Cell Sensitivity Assays: The MTT Assay

Evaluación in vitro del efecto del material particulado y un potencial tratamiento en dos líneas celulares. Maritza Londoño Berrío Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias Medellín, Antioquia, Colombia 2021 II Evaluación in vitro del efecto del material particulado y un potencial tratamiento en dos líneas celulares. Evaluación in vitro del efecto del material particulado y un potencial tratamiento en dos líneas celulares. Maritza Londoño Berrío Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título de: Magister en Ciencia-Biotecnología Director (a): Ph.D., Msc Isabel Cristina Ortiz Trujillo Codirector (a): Msc Juan Bautista López Línea de Investigación: Mutagénesis y Epigenética Ambiental Grupo de Investigación: Biología de sistemas Universidad Pontificia Bolivariana Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias Medellín, Colombia 2021 A mi abuelo “La tarde en que supe de tu muerte…. …Vestí de luto azul y quedé solo en vísperas del día más extenso.” Declaración de obra original Yo declaro lo siguiente: He leído el Acuerdo 035 de 2003 del Consejo Académico de la Universidad Nacional. «Reglamento sobre propiedad intelectual» y la Normatividad Nacional relacionada al respeto de los derechos de autor. Esta disertación representa mi trabajo original, excepto donde he reconocido las ideas, las palabras, o materiales de otros autores. Cuando se han presentado ideas o palabras de otros autores en esta disertación, he realizado su respectivo reconocimiento aplicando correctamente los esquemas de citas y referencias bibliográficas en el estilo requerido. He obtenido el permiso del autor o editor para incluir cualquier material con derechos de autor (por ejemplo, tablas, figuras, instrumentos de encuesta o grandes porciones de texto). Por último, he sometido esta disertación a la herramienta de integridad académica, definida por la universidad. Nombre: Maritza Londoño Berrío Fecha: 26 de noviembre, 2021 Agradecimientos Mis más sinceros agradecimientos a mi directora de tesis, la docente Isabel Cristina Ortíz Trujillo, por todo el acompañamiento y cercanía. A mis compañeros del grupo de investigación Biología de Sistemas, en especial a Verónica Estrada y Leidy Echavarría. A mi familia, en especial a mi madre y abuelos quienes siempre confiaron en mí y se sienten orgullosos de cada paso. A mi compañero, Cristian Hidalgo y a mi hija Maria Antonia por ser un apoyo e inspiración para crecer. Contenido IX Resumen Evaluación in vitro del efecto del material particulado y un potencial tratamiento en dos líneas celulares La interacción de los sistemas biológicos con agentes externos puede representar una desregulación de la homeóstasis celular al generar procesos tóxicos, por esto se hace necesario evaluar la exposición a las diferentes propuestas de ingeniería en todos los campos del desarrollo. Teniendo en cuenta esto, el objetivo del estudio fue evaluar la citotoxicidad y genotoxicidad del material orgánico extraíble (MOE) proveniente de diésel y diésel con mezclas de alcoholes y nanopartículas (NPs) del copolímero de ácido láctico y glicólico (PLGA) y la expresión diferencial de proteínas tras la exposición al MOE. Esto se logró llevando a cabo el ensayo de MTT para determinar la citotoxicidad de estos compuestos, para la evaluación de genotoxicidad se realizó el ensayo de electroforesis alcalino de células individuales (ensayo Cometa) y para la evaluación de la mutagenicidad de Nps se realizó el test de AMES. Posteriormente, para evaluar la expresión diferencial de proteínas, se realizó la extracción de proteínas totales y mediante geles de una dimensión (1D) se evaluó integridad y estabilidad, para la generación de los perfiles proteicos se realizó una electroforesis de dos dimensiones (2D) y las proteínas que se encontraron diferencialmente expresadas frente al control negativo se caracterizaron mediante espectrometría de masas (MALDI-TOF/TOF). Los resultados indicaron efectos genotóxicos, pero no citotóxicos tras la exposición a MP y Nps y no se evidenció mutagenicidad mediada por Nps. En cuanto a la expresión diferencial de proteínas tras la exposición al MOE, se evidenció sobreexpresión de proteínas relacionadas con el estrés oxidativo. En conjunto estos resultados resaltan la necesidad de probar nuevas tecnologías y compuestos a los cuales pueden expuestos los sistemas biológicos. Palabras claves: toxicoproteómica, nanopartículas, diésel con mezcla de alcoholes. X Evaluación in vitro del efecto del material particulado y un potencial tratamiento en dos líneas celulares. Abstract In vitro evaluation of the effect of particulate matter and a potential treatment in two cell lines The interaction of biological systems with external agents may represent a dysregulation of cell homeostasis by generating toxic processes, for this reason it is necessary to evaluate the exposure to different engineering proposals in all fields of development. Taking this into account, the objective of the study was to evaluate the cytotoxicity and genotoxicity of the extractable organic material (MOE) from diesel and diesel with mixtures of alcohols and nanoparticles (NPs) of the lactic and glycolic acid copolymer (PLGA) and the differential expression protein after exposure to MOE. This was achieved by carrying out the MTT test to determine the cytotoxicity of these compounds, for the evaluation of genotoxicity the alkaline electrophoresis test of individual cells was carried out (Comet test) and for the evaluation of the mutagenicity of Nps the test was performed by AMES. Subsequently, to evaluate the differential expression of proteins, the extraction of total proteins was carried out and integrity and stability were evaluated using one-dimensional gels (1D), for the generation of protein profiles a two-dimensional (2D) electrophoresis was performed and the proteins that were found to be differentially expressed versus the negative control were characterized by mass spectrometry (MALDI-TOF / TOF). The results indicated genotoxic, but not cytotoxic, effects after exposure to MP and Nps and there was no evidence of Npsmediated mutagenicity. Regarding the differential expression of proteins after exposure to MOE, overexpression of proteins related to oxidative stress was evidenced. Together these results highlight the need to test new technologies and compounds to which biological systems can be exposed.. Key words: toxicoproteomics, nanoparticles, diesel with a mixture of alcohols. Contenido XI Contenido Pág. Lista de figuras ............................................................................................................ XIII Lista de tablas ............................................................................................................. XIV Introducción .................................................................................................................... 1 1. Evaluación de la genotoxicidad del material orgánico extraíble del material particulado en la línea celular HepG2 ............................................................................ 5 1.1 Introducción........................................................................................................ 6 1.2 Materiales y métodos ......................................................................................... 7 1.2.1 Cultivos celulares............................................................................................. 7 1.2.2 Tratamientos.................................................................................................... 8 1.2.3 Evaluación de la proliferación celular ............................................................... 8 1.2.4 Ensayo de genotoxicidad. Electroforesis alcalina de células individuales (ensayo Cometa) ........................................................................................................ 9 1.2.5 Análisis estadístico ........................................................................................ 10 1.3 Resultados ....................................................................................................... 10 1.3.1 Evaluación de citotoxicidad ............................................................................ 10 1.3.2 Evaluación de genotoxicidad ......................................................................... 11 1.4 Discusión ......................................................................................................... 14 1.5 Conclusiones.................................................................................................... 16 2. Toxicoproteómica del material particulado .......................................................... 17 2.1 Introducción...................................................................................................... 19 2.2 Materiales y métodos ....................................................................................... 20 2.2.1 Cultivos celulares........................................................................................... 20 2.2.2 Extracción y cuantificación de proteínas ........................................................ 21 2.2.3 Cuantificación Proteica y evaluación de la Integridad .................................... 21 2.2.4 Obtención de perfiles proteicos...................................................................... 22 2.2.5 Análisis de imágenes ..................................................................................... 22 2.2.6 Identificación de spots ................................................................................... 23 2.2.7 Análisis bioinformático ................................................................................... 24 2.3 Resultados ....................................................................................................... 24 2.3.1 Obtención de perfiles proteicos...................................................................... 24 2.3.2 Identificación de proteínas diferencialmente expresadas ............................... 28 2.3.3 Análisis bioinformático ................................................................................... 30 2.4 DISCUSIÓN ..................................................................................................... 34 XII 2.1 Evaluación in vitro del efecto del material particulado y un potencial tratamiento en dos líneas celulares. Conclusión ........................................................................................................ 37 3. Biocompatibilidad de nanopartículas poliméricas en dos líneas celulares....... 39 Resumen ..................................................................................................................... 39 Abstract ....................................................................................................................... 39 3.1 Introducción ...................................................................................................... 40 3.2 Materiales y métodos ........................................................................................ 41 3.2.1 Cultivos celulares .......................................................................................... 41 3.2.2 Tratamientos ................................................................................................. 42 3.2.3 Ensayo de proliferación celular: MTT ............................................................ 42 3.2.4 Ensayo de viabilidad celular (integridad de la membrana) mediante exclusión del colorante azul de tripano .................................................................................... 43 3.2.5 Electroforesis alcalina de células individuales (ensayo Cometa) ................... 44 3.2.6 Test de mutagenicidad en Salmonella (Test de AMES). ................................ 45 3.2.7 Análisis estadístico ........................................................................................ 46 3.3 Resultados ........................................................................................................ 47 3.3.1 Ensayo de MTT ............................................................................................. 47 3.3.2 Prueba de viabilidad azul de tripano .............................................................. 48 3.3.3 Ensayo de genotoxicidad .............................................................................. 48 3.3.4 Ensayo de mutagenicidad en Salmonella typhimurium: Test de AMES ......... 50 3.4 Discusión .......................................................................................................... 51 3.5 Conclusión ........................................................................................................ 54 4. Conclusiones y recomendaciones ....................................................................... 57 4.1 Conclusiones .................................................................................................... 57 4.2 Recomendaciones ............................................................................................ 58 Bibliografía .................................................................................................................... 60 Contenido XIII Lista de figuras Pág. Figura 1-1: Longitud de cometa en células expuestas al material orgánico extraíble del material particulado. ....................................................................................................... 12 Figura 1-2: Porcentaje de células HepG2 dañadas durante una exposición al material orgánico extraíble del material particulado. .................................................................... 13 Figura 1-3: Frecuencia de inducción en células HepG2 tras exposición a MOE. ........... 13 Figura 2-1: Flujo de trabajo ...................................................................................... 18 Figura 2-2: Cuantificación de proteínas y evaluación de integridad .......................... 25 Figura 2-3: Perfiles proteicos de células HepG2 expuestas MOE. ........................... 25 Figura 2-4: Evaluación de la expresión diferencial de spots identificados a través de PDQuest. 28 Figura 2-5: Mapa de calor de la expresión diferencial de proteínas identificadas a través de huella peptídica por MALDI TOF. .............................................................................. 29 Figura 2-6: Red de interacción de proteína-proteína (PPI) ............................................ 31 Figura 2-7: Redes y componentes principales de interacción proteína-proteína ............ 33 Figura 3-1Revertantes generadas tras la exposición a NPs de PLGA. .......................... 50 Contenido XIV Lista de tablas Pág. Tabla 2-1: Proteínas identificadas en la línea celular HepG2 mediante “huella peptídica” en respuesta al tratamiento con el material orgánico extraíble del material particulado. 29 Tabla 3-1: Niveles de daño del ADN de células expuestas a nanopartículas. ............. 45 Tabla 3-2: Concentraciones letales y subletales de los diferentes polímeros nanoestructurados. ......................................................................................................... 47 Tabla 3-3: Medida de la longitud del cometa de células expuestas a los diferentes tratamientos y comparación con el control negativo. ....................................................... 48 Tabla 3-4: Población celular dentro de las categorías de daños definidas luego de la exposición a nanopartículas y nanopartículas más paclitaxel.......................................... 49 Introducción El material particulado (MP) proveniente del combustible diésel es una mezcla compleja que se genera tras la combustión incompleta del combustible, esta definición incluye tanto su fracción sólida como líquida y está comprendida por ácidos, productos químicos orgánicos, metales pesados, partículas de polvo y suelo e incluso microorganismos, su toxicidad está dada por su composición fisicoquímica y varía según la fuente, la ubicación, la época del año y el clima (1). Dentro de los componentes orgánicos del MP se incluyen hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP), HAP alquilados, compuestos heterociclos, nalcanos, alcanos ramificados, cicloalcanos saturados, alquilbencenos, ácidos Nalcanoicos, ácidos aromáticos con potencial genotóxico y mutagénico (2). Esto ha creado alertas en reglamentación y políticas ambientales que implementan la búsqueda de combustibles que tengan menos efectos adversos sobre los sistemas biológicos; es así como han surgido combustibles alternativos que han mostrado una reducción significativa en la cantidad de MP, pero de los cuales su poder citotóxico y genotóxico es poco conocido y se hace realmente necesaria su evaluación. Las pruebas in vitro han reflejado que el MP proveniente de fuentes diésel y su material orgánico extraíble tiene efectos a nivel celular que contribuyen a la desregulación de la homeostasis, induciendo un aumento de la muerte celular y en los niveles de rupturas de las cadenas de ADN, estrés oxidativo y formación de aductos de ADN-PAH, junto con una frecuencia de mutación aumentada y reordenamientos genético (3). Las ciencias Ómicas (genómica, transcriptómica, proteómica, metabolómica) es una nueva tendencia en el campo de la toxicología y se ha servido de la evaluación de cambios después de la exposición a diferentes agentes de los nivel de expresión en los genes y proteínas, especialmente aquellos implicados en procesos como inflamación y muerte celular programada (4,5). La toxicoproteómica tiene como objetivo identificar proteínas y vías críticas en los sistemas biológicos que se ven afectadas y responden a exposiciones químicas y ambientales adversas utilizando tecnologías globales de expresión de proteínas (6). Haciendo uso de 2 Introducción principios moleculares y de regulación celular, la toxicoproteómica puede identificar proteínas diferencialmente expresadas después de la exposición a agentes, así como la identificación de isoformas de las proteínas y modificaciones postraduccionales. El conocimiento de estos perfiles diferenciales podría postular biomarcadores de exposición, como indicativos que pueden evaluar objetivamente los procesos fisiológicos tras la exposición al MP antes de que aparezca como desenlace efectos sobre la salud. Dentro de los efectos conocidos del MP y MOE sobre la salud humana se destacan los problemas cardiovasculares, respiratorios, inmunológicos, la asociación con diabetes tipo II y problemas durante la gestación (7), además, para la emisión del combustible diésel ya hay pruebas suficientes que asocien este con cáncer (8). Teniendo como finalidad la búsqueda de estrategias que puedan llevar a la disminución de los efectos del MP o permitan afrontar los problemas a los que ha conducido la exposición al MP o MOE han surgido nuevas tecnologías, entre estas el uso de nanotecnología como una nueva herramienta para el direccionamiento de fármacos o compuestos que contrarresten dichos efectos. En la última década, las nanopartículas (NPs) se han convertido en alternativas atractivas para su explotación en múltiples sectores, donde se destaca su uso en las aplicaciones biomédicas, ya que estos pueden imitar o alterar procesos biológicos; por lo que su uso en la medicina podría dar solución a viejos problemas asociados con la solubilidad, biodisponibilidad, inmunocompatibilidad y citotoxicidad de muchos de los medicamentos de uso tradicional (9). Esta es una estrategia que ha permitido explorar muchas alternativas para mejorar los sistemas comúnmente usados, y han contribuido por ejemplo a nuevos implementos biomédicos multifuncionales por su potencial para ser utilizadas con éxito en la encapsulación de péptidos, medicamentos, ácidos nucleicos, proteínas, entre otros (10). Aunque por definición los biomateriales y nanopartículas se diseñan para que sean biocompatibles y puedan mejorar la calidad de vida de los individuos, la complejidad de los sistemas biológicos hace que esta propiedad sea difícil de cumplir (11). Por esta razón, se diseñan ensayos de biocompatibilidad con estos materiales, donde se incluyen pruebas en modelos celulares y animales para descartar efectos citotóxicos, genotóxicos y mutagénicos. Esto se ejecuta mediante el seguimiento de guías, reglamentos o estándares nacionales o internacionales. En Colombia, por ejemplo, la reglamentación que está orientada a atender las tareas de normalización del uso de nanotecnología, está dada por Introducción 3 el Comité Técnico de Normalización 243-Nanotecnología del ICONTEC, (12) o estándares internacionales como las Normas ISO, OECD (Organización para la cooperación Económica y Desarrollo, entre otras. Teniendo en cuenta la problemática generada por el MP sobre los sistemas biológicos y la necesidad de encontrar estrategias para la prevención y/o tratamiento después de haberse dado la afectación, se plantó como objetivos de esta tesis, evaluar los efectos genotóxicos del material orgánico extraíble del material particulado proveniente de dos combustibles alternativos (diésel con mezcla de etanol y butanol al 10%) y la expresión diferencial de proteínas en células expuestas a dicho extracto, así mismo, evaluar biocompatibilidad de nanopartículas poliméricas como un posible transportador de medicamentos o terapias hacia el pulmón. Esto se logró a través de pruebas de citotoxicidad (ensayo colorimétrico de MTT) para la evaluar la estabilidad de la mitocondria, para probar genotoxicidad después de la exposición de las células a NPs y MP se realizó el ensayo cometa, y para la evaluación de la mutagenicidad el test de AMES. Los análisis de la expresión diferencial de proteínas se realizaron a través de electroforesis de dos dimensiones seguida de un análisis de imágenes para detección de proteínas diferencialmente expresadas, las cuales fueron identificadas a través de espectrometría de masas y con quienes se reconstruyó una red principal de proteínas para determinar posibles procesos que se están viendo alterados a nivel celular. Evaluación de la genotoxicidad del material orgánico extraíble del material particulado en la línea celular HepG2 Resumen El material particulado (MP) proveniente de combustibles diésel es una mezcla compleja que puede variar dependiendo de las características del motor, su tipo, el tipo de combustible y la fuente de producción , se ha demostrado que este tiene efectos negativos sobre la salud ambiental y por esto se ha generado la necesidad de probar combustibles alternativos que puedan tener menor efecto sobre los sistemas biológicos, teniendo en cuenta esto, se evaluó la citotoxicidad y genotoxicidad de la fracción orgánica del material particulado proveniente de motores alimentados con combustibles alternativos que correspondían a diésel mezclados con alcoholes (etanol y butanol al 10%) a través de pruebas in vitro usando la línea celular HepG2, la citotoxicidad fue evaluada a través del ensayo colorimétrico de MTT y la genotoxicidad fue evaluada a través del ensayo cometa. Se encontró una baja citotoxicidad de los extractos, pero una alta genotoxicidad, mostrando en todas las concentraciones probadas diferencias estadísticamente significativas entre el control negativo y los diferentes tratamientos, con esto se concluye que la fracción orgánica del MP tiene un efecto genotóxico que puede conllevar a desequilibrios de la homeostasis celular. Palabras clave: Ensayo cometa, citotoxicidad, diésel con mezcla de alcoholes, modo de operación. 6 Título de la tesis o trabajo de investigación Abstract The particulate matter (PM) of diesel fuels is a complex mixture that can vary depending on the characteristics of the engine, its type, the type of fuel and the source of production, it has been shown to have negative effects on environmental health and For this reason, the need has been generated to test alternative fuels that may have less effect on biological systems, taking this into account, the cytotoxicity and genotoxicity of the organic fraction of the particulate material of engines fed with alternative fuels corresponding to diesel was evaluated. . Mixed with alcohols (10% ethanol and butanol) by in vitro tests using the HepG2 cell line, cytotoxicity was evaluated by the MTT colorimetric test and genotoxicity by the comet test. A low cytotoxicity of the extracts was found, but a high genotoxicity, showing statistically significant differences between the negative control and the different treatments in all the concentrations tested, with this it is concluded that the organic fraction of the PM has a genotoxic effect that can lead to imbalances of cellular homeostasis. Keywords: Comet assay, cytotoxicity, mixed alcohol diesel, mode of operation. 1.1 Introducción El material particulado (MP) proveniente del diésel es una mezcla compleja que se genera tras la combustión incompleta del combustible, esta definición incluye tanto su fracción sólida como líquida y está comprendida por ácidos, productos químicos orgánicos, metales pesados, partículas de polvo y suelo e incluso bacterias (13), su material orgánico extraíble (MOE) consiste en una gran cantidad de compuestos orgánicos entre estos, N-alcanos, alcanos ramificados, cicloalcanos saturados, hidrocarburos aromáticos polisaturados ( HAP), HAP alquilados, alquilbencenos, ácidos n-alcanoicos y ácidos aromáticos (2). Sin embargo, la toxicidad del MP está dada por su composición fisicoquímica y varía según la fuente, su composición, la ubicación, la época del año, el clima, entre otros (1). Las pruebas in vitro han reflejado que el MP proveniente de fuentes diésel y su material orgánico extraíble tiene efectos a nivel celular que contribuyen a la desregulación de la homeostasis, induciendo un aumento de la muerte celular y en los niveles de rupturas de las cadenas de ADN, estrés oxidativo, junto con una frecuencia de mutación aumentada y reordenamientos genéticos (3). Particularmente, el material orgánico extraíble proveniente de partículas urbanas (PM) aunque ha mostrado baja citotoxicidad en términos de disminución de la estabilidad mitocondrial, ha presentado genotoxicidad en términos de Capítulo 1 7 generación de quiebres en la cadena del ADN, aberraciones cromosómicas y generación de micronúcleos (14,15), además la exposición al MP completo ha formación de aductos con el ADN (16). Estas afectaciones a nivel celular causada por el material particulado o su fracción orgánica pueden conllevar a afectos adversos, por ejemplo, cuando se incrementan los niveles de EROs (Especies reactivas de oxígeno), estructuras como las proteínas, los lípidos y los ácidos nucleicos comienzan a tener cambios estructurales y funcionales (17) Con la necesidad de hacer frente a esta situación se ha buscado la disminución de emisiones y se promueve la búsqueda de combustibles que contribuyan a ello. Una propuesta, es disminuir el grado de pureza del diésel con diferentes concentraciones de alcoholes, ya que estos provienen de la biomasa renovable (Etanol – Butanol) (18), sin embargo, hay pocos datos sobre los efectos de estas partículas para la salud humana y ambiental, debido a que hay una gran variedad de combustibles alternativos que provienen de diferentes biomasas y por lo tanto, el tipo de partículas emitidas tiene diferente potencial tóxico. Teniendo en cuenta el potencial del material orgánico extraíble para generar alteraciones a nivel celular, esta investigación propone evaluar in vitro el efecto citotóxico y genotóxico del material particulado proveniente de diésel con mezclas de alcoholes (etanol y butano al 10%) a través de las pruebas colorimétrica de MTT que permite evaluar la estabilidad mitocondrial y la electroforesis de células individuales (ensayo cometa) para determinar si estos extractos generan daños sobre el ADN. 1.2 Materiales y métodos 1.2.1 Cultivos celulares El papel del hígado en el metabolismo de los productos químicos lo convierte en un tejido apropiado para las pruebas de toxicidad, es por esto que fue elegida para esta investigación la línea celular HepG2 (ATCC® HB-8065™) la cual es una línea derivada de un carcinoma hepatocelular de hígado de un varón caucásico de 15 años (19) y que conversa actividad de la familia de citocromos P450 lo que proporciona una herramienta para la investigación del metabolismo y la activación metabólica de sustancias químicas mediada por CYP (20). Esta línea celular fue mantenida en medio de cultivo Roswell Park 8 Título de la tesis o trabajo de investigación Memorial Institute (RPMI), suplementado con suero bovino fetal (SBF) al 10% en una atmósfera húmeda que contenía 5% de CO2 y a una temperatura de 37ºC. 1.2.2 Tratamientos Con los inventarios de emisiones se ha determinado que los vehículos pesados PREEURO generan cerca del 25% de las emisiones de material particulado, y contribuyen a un número significativo de vehículos que circulan actualmente (21). Teniendo en cuenta esto, se usó un motor diésel pre-euro alimentado con combustibles en dos modos de operación: carga baja 43Nm (M4) y carga alta de 95Nm (M2), para: diésel M2 (DM2), diésel M4 (DM4), diésel + etanol 10% M2 (E10M2), diésel + etanol 10% M4 (E10M4), diésel + butanol 10% M2 (B10M2) y diésel + butanol 10%. M4 (B10M4) (22). El MOE fue obtenido siguiendo los lineamientos de Sato et al., (23), en resumen, el MP es mezclado con diclorometano (DCM) en una relación de 1:2, partiendo de 50 mg de MP de cada combustible continuando con ultrasonicación por una hora. Posteriormente, las muestras se filtraron con membranas de nylon con poros de 0,22 μm; para finalmente rotaevaporar el solvente hasta un volumen aproximado de 1 ml y se llevó a sequedad con flujo de N2 gaseoso. Para los ensayos biológicos, cada extracto se diluyó en 2 ml de PBS. 1.2.3 Evaluación de la proliferación celular A través del ensayo colorimétrico MTT (bromuro de 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5 difenil tetrazolio) se realizó la evaluación de la viabilidad de la línea celular HepG2 expuesta a diferentes concentraciones de material particulado. Este ensayo consiste en la evaluación de la conversión de MTT en cristales de formazán por la enzima mitocondrial Succinato deshidrogenasa, esta conversión es un indicativo del funcionamiento de la mitocondria el cual se asocia con la viabilidad celular (28). Siguiendo el protocolo de Muelas et al, (29), en un plato de 96 pozos se sembraron 4.000 células por pozo y cuando se alcanzó una confluencia del 80% fueron tratadas por 24h con 10μl de cada una de las 20 diluciones del tratamiento partiendo de una concentración de 250 μgEq de MP. Al finalizar este tiempo se añadió 10μl de solución de MTT (5 mg/ml) y se incubó el plato durante 6 horas a 37°C con agitación constante y aislado de la luz. Posteriormente, se añadió a cada pozo 100μl de isopropanol ácido frío para disolver los cristales de formazán que se formaron en aquellas células que tenían actividad mitocondrial, y se llevó a agitación constante por 24h. Capítulo 1 9 Finalmente, se realizó la lectura de la densidad óptica con un espectrofotómetro Multiskango a una longitud de onda de 570 nm. Con el fin de verificar la reproducibilidad de los resultados, cada ensayo se realizó en tres momentos independientes por triplicado, como control positivo se utilizó Dimetil sulfóxido (DMSO) al 100%, como control negativo se usó medio de cultivo RPMI. Usando el software estadístico SPSS (SPSS 23.0 para Windows, SPSS Inc., 2010), se realizó el análisis Probit que permitió calcular la probabilidad de muerte a mayores concentraciones que las expuestas, así como determinar la concentración letal 50 (LC50), que se define como la concentración a la cual muere el 50% de la población expuesta al tratamiento y la concentración letal 10 (LC10) donde muere el 10% de la población. 1.2.4 Ensayo de genotoxicidad. Electroforesis alcalina de células individuales (ensayo Cometa) El ensayo cometa alcalino, es una técnica que me permite evaluar el daño producido por un agente sobre el ADN generados por rupturas de una sola hebra de ADN (SSB), sitios lábiles al álcali, reticulación ADN-ADN y ruptura de dos hebras el ADN (SSB) asociada con sitios de reparación de escisión incompleta (24). En resumen, se sembraron 30.000 células por pozo en un plato de 12 pozos, una vez se encontraban a una confluencia del 80% fueron tratadas por 24h con las concentraciones subletales para los diferentes tratamientos. Siguiendo el protocolo de Singh (25) y Olive (26), después de 24h de tratamiento, los cultivos se lavaron dos veces con solución salina al 0,9%, las células se despegaron y se centrifugaron a 1.200 revoluciones por minuto (rpm) durante 7 min, posteriormente, se evaluó viabilidad celular mediante tinción con azul de tripano para asegurar que esta fuese superior al 85%. Las células individuales se embebieron en agarosa gelificante a bajo punto de fusión y se llevaron a un tampón de lisis (NaOH 0,26 M, cloruro de sodio 1,2 M, N-lauroilsarcosina al 0,1% y EDTA 100 Mm) por 24h. Transcurrido este periodo, se procedió a la desnaturalización al sumergir el gelbon en una solución alcalina (NaOH 0,10 M, EDTA 2mM con pH superior a 13) y se sometieron posteriormente a electroforesis (25mV, 300mA) en gel alcalino usando la misma solución. Posteriormente, se hizo la tinción con 10 Título de la tesis o trabajo de investigación 2,5 μg/mL de Bromuro de Etidio (BrEt). El parámetro de medición de daño que se usó en este trabajo fue la longitud de cometa medido con una reglilla microscópica (μm) en 100 células al azar. Se incluyeron muestras de células no tratadas y controles positivo correspondiente al tratamiento con peróxido de hidrógeno (H2O2, 50µM) y control negativo medio de cultivo DMEM. Una vez obtenidos los datos de longitud de cometa, se realizó la clasificación del daño considerándose daño genético a partir de la media del control negativo más dos desviaciones estándar. Se calculó la frecuencia de inducción para cada concentración con el promedio de la longitud del cometa y se relacionó con el promedio del cometa del control negativo, a partir de la ecuación 1.2. FI = 𝑀𝑒𝑑𝑖𝑎𝑛𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑡𝑟𝑎𝑡𝑎𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑀𝑒𝑑𝑖𝑎𝑛𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜 (1.2) 1.2.5 Análisis estadístico El análisis de datos se realizó con el software estadístico IBM SPSS Statistics versión 24.0 IBM Corp. Cada experimento para cada ensayo se realizó en 3 momentos independientes, cada uno por triplicado. Los resultados obtenidos para el ensayo MTT se analizaron a través de una regresión Probit, con el fin de calcular la concentraciones letales y subletales. Para el ensayo cometa se evaluó la normalidad a través del test de Kolmogórov-Smirnov. Posteriormente, se realizaron análisis bivariados a través del test de Kruskal Wallis con corrección de Bonferroni, con el fin de saber si las concentraciones usadas difieren del control negativo. 1.3 Resultados 1.3.1 Evaluación de citotoxicidad La exposición al MOE proveniente de diésel mezclado con alcoholes por 24 horas mostró que estos extractos no generaban un efecto citotóxico (en relación con la viabilidad) sobre la línea celular HepG2, por tanto, se tomaron las concentraciones más altas para la evaluación de la genotoxicidad a través de la electroforesis alcalina de células individuales (ensayo cometa). Capítulo 1 11 1.3.2 Evaluación de genotoxicidad Para la identificación de rupturas de cadena dobles o sencillas en el ADN, se realizó el ensayo cometa alcalino tras exponer a las células durante 24h al MOE de los combustibles mezclados con alcoholes en las concentraciones 250, 125 y 63 µgEq de MP. Se observó que todas las células tratadas con el MOE generan un incremento de la longitud del cometa y muestran diferencias estadísticamente significativas respecto al control negativo con un p < 0.05 (Figura 0-1) cabe destacar que el control positivo (células tratadas con 50µM de H2O2 durante 1 hora) mostró un aumento de las quiebres de la cadena de ADN en todos los experimentos con mediana 43 (39-50)µm. El MOE de E10M4 fue quien presentó una longitud del cometa mayor respecto a los otros tratamientos, mientras que el Diésel de referencia M2 (DM2) presentó menor longitud del cometa respecto a los otros tratamientos, pero aun así mostraba diferencias estadísticamente significativas respecto al control negativo. Se puede observar que hay una relación directa entre el incremento de la concentración y el porcentaje de células con daño indicando un efecto de dosis-respuesta, así la concentración de 63µgEq de MOE de cada uno de los extractos indujo un porcentaje de células con daño superior al 40% respecto al control negativo quien presentaba un porcentaje de células con daño inferior al 20%, también se observó que el porcentaje de células con daño llegó a un porcentaje superior al 80% en las concentraciones 125 y 250 µgEq de MP con cada uno de los extractos Figura 0-2. 12 Título de la tesis o trabajo de investigación Figura 0-1: Longitud de cometa en células expuestas al material orgánico extraíble del material particulado. Longitud de cometa en células expuestas al material orgánico extraíble del material particulado, las barras indican la mediana más rango intercuartílico de la longitud del cometa de células expuestas por 24 horas al MOE de diésel y diésel con mezcla de alcoholes, como control negativo se usó PBS y como control positivo H2O2 a 50µM generando cometas superiores a 43(39-50)µm. Fuente propia. Cuando se observa la Frecuencia de Inducción (FI) (Figura 0-3), se evidencia con mayor claridad como a medida que aumenta la concentración, se incrementa la magnitud del daño sobre el ADN, lo que se destaca aún más en las mezclas de diésel con alcoholes. La comparación entre los modos de operación no muestra diferencias significativas entre estos y muestra una tendencia más potenciada en el caso de diésel con mezcla de etanol al 10% (E10) en ambos modos de operación comparado con el diésel con mezcla de butanol (B10). Capítulo 1 13 Figura 0-2: Porcentaje de células HepG2 dañadas durante una exposición al material orgánico extraíble del material particulado. Porcentaje de células HepG2 dañadas durante una exposición al material orgánico extraíble del material particulado de diésel convencional y diésel con mezcla de etanol (E10) y butanol (B10) al 10%. Las barras negras indican el control negativo (PBS). Las demás barras representan las tres concentraciones más altas de cada extracto utilizadas para los tratamientos. El control positivo mostró un porcentaje de células del 94% con daño. Fuente propia. Figura 0-3: Frecuencia de inducción en células HepG2 tras exposición a MOE. Frecuencia de inducción tras la exposición al MOE provenientes de diésel y diésel con mezcla de butanol (B10) y etanol (E10) al 10%. Las barras negras indican el control negativo (PBS) en los modos de operación M2 y M4. Las demás barras representan las tres concentraciones más altas de cada extracto utilizada para los tratamientos. 14 Título de la tesis o trabajo de investigación Fuente: propia Estos resultados muestran que hay un efecto genotóxico inducido por el MOE de los combustibles con mezclas de alcohol y diésel de referencia al evidenciar cambios significativos respecto al control negativo, pero no respecto al modo de operación de los motores y que dichos cambios incrementan de forma directa con el aumento de la concentración de estos tratamientos. 1.4 Discusión El MP puede generar efectos adversos sobre la salud y está asociado con procesos de inestabilidad genómica y carcinogénesis (27), con base en esta información, se ha generado la necesidad de encontrar alternativas al diésel, entrando al mercado nuevas propuestas de combustibles entre las que se encuentran los mezclados con biomasa, de quienes se ha comprobado tienen menor emisión de material particulado (28), sin embargo, algunos estudios han sugerido que los efectos toxicológicos pueden ser mayores (29,30), esto lleva a que nuevas propuestas de combustibles deban ser evaluadas para conocer si realmente están representando un beneficio para la salud ambiental y humana. Teniendo en cuenta esto, se planteó como objetivo de esta investigación evaluar el efecto citotóxico y genotóxico del material orgánico extraíble del material particulado proveniente de diésel mezclado con alcoholes (etanol y butanol al 10%) y se encontró que estos extractos no son citotóxicos en las concentraciones probadas, pero muestran alta genotoxicidad. La línea celular HepG2 mostró una baja citotoxicidad y alta genotoxicidad después de la exposición al MOE, se pudo observar que esta genotoxicidad incrementaba conforme a aumentaba la concentración de MOE a la que eran expuestas las células. El daño en el ADN era mayor en células expuestas a los combustibles mezclados con alcoholes en comparación con el control negativo. Resultados similares se mostraron tras exponer linfocitos de sangre periférica a estos mismos extractos donde se evidenció daños en el ADN y una mayor frecuencia de inducción en los combustibles mezclados con alcohol y etanol (22). Capítulo 1 15 Estas afectaciones a nivel celular causada por el material particulado o su fracción orgánica pueden conllevar a afectos adversos, por ejemplo, cuando se incrementan los niveles de EROs (Especies reactivas de oxígeno), estructuras como las proteínas, los lípidos y los ácidos nucleicos comienzan a tener cambios estructurales y funcionales (17) y si no hay un control, el estrés oxidativo puede ser responsable de la inducción de varias enfermedades, tanto crónicas como degenerativas. Además, generación de quiebres en la cadena del ADN, aberraciones cromosómicas y generación de micronúcleos son biomarcadores de genotoxicidad que están relacionados con un aumento en el riesgo de padecer cáncer, dado que estas alteraciones citogenéticas hacen parte del fenotipo tumoral (31). Se ha evidenciado que la producción de hidrocarburos aromáticos polisaturados (HAP), el elemento más encontrado en el MOE de combustibles alternativos, depende del tipo de motor, la composición del combustible, las condiciones de funcionamiento del motor y la eficacia del tratamiento posterior de los gases de escape(32), sin embargo, tanto las células expuestas al MOE proveniente de combustibles diésel y diésel alternativos en los modos de operación M2 (cuando el carro está haciendo más esfuerzo) y M4 (cuando el carro tiene poca fuerza y se usa a más velocidad) mostraron un incremento en la genotoxicidad comparados con el control negativo, pero no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre ellos. Es de destacar que la mutagenicidad y genotoxicidad de la fracción orgánica del MP es fuertemente afectada por la formulación del combustible y por las condiciones de operación del motor y se esperaría que a baja carga del motor (M4), la combustión sea más incompleta y en consecuencia se aumenta la emisión de compuestos orgánicos (33). Estudios previos han planteado que el mecanismo de toxicidad y daños generados por el MP están dados por la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) la cual se puede dar por varias vías entre las que se incluye el metabolismo de la HAP mediado por el citocromo P450 (CYP), la iniciación y la estimulación de la respuesta inflamatoria (2), estas ROS pueden contribuir además a generar daños en el ADN, cuyo incremento y la incapacidad de las células para repararlo pueden conducir a inestabilidad genómica que es capaz de actuar como la fuerza motriz para procesos carcinogénicos (34). Debido a las características variables de los diferentes combustibles alternativos al ser dependientes de diversos factores, se hace necesario evaluar y caracterizar las emisiones 16 Título de la tesis o trabajo de investigación de estos y de esta forma poder dilucidar posibles mecanismos de toxicidad. Además, es importante implementar más pruebas biológicas con el fin de evaluar posibles puntos de afección de estos extractos y tener fundamentos para determinar si una alternativa de combustibles contribuye a la salud ambiental. Con el fin de complementar este estudio se propone usar otros biomarcadores que puedan identificar otros puntos finales, con el fin de dilucidar los mecanismos de toxicidad del material particulado completo o el MOE proveniente de combustibles con mezclas de biomasa. Recientemente surgió la toxicogenómica como una disciplina que tiene como objetivo comprender la relación entre el estrés ambiental y la susceptibilidad a las enfermedades humanas, identificar los marcadores biológicos útiles de la enfermedad y la exposición a sustancias tóxicas y dilucidar los mecanismos moleculares de toxicidad (35) al identificar genes (transcriptómica) o proteínas que tuvieron cambios tras la exposición a xenobióticos. Un estudio toxicogenómico proporciona información para descubrir biomarcadores potenciales para la toxicidad de las partículas en suspensión en el aire. La tecnología proteómica también puede aplicarse para evaluar los riesgos potenciales para la salud de varios tóxicos ambientales (4). 1.5 Conclusiones Se ha demostrado que estas propuestas de combustibles mezclados con alcoholes (etanol y butanol al 10%) presentan disminución en la emisión de material particulado, sin embargo, la exposición in vitro de las células HepG2 mostró que el material orgánico extraíble de estas alternativas de diésel conlleva a una mayor genotoxicidad, pero no se afectó la viabilidad celular. Este conocimiento puede contribuir al uso del ensayo cometa como bioindicador de exposición a estos extractos. Se hace entonces necesario evaluar otros biomarcadores que puedan dilucidar el proceso toxicológico para tener un entendimiento de lo que está sucediendo a nivel celular. Toxicoproteómica del material particulado Resumen Con el fin de determinar la expresión diferencial de proteínas in vitro en la línea celular HepG2 tras la exposición al material orgánico extraíble del material particulado proveniente de diésel mezclado con alcoholes (etanol y butanol al 10%), Se realizó la extracción de proteínas totales a partir de cultivos celulares tratados, posteriormente se realizó la evaluación de la integridad a través de electroforesis de una dimensión (1D) para luego obtener los perfiles proteicos mediante una electroforesis de dos dimensiones (2D), el análisis de imágenes en PDQuest reflejó proteínas diferencialmente expresadas las cuales fueron caracterizadas a través de espectrometría de masas (MALDI-TOF/TOF), se identificó la red de interacción proteína-proteína con la base de datos STRING, seguido de un análisis de detección de complejos moleculares con el cual fue posible dilucidar en qué procesos celulares se encontraban implicadas. Los resultados mostraron que las proteínas Cox5A, TPI1, PRDX2, ERP29 y PDIA3 se encontraban sobre expresadas y participaban en procesos relacionados con el estrés oxidativo y la desintoxicación de estos. En conclusión, la exposición a estos tratamientos modula el proteoma de la línea celular HepG2, dando indicios de procesos de detoxificación a nivel celular. Palabras clave: Red de interacción de proteínas, material orgánico extraíble del material particulado, diésel con mezcla de alcoholes. Abstract In order to determine the differential expression of proteins in vitro in the HepG2 cell line after exposure to the organic extract of the particulate material from diesel mixed with alcohols (ethanol and 10% butanol), the extraction of total proteins was carried out from of 18 Título de la tesis o trabajo de investigación treated cell cultures, the integrity evaluation was subsequently carried out through onedimensional electrophoresis (1D) to then obtain the protein profiles by two-dimensional electrophoresis (2D), the image analysis in PDQuest reflected differentially expressed proteins the which were characterized through mass spectrometry (MALDI-TOF / TOF), the protein-protein interaction network was identified with the STRING database, followed by a molecular complex detection analysis with which it was possible to elucidate in what cellular processes were involved. The results showed that the proteins Cox5A, TPI1, PRDX2, ERP29 and PDIA3 were over-expressed and participated in processes related to oxidative stress and their detoxification. In conclusion, exposure to these treatments modulates the proteome of the HepG2 cell line, giving indications of detoxification processes at the cellular level. Keywords: Protein interaction network, organic extract of particulate matter, diesel with mixed alcohols Figura 0-1: Flujo de trabajo Línea celular HepG2 expuesta al material orgánico extraíble del material particulado proveniente de diésel (C+), diésel mezclados con alcoholes (butanol y etanol al 10%) y PBS (C-), posteriormente se realizó la extracción de proteínas totales seguido de la evaluación de la integridad a través de electroforesis de una dimensión (1D) y perfiles proteicos mediante una electroforesis de dos dimensiones (2D), el análisis de imágenes en PDQuest reflejó las proteínas diferencialmente expresadas las cuales fueron caracterizadas a través de espectrometría de masas (MALDI-TOF/TOF) finalmente se realizó el análisis bioinformático. Fuente: propia Capítulo 2 19 1.6 Introducción A nivel celular, el material particulado completo (PM2.5 y PM1.0) puede inducir toxicidad al generar quiebres en el ADN (36–38) y aductos ADN-PHA (39), incremento en la frecuencia de mutación y reordenamientos genéticos (40), además, contribuye a la modificación de la expresión de perfiles de transcriptoma y proteoma de células de mamíferos, al incrementar la expresión de genes y proteínas importantes para procesos inflamatorios (4,5). Este material particulado es una mezcla compleja y dentro de sus componentes se destaca la fracción orgánica la cual está compuesta por una series de Nalcanos, alcanos ramificados, cicloalcanos saturados, hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP), HAP alquilados, alquilbencenos, ácidos n-alcanoicos y ácidos aromáticos (2), y de esta fracción se ha demostrado genera daño genotóxico en células de mamíferos (14,16). Estudios previos han planteado que todos estos mecanismos de toxicidad y daños generados por el MP completo están dados por la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) la cual se puede dar por varias vías entre las que se encuentra el metabolismo de la HAP mediado por el citocromo P450 (CYP) y la iniciación y la estimulación de la respuesta inflamatoria (2), pero el mecanismo de toxicidad no está del todo claro y menos aún para su fracción orgánica de quien existen pocos estudios sobre los procesos celulares que pueden alterar. Nuevas tecnologías de toxico genómica como la transcriptómica y la proteómica presentan nuevas oportunidades para mejorar la comprensión de las relaciones de xenobióticos con los sistemas biológicos, permitiendo la evaluación de la cuantificación de productos moleculares, como la expresión diferencial de proteínas, para conocer los mecanismos subyacentes de toxicidad (6). La diferencia en la expresión de proteínas después de la exposición a partículas de escape diésel ha mostrado aumentos en la enzima glucolítica piruvato quinasa y las enzimas proinflamatorias que desempeña un papel en el desarrollo tumoral (4) y cambios en los niveles de las proteínas asociadas con los procesos biológicos de empalme de ARN, así como citoquinas proinflamatoria (41). 20 Título de la tesis o trabajo de investigación Con el fin de determinar si el material orgánico extraíble del material particulado proveniente diésel con mezcla de alcoholes (butanol y etanol al 10%) modula el proteoma a nivel in vitro de las células hepáticas HepG2, se tuvo como objetivo evaluar la expresión diferencial de proteínas en células expuestas al material orgánico extraíble, con el fin de dilucidar un posible mecanismo de toxicidad de este extracto, así mismo, el conocimiento de estos perfiles diferenciales podría postular biomarcadores de exposición, como indicativos que pueden evaluar objetivamente los procesos fisiológicos tras la exposición al MP antes de que aparezca como desenlace efectos sobre la salud. 1.7 Materiales y métodos 1.7.1 Cultivos celulares La línea celular HepG2 (ATCC® HB-8065™) es una línea derivada de un carcinoma hepatocelular de hígado de un varón caucásico de 15 años (19). Esta línea celular fue mantenida en medio de cultivo Roswell Park Memorial Institute (RPMI), suplementado con suero bovino fetal (SBF) al 10% en una atmósfera húmeda que contenía 5% de CO 2 y a una temperatura de 37ºC. Con los inventarios de emisiones se ha determinado que los vehículos pesados PREEURO generan cerca del 25% de las emisiones de material particulado, y contribuyen a un número significativo de vehículos que circulan actualmente (21). Teniendo en cuenta esto, se usó un motor diésel pre-euro alimentado con combustibles en el modo de operación: carga baja 43Nm (M4) para: diésel M4 (DM4), diésel + etanol 10% M4 (E10M4), y diésel + butanol 10%. M4 (B10M4) (22). El MOE fue obtenido siguiendo los lineamientos de Sato et al., (23), en resumen, el MP es mezclado con diclorometano (DCM) en una relación de 1:2, partiendo de 50 mg de MP de cada combustible continuando con ultrasonicación por una hora. Posteriormente, las muestras se filtraron con membranas de nylon con poros de 0,22 μm; para finalmente rotaevaporar el solvente hasta un volumen aproximado de 1 ml y se llevó a sequedad con flujo de N2 gaseoso. Para los ensayos biológicos, cada extracto se diluyó en 2 ml de PBS. Capítulo 2 21 Un millón de células fueron cultivadas en frascos de cultivo T25 y tratadas cuando alcanzaron una confluencia del 80% con 100µl del extracto orgánico extraíble del diésel de referencia como control positivo (C+), diésel más etanol al 10% (DE), diésel más butanol al 10% (DB) y como control negativo se usó PBS (C-). Los tratamientos se realizaron por 24 horas. 1.7.2 Extracción y cuantificación de proteínas Aproximadamente 2x106 células HepG2 fueron utilizadas para la extracción de proteínas, estas fueron despegadas por tripsinización, lavadas con PBS, y centrifugadas durante 5 minutos a 12.000 rpm. Cada botón de células fue resuspendido en 1.5 ml de buffer de lisis (Urea 7 M, CHAPS 4% y Coctel inhibidor de proteasas 1X), homogeneizado y sometidos a cinco ciclos de congelamiento en nitrógeno líquido (1 minuto) y sonicación (5 minutos) seguidamente se centrifugaron a 13.200 rpm por 1 hora a 4°C. Se recuperó el sobrenadante y se procedió a la precipitación de proteínas al mezclarlo con acetona fría en una relación 1:4 (muestra:acetona) dejándose a -20°C durante la noche. Posteriormente, las proteínas fueron centrifugadas a 13.200 rpm por 1 hora a 4°C y se realizaron dos lavados adicionales en las mismas condiciones de centrifugación (cada uno de 30 minutos). Finalmente, las muestras fueron resuspendidas en buffer de lisis y almacenadas a -70° C hasta su uso. 1.7.3 Cuantificación Proteica y evaluación de la Integridad Las proteínas fueron cuantificadas a través del método del ácido bicinconínico (Pierce™ BCA Protein Assay Kit- Thermo) usando una curva de calibración con albúmina bovina sérica (BSA) según las instrucciones del proveedor. Adicionalmente, se corroboró la eficiencia de estos procedimientos y la integridad de las proteínas por medio de electroforesis de una dimensión (1D) en geles de poliacrilamida al 12% (SDS-PAGE) cargando 10 µg de proteína diluidos en buffer de carga (2-β mercaptoetanol 1M, SDS 2%, Glicerol 10%, Tris pH 6.8, bromofenol blue 0.1%), el revelado de las proteínas fue realizado con tinción de Coomassie (R-250). 22 Título de la tesis o trabajo de investigación 1.7.4 Obtención de perfiles proteicos Para cada tratamiento, se tomó 50µg de proteínas que fueron previamente hidratadas al disolverlas en buffer de hidratación (Urea/Tiourea 7M/2M, CHAPS 4%, DTT 100 mM y 1% de anfolitos pH 3-10 y 4-7) hasta alcanzar un volumen de 200µl. Cada 2 horas y a 4°C las muestras fueron sometidas a cinco ciclos de agitación en vórtex, seguido de sonicación por 5 minutos. Las proteínas hidratadas fueron llevadas a las tirillas de IPG (isoelectric point gel; rango pH 3-10 y 4-7, 7 cm, Invitrogen®) y se incubaron toda la noche a temperatura ambiente. Los corridos de primera y segunda dimensión se realizaron en el sistema ZOOM IPG Runner (Invitrogen®), inicialmente se realizó un pre-corrido de 1 hora a 100 V para permitir la eliminación de sales y otros interferentes presentes en la muestra. Posteriormente, se realizó el corrido de primera dimensión por punto isoeléctrico (PI) bajo las siguientes condiciones: temperatura ambiente y un aumento progresivo del voltaje 200V-450V-600V750V-950V durante 5 minutos, seguido de 1200V-1400V-1600V por 10 minutos cada uno y para finalizar 2000V durante 45 minutos para alcanzar un tiempo final de 1 hora y 40 minutos. Después de finalizar la primera dimensión, se retiró la tirilla de IPG del soporte y se equilibró con el tampón de corrido (buffer LDS-Invitrogen®) más DTT 1X por 15 minutos en agitación y 15 minutos adicionales en agitación con buffer LDS-Invitrogen® más Iodoacetamida 125mM. Para la segunda dimensión (separación por peso molecular, MW), la tirilla se ubicó en el gel preformado (4-12% poliacrilamida Bis-Tris, NuPAGE-gel, Invitrogen®- 80mm x 8mm x1.0mm, Invitrogen) y se corrió a 200 voltios (XCell SureLokcTM, Invitrogen®) durante 45 minutos, con buffer NuPAGE® MES SDS Running Buffer 1X (Invitrogen®). Para el revelado de spots (puntos) en geles 2D se utilizó la técnica de tinción con Sypro Ruby. 1.7.5 Análisis de imágenes Las imágenes de los geles fueron obtenidas con el Biolite- Biospectrum UVP y los análisis comparativos de la expresión de proteínas para cada tratamiento fueron realizados utilizando el software PDQuest versión 8.1.1 (Bio-Rad Laboratories, EE.UU.), para este análisis y para cada muestra, se usaron tres geles correspondientes a cada repetición. Capítulo 2 23 El nivel de sensibilidad, es decir, la elección de los parámetros para la identificación adecuada de spots, se ajustó para asegurar la detección de los puntos más débiles presentes en las imágenes del gel, así, los parámetros y sus respectivos valores en PDQuest fueron: sensibilidad (20,3), valor de pico mínimo (386), escala de tamaño (3), para garantizar una mejor resolución, se seleccionó el modelado gaussiano para la detección de spots. Adicionalmente, como control interno del proceso de comparación en cada condición experimental, se marcó una proteína de referencia (landmark) que estuviera presente en todos los geles a ser analizados, en buena resolución. El siguiente paso fue la detección de apareamiento (match), que consiste en una sobreposición virtual de los geles y de los spots que poseen una misma ubicación, de acuerdo con la cartografía que representa el punto isoeléctrico (pI) como valor en la coordenada “X” y el peso molecular como coordenada “Y”, tanto la detección de puntos como la coincidencia se comprobó uno por uno y se corrigieron si era necesario. El software computa medidas de superposición entre los intervalos de los spots, siendo los intervalos definidos por el rango [Valor central – dispersión, Valor central + dispersión]. Estas medidas cuantifican el nivel de superposición entre los intervalos de cada proteína entre las condiciones experimentales y evalúa como varía la expresión de proteínas entre ellas. En orden de distinguir fácilmente las proteínas diferencialmente expresadas se empleó el valor de veces de cambio (fold change) que se consideró significativo cuando era superior a 2 (sobreexpresión) o menor a 0,5 (subexpresión). 1.7.6 Identificación de spots Seis proteínas de interés entre las que se incluía el lanmark fueron picadas para cada uno de los tratamientos evaluados y enviadas a la universidad de Campinas donde, a través de cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) lograron la identificación de estas. En resumen, las muestras fueron sometidas a tripsina, los péptidos obtenidos fueron analizados por nano LC-MS/MS. Las muestras fueron inyectadas en una columna C18 (Symmetry C18 NanoEase Trap Column 5 μm, Waters) y los espectros MS/MS fueron analizados mediante Mascot (Matrix Science, versión 2.3.02). La identificación por espectrometría de masas arrojó una posible lista de proteínas, cada una de ellas con un código de acceso para la base de datos UniProt de la cual fue posible 24 Título de la tesis o trabajo de investigación obtener información de las mismas. Para cada una de estas proteínas tentativas, se consultó su masa molecular teórica (MW) y punto isoeléctrico (pI) utilizando la herramienta Compute pI/Mw de Expasy. Para la dictaminación de la identificación de proteínas, se seleccionó aquellas que tuvieran un pI y un MW similar a los valores experimentales que se obtuvieron en nuestros experimentos y que adicionalmente tuvieran un score de confianza altamente significativo (por encima de 2). 1.7.7 Análisis bioinformático Se recuperó la información de la interacción proteína-proteína (PPI) a través de la base de datos STRING (Search Tool for theRetrieval of Interacting Genes/Proteins), los parámetros de confianza para STRING que se tuvieron en cuenta fueron: experimento, co-expresión, neighborhood y fusión de genes, con una confianza de 0,07. Y la red construida se visualizó a través de Cytoscape. El análisis de la red se realizó con el complemento Molecular Complex Detection (MCODE) del cual se obtuvieron los cinco principales módulos o interacciones más fuertes entre proteínas para quienes finalmente, a través de Metascape y Reactome se identificaron las funciones celulares y funciones moleculares en las que estaban implicadas estas proteínas, usando un p <0,05 como criterio de corte. 1.8 Resultados 1.8.1 Obtención de perfiles proteicos En momentos independientes, se realizaron tres experimentos que consistieron en la siembra y tratamientos con los extractos orgánicos provenientes de biodiesel de referencia (C+), Diesel + Butanol al 10% (DB10%) y Diesel + Etanol al 10% (DE10%) y PBS (C-) durante 24 horas, seguido de la lisis y extracción de proteínas totales y posteriormente la evaluación de la concentración de proteínas y rendimiento del proceso, como se muestra en la Figura 0-2. La cuantificación y la evaluación de su rendimiento mostró que la obtención de proteínas de las células HepG2 fue exitosa y que las mismas se encontraban íntegras, además, los perfiles de proteína en gel no tuvieron diferencia entre banda del control negativo y las células expuestas a los diferentes tratamientos, se observa que entre los 150 y 37 kDa se reconocen aproximadamente ocho delgadas bandas de proteínas, dos bandas bastante Capítulo 2 25 acentuadas entre 37 y 25 kDa, y finalmente una banda cerca de 20 kDa. Además, se evaluó la concentración y el rendimiento de las proteínas obtenidas (Fig. 1B) donde se obtuvo una concentración superior a 2,0 µg / µl y un rendimiento por encima de 350,5 µg para todas las repeticiones y tratamientos evaluados. Figura 0-2: Cuantificación de proteínas y evaluación de integridad utilizando 1D SDS PAGE. La figura de la izquierda muestra una imagen escaneada de un gel 1D, el carril número 1 corresponde al control negativo (PBS), carril 2: control positivo (diésel de referencia) carril 3: DB10, carril 4: DE10, El marcador de peso molecular se observa a la izquierda. La figura de la derecha muestra las concentraciones de proteína obtenidas a través de las 3 repeticiones para cada uno de los tratamientos, así como el rendimiento de la extracción. Fuente: propia Una vez comprobada la integridad de las proteínas se procedió a montar los geles bidimensionales, Los resultados de la electroforesis 2D para todos los tratamientos y en todas las repeticiones mostraron una buena resolución en términos de número de spots y distancia entre ellos (Figura 0-3: Perfiles proteicos de células HepG2 expuestas MOE. Esto nos indica que no hay interferentes ni degradación proteica y que las proteínas está bien resueltas, esto resultó clave en el análisis comparativo de perfiles proteicos en la búsqueda de proteínas con expresión diferencial a través del software PDQuest de BioRad. Figura 0-3: Perfiles proteicos de células HepG2 expuestas MOE. 26 Título de la tesis o trabajo de investigación Perfiles proteicos obtenidos mediante electroforesis bidimensional. (A) Células HepG2 expuestas a PBS (control negativo) (B) Células HepG2 expuestas a diésel de referencia (control positivo) (C) células expuestas a diésel + Butanol al 10%, (D) células expuestas a diésel + etanol al 10%. Estos corridos se realizaron en tirillas IPG con rango de pH 4-7, para la segunda dimensión se usó un gel 4-12% Bis-tris. El marcador de peso molecular se observa a la izquierda y el gradiente de pH se encuentra en la parte superior, el lanmark o guía del gel se encuentra indicado como Δ. Lanmark PI: 6,5 y MW: 2600kD. Fuente: propia. Los análisis de imágenes en el software PDQuest, revelan un promedio de 115, 134, 137 y 139 spots en el perfil proteico de C-, C+, DB10% y DE10% respectivamente. Al realizar los análisis comparativos entre las diferentes condiciones experimentales se evidencia que 113 spots se encuentran presentes en todas las condiciones y 3 spots presentan expresión exclusiva en los tratamientos (C-, C+ y DE10%). En la Figura 0-4 se realiza la comparación entre los tratamientos evaluados y el número de spots sobreexpresados y subexpresados comparados con el control negativo y el control positivo. De estos spots que mostraron diferencias se encontró que 16 de ellos presentaban cambios de dos veces en la expresión Capítulo 2 27 (subexpresión o sobrexpresados) comparados con el control negativo de los cuales fueron seleccionados para la identificación a través de espectrometría de masas (ubicados en la figura 1-4 C), dichos criterios para la selección de los spots que se identificarían consistieron en que los spots quedaran completamente separados, tuvieran un tamaño considerable para garantizar la cantidad de proteína necesaria y preferiblemente que se encontrara en el centro del gel y de esta forma se garantizaría una alta posibilidad de identificarlos. Además se seleccionó un spot identificado como landmark el cual corresponde al control interno. 28 Figura 0-4: PDQuest. Título de la tesis o trabajo de investigación Evaluación de la expresión diferencial de spots identificados a través de Spots identificados tras la exposición de las células HepG2 al material orgánico extraíble del material particulado proveniente de diésel y diésel con mezclas de alcholes, así como el control negativo. (A) Mapa de la cuantificación absoluta basada en intensidad relativa de spots identificados a través de PDQuest, (B) conteo de la expresión diferencial de spots comparados con el control negativo (PBS). (C) identificación de los spots de interés seleccionados para identificación a través de espectrometría de masas, Δ lanmark Ο proteínas de interés, las proteínas fueron identificas como: (número y código en PDQuest así, 1: 3004; 2:6708; 3: 7201; 4:8202; 5:6101. Fuente: propias 1.8.2 Identificación de proteínas diferencialmente expresadas La identificación de las proteínas de interés se llevó a cabo mediante análisis de huella peptídica por MALDI TOF, estos spots de interés se analizaron para cada uno de los tratamientos (C-, C+, DB y DE), así, se identificaron seis proteínas tal como se muestra en Capítulo 2 29 la Tabla 0-1: Proteínas identificadas en la línea celular HepG2 mediante “huella peptídica” en respuesta al tratamiento con el material orgánico extraíble del material particulado.. Donde se muestra un alto score de confianza para la identificación de estas y su respectivo peso molecular, punto isoeléctrico y número de acceso para Uniprot. Como control interno se tuvo en cuenta un lanmark, proteína que estuviese expresada de forma similar en todos los geles, en buena resolución y ubicada preferiblemente en la zona central del gel el cual correspondió a la proteína identificada como Proteína 2 similar a BolA A3. Tabla 0-1: Proteínas identificadas en la línea celular HepG2 mediante “huella peptídica” en respuesta al tratamiento con el material orgánico extraíble del material particulado. Código Número de acceso Conteo MW PI de péptidos Péptidos únicos Score de confianza (6) 3004 P20674 11000 5,02 10 10 103,3648 (4) 8202 P60174 27300 6,87 19 19 233,8027 (5) 6101 P32119 20080 5,9 18 17 154,7698 (3) 7201 P30040 27120 6,38 17 17 177,5524 (2) 6708 P30101 27300 6,87 19 19 180,5701 (1) 8101 Q9H3K6 12600 6,50 3 3 19,5815 Descripción Citocromo c oxidasa subunidad 5A_ mitocondrial Triosafosfato isomerasa Peroxiredoxin-2 Proteína 29 residente del retículo endoplásmico Proteína disulfuroisomerasa A3 Proteína 2 similar a BolA A3 Una vez identificadas estas proteínas se evaluó en detalle la expresión de estas y se determinó los cambios de estas respecto al control negativo, lo que da indicios de que la exposición a este material particulado proveniente de combustibles alternativos tiene una modulación sobre el proteoma como se observa en la Figura 0-5. Figura 0-5: Mapa de calor de la expresión diferencial de proteínas identificadas a través de huella peptídica por MALDI TOF. 30 Título de la tesis o trabajo de investigación Mapa de calor de la expresión diferencial de proteínas identificadas a través de huella peptídica por MALDI TOF. Se observan los cambios de abundancia de las proteínas de interés con respecto al control negativo. El color neutral (verde) indica menor expresión y los colores negro y rojo indican incremento de abundancia. Fuente: propia 1.8.3 Análisis bioinformático Con el fin de identificar el posible mecanismo de modulación del proteoma generado por el material orgánico extraíble del material particulado proveniente del diésel de referencia y del diésel alternativo utilizado en este trabajo, se evaluó la interacción entre las 5 proteínas diferencialmente expresadas e identificadas a través de huella peptídica por MALDI TOF. A través del análisis STRING de la red de asociación de proteínas, no se identificó una relación entre estas, sin embargo, se realizó el enriquecimiento de nodos al encontrar aquellas proteínas que estuviesen relacionadas con las proteínas de interés a través de experimentos, evidencia de co-expresión, neighborhood y fusión de genes, con una confianza de 0,07. De esta forma, se generó una red de interacción de proteínas (PPI) (Figura 0-6) la cual se encontró conformada por 205 nodos y 3268 interacciones (interacción proteína-proteína) y valor p de enriquecimiento de PPI de 0,07. Se identifica Capítulo 2 31 que no hay relación directa entre las proteínas de interés, sin embargo, esto no descarta que participen en procesos celulares similares. Figura 0-6: Red de interacción de proteína-proteína (PPI) Red de interacción de proteína-proteína (PPI) enriquecidas a través de STRING y modificada con Cytoscape. Los nodos de entrada corresponden a las proteínas diferencialmente expresadas y se presentan como círculos de color naranjado, los nodos enriquecidos se presentan como círculos de color amarillo. Fuente: propia El algoritmo detección de complejos moleculares (MCODE por sus siglas en inglés: Molecular Complex Detection) identificó seis redes importantes 32 Título de la tesis o trabajo de investigación Figura 0-7, la primera red MCODE consta de 55 proteínas y tiene un score de 52,29, en esta red se encuentran proteínas como COA6, NDUFA6, COX4I2, NDUFS2, UQCR11, UQCRQ, NDUFA8, NDUFA13, ATP5F1, NDUFA5, COX6C, COX5A, UQCRC1, COX6A2, COX7C, UQCRC1, COX6C, COX4I1, entre otros. Es probable que esta red esté asociada con metabolismo, transporte de electrones respiratorios, el ciclo del ácido cítrico (TCA), el transporte respiratorio de electrones y respuesta celular al estrés químico. La segunda red MCODE consta de 19 proteínas y tiene un score de 16,33 en esta red se encuentran proteínas como TPI1, ENO3, TPI1, ALDOB, PGK1, PARK7, TALDO1, PRDX6, ALDOA, DERA y TKT. Es probable que esta red esté asociada al metabolismo de carbohidratos, gluconeogénesis, glucolisis y metabolismo. La tercera red MCODE consta de 16 proteínas y presenta un score de 6,26 en ella se encuentran proteínas como PRDX2, PDIA3, SOD1, PRDX6, SOD1, SOD1, TXN, SOD2. Esta red se encuentra asociada con respuestas celulares a estímulos, respuestas celulares al estrés, presentación de antígenos, respuesta celular al estrés químico y desintoxicación de especies reactivas de oxígeno, la cuarta, quinta y sexta red están conformadas por tres proteínas cada una y tienen un score igual a 1. Para cada lista de genes presentes en la PPI se llevó a cabo un análisis de enriquecimiento de procesos y rutas con las siguientes fuentes de ontología: KEGG Pathway, GO Biological Processes, Reactome, fue posible identificar los veinte procesos que mejor representación tenían de la PPI y estos correspondieron a la desintoxicación de especies reactivas de oxígeno, vías implicadas en el metabolismo de carbohidratos, transporte de electrones y metabolismo celular (p<0,05). Para capturar aún más las relaciones entre los términos, se seleccionaron un subconjunto de términos enriquecidos y se representaron como un diagrama de red donde se hace evidente los nodos asociados a un proceso biológico. Capítulo 2 33 Figura 0-7: Redes y componentes principales de interacción proteína-proteína La imagen de la izquierda muestra las redes y componentes principales de interacción proteínaproteína identificados por el algoritmo MCODE. La imagen de la esquina superior derecha e imagen inferior muestra las rutas enriquecidas por todos los nodos involucrados en los módulos identificados. 34 Título de la tesis o trabajo de investigación Fuente: los autores 1.9 DISCUSIÓN La toxicoproteómica tiene como objetivo identificar proteínas y vías críticas en los sistemas biológicos que se ven afectadas y responden a exposiciones químicas y ambientales adversas utilizando tecnologías globales de expresión de proteínas (6), la importancia del conocimiento de estos perfiles diferenciales podría postular biomarcadores de exposición luego de un tratamiento como indicativo del estado de los procesos fisiológicos antes de que aparezca como desenlace de efectos sobre la salud. Por esto, evaluamos la expresión deferencial de proteínas expuestas al material orgánico extraíble del material particulado proveniente de diésel de referencia y dos combustibles alternativos diésel más butanol al 10% y diésel más etanol al 10%. Los resultados mostraron que estos tratamientos modulaban el proteoma de la línea celular HepG2, generando cambios en proteínas como la subunidad 5A de la citocromo C oxidasa (Cox5A), triosafosfato isomerasa (TPI1), peroxiredoxina 2 (PRDX2), proteína 29 del retículo endoplasmático (ERP29) y la proteína disulfuro-isomerasa A3 (PDIA3) de quienes se conoció participan en procesos como desintoxicación de especies reactivas de oxígeno, vías implicadas en el metabolismo de carbohidratos, transporte de electrones y metabolismo celular. La estrategia de electroforesis de dos dimensiones junto con el análisis LC-MS/MS utilizada en esta investigación permitió visualizar que el proteoma de la línea celular HepG2 expuesta a los diferentes tratamientos presenta perfiles proteicos semejantes que conservan un patrón de expresión, donde no evidencia degradación de las proteínas y presentan una buena resolución en términos de número de spots y distancia entre ellos, además. A través del análisis de imágenes por PDQuest fue posible identificar diferencias en la intensidad relativa de spots, aquellos que se consideraron con cambios significativos superaban o estaban por debajo dos veces o más de la intensidad de los spots presentes en el control negativo (fold change >2), así, de un total de 16 proteínas expresadas diferencialmente, cinco proteínas fueron identificadas a través de LC-MS/MS, la selección de estas proteínas se dio teniendo en cuenta que en los geles los spots quedaran completamente separados, tuvieran un tamaño considerable para garantizar la cantidad de proteína necesaria y preferiblemente que se encontrara en el centro del gel y de esta forma se garantizaría una alta posibilidad de identificarlos.. Capítulo 2 35 Las proteínas diferencialmente expresadas (COX5A, TPI1, ERP29, PRDX2 y PDIA3) mostraron un incremento en la expresión comparado con el control negativo en la línea celular HepG2, El análisis bioinformático mostró varias rutas biológicas enriquecidas del subconjunto de proteínas identificadas, estas rutas están relacionadas con la glucólisis y el metabolismo de carbohidratos, así como desintoxicación de especies reactivas de oxígeno, así mismo es importante destacar que en el modelo de cáncer hepático (HepG2), estas proteínas se encuentran con una expresión normal lo que hace posible su comparación aunque esta corresponda a una línea celular tumoral. La subunidad 5A de la citocromo C oxidasa (Cox5A) se vio sobre-expresada en todos los tratamientos comparados con el control negativo, esta es un componente de la citocromo C oxidasa (42). La expresión anormal de Cox5a puede generar alteraciones en los procesos biológicos, su incremento se ha relacionado con la atenuación de la disfunción de la respiración mitocondrial y compensando de la cantidad disminuida de ATP disponible (43). No se ha encontrado una asociación de partículas contaminantes con cambios en la expresión de esta proteína, pero se sabe que bajo tratamientos tóxicos (La doxorrubicina DOX) o hipoxia, su expresión al alza está relacionado con la inhibición de la apoptosis. Otra proteína implicada en la glucolisis y la gluconeogénesis es la triosafosfato isomerasa (TPI1), esta es una enzima metabólica extremadamente eficaz que cataliza la interconversión entre fosfato de dihidroxiacetona (DHAP) y D-gliceraldehído-3-fosfato (G3P) en la glucólisis y la gluconeogénesis (44), la sobreexpresión de TPI1 se correlacionó con la detención de la fase G1/S, de hecho, en cáncer de hígado se ha indicado que TPI1 inhibe el crecimiento de células, la migración y la invasión celular in vitro (45). Algunos estudios han sugerido que la peroxiredoxina 2 (PRDX2), puede regular muchas funciones celulares como la proliferación y diferenciación celular, modulación de la supervivencia celular y detoxificación de especies reactivas de oxígeno (46,47). su sobreexpresión puede contribuir a la disminución de ROS al participar activamente en el mantenimiento del equilibrio redox para prevenir que las células sufran daños oxidativos que provocan la apoptosis (48). Otros estudios también han postulado este mecanismo como generador de toxicidad a nivel celular después de la exposición a material particulado completo generando cambios en el proteoma de tejido pulmonar, cardiovascular (49), epitelial (50) e hígado (51). En términos de la fracción orgánica del material particulado se ha postulado que esta generación de especies reactivas de oxígeno se da a través de 36 Título de la tesis o trabajo de investigación quinonas derivadas de la metabolización de hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAH) por enzimas de fase I (CYP450) (52), lo que pude alterar el equilibrio redox dentro de las células mediante la formación de macromoléculas celulares oxidadas que incluyen lípidos, proteínas y ADN. Se ha demostrado que la propia producción de ROS desencadena la UPR en algunos casos y dado que el plegamiento de proteínas es dependiente de redox, se hace interesante que proteínas relacionadas con el estrés del retículo endoplasmático se vean expresadas diferencialmente, por ejemplo, la proteína 29 del retículo endoplasmático (ERP29) es una proteína que interviene en el plegamiento y la exportación de secreción de proteínas, además, ERP29 es una proteína inducible por estrés del retículo endoplasmático (53), otros estudios han sugerido que las partículas de material particulado de tamaño fino y ultrafino son capaces de inducir estrés del retículo endoplasmático en líneas celulares pulmonares, hepático y nerviosas (54–56) y puede ser un mecanismo por el cual la fracción orgánica extraíble del MP ejerza toxicidad, además, la sobreexpresión de ERP29 se ha asociado con la resistencia al estrés oxidativo sugiriendo un papel protector ante este (57), así mismo, incremento en la expresión de esta proteína está asociado con la inhibición parcial de la proliferación en las células HepG2 (58). Además, la proteína disulfuro-isomerasa A3 (PDIA3), también conocida como proteína residente del retículo endoplásmico, también protege a las células de la apoptosis inducida por estrés del retículo endoplasmático (59). En este trabajo se encontró que todas las proteínas evaluadas tenían una relación directa o indirecta con los procesos celulares implicados en la respuesta al estrés oxidativo, así se postula que proteínas diferencialmente expresadas pueden estar participando en un proceso de detoxificación de ROS mediado por H2O2, quien al incrementar sus niveles en la célula puede estar desregulando la homeostasis y modulando el proteoma para generar una respuesta celular ante esta señal de estrés. Esto fue posible observarlo tanto en el tratamiento con el control positivo como con los tratamientos para las alternativas de diésel. Otras investigaciones han mostrado además, a través de pruebas in vitro el MP proveniente de fuentes diésel y su material orgánico extraíble tiene efectos a nivel celular que contribuyen a la desregulación de la homeostasis, induciendo un aumento de la muerte celular y en los niveles de rupturas de las cadenas de ADN, estrés oxidativo y formación de aductos de ADN-PAH (3). Así mismo, la diferencia en la expresión de genes y proteínas después de la exposición a partículas de escape diésel Capítulo 2 37 mediante técnicas como transcriptoma y plataforma de microarreglos observó diferencia en la expresión de citoquinas proinflamatorias (5) y enzimas antioxidantes (60) así como cambios en la expresión de genes requeridos para el mantenimiento del genoma mitocondrial, la apoptosis y la producción de energía (61). En conjunto, estos resultados pueden estar mostrando una respuesta celular a la detoxificación de especies reactivas de oxígeno generadas por la exposición al material orgánico extraíble del material particulado, se considera necesario entonces ampliar estos resultados con análisis de cuantificación de proteínas a nivel in vitro a través de técnicas como Elisa, para confirmar la expresión diferencial de las mismas luego de la exposición al material orgánico extraíble del material particulado, además, realizar una comparación con la expresión de genes, ya que la información proporcionada por el transcriptoma es relevante para encontrar mecanismos de toxicidad, pero se estaría dejando a un lado la regulación postraduccional que podrían estar ejerciendo los agentes tóxicos y es por esto por lo que un análisis complementario sería el uso de la plataforma de análisis proteómico. 1.1 Conclusión El material orgánico extraíble del material particulado proveniente de diésel y diésel con mezclas de alcoholes (butanol y etanol al 10%) regula el proteoma de la línea celular HepG2 al incrementar la expresión de proteínas relacionadas con el metabolismo mitocondrial y detoxificación de especies reactivas de oxígeno, se encontró además que el proteoma de las células expuestas a MOE de los diferentes combustibles es más similar entre ellos que el proteoma correspondiente al control negativo (células no expuestas). En conjunto, estos resultados pueden estar mostrando una respuesta celular a la detoxificación de especies reactivas de oxígeno generadas por la exposición al material orgánico extraíble del material particulado, dando ideas de los posibles mecanismos de toxicidad celular después de la exposición a este extracto. Finalmente, cambios en la expresión de estas proteínas pueden evaluarse como futuros biomarcadores de exposición e indicadores de riesgo temprano de exposición al MOE. Biocompatibilidad de nanopartículas poliméricas en dos líneas celulares. Resumen Para el uso de nanopartículas (NPs) en medicina es necesario evaluar sus posibles riesgos para lograr un desarrollo eficiente y seguro, por ello, el objetivo del estudio fue evaluar la biocompatibilidad en términos de viabilidad, genotoxicidad y mutagenicidad de una nueva propuesta de nanopartículas (NPs) que serán usados para la producción de stent recubiertos con NPs para el tratamiento del cáncer de pulmón. Para esto se desarrolló un estudio experimental in vitro en las líneas celulares humanas A549 (pulmón) y HepG2 (hígado) expuestas a diferentes tipos de NPs. Se probó la citotoxicidad evaluando la viabilidad celular mediante el ensayo colorimétrico MTT y el ensayo de exclusión con el colorante azul de tripano, mientras que el daño del ADN fue evaluado por medio del ensayo cometa alcalino. Por otra parte, la mutagenicidad fue evaluada mediante el test de mutagenicidad con Salmonella typhimurium (test de AMES). Los resultados mostraron baja citoxicidad de NPs presentando una concentración letal 50 (LC50) superior a 2mg/ml, un efecto genotóxico bajo y ningún efecto mutagénico. Se concluye que es necesario realizar más pruebas para dilucidad los mecanismos de toxicidad de estas NPs. Palabras clave: citotoxicidad, genotoxicidad, mutagenicidad, PLGA Abstract For the use of nanoparticles (NPs) in medicine, it is necessary to evaluate their possible risks to achieve efficient and safe development, therefore, the objective of the study was to evaluate the biocompatibility in terms of viability, genotoxicity and mutagenicity of a new nanoparticle proposal (NPs) that will be used for the production of NPs-coated stents for the treatment of lung cancer. For this, an experimental in vitro study was developed in 40 Título de la tesis o trabajo de investigación human A549 (lung) and HepG2 (liver) cell lines exposed to different types of NPs. Cytotoxicity was tested by evaluating cell viability by the MTT colorimetric assay and the trypan blue dye exclusion assay, while ADN damage was evaluated by the alkaline comet assay. On the other hand, the mutagenicity was evaluated by the mutagenicity test with Salmonella typhimurium (AMES test). The results showed low cytoxicity of NPs presenting a lethal concentration 50 (LC50) higher than 2mg / ml, a low genotoxic effect and no mutagenic effect. It is concluded that it is necessary to carry out more tests to elucidate the toxicity mechanisms of these NPs. Keywords: cytotoxicity, genotoxicity, mutagenicity, PLGA 1.2 Introducción La obstrucción de las vías respiratorias centrales, la tráquea y los bronquios del tronco principal, puede resultar de una variedad de procesos patológicos, dichas obstrucciones se presentan en aproximadamente el 30% de los pacientes con cáncer de pulmón y cerca del 35% de los pacientes mueren como resultado de asfixia, hemoptisis y neumonía postobstructiva (62,63). Los stents diseñados para liberar controladamente diferentes medicamentos en el tratamiento local del tumor que obstruye la vía respiratoria pueden ser una alternativa para mejorar la calidad de vida de los pacientes y disminuir la mortalidad asociada a las complicaciones de los pacientes que sufren cáncer de pulmón, además, han surgido algunas herramientas para el direccionamiento de medicamentos a través de estos stents al incorporar nanopartículas (NPs) por su potencial para ser utilizadas en la encapsulación de péptidos, medicamentos, ácidos nucleicos, proteínas, entre otros (9) entre los que se destacan algunas NPs poliméricas como el ácido poliláctico (PLA), ácido poliglicólico (PGA), policaprolactona PCL, poli (ácido láctico-co-glicólico) PLGA y polidioxanona (PDO) (Novotny et al. 2012), hidroxiapatita (64), AMP (65) y derivados del magnesio (66) como es el caso del óxido de magnesio (MgO) y Mg(OH). Aunque por definición los NPs se diseñan para que sean biocompatibles y puedan mejorar la calidad de vida de los individuos, la complejidad de los sistemas biológicos hace que esta propiedad sea difícil de cumplir (11) y esto ha contribuido a que se encuentren discordancias en los efectos de las NPs en los sistemas biológicos reportándose casos en los que pueden generar o no, respuestas tóxicas tras la interacción con estructuras celulares como la membrana plasmática, orgánulos o con el material genético (10). Capítulo 3 41 Es por esto que se hace necesario que toda nueva propuesta de NPs deba ser cuidadosamente evaluada antes de su uso en medicina a través del seguimiento de guías, reglamentos o estándares nacionales, es el caso de La Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos (OCDE) que contribuyó con la construcción de una estandarización de las pruebas más pertinentes para dichas evaluaciones, sugiriendo que se debe comenzar con ensayos in vitro que proporcionan un medio rápido y eficaz para evaluar una serie de criterios de valoración toxicológica como la viabilidad celular, las alteraciones en el metabolismo, crecimiento poblacional o alteraciones estructurales y su relación con las concentración de los materiales evaluados (9), con el fin de detectar los efectos primarios en ausencia de efectos secundarios (sobre el organismo completo). Teniendo en cuenta que las características de las NPs pueden variar según su composición química, las técnicas de preparación, su forma y tamaño, carga superficial y su efecto puede ser diferente según el blanco al que sea dirigido; el objetivo de este estudio fue evaluar los efectos citotóxicos de los NPs que conformarían una nueva propuesta de stents bioabsorbibles nanoreforzados así como, genotóxicos y mutagénicos de NPs con las que estaría recubierto. Esto se logró mediante la evaluación de viabilidad por medio de las pruebas de azul de tripano y el ensayo colorimétrico de MTT, la evaluación de la genotoxicidad fue evaluada mediante el ensayo cometa y la mutagenicidad fue evaluada mediante el test de AMES en Salmonella. y se determinó que las concentraciones letales de las NPs y los nanomateriales se encuentran por encima de 2mg/ml y que los tejidos generados no generan daño en la membrana celular; finalmente, se demostró que las nanopartículas tienen efecto genotóxico generando un daño leve sobre la línea celular de pulmón A549 y no contribuyeron a una fuente de mutagenicidad en la cepa de bacterias evaluadas. 1.3 Materiales y métodos 1.3.1 Cultivos celulares Las líneas celulares usadas fueron: A549 línea (ATCC®) la cual fue iniciada en 1972 por DJ Giard, et al. (19) mediante cultivo de explantes de tejido carcinomatoso de pulmón de un varón caucásico de 58 años y la línea celular modelo HepG2, derivada de un carcinoma hepatocelular de hígado de un varón caucásico de 15 años (19). Ambas líneas celulares 42 Título de la tesis o trabajo de investigación fueron elegidas por ser blanco para esta terapia con nanopartículas resaltando que la línea celular hepática HepG2 tiene activados citocromos de la familia P450 (CYP) lo que proporciona una herramienta para la investigación del metabolismo y la activación metabólica de sustancias químicas mediada por CYP (20). Estas líneas celulares fueron mantenidas en medio de cultivo Roswell Park Memorial Institute (RPMI), suplementado con suero bovino fetal (SBF) al 10% y mantenidas en una atmósfera húmeda que contenía 5% de CO2 y a una temperatura de 37ºC. Las líneas se mantuvieron entre los pases 4 y 17 y los ensayos de citotoxicidad y genotoxicidad se realizaron cuando se encontraban en una confluencia del 80%. 1.3.2 Tratamientos Los tratamientos consistieron en NPs de Fosfato amorfo de magnesio (AMP), polímero microporoso conjugado (CMP), Hidroxiapatita (HA), Óxido de magnesio (MgO), Hidróxido de magnesio [Mg(OH)2] y NPs de PLGA que encapsulaban o no paclitaxel (PTX). Para estos tratamientos se partió de una concentración de 2mg/mL (stock) ya que esta corresponde a la concentración requerida para la fabricación de las NPs. Los tratamientos se realizaron exponiendo a cada una de las células a estos compuestos por 24 horas. Para el ensayo MTT y la curva de citotoxicidad en bacterias, se evaluaron 20 concentraciones, partiendo de 2mg/ml y realizando 20 diluciones seriadas 1:1 en PBS libre de calcio y magnesio, hasta alcanzar una concentración de 3,81X10-6 mg/ml. Para el ensayo cometa, las células fueron expuestas a 2.0, 1,0, 0.5, 0.25 y 0.125 mg/ml de NPs cargadas con PTX y NPs sin carga, concentraciones que correspondieron a concentraciones inferiores a la concentración letal 20 (LC20). Para el caso de los tejidos conformados con NPs en presencia o ausencia de crosslinking y con incorporación o no de NPs, las células se expusieron a concentraciones de 2mg, 1mg y 0,5mg para la realización de las pruebas de azul de tripano. 1.3.3 Ensayo de proliferación celular: MTT Se realizó la evaluación de la citotoxicidad de las NPs a través del ensayo colorimétrico MTT (bromuro de 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5 difenil tetrazolio), el cual se basa en la Capítulo 3 43 conversión de MTT en cristales de formazán por la enzima mitocondrial Succinato deshidrogenasa y en él se relaciona dicha actividad con las células viables o vivas (67). Siguiendo el protocolo de Muelas et al, (68), en un plato de 96 pozos se sembraron 4.000 células por pozo y cuando se alcanzó una confluencia del 80% fueron tratadas por 24h con 10μl de cada una de las 20 diluciones del tratamiento. Al finalizar este tiempo se añadió 10μl de solución de MTT (5 mg/ml) y se incubó el plato durante 6 horas a 37°C con agitación constante y aislado de la luz. Posteriormente, se añadió a cada pozo 100μl de isopropanol ácido frío para disolver los cristales de formazán que se formaron en aquellas células que tenían actividad mitocondrial, y se llevó a agitación constante por 24h. Finalmente, se realizó la lectura de la densidad óptica con un espectrofotómetro MultiskanGo a una longitud de onda de 570 nm. Con el fin de verificar la reproducibilidad de los resultados, cada ensayo se realizó en tres momentos independientes por triplicado, como control positivo se utilizó Dimetil sulfóxido (DMSO) al 100%, como control negativo se usó medio de cultivo RPMI y como control solvente agua ultra-pura. Usando el software estadístico SPSS (SPSS 23.0 para Windows, SPSS Inc., 2010), se realizó el análisis Probit que permitió calcular la probabilidad de muerte a mayores concentraciones que las expuestas, así como determinar la concentración letal 50 (LC50), que se define como la concentración a la cual muere el 50% de la población expuesta al tratamiento y la concentración letal 10 (LC10) donde muere el 10% de la población. 1.3.4 Ensayo de viabilidad celular (integridad de la membrana) mediante exclusión del colorante azul de tripano El azul de tripano es un colorante utilizado para el recuento de células íntegras por exclusión de dicho colorante. Este método se basa en el hecho de que una célula muerta es incapaz de excluir de su citoplasma el colorante azul de tripano, debido a que ha perdido la integridad de su membrana plasmática, lo que permite su identificación a través de microscopia óptica clasificando a las células vivas (viables) como aquellas que se observan refringentes y las células muertas (no viables) de un color azul. Siguiendo el protocolo de Strober (69), en un plato de 6 pozos, se cultivaron 50.000 células por pozo para las líneas celulares A549 y HepG2, y se expusieron a concentraciones de 44 Título de la tesis o trabajo de investigación 2.0, 1,0, 0.5, 0.25 y 0.125 mg/ml de las NPs o sus precursores. Posteriormente, se adicionó el colorante azul de tripano a una concentración de 0,4 % (v/v) y se realizó la lectura con el microscopio óptico identificando las células vivas (refringentes, sin color) y las células muertas (células teñidas de azul). El porcentaje de viabilidad se calculó relacionando el total de células con las células vivas y se expresó en términos de porcentaje (ecuación 3.1): %Viabilidad = 𝐶é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑣𝑖𝑣𝑎𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 ∗ 100% (3.1) Cada ensayo se realizó en tres momentos independientes por triplicado con su respectivo control negativo (medio de cultivo DMEM) y control positivo (DMSO 100%). Usando el software estadístico SPSS (SPSS 23.0 para Windows, SPSS Inc., 2010), se chequeó la normalidad de los datos y se procedió a evaluar si existían diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos evaluados y el control negativo. 1.3.5 Electroforesis alcalina de células individuales (ensayo Cometa) El ensayo cometa alcalino, es una técnica que me permite evaluar el daño producido por un agente sobre el ADN generados por rupturas de una sola hebra de ADN (SSB), sitios lábiles al álcali, reticulación ADN-ADN y SSB asociada con sitios de reparación de escisión incompleta (24). En resumen, se sembraron 30.000 células por pozo en un plato de 12 pocillos, una vez se encontraban en una confluencia del 80% fueron tratadas por 24h con las concentraciones subletales (0,4; 0,2; 0,01 mg/ml) para los diferentes tratamientos de NPs en presencia o ausencia de paclitaxel. Siguiendo el protocolo de Singh (25) y Olive (26), después de 24h de tratamiento, las cajas de seis pozos se lavaron dos veces con solución salina al 0,9%, las células se despegaron y se centrifugaron a 1.200 revoluciones por minuto (rpm) durante 7 min, posteriormente, se evaluó viabilidad celular mediante tinción con azul de tripano para asegurar que esta fuese superior al 85%. Las células individuales se embebieron en agarosa gelificante a bajo punto de fusión y se sometieron a una solución de lisis (NaOH 0,26 M, cloruro de Capítulo 3 45 sodio 1,2 M, N-lauroilsarcosina al 0,1% y EDTA 100 Mm) por 24h. Transcurrido este periodo, se procedió a la desnaturalización al sumergir el gelbon en una solución alcalina (NaOH 0,10 M, EDTA 2mM con pH superior a 13) y se sometieron a electroforesis (25mV 300mA) en gel alcalino usando la misma solución. Posteriormente, se hizo la tinción con 2,5 μg/mL de Bromuro de Etidio (BrEt). El parámetro de medición de daño que se usó en este trabajo fue la longitud de cometa medido con una reglilla microscópica (μm) en 100 células al azar. Se incluyeron muestras de células no tratadas y controles positivo (Peróxido de hidrógenoH2O2) a una concentración molar de 100uM y control negativo medio de cultivo DMEM. Una vez obtenidos los datos de longitud de cometa, se realizó la clasificación del daño considerándose daño genético a partir de la media del control negativo más dos desviaciones estándar. A 100µm (máxima medida de la reglilla ocular) se le restó el mínimo de daño, el resultado se dividió en cinco categorías o niveles de daño: sin daño, daño bajo, daño medio, daño alto y daño total como se muestra en la Tabla 0-1: Niveles de daño del ADN de células expuestas a nanopartículas. Tabla 0-1. Tabla 0-1: Niveles de daño del ADN de células expuestas a nanopartículas. Nivel de daño Daño 0 Daño 1 Daño 2 Daño 3 Daño 4 Categoría de daño Sin daño Daño bajo Daño medio Daño alto Daño total Rango (µm) 0–6 7 – 29 30 – 53 54 – 76 77 – 100 La frecuencia de inducción (FI) fue calculada para cada concentración usando el promedio encontrado de la longitud del cometa y relacionándolo con el promedio del cometa encontrado en el control negativo como se muestra en la ecuación 3.2 𝑀𝑒𝑑𝑖𝑎𝑛𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑡𝑟𝑎𝑡𝑎𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 FI = 𝑀𝑒𝑑𝑖𝑎𝑛𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜 (3.2) 1.3.6 Test de mutagenicidad en Salmonella (Test de AMES). Para esta prueba, se hizo uso de las cepas de Salmonella typhimurium mutadas para varios genes en el operón de histidina (70). El efecto mutagénico se evaluó en presencia y ausencia de enzimas de metabolización de xenobióticos (oxigenasas P450 (CYP) 46 Título de la tesis o trabajo de investigación contenidas en la fracción microsomal (S-9) de hígado de rata macho (Moltox, Molecular Toxicology, Inc) a una concentración del 10%. Antes de la evaluación mutagénica de los compuestos, se verificó la presencia de marcas específicas para cada cepa (70) y se determinó las concentraciones subletales por debajo de LC10. Como control negativo, se usó agua ultra-pura, para la cepa TA98 sin S9, se usó como control positivo Daunomicina 6µg por plato, para la cepa TA100 se usó como control positivo 4-nitroquinolina (4NQ) 1,5µg por plato, obteniendo, como control positivo con activación metábolica se usó 2-aminoantraceno (2AA) 1,5µg por plato tanto para TA98 como para la cepa TA100. Inicialmente, cada cepa bacteriana se cultivó en 10 ml de caldo nutritivo a 37 ° C durante 16 h con agitación constante, luego se agregaron alícuotas de 100 μl de cada cultivo bacteriano a tubos de ensayo y posteriormente se añadió 10 μl tratamiento y 100μl de la mezcla S9 o PBS, las bacterias se dejaron expuestas al tratamiento durante 90 min a 37°C y con agitación constante. Después de la incubación, se agregaron 3ml de superficie de agar (agar superior) a cada uno tubo de ensayo, se agitó y se dispersó agitado con vórtex durante 10s y dispensado en placas de Petri que contenía agar mínimo. Las cajas se dejaron secar y se llevaron a una incubadora a 37 ° C durante 48 h y pasado este tiempo, se obtuvieron datos del número de bacterias revertantes. Se evaluó la normalidad de los datos de esta variable mediante el test de KolmogorovSmirnov y se procedió a la comparación entre tratamientos mediante estadística no paramétrica. Además, se calculó el índice de mutagenicidad (IM) para cuantificar la mutagenicidad de las NPs sobre el ADN bacteriano a partir de la ecuación 3.2. 𝐼𝑀 = 𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 𝑟𝑒𝑣𝑒𝑟𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠 𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜 (3.2) El compuesto probado se categorizó en función del índice de mutagenicidad como mutágeno fuerte (MI> 2), mutágeno débil (rango de MI entre 1 y 2) o no mutágeno (MI ≤1). 1.3.7 Análisis estadístico El análisis de datos se realizó con software estadístico IBM SPSS Statistics versión 24.0 IBM Corp. Cada experimento para cada ensayo se realizó en 3 momentos independientes, cada uno por duplicado. Capítulo 3 47 Los resultados obtenidos para el ensayo MTT se analizaron a través de una regresión Probit, con el fin de calcular la concentraciones letales y subletales. Para el test de Ames y el ensayo cometa se evaluó la normalidad a través del test de Kolmogórov-Smirnov. Posteriormente, se realizaron análisis bivariados a través del test de Kruskal Wallis con corrección de Bonferroni, con el fin de saber si las concentraciones usadas difieren del control negativo. 1.4 Resultados 1.4.1 Ensayo de MTT Se encontró que la viabilidad después de las 24h de exposición a todas las NPs tiene una relación inversamente proporcional a las concentraciones, es decir, las células expuestas a una mayor concentración de los tratamientos evaluados presentaban menor viabilidad, además fue evidente que la viabilidad celular comienza a decrecer a concentraciones superiores a 0,5 mg/ml. A partir de estos datos, se determinó mediante un análisis Probit las concentraciones letales y subletales donde se encontró que en todos los casos la concentración subletal es superior a 2mg/ml como se muestra en la Tabla 0-2. Tabla 0-2: Concentraciones letales y subletales de los diferentes polímeros nanoestructurados. Compuesto AMP CMP HA MgO Mg(OH)2 Línea celular A549 LC50 (mg/ml) 2,11 HepG2 4,37 A549 4,35 HepG2 4,60 A549 6,54 HepG2 6,42 A549 6,79 HepG2 6,81 A549 4,19 HepG2 3,92 48 Título de la tesis o trabajo de investigación POL I NPs PLGA NPs + PTX A549 13,97 HepG2 9,15 A549 2,34 HepG2 2,43 A549 2,53 HepG2 2,51 1.4.2 Prueba de viabilidad azul de tripano Se encontró una viabilidad celular después de la exposición a las NPs en presencia o ausencia de paclitaxel era superior al 80% en todos los tratamientos y concentraciones y las comparaciones múltiples mediante una Anova y prueba pos-hot no mostraron diferencias significativas (p< 0,05) respecto al control negativo. 1.4.3 Ensayo de genotoxicidad El ensayo de genotoxicidad reflejó que los tratamientos con NPs generaron cometas de un tamaño mayor comparado con el control negativo y se mostró que la longitud de la cola es proporcional al incremento de la concentración de los tratamientos con NPs y NPs cargadas. La mediana de longitud del cometa de las células A549 tratadas con el control negativo fue de 6 (5-6) µm (Mediana (Q1,Q3)), mientras que las longitudes superiores correspondieron a las concentraciones más altas (0,4 mg/ml) de NPs 13 (11,15) µm y NPs+PTX 16 (14,20)µm. Los datos se comportaron de una forma no normal (p=0,001), la longitud del cometa y la comparación entre grupos mostró que existían diferencias entre todas las concentraciones (0,04 - 0,01mg/ml) con respecto al control negativo (p= 0,001) como se muestra en la Tabla 0-3. La frecuencia de inducción mostró cambios significativos en la línea celular A549 en las concentraciones de 0,04 y 0,02 mg/ml de las NPs y la concentración 0,04 para el caso de NPs + PTX. Tabla 0-3: Medida de la longitud del cometa de células expuestas a los diferentes tratamientos y comparación con el control negativo. Capítulo 3 Línea celular 49 Tratamiento NPs A549 NPs+ PTX NPs HepG2 NPs+ PTX Longitud del Concentración (mg/ml) cometa Valor P* Mediana (Q1, Q2) Frecuencia de inducción C- 6 (5,6) -- 0,04 16 (14,20) < 0,001 2,88 0,02 11 (9,14) < 0,001 2,01 0,01 9 (8,10) < 0,001 1,57 C- 6 (5,6) -- 0,04 13 (11,15) < 0,001 2,26 0,02 10 (8,11) < 0,001 1,65 0,01 8 (7,10) < 0,001 1,43 C- 6 (6,8) -- 0,04 11 (8,14) < 0,001 1,72 0,02 11 (8,15) < 0,001 1,73 0,01 12 (8,15) < 0,001 1,77 C- 6 (5,7) -- 0,04 11 (7,14) < 0,001 1,70 0,02 11 (8,14) < 0,001 1,68 0,01 11 (7,14) < 0,001 1,64 * Se considera diferencia estadísticamente significativa cuando el valor P < 0,05. Los valores P corresponden a las comparaciones del control negativo (agua ultra-pura) con el resto de las concentraciones. La ubicación de las células en las diferentes categorías (Tabla 0-4) indicó que para el control negativo el porcentaje de células sin daño es superior al 80% mientras que, para los demás tratamientos en todas sus concentraciones, cerca del 70% de la población celular se ubica dentro de las categorías daño bajo. Tabla 0-4: Población celular dentro de las categorías de daños definidas luego de la exposición a nanopartículas y nanopartículas más paclitaxel. 50 Título de la tesis o trabajo de investigación Línea celular Tratamiento NPs A549 NPs+ PTX NPs HepG2 NPs+ PTX Concen tración Sin daño Daño Daño Daño Daño bajo medio alto total C- 85,3 14,7 0 0 0 0,04 42,3 56,3 1,3 0 0 0,02 0,7 98,0 1,3 0 0 0,01 1,7 98,3 0 0 0 C- 2,3 97,7 0 0 0 0,04 7,3 92,7 0 0 0 0,02 14,4 85,6 0 0 0 0,01 2,3 97,7 0 0 0 C- 79,3 20,7 0 0 0 0,04 52,3 47,7 0 0 0 0,02 21,3 78,7 0 0 0 0,01 19,7 80,3 0 0 0 C- 79,3 20,7 0 0 0 0,04 22,3 77,7 0 0 0 0,02 22,3 77,7 0 0 0 0,01 22,7 77,3 0 0 0 1.4.4 Ensayo de mutagenicidad en Salmonella typhimurium: Test de AMES La curva de citotoxicidad de las cepas TA98 y TA100 de Salmonella typhimurium con el tratamiento con NPs de PLGA mostró que no existía citotoxicidad ni cambios diferenciales en el número de colonias revertantes. Los análisis de normalidad mostraron que los datos se distribuían de forma no normal (p=0,001) y existía homogeneidad entre las repeticiones. No se encontraron diferencias entre los tratamientos con NPs de PLGA sin carga (Figura 0-1) y las Nps con carga (PLGAPTX) y las bacterias sin tratar (p=0,219). Figura 0-1Revertantes generadas tras la exposición a NPs de PLGA. Capítulo 3 51 Comparación de revertantes generadas tras la exposición a NPS de PLGA y el control negativo (PBS). Para la cepa TA98 sin S9, se usó como control positivo Daunomicina 6µg por plato obteniendo 1328 (1300, 1379) revertantes, para la cepa TA100 se usó como control positivo 4NQ 1,5µg por plato, obteniendo 2300 (2215, 2367) revertantes. Como control positivo con activación metabólica se usó 2AA 1,5µg por plato, obteniendo 1373 (1340, 1409) y 1684 (1655, 1704) revertantes para la cepa TA98 y TA100 respectivamente, *p <0,001. Fuente: propia 1.5 Discusión La estrategia del uso de NPs y NM en medicina ha permitido explorar muchas alternativas para mejorar los sistemas comúnmente usados en terapia dirigida y han contribuido por ejemplo a nuevos implementos biomédicos multifuncionales por su potencial para ser usados en biotecnología, sin embargo, cabe resaltar que toda nueva propuesta de NPs debe ir acompañada de un estudio de seguridad biológica y es por esto que el objetivo de este estudio fue determinar los efectos citotóxicos, genotóxicos y mutagénicos de las NPs que conformarían una nueva propuesta de stents bioabsorbibles nanoreforzados, que se pretende usar para el tratamiento de obstrucción en vías respiratorias. Esto se logró haciendo uso de las pruebas sugeridas por la OCDE y se encontró que los valores de toxicidad son mayores a las concentraciones requeridas para la síntesis de stents, el efecto genotóxico fue mínimo bajo el tratamiento con NPs en la línea celular A549 y HepG2 generando un daño bajo en el ADN y así mismo, las NPs no fueron tóxicas ni mutagénicas en bacterias. 52 Título de la tesis o trabajo de investigación Los resultados de las concentraciones letales de las NPs poliméricas fueron superiores a 2mg/ml reflejando baja toxicidad acorde con otros estudios que han determinado que NPs como la hidroxiapatita (64), y el Fosfato amorfo de magnesio (AMP) (65) y derivados del magnesio como MgO (71) y Mg(OH)2 presentan baja toxicidad (66) en células humanas, lo que los postula como buenos candidatos para tratamientos en humanos. Aunque la evaluación de la biocompatibilidad es importante, esta no es una propiedad intrínseca de un material, sino que depende del entorno biológico y la tolerabilidad que existe con respecto a las interacciones específicas de los NPs con las células (72). Por ello, es necesario evaluar los estas en las células que mejor representen el tejido al cuál iría dirigido y fue esta la razón por la cual las células donde se evaluaron estos materiales fueran la línea celular pulmonar dado que los stents se estarían realizando con el fin de tratar las obstrucciones en vías respiratorias. En la búsqueda de una mejor eficiencia para la administración de medicamentos o la implementación de nanomateriales para dar soluciones a problemas biológicos ha habido un interés considerable en el desarrollo de NPs biodegradables, como es el caso de poli (ácido láctico-co-glicólico) o PLGA; de hecho, este ya ha sido aceptado por la FDA para su implementación como uso terapéutico en humanos, siendo una de sus aplicaciones más importantes la encapsulación de medicamentos contra el cáncer (73). Los valores de las concentraciones letales de las NPs de PLGA con y sin carga fueron de 2,34mg/ml y 2,54mg/ml respectivamente, valores comparables con otros reportados en la literatura (LC50 entre 2,64 y 4,536mg/ml) (74). Sin embargo, se ha reportado que la variación de la citotoxicidad de las NPs de PLGA puede deberse a la forma (75) y el tamaño (76) lo que exige una caracterización más detallada de las NPs evaluadas. Una vez evaluados los precursores del stent, se procedió a evaluar una primera capa o tejido de estos haciendo uso o no de la técnica de electro spinning, esta es una técnica muy prometedora para producir nanofibras dadas las posibilidades de diseñarla con dimensiones controladas y propiedades mecánicas deseadas (23,24), sin embargo, se desconoce si las modificaciones generadas sobre las NPs pueden contribuir a toxicidad. Las pruebas realizadas demostraron que la citotoxicidad de estos tejidos no fue significativa, sin embargo, es importante destacar que el tiempo de exposición de las células a los mismos fue de 24h donde no se evidenció una degradación completa de estas fibras y esto pudo contribuir a no observar señales de citotoxicidad en términos de pérdida Capítulo 3 53 de viabilidad celular, por lo que se propone realizar esta evaluación después de una exposición más prolongada. Los tratamientos con NPs para las pruebas de genotoxicidad se realizaron a partir de las concentraciones subletales y no la de partida (2mg/ml), pues se podría generar aglomeración de las NPs a concentraciones altas, afectando la biodisponibilidad o posibilidad de ingresar a las células (falsos negativos) (77), además, esta se encontraba cercana a la LC50 y se podría detectar un daño genotóxico significativo si las células tienen activas algunas vías como necrosis o apoptosis (falsos positivos) (78). Los resultados de genotoxicidad mostraron que se generó un daño en el ADN evidenciado por un tamaño de los cometas (5,5um) significativamente mayor al control negativo; y aunque la mayor proporción de células se encontraba en las categorías de daño bajo, estos daños pueden alterar procesos intrínsecos de las células. Otros estudios han mostrado que concentraciones mayores a 2mg/ml de PLGA inducen daño en el ADN de las células tratadas y dicha genotoxicidad puede estar relacionada con los productos de su degradación (79), aunque se debe tener en cuenta que los datos genotoxicológicos publicados para los nanomateriales son difíciles de comparar incluso con las mismas NPs ya que a menudo falta información de la caracterización; además de las posibles variaciones de la pureza de las NPs, protocolo de dispersión, estabilidad de la suspensión en medios biológicos y otras propiedades físico-químicas (80). Lo que redunda en la necesidad de evaluar estas propiedades con el fin de completar los estudios sugeridos por la OCDE. La exposición de las bacterias Salmonella typhimurium a las NPs sin carga y a las NPs+PTX no mostraron efecto citotóxicos ni mutagénicos al no revelar diferencia en el número de revertantes generados tras la exposición a estos tratamientos comparados con el control negativo. Se han informado resultados negativos en el test de AMES similares para otras NPs como nanotubos de carbono de pared simple (SWCNT) (81), NPs de plata (82), dióxido de titanio (TiO2) (83) entre otras (77,80), esto se ha asociado con las limitaciones como la relación entre el tamaño de la NPs y las bacterias el cual no difiere mucho y que las NPs en algunos casos presentan capacidad antimicrobiana (82) además, no está claro cómo es la interacción entre las NPs y la pared celular bacteriana (84). Para resolver esta falta de concordancia entre mutagenicidad y clastogenicidad, se necesitan experimentos adicionales como por ejemplo la realización del test de AMES con otras 54 Título de la tesis o trabajo de investigación cepas celulares como por ejemplo, la cepa TA102 que permite la evaluación de estrés oxidativo en bacterias (85), así mismo pruebas de mutagenicidad en mamíferos. No se tiene claro el mecanismo exacto de la toxicidad, pero se conoce que la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y el estrés oxidativo son dos rutas probables para la generación de toxicidad a partir de nanopartículas, esta desregulación del ambiente lo que puede ayudar a generar citotoxicidad por desregulación del metabolismo mitocondrial como fue evidenciado a través de la prueba de MTT, también puede contribuir a generar daños sobre el ADN como se evidenció en el ensayo cometa. Estas ROS han sido evaluadas en NPs de ZnO, TiO2, CuO, así como NPs de sílice y plata (9,82,86) y se ha encontrado un incremento significativo que conllevan a un desbalance de las células generando daños que pueden llevar a muerte celular (84). Aunque se abarcaron cuatro puntos importantes para determinar la citotoxicidad de las NPs, daño en la membrana mediante la prueba de azul de tripano, la alteración del metabolismo mediante la prueba de MTT, los daños en el ADN mediante el ensayo cometa y mutagenicidad por el test de AMES, se hace necesario evaluar si existe alteración en el ciclo celular o cambios a nivel epigenético, lo cual recientemente se ha evidenciado con una correlación de la metilación del ADN y la exposición a NPs, aun cuando los efectos citotóxicos son bajos (87). Además, dada la hipótesis ya existente sobre la generación de ROS a partir del tratamiento con NPs, puede ser transcendental dilucidar cuál es la razón de las alteraciones en cada uno de estos puntos, se propone que el estrés oxidativo y la generación de ROS son los posibles candidatos para la generación de estas afectaciones en las células. 1.6 Conclusión Las NPs no mostraron toxicidad alta, pero fue evidente que la viabilidad celular es dependiente de la concentración de exposición a las mismas. Los valores de las concentraciones letales (LC50) se encuentran por encima de los valores requeridos para síntesis de los stents. Por otra parte, las nanopartículas de PLGA con o sin carga de PTX mostraron que todos los tratamientos causaron daño sobre el material genético lo que podría contribuir a posibles efectos adversos a nivel celular dada la acumulación de daño en el ADN que no pueda ser reparado y no tuvieron efecto mutagénico sobre bacterias. Esto podría limitar el uso de estas NPs como sistema de entrega de medicamentos hasta Capítulo 3 55 lograr modificaciones en las mismas que disminuyan los posibles efectos sobre los sistemas biológicos o hasta la realización de más pruebas que conlleven a la determinación de los procesos biológicos que se están viendo alterados a nivel celular. Además, con este estudio se resalta la necesidad de realizar pruebas que evalúen diferentes puntos finales ya que, aunque las NPs presenten baja citotoxicidad pueden estar alterando la homeostasis celular desde otras perspectivas. Conclusiones y recomendaciones 1.7 Conclusiones Las políticas actuales para contrarrestar los efectos de la contaminación ambiental se basan en la disminución de emisiones de agentes contaminantes, pero no se tiene en cuenta los posibles efectos de estos agentes sobre los sistemas biológicos lo que creemos estrictamente necesario para comprobar que los combustibles alternativos en realidad están contribuyendo a una solución. Teniendo en cuenta y que se ha demostrado que los combustible diésel mezclados con alcoholes (etanol y butanol al 10%) presentan disminución en la emisión de material particulado se evaluó los efectos genotóxicos y la expresión diferencial de proteínas a nivel in-vitro de la fracción orgánica extraíble del material particulado proveniente de diésel y diésel con mezclas de alcoholes. Se encontró que células HepG2 expuestas a estos extractos no presentan alternaciones en el funcionamiento de las mitocondrias que conlleven a muerte celular, lo que llevó a concluir que la exposición al MOE no genera disminución de la viabilidad celular. En cuanto a la genotoxicidad se comprobó que estos extractos generan daños en el ADN comprobado a través del ensayo cometa, entre los posibles tipo de daño que se generaron tras la exposición se encuentran los quiebres de doble cadena y de cadena sencilla, lábiles al álcali, reticulación ADN-ADN, sin embargo el ensayo cometa alcalino no permite discriminar específicamente cuál de estos daños se generó Se encontró así mismo que el material orgánico extraíble del material particulado proveniente de estas alternativas de diésel regula el proteoma de la línea celular HepG2 al incrementar la expresión de proteínas relacionadas con el metabolismo mitocondrial y detoxificación de especies reactivas de oxígeno y se encontró además que el proteoma de las células expuestas a MOE de los diferentes combustibles es más similar entre ellos que el proteoma correspondiente al control negativo (células no expuestas). 58 Título de la tesis o trabajo de investigación En conjunto, estos resultados indican que hay procesos toxicológicos asociados con la exposición al material orgánico extraíble del material particulado proveniente de diésel con mezcla de alcoholes, otros estudios han postulado que los daños en el ADN pueden estar asociados con la desregulación de especies reactivas de oxígeno lo que puede generar un estrés oxidativo que finalmente perturba la homeóstasis celular contribuyendo como en este caso a generar genotoxicidad, proceso confirmado por la expresión diferencial de proteínas que mostró que la células estaba enfrentando un proceso que parece estar relacionado con la detoxificación de especies reactivas de oxígeno. Teniendo en cuenta la problemática generada por el MP y su MOE sobre los sistemas biológicos y la necesidad de encontrar estrategias para la prevención y/o tratamiento después de haberse dado la afectación, se realiza la búsqueda de nuevas tecnologías entre las que se encuentra la nanotecnología quien también debe ser cuidadosamente evaluada para determinar que no represente un problema tras su exposición con los biológicos, teniendo en cuenta esto, unas nueva propuesta de NPs dirigidas hacia células de pulmón para liberación de medicamento fueron evaluadas para comprobar su seguridad biológica. Las NPs no mostraron toxicidad alta, pero fue evidente que la viabilidad celular es dependiente de la concentración de exposición a las mismas. Los valores de las concentraciones letales (LC50) se encuentran por encima de los valores requeridos para síntesis de los stents. Por otra parte, las nanopartículas de PLGA con o sin carga de PTX generaron daño bajo sobre el material genético lo que podría contribuir a posibles efectos adversos a nivel celular en caso de que estos daños no pueda ser reparado, por otro lado, estas Nps no tuvieron efecto mutagénico sobre bacterias. Se resalta la necesidad de realizar pruebas que evalúen diferentes puntos finales ya que, aunque las NPs presenten baja citotoxicidad pueden estar alterando la homeostasis celular desde otras perspectivas. 1.8 Recomendaciones Con este proyecto se aporta conocimiento sobre la toxicidad del material orgánico extraíble del material particulado proveniente de una nueva alternativa de combustible que consiste en la inyección de alcoholes (butanol, etanol en un porcentaje de 10%) y la evaluación de la compatibilidad de Nps con los sistemas biológicos, Estos resultados contribuyen a la identificación efectos genotóxicos del MP y las NPs, sin embargo, se requiere la evaluación Bibliografía 59 de otros biomarcadores para conocer los mecanismos que subyacen a dicha toxicidad. Se postula el estrés oxidativo como una las vías que están generando alteraciones en las células luego la exposición a estos xenobióticos y se sugiere entonces realizar pruebas para comprobar la desregulación de especies reactivas de oxígeno a nivel intracelular. El uso de proteómica como herramienta novedosa y complementaria a los análisis convencionales puedo dilucidar posibles vías de toxicidad mediada por especies reactivas de oxígeno. Además, contribuye con la elección de posibles biomarcadores de exposición temprana al material particulado. Por otra parte, las nanopartículas poliméricas que podrían encapsular un tratamiento dirigido hacia pulmón contrarrestando afecciones pulmonares que se dan a nivel celular las cuales contribuyen a la desregulación de la homeostasis, induciendo un aumento de la muerte celular y en los niveles de rupturas de las cadenas de ADN, estrés oxidativo, junto con una frecuencia de mutación aumentada y reordenamientos genéticos generadas por el MP, fueron probadas encontrando efectos genotóxicos, pero no citotóxicos. Cambios en la expresión de estas proteínas pueden ser evaluados en células no tumorales y determinar la posibilidad de encontrar con ello futuros biomarcadores de exposición e indicadores de riesgo temprano de exposición al MOE, se considera necesario entonces ampliar estos resultados con análisis de cuantificación de proteínas a nivel in vitro a través de técnicas como Elisa, para confirmar la expresión diferencial de las mismas luego de la exposición al material orgánico extraíble del material particulado, además, realizar una comparación con la expresión de genes, ya que la información proporcionada por el transcriptoma es relevante para encontrar mecanismos de toxicidad. 60 Título de la tesis o trabajo de investigación Bibliografía 1. Yadav R, Sahu LK, Beig G, Tripathi N, Jaaffrey SNA. Ambient particulate matter and carbon monoxide at an urban site of India: Influence of anthropogenic emissions and dust storms. Environmental Pollution. 1 de junio de 2017;225:291-303. 2. 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