Laporan Praktikum Mikrofar

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI PEWARNAAN TAHAN ASAM Kamis, 12 Maret 2015 Kelompok I Kamis, Pukul 10.00 – 13.00 WIB Nama NPM Oryza Sativa Sinuhaji 260110130006 LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN 2015 Nilai TTD PEWARNAAN TAHAN ASAM I. TUJUAN Mengamati dua kelompok bakteri, yaitu bakteri tahan asam dan bakteri tak tahan asam, dengan menggunakan prosedur pewarnaan tahan asam pewarnaan (Ziehl-Neelsen). Memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut. II. PRINSIP 2.1 Penetrasi Zat Warna Jika sitoplasma terwarnai, maka sel- sel bakteri akan menahan zat warna tersebut dan tidak terpucatkan sekalipun oleh zat bersifat keras, seperti asam alkohol. Asam alkohol merupakan pcmucat yang sangat intensif. Pada pewarnaan ini, mikroorganisme yang dapat menahan zat warna utama dikatakan tahan asam dan berwarna merah. Sedang pada bakteri biasa senyawa karbol fuksin mudah dipucatkan oleh alkohol asam dan menyerap biru metilen sehingga sel berwarna biru. 2.2 Pewarnaan Tahan Asam Prosedur ini menggunakan pewarna utama karbol fuksin dengan pemanasan dan biru metilen sebagai pewarna tandingan. Pada modifikasi lain teknik ini perlakuan panas diganti dengan penggunaan pembasah (suatu deterjen untuk mengurangi tegangan permukaan lemak) untuk menjamin penetrasi pewarna. 2.3 Pemanasan Dalam pewarnaan ini jangan sampai preparat mengering, jika dilakukan pemanasan. Dinding sel harus utuh untuk mencegah lipid yang telah terwarnai meninggalkan sel untuk melarut ke dalam pemucat. Bila dinding ini pecah maka lipid meninggalkan sel dan sifal tahan asamnya akan hilang. 2.4 Impermeabilitas Bakteri Tahan Asam Konsentrasi lemak yang tinggi menyebabkan bakteri tahan asam mempunyai sifat- sifat khusus, yaitu hidrofobik, tahan asam, impermeabel bila diwarnai. Dinding bakteri yang tahan asam mempunyai lapisan lilin dan lemak yang sukar ditembus zat pewarna. III. TEORI DASAR Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untukmengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifatfisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Anjani, 2014). Bakteri tahan asam (BTA) merupakan bakteri yang memiliki ciri- ciri yaitu berantai karbon (C) yang panjangnya 8 - 95 dan memiliki dinding sel yang tebal yang terdiri dari lapisan lilin dan asam lemak mikolat, lipid yang ada bisa mencapai 60% dari berat dinding sel. Bakteri yang termasuk BTA antara lain Mycobacterium tuberculose, Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae, Nocandia meningitidis, dan Nocandia gonorrhoeae. Mycobacterium tuberculose adalah bakteri patogen yang dapat menyebabkan penyakit tuberculose, dan bersifat tahan asam sehingga digolongkan sebagai bakteri tahan asam (BTA). Penularan Mycobacterium tuberculose terjadi melalui jalan pernafasan (Jawetz, 1986). Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna kepermukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiasakan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatkan. Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang berperan memberikan warna disebut Kromotor bermuatan positif, zat warna asam yang berperan memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena memiliki muatan positif antara lain Eosin, Congo Red dll. Contoh warna asam yaitu Crystal violet, methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite green, dll (Hermawan, 2015). Pewarnaan Ziehl Neelson atau pewarnaan tahan asam memilahkan kelompok Mycobacterium dan Nocandia dengan bakteri lainnya. Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam karena dapat mempertahankan zat warna pertama (carbol fuchsin) sewaktu dicuci dengan larutan pemucat (alkohol asam). Larutan asam terlihat berwarna merah, sebaliknya pada bakteri yang tidak tahan asam karena larutan pemucat (alkohol asam) akan melakukan reaksi dengan carbol fuchsin dengan cepat, sehingga sel bakteri tidak berwarna (Brookks, 2005). Pada pewarnaan bakteri dengan metode Ziehl-Neelsen dapat menggolongkan bakteri menjadi dua, yaitu : 1. Bakteri yang berwarna merah dengan pewarnaan Ziehl- Neelsen disebut bakteri tahan asam (acid fast). 2. Bakteri yang berwarna biru dengan pewarnaan Ziehl- Neelsen disebut bakteri tidak tahan asam (non acid fast). Metode Ziehl-Neelsen digunakan karena cukup sederhana dan mempunyai sensitivitas serta spesifitas yang cukup tinggi. Spesifitas dan sensitivitas yang tinggisebenarnya dimiliki oleh metode fluorokrom. Bakteri yang terwarnai menunjukkan warna yang kontras dengan lingkungannya dan tidak membutuhkan perbesaran sampai 1000x sehingga bisa mempercepat waktu. Akan tetapi, alat yang digunakan tidak ada yaitu mikroskop fluorescens (Lay, 1994). IV. ALAT DAN BAHAN 4.1 Alat 4.1.1 Bak pewarna 4.1.2 Botol semprot 4.1.3 Kaca objek 4.1.4 Kapas 4.1.5 Kertas saring 4.1.6 Korek api 4.1.7 Mikroskop 4.1.8 Ose 4.1.9 Pembakar spirtus 4.1.10 Penangas air 4.1.11 Tabung reaksi 4.2 Bahan 4.2.1 Alkohol 70% 4.2.2 Aquades 4.2.3 Asam alkohol (3% HCl dalam alkohol 95%) 4.2.4 Suspensi bakteri saprofit 4.2.5 Zat warna biru metilen 4.2.6 Zat warna karbol fuchsin 4.3 Gambar alat Bak pewarna Botol Semprot Kaca objek Kapas Kertas saring Pembakar Spirtus Korek Penangas air Mikroskop Ose Tabung Reaksi V. PROSEDUR KERJA Semua alat dan bahan disiapkan, yaitu zat pewarna, pembakar spritus dan korek api, ose, kaca objek, kapas, kertas saring dan suspensi bakteri saprofit. Kaca objek diambil dan dibersihkan menggunakan alkohol 70% sampai berdecit menggunakan kapas. Pembakar spritus kemudian dinyalakan, ose diambil dan di fiksasi diatas pembakar spritus dan didinginkan dekat api. Ose yang sudah dingin digunakan untuk mengambil suspensi bakteri dengan cara membuka sumbat kasa dari tabung reaksi dekat dengan api, kemudian ose dicelupkan dan diambil keluar, lalu mulut tabung reaksi dan sumbatnya difiksasi dan ditutup. Suspensi bakteri diambil dan dibuat olesan pada kaca objek, selanjutnya olesan bakteri tersebut digenangi dengan zat pewarna karbol fuchsin selama 5 menit sambil dipanaskan diatas penangas air. Kemudian pada salah satu bagian kaca objek diberi tanda lingkaran menggunakan spidol. Kaca objek dibilas menggunakan aquades. Selanjutnya dibilas menggunakan alkohol asam sampai latar belakang olesan berwarna merah muda pucat. Selanjutnya, genangi olesan dengan pewarna tandingan biru metilen selama 2 menit, kemudian dibilas dengan aquades dan dikeringkan menggunakan kertas saring. Kemudian ditetesi minyak imersi dan dilihat dibawah mikroskop dengan perbesaran 10 x 10. VI. DATA PENGAMATAN Perlakuan Pengamatan Kaca objek dibersihkan dengan Kaca objek bebas lemak menggunakan alkohol sampai berdecit Ose difiksasi menggunakan Ose steril yang siap pakai pembakar spirtus dan didinginkan dekat api Suspensi bakteri Saprofit dalam Diperoleh suspensi bakteri pada ose tabung reaksi diambil menggunakan ose dekat dengan api Fiksasi mulut tabung reaksi dan Tabung reaksi tetap steril sumbat kapasnya kemudian ditutup Suspensi dioleskan pada kaca objek Suspensi bakteri yang digenangi zat dan digenangi dengan zat pewarna pewarna karbol fuchsin diatas penangas air menempel pada kaca objek Kaca objek diberi lingkaran pada Terdapat daerah pengamatan salah satu sisi lain menggunakan berbentuk lingkaran spidol Kaca objek dibilas dengan aquades Belakang olesan berwarna merah kemudian dibilas dengan alkohol muda pucat asam Genangi olesan dengan zat pewarna Olesan menjadi ungu pucat hasil biru metilen selama 2 menit, dibilas bilasan dengan aquades Kaca objek dikeringkan dan diberi Bakteri terlihat menumpuk minyak imersi, diamati dibawah berwarna ungu mikroskop perbesaran 10 x 10 VII. PEMBAHASAN Praktikum Mikrobiologi Farmasi kali ini berjudul Pewarnaan Tahan Asam dengan tujuan untuk mengamati bakteri tahan asam dan bakteri tak tahan asam, dengan menggunakan prosedur pewarnaan tahan asam (pewarnaan Ziehl-Neelsen) serta memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut. Prinsip yang berpengaruh pada praktikum ini adalah penetrasi zat warna, yaitu jika sitoplasma terwarnai, maka sel- sel bakteri akan menahan zat warna tersebut dan tidak terpucatkan sekalipun oleh zat bersifat keras, seperti asam alkohol, pewarnaan tahan asam dimana prosedur ini menggunakan pewarna utama karbol fuksin dengan pemanasan dan biru metilen sebagai pewarna tandingan, pemanasan dalam pewarnaan ini jangan sampai preparat mengering, jika dilakukan pemanasan, serta impermeabilitas bakteri tahan asam, yang mana dinding bakteri yang tahan asam mempunyai lapisan lilin dan lemak yang sukar ditembus zat pewarna. Dalam praktikum ini zat pewarna yang akan digunakan adalah karbol fuchsin dan biru metilen dan alkohol asam dengan sampel berupa suspensi Mycobacterium tuberculose yang sudahn dilemahkan agar saat digunakan pada praktikum tidak menginfeksi. Selain itu juga digunakan aquades untuk membilas zat pewarna, dan minyak imersi untuk memperbesar penampakan bakteri saat diamati menggunakan mikroskop. Alat- alat yang digunakan antara lain, bak pewarna untuk menampung air bilasan zat pewarna, botol semprot yang akan mengalirkan aquades, kaca objek untuk meletakkan sampel diatas daerah pengamatan, kapas bebas lemak untuk membersihkan kaca objek, kertas saring untuk mengeringkan kaca objek setelah pembilasan, korek api untuk menyalakan pembakar spirtus, mikroskop untuk mengamati sampel pada kaca objek, ose yang difiksasi untuk mengambil sampel, tabung reaksi yang disumbat dengan kapas dan kasa berisi suspensi bakteri, waterbath untuk memanaskan sampel, dan pembakar spirtus sebagai media pensterilisasi alat. Langkah pengerjaannya dimulai dengan menyiapkan semua zat pewarna, sampel suspensi bakteri dan alat- alat yang akan digunakan. Dalam praktikum kali ini, suspensi bakteri telah disiapkan dan sudah siap untuk digunakan langsung. Selanjutnya kaca objek dibersihkan menggunakan kapas yang telah dibasahi dengan alkohol 70% sampai berdecit yang menandakan bahwa pada kaca objek sudah tidak terdapat lemak. Pembakar spirtus dinyalakan menggunakan korek api, ose diambil dan difiksasi diatas pembakar spritus dan didinginkan dekat api tujuannya untuk mensterilkan ose yang akan dipakai agar sampel tidak tercampur dengan pengotor atau zat pencemar lainnya. Ose yang sudah dingin digunakan untuk mengambil suspensi bakteri ke dalam tabung reaksi. Sampel diambil dekat dengan api agar tidak ada sampel yang tercecer kemudian mulut tabung reaksi dan sumbat kapas difiksasi dan ditutup dan dikemballikan ke tempat semula. Sampel suspensi bakteri yang telah diambil menggunakan ose, dioleskan pada bagian lingkaran pengamatan pada kaca objek dan dilewatkan diatas api 3-5 kali agar sampel menempel pada kaca objek dan tidak ikut terbilas saat pewarnaan. Ose yang telah digunakan kemudian difiksasi kembali dan disimpan pada tempat semula agar rapi dan bersih. Mewarnai bakteri yang tahan terhadap asam digunakan cara pewarnaan Ziehl Neelsen. Pewarnaan Ziehl Neelsen terdapat beberapa perlakuan dan zat kimia yang diberikan. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri tetapi tidak mengubah struktur sel bakteri. Kemudian, olesan digenangi dengan zat pewarna karbol fuchsin, tujuan pemberian karbol fuchsin adalah untuk mewarnai seluruh sel bakteri. Kemudian salah satu bagian kaca objek diberi tanda lingkaran menggunakan spidol yang merupakan daerah pengamatan, sehingga akan memudahkan saat menggunakan mikroskop. Kaca objek dibilas dengan aquades kemudian dibilas dengan alkohol asam. Perlakuan pencucian dengan menggunakan aquades mengalir bertujuan untuk menutup kembali lemaknya. Tujuan pemberian alkohol asam adalah meluruhkan warna dari carbol fuchsin, tetapi pada golongan BTA tidak terpengaruh pemberian alkohol asam karena memiliki lapisan lipid yang sangat tebal sehingga alkohol sukar menembus dinding sel bakteri tersebut dan warna merah akibat pemberian carbol fuchsin tidak hilang. Kemudian, genangi olesan dengan zat pewarna biru metilen selama 2 menit, dan dibilas dengan aquades sehingga olesan berwarna biru pucat. Tujuan pemberian biru metilen adalah memberi warna background. Kemudian, dilap dengan menggunakan kertas saring yaitu dengan cara menepuk- nepuk kaca objek, kaca objek dilap bukan dengan digesek agar sampel yang sudah menempel tidak ikut terangkat. Selanjutnya, ditetesi minyak imersi agar diperoleh perbesaran yang lebih baik saat melakukan pengamatan menggunakan mikroskop cahaya. Hasil yang diperoleh dari pengamatan menggunakan mikroskop dengan perbesaran 10 x 10 adalah terlihat bakteri yang tertumpuk berwarna ungu tua akibat tertumpuk dengan zat pewarnanya. Saat melakukan pengamatan menggunakan mikroskop, jumlah bakteri yang terlihat hanya sedikit, kemungkinan terjadi beberapa kesalahan antara lain saat pengambilan sampel ose yang digunakan masih cukup panas sehingga bakteri mati; zat pewarna yang terlalu cepat atau terlalu banyak dibilas dengan aquades sehingga zat warna belum sempat masuk kedalam sel bakteri; pengeringan bilasan zat warna terlalu ditekan; dan saat melewatkan kaca objek diatas api terlalu lama menyebabkan bakteri mati. VIII. KESIMPULAN DAN SARAN 8.1 Kesimpulan Dari percobaan yang telah dilakukan diperoleh kesimpulan, yaitu metode pewarnaan tahan asam (pewarnaan Ziehl- Neelsen) terhadap suspensi bakteri Saprofit dengan pewarna karbol fuchsin dan biru metilen dengan perbesaran mikroskop 10 x 10 terlihat sel bakteri berwarna ungu karena tertumpuk dengan zat pewarna yang digunakan. Seharusnya diperoleh pengamatan berupa bakteri yang tahan asam berwarna merah dan bakteri yang tidak tahan asam berwarna biru. 8.2 Saran Untuk praktikum selanjutnya disarankan agar selama pengerjaan lebih tenang dan tertib agar tidak mengganggu praktikan lain yang sedang bekerja. Penggunaan ose setelah difiksasi harus didinginkan tersebih dahulu sebelum mengambil sampel. Penggunaan suspensi bakteri dalam tabung reaksi kiranya bergantian dan tidak egois. Dan setelah menggunakan alat dan bahan dikembalikan ketempat semula agar tidak berantakan dan meja kerja tetap bersih. IX. DAFTAR PUSTAKA Anjani, Ni Kadek D. 2014. Pewarnaan BTA available online at http://www.academia.edu/7704555/PEWARNAAN_BTA (diakses pada 17 Maret 2015). Brookks, Geo.F, dkk. 2005. Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta: Salemba Medika. Hermawan, M. 2014. Pewarnaan Gram available online at http://www.academia.edu/6554037/5_Pewarnaan_Gram (diakses pada 13 Maret 2015). Jawetz, E, Melnick dan E.A Adelberg. 1986. Mikrobiologi untuk Profesi Kesehatan. Jakarta: EGC. Lay, B. W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PT. Raga Grafindo Persada.