coloma, 7 E-171716 SANT ESTEVE DE BAS (GI) SPAIN
Tel. +34 972 69 08 00 Fax +34 972 69 00 99. e-mail: [email protected]
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Colinesterasa - Dibucaina
Reactivo auxiliar. Inhibición de la dibucaina

Determinación cuantitativa de colinesterasa con 25º - 30ºC 37ºC

inhibición de dibucaina Sin inhibidor RT (mL) 1,5 1,5
IVD Con inhibidor RT-I (mL) 1,5 1,5
Muestra ( L) 10 --
Conservar a 2-8ºC Muestra diluida 1/2 con ClNa 9 g/L ( L) -- 10
PRINCIPIO DEL METODO 4. Mezclar. Leer la absorbancia (A) inicial de la muestra, poner en marcha
Método de butirilcolina cinética usando la dibucaína como inhibidor. el cronometro y leer la absorbancia cada 30 segundos durante 1,5 min.
La colinesterasa hidroliza la butiriltiocolina a tiocolina y butirato. 5. Calcular el promedio de la diferencia de absorbancia por intervalo de 30
La tiocolina reacciona con el ácido 5.5’-ditiobis-2-nitrobenzoico (DTNB) y
segundos ( A/30 s).
forma ácido 5-mercapto-2-nitrobenzoico (5-MNBA), según el siguiente
esquema de reacción: CALCULOS
Colinester asa Tv= Volumen total en mL
Butiriltiocolina + H2O Tiocolina + Butirato 25º- 30ºC A / 30 s x 22537* = U/L DTNB = 13.5 a 405 nm
* Tv x 1000
x LP x Sv LP= Paso de luz
Tiocolina + DTNB 5-MNBA 37ºC A / 30 s x 45074* = U/L Sv= Volumen muestra mL
La velocidad de formación de 5-MNBA, determinado fotometricamente, es
proporcional a la actividad enzimática de colinesterasa en la muestra Activ idadcon inhibidor (U / L)
Porcentaje de inhibición (%): 100- x 100
ensayada1,2. Activ idadsininhibidor (U / L)
SIGNIFICADO CLINICO Unidades: La unidad internacional (UI) es la cantidad de enzima que convierte 1 mol
La colinesterasa es una enzima presente en el plasma, sintetizada en el de substrato por minuto. La concentración se expresa en unidades por litro (U/L).
hígado. Su función fisiológica no se conoce claramente, aunque se le
atribuye un papel importante como regulador de la concentración de la CONTROL DE CALIDAD
colina en el plasma. Es conveniente analizar junto con las muestras sueros control valorados:
La determinación de su actividad nos ayuda a evaluar la función hepática, SPINTROL H Normal y Patológico (Ref. 1002120 y 1002210). Si los valores
detectar la exposición excesiva a pesticidas organofosforados e identificar hallados se encuentran fuera del rango de tolerancia, se debe revisar el
pacientes con formas atípicas de la enzima que presentan una instrumento, los reactivos y la técnica. Cada laboratorio debe disponer su propio
sensibilidad aumentada al anestésico succinilcolina1,5,6. Control de Calidad y establecer correcciones en el caso de que los controles no
El porcentaje de inhibición de la dibucaina se determina cumplan con las tolerancias.
complementariamente a la actividad de la colinesterasa para detectar la
presencia de variantes anormales de colinesterasa1,5,6. VALORES DE REFERENCIA1,2
El diagnostico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos Porcentaje de inhibición de la actividad de colinesterasa por la dibucaina:
clínicos y de laboratorio. Normal 70-90% Heterozigotos 30-70% Homozigotos 0-20%
Estos valores son orientativos. Es recomendable que cada laboratorio
REACTIVOS establezca sus propios valores de referencia.
CHOLINESTERASE Ref: 1001100
R1 CARACTERISTICAS DEL METODO
Fosfato pH 7,7 50 mmol/L
Tampón Rango de medida: Hasta el limite de linealidad 0.250 A / 30 s.
R2 Ác. 5,5-ditiobis-2-nitrobenzoico (5,5 DTNB) 0,25 mmol/L Si la concentración de la muestra es superior al limite de linealidad, diluir 1/2 con
Substrato Butiriltiocolina 7 mmol/L ClNa 9 g/L y multiplicar el resultado final por 2.
Exactitud: Los reactivos SPINREACT (y) no muestran diferencias sistemáticas
CHE-DIBUCAINE significativas cuando se comparan con otros reactivos comerciales (x).
R3 Las características del método pueden variar según el analizador utilizado.
Clorhidrato de Dibucaina 2,6 mmol/L
Inhibidor
INTERFERENCIAS
Hemólisis moderada no interfiere en los resultados1,2.
PREPARACION
Se han descrito varias drogas y otras substancias que interfieren en la
Reactivo de trabajo (RT): determinación de la colinesterasa3,4.
Disolver ( ) un comprimido de R 2 Substrato en un vial de R 1 Tampón.
Tapar el vial y mezclar suavemente hasta disolver su contenido. NOTAS
Inhibición (RT-I): 1. Usar solo material de vidrio. Los inhibidores pueden liberarse de algunos
Añadir 300 L de R 3 Inhibidor al reactivo de trabajo (RT). plásticos1.
Estabilidad: 2 horas a 2-8ºC. 2. SPINREACT dispone de instrucciones detalladas para la aplicación de
este reactivo en distintos analizadores.
CONSERVACION Y ESTABILIDAD
BIBLIOGRAFIA
Todos los componentes del kit son estables, hasta la fecha de caducidad
1. King M. Cholinesterase. Kaplan A et al. Clin Chem The C.V. Mosby Co. St Louis.
indicada en la etiqueta, cuando se mantienen los frascos bien cerrados a Toronto. Princeton 1984; 1108-1111.
2-8ºC, protegidos de la luz y se evita su contaminación. 2. Whittaker M. et al. Comparasion of a Commercially Available Assay System with
No usar las tabletas si aparecen fragmentadas. Two Reference Methods for the Determination of Plasma Cholinesterase
No usar reactivos fuera de la fecha indicada. Variants..Clin. Chem 1983;(29/10); 1746-1760.
Indicadores de deterioro de los reactivos: 3. Young DS. Effects of drugs on Clinical Lab. Tests, 4th ed AACC Press, 1995.
- Presencia de partículas y turbidez. 4. Young DS. Effects of disease on Clinical Lab. Tests, 4th ed AACC 2001.
- Absorbancias (A) del Blanco a 405 > 0,70. 5. Burtis A et al. Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3rd ed AACC 1999.
6. Tietz N W et al. Clinical Guide to Laboratory Tests, 3rd ed AACC 1995.
MATERIAL ADICIONAL
- Espectrofotómetro o analizador para lecturas a 405 nm. PRESENTACION
- Baño termostatable a 25ºC, 30ºC ó 37ºC ( 0,1ºC) Cont.
- Cubetas de 1,0 cm de paso de luz. Ref:1001101 R3: 1 x 5 mL
- Equipamiento habitual de laboratorio (Nota 1).
MUESTRAS
Suero o plasma heparinizado 1. Estabilidad de la muestra: 7 días a 2-8ºC.
PROCEDIMIENTO
1. Condiciones del ensayo:
Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 405 nm
Cubeta:. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 cm paso de luz
Temperatura constante . . . . . . . . . . . . . . . .25ºC / 30ºC / 37ºC
2. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada o aire.
3. Pipetear en una cubeta:

BEIS21-E 06/10/11 SPINREACT,S.A./S.A.U. Ctra.Santa Coloma, 7 E-17176 SANT ESTEVE DE BAS (GI) SPAIN
Tel. +34 972 69 08 00 Fax +34 972 69 00 99. e-mail: [email protected]