Seminar Nasional Edusainstek ISBN : 978-602-5614-35-4

FMIPA UNIMUS 2018

ISOLASI BAKTERI PENGHASIL ENZIM PROTEASE

BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS IROD2 PADA
ONCOM MERAH PASCA FERMENTASI 48 JAM

Dwi Pamaya1, Sakti Imam Muchlissin2, Endang Tri wahyuni maharani3, Sri Darmawati4,
Stalis Norma Ethica5
1
Health Analytst DIV Study Program, Faculty of Nursing and Health Sciences, Universitas
Muhammadiyah Semarang, Indonesia
email : [email protected]
2
Faculty of Fisheries and Marine Sciences, Universitas Diponegoro, Semarang, Indonesia
email : [email protected]
5
Health Analyst DIII Study Program, Faculty of Nursing and Health Sciences, Universitas
Muhammadiyah Semarang, Indonesia
email : [email protected]

Abstract
Proteolytic bacteria are the bacteria capable of producing extracellular
protease enzymes, namely protein-breaking enzymes that are widely used in
many industrial fields. This study aimed to isolate a proteolytic bacterium found
on 48-h post-fermented oncom and molecular identification method. The initial
isolation and purification process of the colony was carried out using Nutrient
Agar medium. Selection of protease enzyme obtained by bacterial isolate was
done on Milk Skim Agar medium. Identification process of the isolate was done
through amplification of 16S rRNA gene using PCR, sequencing and analysis of
gene sequences using BLAST program. From the isolation process a bacterial
isolate that has proteolytic by the ability to produce a clear zone of 82.00 on
plate. The result of the 16S rRNA gene sequence analysis showed that the
proteolytic bacterial isolate obtained in this study had a 98% homology level
with 16S ribosomal RNA isolate of Bacillus amyloliquefaciens strain A1142
(Genbank access code: KTT722836.1). Based on the results of the molecular
identification, the isolate was identified as Bacillus amyloliquefaciens strain
IROD2 (IROD2 = Indonesia Red Oncom Day2). As conclusion, from 48-h post
fermented red oncom, a protease producing bacterial strain molecularly
identified as Bacillus amyloliquefaciens strain IROD2.

Keywords: Moleculary was identified, Proteolitic bacteria, 16S rRNA gene

1. PENDAHULUAN

Perkembangan industri enzim telah pesat dan menempati posisi penting dalam bidang
industri. Kesadaran masyarakat terhadap masalah lingkungan yang semakin tinggi serta
adanya tekanan dari para ahli dan pecinta lingkungan menjadikan teknologi enzim sebagai
salah satu alternatif untuk menggantikan berbagai proses kimiawi dalam bidang industri
(Soeka dkk, 2011).
Dalam industri pengolahan jenis makanan fermentasi, umumnya proses dilakukan
dengan mendayagunakan aktivitas metabolisme suatu mikroba atau campuran dari beberapa
spesies untuk menghasilkan senyawa tertentu. Iklim Indonesia yang hangat membuat
mikroba dapat tumbuh dan berkembang, di Indonesia tidak asing dengan pangan fermentasi
karena banyak pangan fermentasi salah satunya adalah oncom (Afifah, 2014).
Oncom adalah makanan asal Indonesia yang populer di daerah Jawa Barat. Makanan
ini adalah produk fermentasi yang dilakukan oleh beberapa jenis kapang. Oncom merah
didegradasi oleh kapang Neurospora sitophila sedangkan oncom hitam didegradasi oleh

40
Seminar Nasional Edusainstek ISBN : 978-602-5614-35-4
FMIPA UNIMUS 2018

kapang Rhizopus oligosporus. Kapang oncom mengeluarkan enzim amilase, lipase dan
protease yang aktif selama proses fermentasi. Mikroba yang berperan dalam pembuatan
pangan fermentasi dapat dikembangkan manfaatnya dalam hal lain, misalnya metabolit yang
dihasilkan seperti enzim (Turmala dan Taufik, 2016 ; Nuritasari, 2012).
Bakteri proteolitik adalah bakteri yang mampu mendegradasi protein, memproduksi
enzim protease ekstraseluler. Protease merupakan enzim proteolitik yang mengkatalisis
pemutusan ikatan peptida pada protein. Untuk mensekresikan protease yang dapat
mendegradasikan protein, maka pada medium disertakan susu skim yang mengandung
kasien. Kasein merupakan protein utama susu, suatu mikromolekul yang tersusun atas sub
unit asam amino yang dihubungkan dengan ikatan peptida. Kasein berfungsi sebagai substrat
bagi enzim protease. Pada umumnya bakteri proteolitik adalah bakteri dari genus Bacillus,
Pseudomonas, Proteus Streptobacillus, Staphylococcus, Streptococcus (Puspita, 2012).
Saat ini dikembangkan metode identifikasi berbasis molekuler yang lebih cepat
dengan tingkat sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi, yaitu dengan analisis sekuensing gen
16S rRNA (16S Ribosomal Ribonucleic Acid/Asam ribonukleat pengkode ribosom istilah
16S rRNA) (Rinanda, 2011).
Menurut penelitian yang dilakukan oleh Afifah (2014), ditemukan 43 isolat yang
dapat tumbuh dalam media skim milk agar (SMA) dan memiliki potensi menghasilkan
protease yang ditandai dengan kemampuannya dalam menghasilkan zona bening pada media
SMA. Enam belas isolat (RO1-19) berasal dari oncom merah segar, 11 isolat (ROa-k)
berasal dari oncom merah yang telah mengalami perlakuan pemanasan 80ºC selama 15
menit, 7 isolat (1-7.g) dari tempe gembus segar, dan 6 isolat (a-f.g) dari yang telah
mengalami perlakuan pemanasan 80ºC selama 15 menit. Berdasarkan latar belakang
penelitian ini, dilakukan karena sebelumnya telah dilakukan isolasi bakteri oncom merah
segar tetapi, belum pernah dilaporkan isolasi bakteri proteolitik oncom merah pasca
fermentasi.

2. KAJIAN LITERATUR
2.1 Enzim Protease
Protease merupakan salah satu kelompok enzim yang banyak digunakan dalam
bidang industri. Protease merupakan enzim yang berfungsi menghidrolisis ikatan peptida
pada protein menjadi oligopeptida dan asam amino. Protease (protease serin, protease
sistein/tiol, protease aspartat dan protease logam) adalah enzim yang banyak digunakan
dalam industri, misalnya industri farmasi, kulit, detergen, makanan dan pengolahan limbah.
Protease yang digunakan di dalam industri jumlahnya sekitar 60% dari penjualan enzim di
dunia. Protease dapat diisolasi dari berbagai organisme seperti bakteri 44,78%, tanaman
43,85%, dan hewan 11,15%, Protease dari bakteri merupakan jumlah yang paling banyak
dibandingkan dengan sumber lain, yaitu protease dari tumbuhan dan hewan. (Kurnia, 2010;
Baehaki, 2011).

2.2 Oncom
Oncom merupakan salah satu makanan fermentasi asal Indonesia. Fermentasi
yaitu suatu proses metabolisme yang menghasilkan energi dengan cara menguraikan
protein, karbohidrat dan lemak tanpa kehadiran oksigen bebas. Bahan baku yang
umum digunakan dalam proses pembuatan oncom adalah bungkil kacang tanah atau
ampas tahu. Bungkil kacang tanah adalah ampas yang berasal dari kacang tanah yang
telah diambil minyaknya dengan proses pemerasan mekanis atau proses ekstraksi,
sedangkan ampas tahu merupakan residu pengolahan kedelai menjadi tahu. Ampas
tahu sebenarnya masih mempunyai nilai gizi yang cukup tinggi, tetapi kebanyakan
sifat organoleptiknya kurang disukai. Ampas tahu dengan proses fermentasi (oncom
merah) lebih disukai sebagai makanan dari pada tanpa fermentasi. Proses pembuatan

41
Seminar Nasional Edusainstek ISBN : 978-602-5614-35-4
FMIPA UNIMUS 2018

oncom termasuk jenis fermentasi media padat, yaitu fermentasi yang menyertakan
penggunaan substrat padat sebagai sumber karbon, nitrogen, dan energi (Sarwono,
2010;Afifah, 2014)

2.3 Bakteri proteolitik

Bakteri proteolitik adalah bakteri yang mampu memproduksi enzim protease
ekstraseluler, yaitu enzim pemecah protein yang diproduksi di dalam sel kemudian
dilepaskan keluar dari sel. Bakteri proteolitik adalah bakteri dari genus Bacillus,
Pseudomonas, Proteus, Steptobacillus dan Staphylococcus (Rizaldi dkk, 2016).

2.4 Identifikasi Molekuler Menggunakan PCR 16S rRNA

Identifikasi bakteri yang lebih spesifik dapat dilakukan dengan identifikasi
molekuler menggunakan molekuler 16S rRNA karena molekul ini bersifat Subkuitus dengan
fungsi yang identik pada seluruh organisme. Analisis sequensing 16S rRNA sudah banyak
digunakan dibidang mikrobiologi. Metode berbasis molekular ini dinilai lebih cepat dan
akurat dalam mengidentifikasi bakteri serta memiliki sejumlah keunggulan dibandingkan
metode mikrobiologi konvensional. Gen 16S ribosomal RNA (16S rRNA) memiliki daerah
yang conserved (lestari) sehingga tepat digunakan dalam Polymerase Chain Reaction (PCR)
dan analisis sekuensing untuk menentukan taksonomi, filogeni dan keanekaragaman antar
spesies (Rinanda, 2011).

2.6 Polymerase Chain Reaction(PCR)

PCR atau Polymerase Chain Reaction merupakan teknik amplifikasi DNA secara
invitro. PCR merupakan cara yang sensitif, selektif dan sangat cepat untuk memperbanyak
sekuen DNA yang diinginkan. Adapun prinsip dasar dari PCR yaitu :
1. Denaturasi
Denaturasi tahap awal dilakukan sebelum enzim taq polimerase ditambahkan ke
dalam tabung reaksi. Denaturasi DNA merupakan proses pembukaan DNA untai ganda
menjadi DNA untai tunggal (Murray dkk, 2006).
2. Annealing (Penempelan Primer)
Kriteria yang umum digunakan untuk merancang primer yang baik adalah bahwa
primer sebaiknya berukuran 18 – 25 basa, mengandung 50 – 60 % G+C dan untuk kedua
primer tersebut sebaiknya sama. Sekuens DNA dalam masing-masing primer itu sendiri juga
sebaiknya tidak saling berkomplemen, karena hal ini akan mengakibatkan terbentuknya
struktur sekunder pada primer tersebut dan mengurangi efisiensi PCR. Waktu annealing
yang biasa digunakan dalam PCR adalah 30-45 detik. (Handoyo dan Rudiretna, 2000)
3. Pemanjangan Primer (Extention)
Selama tahap ini Taq polymerase memulai aktivitasnya memperpanjang DNA
primer dari ujung 3’. Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim tersebut pada temperatur
72ºC diperkirakan 35 – 100 nukleotida/detik, bergantung pada buffer, pH, konsentrasi garam
dan molekul DNA target. Dengan demikian untuk produk PCR dengan panjang 2000 pasang
basa, waktu 1 menit sudah lebih dari cukup untuk tahap perpanjangan primer ini. Biasanya di
akhir siklus PCR waktu yang digunakan untuk tahap ini diperpanjang sampai 5 menit
sehingga seluruh produk PCR diharapkan terbentuk DNA untai ganda. Reaksi-reaksi tersebut
di atas diulangi lagi dari 25 – 30 kali (siklus) sehingga pada akhir siklus akan diperoleh
molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru yang merupakan hasil polimerasi dalam
jumlah yang jauh lebih banyak dibandingkan dengan jumlah DNA cetakan yang digunakan.

3. METODE PENELITIAN
Jenis penelitian ini observasi untuk mengetahui adanya bakteri Proteolitik penghasil
enzim protease pada oncom pasca fermentasi 48 jam. Populasi penelitian adalah oncom
yang dijual di pasar tradisional kota Semarang. Sampel penelitian oncom pasca fermentasi

42
Seminar Nasional Edusainstek ISBN : 978-602-5614-35-4
FMIPA UNIMUS 2018

48 jam.Data yang digunakan dalam penelitian ini adalah secara deskriptif. Penelitian telah
dilakukan di Laboratorium Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Diponegoro
Semarang. Waktu penelitian dilaksanakan bulan April-Mei 2018.
Alat dan bahan yang digunakan yaitu: neraca analiti, ose, bunsen, lampu spritus,
cawan petri, mikropipet, yellow tip, white tip, mikrotube, inkubator 37ºC, mikroskop,
autoclave, labu erlenmeyer, tabung reaksi, pipet tetes, vortex (Thermo Mixer TM205), Mesin
PCR, elektroforesis chamber, dan UV transminator. Peralatan lain yang digunakan antara
lain alumunium foil, lemari pendingin, alat tulis, dan kamera digital.
Media Brain Heart Infusion Broth (BHI, Oxoid), media Brain Heart Infusion Agar
(BHIA, Oxoid), Nutrien Agar Plate (NAP, Oxoid,Gentian violet, Gram iodine, alkohol
asam, safranin 1%, Skim Milk Agar (SMA) (Sigma Aldirch, USA), Nacl fisiologis, aquadest
steril, buffer lysis, Chelex 100 Resin (Bio Rad). Go Taq Green Master Mix (Promega),
etanol 75%, ddH2O, Primer 27 F, Primer 1492 R, Phosphate Buffer Saline (PBS), Marker
1500bp dan gel agarosa 1%. Data yang digunakan dalam penelitian ini merupakan data
primer dan data yang diperoleh ditabulasikan kemudian disajikan dalam bentuk narasi
deskriptif.
Teknik analisis yang dilakukan sampel oncom dibeli dipasar, dilakukan lanjutan
pasca fermentasi selama 48 jam. Sampel oncom ditimbang ± 1 gram lalu digerus,
dimasukkan kedalam tabung pengeceran yang berisi 9 ml Nacl fisiologis dengan kode tanpa
pengenceran (TP) lalu di vortex hingga homogen kemudian pipet 1 ml masukan pada tabung
pengenceran selanjutnya 10-1 dan 10-2,10-3,10-4, hingga 10-5). Kemudian dilakukan inokulasi
dengan media Nutrient Agar (NA), inkubasi selama 1x24 jam pada temperatur 37ºC dan
dilakukan purifikasi hingga didapatkan koloni yang murni. Setelah didapatkan koloni yang
murni dilakukan uji penghasil enzim protease menggunakan media susu skim, Isolasi DNA
genom bakteri, Amplifikasi gen 16S rRNA, dan sekuensing Produk PCR berupa DNA gen
16S rRNA kemudian dikirim ke ke 1st BASE sequencing INT di Malaysia untuk dilakukan
sekuensing. Hasil proses sekuensing adalah urutan gen 16S rRNA bakteri yang kemudian
digunakan sebagai input program BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Analisis
BLAST dilakukan untuk mengetahui tingkat homologi sekuen 16S rRNA yang diperoleh
dengan sekuen gen yang sama dari bakteri lain yang sebelumnya telah terdaftar dalam
database bank gen (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Urutan basa nitrogen dari
isolat terpilih dan strain acuan dianalisis menggunakan program Molekuler Evolutionary
Genetics Analysis (MEGA7).

4. HASIL PENELITIAN
4.1 Isolasi dan Purifikasi Bakteri
Isolasi merupakan proses pemindahan organisme dari habitat asli ke dalam habitat
baru untuk dikembangbiakkan. Purifikasi merupakan pemurnian atau memisahkan koloni
bakteri agar hanya didapatkan bakteri yang murni. Dari hasil pemurnian didapatkan 5 koloni
bakteri yang murni dengan kode isolat IROD2.1, IROD2.2, IROD2.3, IROD2.4 dan IROD2.5
dapat dilihat pada Gambar 1.

Gambar 1. Hasil Isolasi Koloni bakteri

(1) IROD2.1 (2) IROD2.2 (3) IROD2.3 (4) IROD2.4 (5) IROD2.5

43
Seminar Nasional Edusainstek ISBN : 978-602-5614-35-4
FMIPA UNIMUS 2018

4.2 Pewarnaan Gram Isolat Bakteri

Hasil pewarnaan Gram dari 5 isolat bakteri, isolat bakteri dengan kode isolat
IROD2.1 dan IROD2.3 termasuk Gram-Positif dan berbeda dengan kode isolat IROD2.2,
IROD2.4, IROD2.5 merupakan Gram-Negatif. Dari kelima koloni diatas dipilih satu bentuk
koloni yang unik dalam hal ini mempunyai ciri irregular, Spreading and Mukoid untuk
dilanjutan ke tahap molekuler dengan kode IROD2.

No Kode Sampel Karakteristik koloni bakteri

1 IROD2.1 Kokus Gram-Positif
2 IROD2.2 Basil Gram-Negatif
3 IROD2.3 Streptobasil Gram-Positif
4 IROD2.4 Basil Gram-Negatif
5 IROD2.5 Diplococcus Gram-Negatif

4.3 Uji Bakteri Penghasil Enzim Protease

Dalam pengujian penghasil enzim protease, hasil yang diperoleh yaitu adanya zona
bening disekitar media dengan diameter 82,00 yang menandakan adanya bakteri protease
yang dapat menghidrolisis protein.

(a) (b)
Gambar 1. Hasil Pengujian Aktivitas Penghasil Enzim Protease
(a) SMA (b) Pembacaan zona bening Protease

Uji kualitas dan Kuantitas DNA Genom bakteri

Hasil pengukuran kualitas dan kuantitas DNA Genom bakteri dapat dilihat pada
Tabel. 2
Tabel 2. Hasil Pengukuran Konsentrasi DNA genom bakteri
No Kode Sampel 260/280 Unit
1 Blanko 1.53 ng/µl
2 Sampel 1.39 ng/µl

Hasil uji kuantitas dan kualitas DNA yang diperoleh pada penelitian ini, didapatkan hasil
pengukuran konsentrasi DNA OD.260/280 : 1.39 ng/µl dan terdapat pita DNA genom.

44
Seminar Nasional Edusainstek ISBN : 978-602-5614-35-4
FMIPA UNIMUS 2018

Amplifikasi Fragmen Gen 16S rRNA metode PCR

1 2

Gambar 12. Elektroforesis PCR

DNA Marker (1), DNA sampel (2)
Berdasarkan hasil eletroforesis PCR didapatkan satu untai ganda DNA yang sejajar
dengan marker ±1500bp sejajar dengan produk amplifikasi gen 16S rRNA isolat bakteri
IROD2 dengan demikian dapat dikatakan gen 16S rRNA bakteri dapat di amplifikasi.

4.4 Sekuensing DNA pengkode Gen 16S rRNA

Amplifikasi isolat bakteri yang berhasil selanjutnya dikirim ke PT. Genetika Science
Indonesia yang kemudian akan dikirim ke 1st BASE sequencing INT di Malaysia untuk
pemetaan pasang basa. Hasil yang diperoleh dari Malaysia selanjutnya dianalisis pada Gen
Bank menggunakan BLAST. Urutan basa nitrogen yang diperoleh mempunyai Kemiripan
98% dengan fragmen gen 16S ribosomal RNA isolat bakteri Bacillus amyloliquefaciens
strain A1142 (Genbank kode akses: KT722836.1).

5.SIMPULAN
Berdasarkan hasil isolasi dan purifikasi diperoleh 5 koloni dengan bentuk yang
berbeda-beda, dari ke 5 koloni dipilih satu koloni bakteri yang unik berbentuk irregular,
spreading and mukoid dengan aktivitas proteolitik yang ditunjukkan adanya zona bening
pada media Milk Skim Agar dengan diameter 82,00 mm. Hasil analisis molekuler berbasis
sekuen gen 16S rRNA, isolat IROD2.3 teridentifikasi sebagai Bacillus amyloliquefaciens
strain A1142 (Genbank kode akses: KY129662.1) sehingga isolat diberi nama Bacillus
amyloliquefaciens IROD2 (IROD2=Indonesian Red Oncom Day-2). Disarankan kepada
peneliti yang lain untuk melakukan penelitian isolasi dan identifikasi bakteri molekuler
penghasil protease mengunakan sampel fermentasi yang berbeda.

6.REFERENSI
Afifah, D.N., 2014. Protease Fibrinolitik Dari Mikroba Pangan Fermentasi
Oncom Merah Dan Tempe Gembus. Disertasi. Bogor: Sekolah Pascasarjana Institut
Pertanian Bogor
Baehaki, A. and Budiman, A., 2011. Isolasi dan karakterisasi protease dari bakteri
tanah rawa Indralaya, Sumatera Selatan. J. Teknol. dan Industri
Pangan, 22(1). Bardacki, F. and D. O. F. Skibinski. 1994.
Application of the RAPD Technique in Tilapia Fish : Spesies and
Subspesies Identification . Heredity 73.
Darmawati, S. 2014. Modul Praktikum Biomolekuler. Program Studi DIV Analis Kesehatan
Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan. Universitas Muhammadiyah Semarang.
Ela Turmala S, D. and Yusman Taufik, D., 2016. Pengaruh konsentrasi
inokulum acetobacter aceti dan lama fermentasi terhadap karakteristik vinegar
murbei (Morus alba)[Effect Of Concentration and Old Acetobacter aceti Inoculum

45
Seminar Nasional Edusainstek ISBN : 978-602-5614-35-4
FMIPA UNIMUS 2018

Fermentation Characteristics Of Mulberry Vinegar (Morus alba)] (Doctoral

dissertation, Fakultas Teknik Unpas).
Ethica, S.N., Nataningtyas, D.R., Lestari, P., Istini, I., Semiarti, E., Widada, J. and Raharjo,
T.J., 2013. Comparative Evaluation of Conventional Versus Rapid Methods for
Amplifiable Genomic DNA Isolation of Cultured Azospirillum sp. JG3. Indonesian
Journal of Chemistry, 13(3), pp.248-253.
Fatchiyah, Estri, L. A, Sri, W., dan Sri, R. 2011. Biologi Molekular Prinsip Dasar
Analisis. Erlangga. Jakarta
Kurnia, D. R. D. (2010). Studi Aktivitas Enzim Lipase dari Aspergillus niger
sebagai biokatalis pada proses gliserolisis untuk menghasilkan
monoasilgliserol (phdthesis). Universitas Diponegoro.
Puspitasari, F.D., Shovitri, M. and Kuswytasari, N.D., 2012. Isolasi dan
karakterisasi bakteri aerob proteolitik dari tangki septik. Jurnal Sains dan
Seni ITS, 1(1), pp.E1-E4.
Rinanda, T. (2011). Analisis Sekuensing 16S rRNA di Bidang Mikrobiologi Jurnal
Kedokteran Syiah Kuala, 11(3), 172–177. article.
Rohmah, N.S., 2017. Isolasi dan Identifikasi Bakteri yang Berpotensi sebagai Agen
Bioremediasi Timbal (Pb) dari Lumpur Lapindo. Skripsi tidak diterbitkan.
Sarwono, B., 2010. Usaha membuat tempe dan oncom. PT Niaga
Swadaya.
Soeka, Y.S., Rahayu, S.H., Setianingrum, N. and Naiola, E., 2011. Kemampuan bacillus
licheniformis dalam memproduksi enzim protease yang bersifat alkalin dan
termofilik. Media Penelitian dan Pengembangan Kesehatan, 21(2 Jun).

46