Program: Provocări în sănătatea publică la nivel european, finanțat prin Mecanismul Financiar SEE 2014-2021

Operator de Program: Ministerul Sănătății din România

Proiect: “Întărirea capacității instituționale pentru controlul infecțiilor spitalicești și gestionarea consumului de
antibiotice în România”
Cod proiect: PDP-8
Promotor de proiect: Institutul Național de Boli Infecțioase „Prof. Dr. Matei Balș" din București

Ghid pentru prevenirea și limitarea fenomenului de

rezistență la antimicrobiene (AMR) și a infecțiilor asociate
asistenței medicale (IAAM) – Microbiologie

Livrabil pentru Activitatea 6.1 – Revizuirea NAP și a instrumentelor

operaționale

Avizat din partea echipei proiectului,

Prof. dr. Ștefan Sorin ARAMĂ
Manager de proiect

Realizat: 31.12.2022
Actualizat: 28.08.2023

Granturile SEE și Norvegiene

Working together for a green, competitive and inclusive Europe
 Ghid pentru prevenirea și limitarea AMR și IAAM –
Microbiologie

Autori:

Conf. univ. Dr. Edit Székely, Medic primar Medicină de laborator și microbiologie medicală, Spitalul
Clinic Județean de Urgență Târgu-Mureș, Universitatea de Medicină,
Farmacie, Științe și Tehnologie „George Emil Palade” din Târgu Mureș
Ș.l. Dr. Dragoș Florea, Medic primar Medicină de laborator, Institutul Național de Boli Infecțioase
„Prof. Dr. Matei Balș”, Universitatea de Medicină și Farmacie „Carol
Davila” din București
Dr. Marina Indreaș, Medic primar Laborator clinic și microbiologie, Spitalul Judeţean de Urgenţă Bacău

Cu contribuția:

Prof. univ. Dr. Alexandru Rafila, Medic primar Medicină de laborator, Medic primar Sănătate publică
și management sanitar, Medic primar Microbiologie medicală, Institutul
Național de Boli Infecțioase „Prof. Dr. Matei Balș”, Universitatea de
Medicină și Farmacie „Carol Davila” din București
Prof. univ. Dr. Gabriel Adrian Popescu, Medic primar Boli infecțioase, Institutul Național de Boli
Infecțioase „Prof. Dr. Matei Balș”, Universitatea de Medicină și Farmacie
„Carol Davila” din București
Conf. univ. Dr. Anca-Cristina Drăgănescu, Medic primar Pediatrie, medic specialist Boli infecțioase,
Institutul Național de Boli Infecțioase „Prof. Dr. Matei Balș”,Universitatea
de Medicină și Farmacie „Carol Davila” din București
Conf. univ. Dr. Gheorghiță Valeriu, Medic primar Boli infecțioase, Spitalul Clinic de Urgență ”Prof. Dr.
Agrippa Ionescu”, Universitatea de Medicină și Farmacie „Carol Davila”
din București
S.l. Dr. Nica Maria, Medic primar Medicină de laborator, Spitalul Clinic de Boli Infecțioase și Tropicale
„Dr. V. Babeș" București, Universitatea de Medicină și Farmacie „Carol
Davila” din București

Granturile SEE și Norvegiene

Working together for a green, competitive and inclusive Europe
Ș.l. Dr. Dorina Maria Crăciun, Medic primar Epidemiolog, Spitalul Clinic de Urgență pentru Copii
„Grigore Alexandrescu", București, Universitatea de Medicină și Farmacie
„Carol Davila” din București
Dr. Roxana-Ioana Șerban, Medic primar Epidemiolog, Cercetător științific gr. 3, Institutul Național de
Sănătate Publică, Centrul Național de Supraveghere și Control al Bolilor
Transmisibile
Dr. Andreea-Sorina Niculcea, Medic primar Epidemiolog, Institutul Național de Sănătate Publică,
Centrul Național de Supraveghere și Control al Bolilor Transmisibile
Dr. Hanne-Merete Eriksen-Volle, Dr. Miriam Sare, Dr. Christine Ardal, Horst Bentele, Dr. Oliver
Kacelnik și Dr. Ernst Kristian Rødland, Norwegian Institute of Public Health

Proiectul „Întărirea capacității instituționale pentru controlul infecțiilor spitalicești și gestionarea consumului de
antibiotice în România”, cod proiect PDP-8, este coordonat de Ministerul Sănătății, derulat de Institutul Național
de Boli Infecțioase „Prof. Dr. Matei Balș" din București, în parteneriat cu Institutul Norvegian de Sănătate Publică,
și are sprijinul Organizației Mondiale a Sănătății, de la care s-au achiziționat servicii de expertiză tehnică. Proiectul
este finanțat prin Mecanismul Financiar SEE 2014-2021 - Provocări în sănătatea publică la nivel european.
Bugetul proiectului este de 1,741,154 euro. Date contact proiect: website: https://mateibals.ro/proiecte/pdp-8-
proiect-amr/; adresa e-mail: [email protected]. Conținutul acestui material nu reprezintă în mod necesar
poziția oficială a Granturilor SEE 2014 – 2021. Întreaga răspundere asupra corectitudinii și coerenței informațiilor
prezentate revine inițiatorilor. Pentru informații oficiale despre Granturile SEE 2014-2021 accesați
www.eeagrants.org, www.eeagrants.ro și www.ro-sanatate.ms.ro.

Granturile SEE și Norvegiene

Working together for a green, competitive and inclusive Europe
GHID DE DIAGNOSTIC MICROBIOLOGIC - GENERALITĂȚI ..................................................................................... 2
DIAGNOSTICUL MOLECULAR MICROBIOLOGIC.......................................................................................................11
TESTAREA SENSIBILITĂȚII LA ANTIBIOTICE ..........................................................................................................21
GHID DE ASIGURAREA CALITĂȚII REZULTATELOR ÎN LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE .................... 74
DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC AL INFECȚIILOR SISTEMICE - HEMOCULTURA.........................................84
DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC AL INFECȚIILOR SISTEMULUI NERVOS CENTRAL................................. 103
INVESTIGAREA BACTERIOLOGICĂ A TRACTULUI RESPIRATOR SUPERIOR ȘI A CAVITĂȚILOR
CONEXE .................................................................................................................................................................. 114
DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC AL INFECȚIILOR TRACTULUI RESPIRATOR INFERIOR........................ 132
DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC AL INFECȚIILOR CUTANATE ȘI ALE PĂRȚILOR MOI ............................ 149
DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC AL INFECȚIILOR DE TRACT URINAR ........................................................ 163
DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC AL INFECȚIILOR INTRAABDOMINALE ..................................................... 178
DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC AL INFECȚIILOR OSTEOARTICULARE ...................................................... 182
DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC AL INFECȚIILOR GASTROINTESTINALE (CU EXCEPȚIA CELOR
CAUZATE DE CLOSTRIDIOIDES DIFFICILE).................................................................................................... 194
DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC AL INFECȚIILOR CU HELICOBACTER PYLORI .......................................... 201
DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC AL INFECȚIEI DETERMINATE DE CLOSTRIDIOIDES DIFFICILE .......... 208
DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC AL INFECȚIILOR GENITALE ........................................................................ 212
DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC AL INFECȚIILOR OCULARE.......................................................................... 229
DEPISTAREA PORTAJULUI DE GERMENI MULTIDROG REZISTENȚI (MDR)................................................. 238
CONTROLUL MICROBIOLOGIC AL MEDIULUI DE SPITAL .................................................................................. 242

1
 Ghid de diagnostic microbiologic - generalități

I. Scopul ghidului
Acest document reprezintă un ghid de diagnostic microbiologic, standardizare a testării și
a interpretării rezistenței la antibiotice, raportare selectivă şi secvenţială a rezultatelor
antibiogramei.
Rolul acestui ghid este de a îmbunătăți cunoștințele și atitudinea personalului medical cu
privire la investigațiile microbiologice, cu scopul evitării utilizării de primă intenţie a antibioticelor
restricţionate.
Acest document face parte dintr-un pachet de ghiduri şi protocoale, împreună cu ghidurile
de utilizare a antibioticelor pentru principalele sindroame infecțioase și pentru implementarea de
programe privind utilizarea judicioasă a antibioticelor în spitale.

II. Principiile diagnosticului microbiologic

Indicațiile examenului microbiologic

Examenul microbiologic se efectuează doar în cazul unor indicații bine stabilite, când
rezultatul poate influența atitudinea terapeutică.
Gestionarea adecvată a probelor biologice este cheia unui diagnostic precis de laborator,
afectează direct îngrijirea și evoluţia pacientului, influențează deciziile terapeutice, controlul
infecțiilor asociate asistenței medicale, durata de spitalizare și costurile generale de spitalizare. De
asemenea are un rol major în influențarea costurilor laboratorului, are un impact direct asupra
eforturilor de prescriere judicioasă a antibioticelor și în mod clar influențează eficiența
laboratorului. Cele mai bune rezultate pentru pacienți sunt rezultatul unor parteneriate puternice
între clinician și specialistul în microbiologie. Acest document ilustrează și promovează acest
parteneriat și subliniază importanța adecvării gestionării eșantionului în funcție de relevanța clinică
a rezultatelor.

Definirea colonizării, semnificația acesteia

Colonizarea nu reprezintă o infecție. Este un proces nepatogen în care are loc multiplicarea
microorganismelor pe suprafețele organismului gazdă – tegumente, mucoase precum nazală,
conjunctivală, oro-faringiană şi la poarta de intrare a tractului urogenital, respirator, digestiv - fără
a determina alterări morfo-funcționale ale țesuturilor, o reacție imună, o simptomatologie clinică
evident detectabilă. Suprafețele gazdei sunt colonizate de către microorganisme comensale și
mutualiste care nu aduc un prejudiciu definit. Aceste microorganisme de colonizare formează
microbiota indigenă și în anumite situații pot produce infecții.

2
Definirea contaminării
În microbiologie contaminarea reprezintă prezența germenilor pe suprafețe inerte sau ale
organismului uman, situație în care reacțiile tisulare locale sau imune sunt absente, bacteria fiind
prezentă o durată scurtă de timp.
Contaminarea unui produs biologic se referă la introducerea unor microorganisme în cursul
recoltării, care nu erau prezente în produs (de exemplu, contaminarea cu floră tegumentară a
hemoculturilor, contaminarea cu flora tractului respirator superior a probelor recoltate din tractul
respirator inferior, contaminarea urinii cu bacterii din uretra distală, etc.). Acestea pot cauza
rezultate fals pozitive.
În organism se delimitează zone normal sterile (mediul intern, țesuturile, cavitățile
seroase), zone normal necolonizate deși contaminate ocazional sau periodic (sinusurile paranazale,
urechea medie, etajul infraglotic al căilor respiratorii, căile biliare, căile genitale interne, vezica
urinară, stomacul, duodenul), și zone normal colonizate (colonul și ileonul terminal, căile aero-
digestive superioare, uretra distală, vaginul, tegumentul).

Agentul etiologic al unei infecții

Semnificația clinică a microorganismelor depistate într-un prelevat se face în funcție de:
- condiția microbiologică a prelevatului,
- patogenitatea și raporturile izolatului cu microbiota indigenă,
- contextul clinic,
- reactivitatea antiinfecțioasă a pacientului.
În cazul prelevatelor normal sterile (hemocultură, lichide de puncție): însăși prezența în
aceste prelevate conferă microorganismelor depistate semnificație clinică. Excepție fac
microorganismele accidental patogene rezidente ale tegumentelor care necesită argumente
suplimentare.
În cazul prelevatelor contaminate pe traiectele de eliminare naturală (secrețiile din tract
respirator inferior în principal sputa, urina din jet mijlociu, plăgi superficiale sau prelevate
subcutanate, prelevate cu tamponul din urechea medie): izolarea unor microorganisme patogene
sau oportuniste străine microbiotei indigene a traiectelor de eliminare are semnificație clinică (ex:
Mycobacterium tuberculosis în spută). Semnificația clinică a microorganismelor oportuniste care
contaminează uzual aceste prelevate trebuie argumentată prin criterii suplimentare:
- Criteriul izolării cantitative în cultură
- Criteriul asocierii semnificative cu celulele inflamatorii la examenul citobacterioscopic.
În cazul prelevatelor din zone normal colonizate (tegumente, mucoase, materii fecale):
identificarea integrală a izolatelor din asemenea probe este inutilă. Se urmăresc numai principalele
microorganisme care pot cauza un anumit sindrom clinic (ex. Streptococcus pyogenes din exsudat
faringian, Streptococcus agalactiae din secreția vaginală, salmonele, shigele din materii fecale).

3
III. Recoltarea și transportul probelor biologice
Selectarea și colectarea probelor de microbiologie sunt responsabilitatea personalului
medical, mai puțin a laboratorului, deși specialistul de Microbiologie poate și trebuie să fie apelat
pentru consultare. Personalul medical trebuie să consulte laboratorul pentru a se asigura că
indicația de recoltare, selecția produsului adecvat, prelevarea, transportul și depozitarea probelor
pe care le recoltează sunt gestionate corespunzător.
Manualul de recoltare al laboratorului de microbiologie trebuie să fie disponibil în orice
moment, pentru ca întregul personal medical să îl poată consulta.
Acest lucru poate facilita colaborarea dintre laborator, cu specialiștii din microbiologie și
personalul care se ocupă de colectarea probelor. Îngrijirea pacientului este un efort de echipă. Dacă
managementul probei, de la selectarea celui mai potrivit produs biologic până la transportul corect
la laborator nu este efectuat corect, contribuția laboratorului la diagnostic este minimă sau chiar
absentă.

Principii generale de recoltare

Selectarea prelevatului reprezentativ

Prelevatele de calitate proastă sau care nu sunt reprezentative pentru sindromul infecțios
investigat trebuie respinse de către laborator. Microbiologul trebuie să sune imediat medicul
clinician și să clarifice situația respectivă. Rezultatele obținute de laborator din asemenea probe
pot fi înșelătoare și pot duce la diagnostice eronate și la tratamente necorespunzătoare. Medicii
clinicieni nu trebuie să ceară laboratorului să raporteze ,,tot ce crește” sau să solicite investigații
microbiologice în lipsa semnelor de infecție (de exemplu: urocultură la pacienții cu sondă urinară
asimptomatici, vârf de cateter intravascular în lipsa suspiciunii unui sepsis).
În principiu laboratorul are nevoie de produsul respectiv, nu de tamponul din produsul
respectiv.
Prelevatele examinate trebuie să conțină realul produs patologic. Distribuția
microorganismelor în probele de spută, materii fecale, exsudate de pe suprafața mucoaselor sau
din plăgi este neuniformă. Trimiterea la laborator a salivei în loc de spută, a tamponului cu salivă
în loc de exsudat din fosele amigdaliene, a unor porțiuni nereprezentative dintr-un scaun muco-
sanguinolent duce la un răspuns inutil din partea laboratorului. Sputa nu este cel mai reprezentativ
produs biologic pentru diagnosticul pneumoniei bacteriene. Agentul etiologic este mai probabil
izolat din hemocultura, lavaj bronhoalveolar sau aspirat transtraheal.
Criterii de respingere a probelor destinate examinării microbiologice:
- Probe neetichetate sau etichetate greșit
- Probe primite în recipient necorespunzător, distrus sau neetanș
- Probe vizibil contaminate (ex. spută cu resturi alimentare)
- Probe care nu au fost păstrate în condițiile recomandate și/sau transportul a fost întârziat (Ex.
urină peste 1 oră la temperatura camerei)
- Probe cu solicitări necorespunzătoare

4
- Probă în cantitate insuficientă pentru solicitările făcute
- Probă necorespunzătoare pentru cererea de analize microbiologice (de ex. probă transportată
în sistem aerob cu solicitare de cultură anaerobi)
- Probă identică cu o altă probă primită în aceeași zi, cu solicitări identice, fără să existe o
precizare clară a diferenței dintre ele (excepție hemocultura, cu precizarea că flacoanele
recoltate de pe cateter trebuie identificate ca atare).
Probe care aduc informații microbiologice discutabile. Sunt 2 categorii:
A. se solicită în schimb recoltare de țesut sau aspirat din leziune:
- Tampon mucoasa orală sau periodontal
- Tampon leziune decubitus
- Tampon ulcer varicos
- Tampon leziune prin arsură
- Tampon leziune gangrenoasă superficială
- Tampon perirectal
B. probe care nu se prelucrează pentru examinări microbiologice:
- Conținut intestinal
- Lichid de vărsătură
- Vârf cateter Foley
- Material de la colostomă
- Lohii
- Aspirat gastric de la nou-născuți.

Momentul recoltării
Alegerea momentului optim al recoltării presupune cunoașterea evoluției și fiziopatologiei
procesului infecțios. Ritmul prelevărilor influențează sensibilitatea diagnosticului și relația cost-
beneficiu. De exemplu: sputa recoltată dimineața, prima urină de dimineață, 2-3 seturi de
hemoculturi în prima zi de internare.
Recoltarea se face înaintea instituirii tratamentului antimicrobian. Probele obținute sub
antibioterapie nu pot fi respinse deoarece uneori antibioticul nu realizează concentrații inhibitorii
în focarul infecțios și microorganismul poate fi izolat după ce inoculul a fost diluat în mediul de
cultură. Se va menționa pe cererea de examen microbiologic antibioticul administrat. Raportul
final eliberat de laborator trebuie să conțină informații referitoare la posibile interferențe.

Recoltare în condiții de asepsie

Trebuie prevenită sau redusă contaminarea probelor cu microbiota indigenă din secreții,
exsudate, țesuturi sau organe învecinate.

5
 Se poate recurge la prelevări care șuntează căile naturale de eliminare (aspirat transtraheal
sau puncție suprapubiană), care însă sunt tehnici agresive.

Cantitatea recoltată
Probele trebuie prelevate în cantitate suficientă, astfel încât să se poată efectua toate
examinările necesare.

Recipiente pentru recoltare

Recipientele folosite la recoltare trebuie să fie sterile, de unică utilizare, cu închidere
etanșă.
Prelevarea pe tampon este contraindicată pentru izolarea bacteriilor anaerobe.
Recoltarea probelor bioptice sau a aspiratelor din colecții este preferată recoltării pe
tampon din următoarele motive:
- tamponul prelevă o cantitate foarte mică de produs, astfel că examinările microbiologice sunt
reduse în funcție de cantitatea de material disponibilă
- în cursul prelevării cu tamponul acesta se poate contamina cu flora microbiană din vecinătate
din cauza firișoarelor mici de vată
- materialul din tampon poate fi toxic pentru unele bacterii
- în cazul în care prelucrarea probelor este întârziată, bacteriile supraviețuiesc mai bine în proba
bioptică sau în aspirat decât pe tampon;

Cererea de analize
Scopul cererii de analize este de a oferi laboratorului informații importante necesare pentru
prelucrarea probei și pentru interpretarea rezultatului. De fapt, toată activitatea laboratorului
depinde de informațiile cuprinse în cererea de analize. Cu cât informațiile sunt mai puține, cu atât
este mai dificilă interpretarea rezultatelor.
Cererea de analize trebuie sa conțină:
- numele și prenumele pacientului, vârstă, sex
- codul numeric de identificare a pacientului
- adresa, secție, salon
- informații legate de solicitarea clinicianului
- informații legate de locul anatomic de unde a fost recoltată proba
- data și ora recoltării
Alte informații necesare pentru laborator:
- diagnosticul clinic, date clinice relevante, condiția fiziologică a pacientului (de ex. sarcina),
existența unei afecțiuni concomitente, statusul imun, risc de infecție cu un microorganism
potențial epidemic

6
- scopul analizei: diagnosticul etiologic al unei infecții, testarea pentru un microorganism
anume, screening pentru colonizare, monitorizarea unui tratament, control după tratament
- date relevante din istoricul pacientului (alimentație, stil de viață, călătorii, etc.)
- proceduri speciale folosite pentru obținerea probei
- tratament cu antibiotice cu precizarea moleculelor/claselor de antibiotic, data și ora ultimei
administrări
- marcarea probelor care necesită prelucrare urgentă, în funcție de protocoalele instituției
- precizarea posibilei prezențe a unui agent infecțios cu patogenitate deosebită (Mycobacterium
tuberculosis, etc.) sau suspiciunea unei etiologii rare sau neobișnuite care ar necesita condiții
de cultivare diferite de cele utilizate de rutină.
Atunci când nu există date clinice, microbiologul poate decide să refuze prelucrarea unei
probe care nu a fost recoltată printr-o procedură invazivă și dacă pacientul nu se află într-o stare
critică.
În situația unei urgențe, atunci când sunt solicitate investigații speciale, clinicianul ar trebui
să comunice direct cu microbiologul.

Transport
Probele pentru microbiologie conțin microorganisme vii care se multiplică și mor foarte
rapid. Dacă ele se multiplică sau mor în timpul recoltării, transportului sau depozitării, proba
respectivă nu mai este reprezentativă pentru procesul infecțios investigat.
Toate probele trebuie să fie transportate cât mai repede la laborator, preferabil în 2 ore de
la recoltare. Dacă transportul este întârziat, probele pot fi păstrate numai în condiții specifice. În
general depozitarea probelor destinate culturilor bacteriene nu se face mai mult de 24 ore.
Virusurile pot fi stabile până la 2-3 zile la 4 °C.
Timpul optim de transport diferă în funcție de cantitatea de probă:
- Cantitățile mici se trimit în 15-30 minute
- Probele bioptice pot fi ținute la 24 ore la 25 °C într-un sistem de transport anaerob.
NU se refrigerează: lichidul cefalorahidian, secrețiile genitale, secrețiile oculare, aspiratele
din urechea internă, alte probe care ar putea conține microorganisme sensibile la temperaturi joase,
bacterii strict anaerobe.
Recipientele trebuie să fie etichetate corect.
Rezultatele diagnosticului bazat pe cultivare sunt influențate de tratamentele antibiotice în
curs, care afectează viabilitatea bacteriilor. De asemenea condițiile de transport au un rol important
în succesul cultivării.

IV. Metode de diagnostic bazate pe cultivare

Probele se vor lucra în condiții de biosiguranță de nivel 2.

7
 Procedurile de laborator generatoare de aerosoli trebuie efectuate în hotă de siguranță
microbiologică (cu flux laminar clasa II A), cu excepția cazului în care este implicat un
microorganism din grupul de risc 3 (ex. în cazul manipulării culturilor de Mycobacterium spp. sau
Salmonella Typhi sau Salmonella Paratyphi A, B și C) situație în care trebuie utilizate echipamente
și proceduri adecvate acestui nivel.
Cultivarea bacteriilor în microbiologia clinică are drept scop:
- Izolarea lor din produsele patologice
- Identificarea
- Testarea sensibilității la antibiotice
La primirea probelor în laborator, microbiologul hotărăște:
- mediile de cultură și metodele de izolare
- atmosfera, temperatura și intervalul de timp de incubare necesare pentru izolarea
microorganismelor cu semnificație clinică
- semnificația clinică a izolatelor, algoritmul de identificare.
Pentru fiecare categorie de prelevat se utilizează uzual un mediu sau un set de medii care
permit izolarea bacteriilor cel mai frecvent implicate în infecțiile zonei respective. În funcție de
datele clinico-epidemiologice, aceste medii pot fi suplimentate.
Identificarea bacteriilor se poate face prin metode convenționale (pe baza caracterelor
morfotinctoriale și biochimice, a structurii antigenice și prin testele de patogenitate), însă acestea
au putere discriminativă limitată. Se recomandă utilizarea unor sisteme de identificare
automatizate sau MALDI-TOF care permit o identificare mai exactă și rapidă a izolatelor.
Testarea sensibilității trebuie făcută numai pe izolate semnificative clinic, nu pe toate
microorganismele izolate în cultură.
Se recomandă păstrarea culturilor pure ale izolatelor semnificative cel puțin trei zile după
eliberarea rezultatului final în vederea posibilității repetării sau extinderii ulterioare a unor analize.
Tulpinile bacteriene neidentificabile trebuie conservate și trimise pentru identificare la
laboratoarele cu capacitate diagnostică mai mare. De asemenea se recomandă păstrarea izolatelor
cu fenotip neașteptat, cu fenotip MDR/XDR/PDR sau de importanță epidemiologică (de exemplu
cele implicate într-un focar) cel puțin un an.
Conservarea tulpinilor se poate face prin însămânțare în medii agarizate păstrate la frigider
timp de câteva săptămâni. Germenii nepretențioși pot fi păstrați în bulion nutritiv cu substanțe
crioprotectoare (glicerină 15%) la -20℃. Pentru conservare mai sigură și pe termen lung, inclusiv
a bacteriilor pretențioase, se recomandă congelare la temperaturi de sub -70℃.

V. Metode de detectare a antigenelor

Metodele ce detectează antigenele sunt larg utilizate în domeniul microbiologiei. Acestea
pot fi utilizate pe parcursul diagnosticului bacteriologic în scopul identificării unui patogen din
cultură bacteriană sau ca și metodă de diagnostic rapid direct din produsul biologic.

8
 La baza acestor metode stau reacțiile antigen-anticorp, iar în funcție de modul în care se
evidențiază formarea complexului imun (=reacție pozitivă, antigen prezent) pot fi clasificate în:
a. Metode în care complexul imun se vizualizează cu ochiul liber:
- reacția de aglutinare pe lamă utilizată pentru stabilirea serogrupului/serotipului
bacterian
- reacțiile de aglutinare pe suport, latexaglutinarea - (ex. identificarea Staphylococcus
aureus, stabilirea grupelor Lancefield la streptococi, determinarea fenotipului MRSA
prin evidențierea prezenței PBP2a la S. aureus, identificarea unor patogeni implicați în
meningite bacteriene, etc.)
b. Metode în care formarea complexului imun se evidențiază:
- cu ajutorul unei reacții enzimatice (metodele imunoenzimatice efectuate în godeu sau
pe membrană)
- cu utilizarea unui anticorp marcat cu fluorocrom și evidențierea fluorescenței din
complexul imun format (imunofluorescență)
- pe baza unei reacții chimice (chemiluminiscență).
Aceste metode au performanțe bune, însă necesită aparatură specială. Excepție fac
metodele imunoenzimatice efectuate pe membrană (metode imunocromatografice), care se pot
efectua rapid fără necesitatea unei infrastructuri de laborator. Din aceste considerente sunt utile în
diagnosticul rapid al infecțiilor, însă trebuie avută în vedere performanța lor foarte variată în
funcție de produs. În general, aceste metode au sensibilitate redusă și specificitate acceptabilă.
Astfel, un rezultat pozitiv documentează, pe când un rezultat negativ nu exclude infecția.
Metodele imunocromatografice au multiple aplicații în bacteriologie (determinarea
antigenelor de Streptococcus pyogenes din secreția faringiană, detectarea antigenelor de
Legionella pneumophila și Streptococcus pneumoniae din urină, detectarea antigenelor de
Campylobacter spp, Helicobacter pylori, a toxinelor de Clostridioides difficile din materii fecale,
etc.) în diagnosticul parazitologic și virusologic.

VI. Metode bazate pe teste moleculare

Sensibilitatea și specificitatea superioare altor metode de diagnostic, precum și timpul scurt
necesar pentru obținerea rezultatelor reprezintă argumentele pentru care tehnicile moleculare și în
special cele bazate pe amplificarea acizilor nucleici (PCR) sunt în prezent utilizate pe scară largă
în laboratoarele de microbiologie la nivel european. Aceste teste se dezvoltă și se adaptează
continuu la necesitățile diagnosticului microbiologic, fiind capabile să ofere simultan și rapid (ore)
informații privind prezența unor variați agenți microbieni în diverse probe biologice (diagnostic
sindromic), eventual și a unor markeri genetici de rezistență la antimicrobiene. Limitele acestor
metode sunt în principal cele determinate de costurile echipamentelor și instruirea personalului
specializat, resurse necesare inițial care pot fi recuperate printr-o utilizare cost-eficientă a testelor
moleculare.

9
VII. Raportarea rezultatelor
Rezultatele raportate de laboratorul de microbiologie trebuie să fie exacte, semnificative și
relevante din punct de vedere clinic.

VIII. Bibliografie
Buiuc D: Logica microbiologiei clinice. In Buiuc D, Neguț M: Tratat de microbiologie
clinică. Ediția a III-a, Editura Medicală, 2017: 2-34.
Miller JM, Miller SA: Communicating Laboratory needs. In Miller JM, Miller SA: A guide
to specimen management in clinical microbiology. 3rd edition, ASM Press, 2017:8-11.
Pascual A, Peigue-Lafeuille H: The principles of microbiological work and good
laboratory practices. In European Manual of Clinical Microbiology, editors Cornaglia G, Courcol
R, Hermann JL, Kahlmeter G, Publisher SFM, 2012:21-28.
Roberts L: Specimen collection and processing. In Mahon CR, Lehman DC, Manuselis G:
Textbook of diagnostic microbiology. 5th edition, Saunders Elsevier, 2015:111-120.

10
 Diagnosticul molecular microbiologic

I. Introducere
Tehnicile moleculare și în special cele bazate pe amplificarea acizilor nucleici sunt în
prezent utilizate pe scară largă în laboratoarele de microbiologie, atât pentru diagnosticarea și
monitorizarea pacienților cu boli infecțioase, cât și în investigațiile epidemiologice. Numeroasele
progrese din domeniul amplificării acizilor nucleici, precum automatizarea tehnologiei sau
posibilitatea de a detecta simultan mai multe ținte (multiplexare), au creat noi oportunități de
dezvoltare a laboratoarelor de microbiologie în direcția obținerii de rezultate relevante clinic într-
un timp cât mai scurt.
O prezentare extinsă a numeroaselor și variatelor metode moleculare existente ar depăși
scopul acestui ghid, de aceea capitolul de față va prezenta succint principalele metode moleculare
și unele aplicații ale acestora utilizate în microbiologia clinică; dintre acestea cele bazate pe
amplificarea acizilor nucleici prin PCR (polymerase chain reaction) au performanțele cele mai
bune și sunt cele mai utilizate în practică.

II. Metode bazate pe detecția acizilor nucleici

Metode fără amplificare

Aceste metode de hibridizare utilizează sonde oligonucleotidice, care sunt secvențe ADN
sau ARN marcate cu o enzimă sau o moleculă chemiluminiscentă. Sondele se cuplează prin
complementaritate (hibridizează) cu secvențe țintă din genomul microorganismelor căutate;
nivelul taxonomic la care se realizează identificarea depinde de secvențele țintă alese de
producătorul sondelor. Lungimea sondelor și cuplarea prin complementaritate asigură o
specificitate bună, dar lipsa amplificării explică sensibilitatea redusă a truselor bazate pe
hibridizarea sondelor nucleotidice. De aceea utilizarea acestor truse este limitată în special la
identificarea din cultură (de exemplu pentru micobacterii sau fungi dimorfi) și din acele probe
biologice în care numărul microorganismelor este mare (ex. angina streptococică). Hibridizarea
sondelor se poate realiza în fază lichidă, solidă sau in situ. Hibridizarea in situ este un tip de
hibridizare în fază solidă în care acizii nucleici țintă se găsesc în celule fixate pe o lamă de
microscop (ex. țesut fixat în formol și inclus în parafină).
Sondele de tip peptide nucleic acid (PNA) au o structură diferită de sondele ADN prin aceea
că este înlocuită “coloana vertebrală” electronegativă a ADN, formată din deoxiriboze unite prin
legături fosfodiesterice, cu poliamidă (peptide). Deoarece sondele PNA sunt neutre electric ele
hibridizează mai rapid și mai intens comparativ cu sondele ADN. Tehnica PNA-FISH (PNA
fluorescent in situ hybridization), care utilizează sonde PNA ce recunosc secvențe ARNr, permite
identificarea din hemocultura pozitivă a anumitor specii (S. aureus, stafilococi coagulazo-negativi,
Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, specii
de Candida) cu ajutorul unui microscop cu fluorescență.

11
Metode cu amplificare
Au o sensibilitate analitică mai bună comparativ cu metodele fără amplificare. Metoda de
amplificare prin PCR a acizilor nucleici are performanțele cele mai bune și de aceea este cea mai
utilizată, dar există și alte categorii de metode, precum amplificarea semnalului sau amplificarea
izotermă a acizilor nucleici.

Metode bazate pe amplificarea semnalului

Atașarea pe secvența țintă a unui număr crescut de molecule marcate (deci amplificarea
semnalului emis) explică de ce aceste metode au o sensibilitate analitică mai bună comparativ cu
metodele fără amplificare. Aceste metode nu realizează amplificarea enzimatică a secvențelor
țintă, de aceea sunt mai puțin afectate de prezența unor inhibitori în proba biologică. De asemenea
pot detecta direct ARN, fără a fi necesară etapa intermediară de sinteza a ADN-ului complementar.

Metoda cu ADN ramificat (branched DNA, bDNA)

Metoda constă într-o hibridizare în fază solidă de tip sandwich, care include molecule cu rol
de amplificare a semnalului. Acestea sunt molecule de ADN ramificat (cu până la 15 ramuri
identice) care se cuplează cu sondele oligonucleotidice specifice secvențelor țintă și vor fixa la
rândul lor mai multe sonde marcate enzimatic (câte trei pentru fiecare ramură), astfel fiind
amplificat semnalul. Există truse comerciale bazate pe metoda bDNA pentru cuantificarea HIV,
HBV, HCV.

Hybrid Capture
În această metodă ADN-ul țintă din proba biologică este denaturat, apoi este hibridizat cu
sonde ARN specifice. Moleculele hibrid ADN-ARN sunt captate de anticorpi antihibrid fixați pe
un suport solid și vor cupla la rândul lor anticorpi antihibrid marcați enzimatic. Deoarece fiecare
hibrid poate cupla mai mulți anticorpi marcați are loc amplificarea semnalului. Truse comerciale
care se bazează pe acestă metodă se folosesc pentru detecția HPV, N. gonorrhoeae, C. trachomatis
în probe biologice.

Metode bazate pe amplificarea țintei

Aceste tehnici se bazează pe procese mediate enzimatic prin care se sintetizează un număr
foarte mare de copii ale unei anumite regiuni din acidul nucleic țintă. Pentru inițierea sintezei sunt
necesari primeri (secvențe oligonucleotidice) care recunosc și se cuplează prin complementaritate
cu anumite secvențe de pe fiecare dintre cele două catene ADN. În cursul unui ciclu de sinteză se
obțin copii ale regiunii țintă, care pot deveni matrițe pentru noi sinteze în următoarele cicluri. După
1-3 ore, timp în care are loc repetarea de zeci de ori a ciclurilor de sinteză, se obțin zeci de milioane
până la miliarde de copii ale regiunii țintă. Această amplificare exponențială a țintei explică
sensibilitatea crescută a acestor tehnici comparativ cu celelalte metode moleculare, dar și unul
dintre principalele riscuri ale acestor tehnici: contaminarea cu produși de amplificare și obținerea
de rezultate fals-pozitive. Acest risc potențial de contaminare poate fi redus și trebuie permanent
ținut sub control prin măsuri specifice, care încep cu modul de organizare a laboratorului și
continuă cu respectarea anumitor circuite și proceduri (vezi 3.1).

12
 Reacția de amplificare PCR (Polymerase chain reaction)
Tehnica PCR este o metodă termo-enzimatică prin care se realizează sinteza repetitivă de
copii ale unei regiuni din ADN-ul țintă folosind ADN-polimeraza. În forma sa cea mai simplă
această tehnică, realizată cu ajutorul unui aparat PCR, constă în denaturarea inițială a amestecului
de reacție, urmată de realizarea unui număr de cicluri PCR (obișnuit 30-40). Un ciclu PCR
cuprinde trei etape: denaturarea, hibridizarea primerilor și elongarea. În cursul denaturării
amestecul de reacție este încălzit pentru a separa cele două catene ADN, fiecare dintre acestea
fiind utilizată ca matriță în etapele următoare. Amestecul este apoi răcit până la temperatura la care
se realizează cuplarea primerilor cu secvențe specifice din cele două catene. În a treia etapă
amestecul este adus la temperatura optimă pentru activitatea ADN-polimerazei, enzimă care va
realiza extensia primerilor și sinteza unei noi catene, complementare catenei inițiale. Atât catenele
nou sintetizate cât și ADN-ul inițial pot servi ca matriță pentru sinteză în ciclurile următoare. La
sfârșitului fiecărui ciclu PCR se dublează (teoretic) numărul produșilor de amplificare, astfel încât
după n cicluri se obține o amplificare de 2n. Întregul proces este desfășurat într-un aparat PCR,
care asigură cu precizie temperatura și durata fiecărui segment din ciclu, precum și numărul de
cicluri.
Ideal după 30 cicluri apare o amplificare de 230, adică de aproximativ 109 ori a regiunii țintă.
Practic eficiența amplificării poate fi redusă din cauza unor condiții de reacție suboptime sau
prezenței unor substanțe cu efect de inhibare a reacției. Această ultimă situație, care ar putea duce
la rezultate fals-negative, trebuie permanent monitorizată și ținută sub control prin respectarea unor
proceduri specifice în etapele de extracție și amplificare a acizilor nucleici (vezi 3.2).
Detecția produșilor de amplificare poate avea loc după terminarea PCR (end-point PCR) sau
în timpul amplificării (real-time PCR).

Revers-transcriere PCR
Tehnica PCR permite amplificarea unei ținte ADN. Dacă ținta este ARN este nevoie de
revers-transcriere PCR (RT-PCR), metoda care are o etapă inițială de revers-transcriere a ARN
țintă în ADN complementar (ADNc), urmată de amplificarea prin PCR a acestui ADNc. Aceste
etape pot avea loc consecutiv, în același tub de reacție, sau independent (în reacții separate).

Nested PCR
Constă în două runde de PCR și două perechi de primeri. În prima rundă se utilizează o
pereche de primeri și 15-30 cicluri de amplificare, iar în a doua rundă a doua pereche de primeri
recunoaște o secvență din interiorul produșilor de amplificare obținuți în prima rundă, astfel fiind
obținute creșterea sensibilității și specificității PCR.

Multiplex PCR
Se folosește pentru amplificarea simultană a mai multor secvențe țintă în același tub de
reacție. Necesită utilizarea unor perechi de primeri atent selecționați, astfel încât aceștia să aibă
aceeași temperatură de hibridizare și să nu fie complementari. Numărul de ținte care pot fi
identificate prin același test variază (de la 3 la peste 20), în special în funcție de metoda de detecție
a produșilor de amplificare. În practică testele bazate pe multiplex PCR se utilizează frecvent în
diagnosticul unor sindroame (de exemplu în infecții ale sistemului nervos, respiratorii sau

13
digestive) deoarece permit identificarea rapidă și simultană a mai multor microorganisme, eventual
și a unor factori de patogenitate sau markeri de rezistență la antibiotice direct din probe biologice.

Real-time PCR
În tehnica real-time PCR detecția produșilor de amplificare este realizată în timp real, în
fiecare ciclu. Acest fapt este posibil deoarece produșii de amplificare generați se cuplează (direct
sau indirect) cu fluorocromi care vor emite o fluorescență specifică. Tehnica necesită echipamente
speciale (de real-time PCR) care față de echipamentele PCR au în plus un modul optic (care
măsoară cu precizie intensitatea emisiei fluorescente în momente precis definite pentru fiecare
reacție), precum și un software care transformă aceste semnale în informații privind cinetica
fiecărei reacții. Curba de amplificare este un grafic al intensității fluorescenței în funcție de timp
(ciclu), un parametru util fiind ciclul prag (Cycle threshold, Ct), adică acel ciclu la care intensitatea
fluorescenței depășește un anumit nivel prag (adică există o creștere semnificativă a fluorescenței).
În cazul testelor calitative depășirea acestui prag corespunde detectării țintei (rezultatul se exprimă
ca: țintă detectată). În cazul testelor cantitative este necesară compararea valorii Ct pentru probă
cu valorile Ct ale unor standarde de concentrații cunoscute, intensitatea fluorescenței emise fiind
direct proporțională cu numărul de copii ale regiunii țintă.
În formatul cel mai simplu al real-time PCR produșii de amplificare sunt detectați pe măsură
ce se formează datorită cuplării acestora cu un colorant fluorescent (de exemplu SYBR green), cu
afinitate pentru ADN dublu catenar (ADN d.c.). Fluorescența emisă de fluorocromul cuplat fiind
mult mai mare decât cea a fluorocromului liber, intensitatea fluorescenței este direct proporțională
cu numărul produșilor PCR. Deoarece SYBR green are afinitate pentru orice moleculă ADN d.c.
(de exemplu produși de amplificare specifici, produși nespecifici, dimeri de primeri) specificitatea
acestui format de real-time PCR poate fi afectată; creșterea specificității se poate obține prin
analize suplimentare (de exemplu analiza corelației dintre intensitatea fluorescenței și temperatură
– melting curve). Acest tip de detecție nu poate fi folosit pentru teste multiplex.
Specificitatea real-time PCR poate fi crescută prin adăugarea în amestecul de reacție a unor
sonde oligonucleotidice. Fiecare sondă recunoaște specific o anumită regiune dintr-un produs de
amplificare și este marcată cu un anumit fluorocrom, creșterea fluorescenței emise de acel
fluorocrom fiind un indicator al generării produsului de amplificare. Detecția simultană a mai
multor produși real-time PCR este posibilă dacă se utilizează sonde specifice fiecărui produs și
fiecare sondă este marcată cu alt fluorocrom, acest format real-time PCR fiind utilizat de unele
teste multiplex. Există mai multe tipuri de sonde, dar descrierea caracteristicilor lor depășește
scopul acestui ghid.
Tehnica real-time PCR prezintă numeroase avantaje. Deoarece amplificarea și detecția au
loc în același tub închis, nu este nevoie de etape post-PCR, deci timpul este mai redus și se elimină
riscul de contaminare cu produși PCR. Real-time PCR are o sensibilitate crescută comparativ cu
end-point PCR și permite o cuantificare exactă a concentrației inițiale a țintei, deoarece măsoară
produșii în faza exponențială a amplificării. Testele multiplex sunt uneori de tip real-time PCR,
dar suprapunerea spectrelor de emisie ale fluorocromilor limitează capacitatea de multiplexare
(numărul de ținte) de obicei la patru.

14
 Alte metode bazate pe amplificarea țintei

Metode bazate pe transcriere

Aceste metode au în comun amplificarea izotermă a ARN prin următoarele etape mediate
enzimatic: revers-transcrierea ARN, formarea unui hibrid ARN-ADNc, degradarea catenei
originale de ARN, generarea de ADN d.c., utilizarea ADNc ca matriță pentru generarea multor
copii ARN, produși care la rândul lor pot reintra în ciclul de amplificare. Aceste metode izoterme
au avantajul că nu necesita echipamente PCR. Exemple din această categorie de metode sunt
NASBA (nucleic acid sequence-based amplification) și TMA (transcription-mediated
amplification).
Amplificarea în buclă (loop mediated amplification, LAMP) este o metodă izotermă de
amplificare prin care se creează molecule de ADN cu multiple bucle ce conțin repetări ale
secvenței țintă. Detecția produșilor de amplificare se poate face în timp real prin măsurarea
turbidității în tubul de reacție. Principalul avantaj al acestei metode este acela că nu necesită
echipamente complexe, ci poate fi utilizată cu echipamente simple, în condiții de teren. Totuși
această metodă are performanțe mai reduse comparativ cu alte metode și de aceea este puțin
utilizată în practică.

Detecția și analiza produșilor de amplificare

Detecția și analiza produșilor de amplificare se pot face pe măsură ce produșii se generează
(real-time PCR) sau după etapa de amplificare (detecție post-PCR). Există mai multe metode
pentru detecția post-PCR a produșilor de amplificare: electroforeză în gel de agaroză, hibridizare
cu sonde cu specificitate alelică, secvențiere, hibridizare cu sonde fixate pe microarray (de
densitate mică sau moderată).

Electroforeza în gel
Vizualizarea produșilor de amplificare după separare electroforetică și marcare cu bromură
de etidiu a fost prima metodă de detecție și este încă utilizată în unele tehnici. În prezent există și
metode automate de evidențiere a produșilor prin electroforeză.
Analiza fragmentelor de restricție (restriction fragment length polymorphism, RFLP) este
utilizată în cazul unor investigații epidemiologice și constă în scindarea cu endonucleaze de
restricție a produșilor de amplificare, urmată de separarea fragmentelor prin electroforeză și
analiza acestora.

Hibridizarea cu sonde cu specificitate alelică

În această tehnică (Line probe assay, LIPA) sonde oligonucleotidice atașate pe stripuri
imobilizează produși PCR marcați cu biotină. Deoarece această reacție se desfășoară în condiții
stringente, sondele hibridizează doar produșii cu secvență perfect complementară, putând
discrimina polimorfisme la nivelul unui singur nucleotid. Etapele ulterioare hibridizării permit
vizualizarea produșilor imobilizați și oferă informații despre secvența acestora.
Truse comerciale care utilizează această tehnică se folosesc pentru genotiparea HCV, HPV,
HBV, pentru identificarea micobacteriilor și pentru identificarea mutațiilor de rezistență la HBV
sau la Mycobacterium tuberculosis.

15
 Secvențierea acizilor nucleici
Determinarea unei anumite secvențe ADN dintr-o probă clinică poate fi necesară în scop
diagnostic sau epidemiologic și se poate realiza prin PCR și secvențierea produșilor prin metoda
Sanger. Acestă metodă constă în generarea unor fragmente ADN de mărimi diferite, datorită
încorporării aleatorii de către ADN-polimerază a unor dideoxinucleotid e (ddNTP) care vor bloca
elongarea catenei (dideoxynucleotide chain termination). Aceste fragmente marcate fluorescent
sunt apoi separate prin electroforeză capilară, trec printr-un fascicul laser, iar înregistrarea
fluorescenței corespunzătoare fiecărui ddNTP și procesarea digitală a acestor semnale oferă
informații despre secvența ADN. Secvențierea automată Sanger generează secvențe de calitate
pentru regiuni de până la 800 perechi de baze (bp). Pentru secvențierea unei regiuni mai lungi sunt
necesare amplificarea separată a mai multor segmente din acea regiune, secvențierea fiecărui
segment în parte și asamblarea citirilor.
Secvențierea de nouă generație permite caracterizarea unor regiuni mai largi (până la
mărimea întregului genom microbian) și poate fi aplicată în multiple domenii: identificare
microbiană, identificarea unor variante asociate cu patogenitate crescută sau cu mutații de
rezistență, detecția unor mutații rare într-o populație microbiană, studierea microbiotei,
caracterizarea filogenetică în cursul unor investigații de epidemiologie moleculară și altele. Există
mai multe platforme pentru secvențierea de nouă generație (Illumina, Ion Torrent, Nanopore etc.)
dar descrierea lor depășește scopul acestui ghid.

III. Cerințe specifice laboratorului de diagnostic molecular

Laboratoarele clinice care vor să utilizeze tehnici de diagnostic molecular trebuie să respecte
cerințe specifice acestui tip de diagnostic. Aceste cerințe urmăresc în principal prevenirea și
controlul contaminării cu acizi nucleici, risc care decurge din sensibilitatea analitică foarte mare a
metodelor de amplificare a țintei. Aceste cerințe specifice se regăsesc în fiecare dintre etapele
diagnosticului: preanalitică (recoltare, stocare, procesare primară a probelor), analitică (protocoale
de lucru, asigurarea calității) și post analitică (interpretarea rezultatelor, manipularea deșeurilor).
O altă cerință specifică laboratorului de diagnostic molecular este prevenirea contactului acizilor
nucleici țintă cu enzime care îi pot degrada (DNAze sau RNAze). Aceste cerințe impun măsuri
specifice diagnosticului molecular, precum organizarea activității în mai multe etape și zone
distincte, respectarea fluxului unidirecțional de activitate, respectarea strictă a unor protocoale de
lucru, utilizarea de materiale de unică folosință și de reactivi certificați pentru diagnostic molecular
(molecular biology grade), adică reactivi care sunt certificați că nu conțin ADN, ARN, DNAze,
RNAze.
Respectarea cerințelor privind recoltarea, transportul, stocarea și procesarea primară a
probelor reprezintă o condiție pentru obținerea unor rezultate de calitate. Menținerea integrității
acizilor nucleici pe parcursul acestor etape depinde de mai mulți factori, cum ar fi tipul de probă,
tipul de țintă, temperatura și durata stocării probei.
În prima etapă analitică se realizează extracția acizilor nucleici. Această etapă se poate realiza
automat sau manual și are ca obiective eliberarea acizilor nucleici din microorganism, purificarea
acestora și îndepărtarea substanțelor cu efect inhibitor din proba biologică, cu menținerea
integrității acizilor nucleici și uneori concentrarea lor. Există numeroase protocoale de extracție,
care diferă în funcție de tipul probei, tipul acidului nucleic țintă, performanțele purificării,

16
echipamentele necesare, costuri. Indiferent de metoda aleasă laboratorul trebuie să monitorizeze
prin controale specifice menținerea integrității acizilor nucleici țintă și îndepărtarea inhibitorilor
în cursul acestei etape.

Prevenirea și controlul contaminării în laboratorul de diagnostic

molecular
Personalul din laboratoarele de microbiologie se preocupă în mod constant de prevenirea
contaminării în cursul manipulării probelor și culturilor. Diagnosticul molecular impune un grad
considerabil mai ridicat de precauție, deoarece chiar contaminări de nivel jos, care nu vor fi
detectate prin metode fenotipice, pot duce la rezultate fals-pozitive prin tehnici moleculare.
Contaminarea poate avea loc în oricare dintre etapele diagnosticului molecular și poate fi de mai
multe tipuri: contaminarea probei în etapa preanalitică (de exemplu contaminarea cu altă probă
sau cu elemente de mediu printr-un mod inadecvat de recoltare și procesare), contaminarea în
cursul etapei de extracție (cu altă probă, cu control pozitiv sau cu produși de amplificare) sau ,
dacă este cazul, a celei post-PCR (cu produși de amplificare).
Prevenirea contaminării cu ADN sau ARN din probe se realizează printr-un set de măsuri
care includ: manipularea flacoanelor și tuburilor într-un mod care previne formarea de aerosoli,
centrifugarea ușoară înainte de deschiderea unui tub, deschiderea pe rând doar a câte unui singur
tub, decontaminarea riguroasă a suprafețelor de lucru, utilizarea de cabinete de siguranță
microbiologică, utilizarea vârfurilor cu filtru pentru transferuri lichidiene.
Prevenirea contaminării cu produși de amplificare se realizează prin organizarea etapelor de
lucru în arii distincte independente (preamplificare, amplificare, postamplificare), cu respectarea
fluxului unidirecțional de activitate, respectarea strictă a unor protocoale de lucru. Uneori la
acestea se adaugă inactivarea produșilor de amplificare prin metode fotochimice sau enzimatice
(de exemplu cu uracil-N glicozilază, UNG). Aceste precauții sunt deosebit de importante mai ales
în laboratoarele care realizează analiză post-PCR (de exemplu electroforeză sau secvențiere).
Monitorizarea contaminării în cursul etapelor de extracție, pregătire a reactivilor PCR,
amplificare - detecție este obligatorie și se realizează în principal prin includerea în fiecare rundă
de testare a cel puțin unui control negativ.

Asigurarea calității rezultatelor

Asigurarea calității rezultatelor este obligatorie în diagnosticul molecular.

Control/controale negative
Monitorizarea contaminării în cursul etapelor de extracție, pregătire a reactivilor PCR,
amplificare - detecție se realizează obligatoriu în fiecare rundă de testare prin includerea a cel puțin
unui control negativ, care va fi testat ca o probă obișnuită. Controlul negativ trebuie inclus
indiferent dacă extracția și pregătirea reactivilor se fac automat sau manual și indiferent dacă
metoda este comercială sau validată de laborator (in-house). Detecția amplificării țintei în controlul
negativ invalidează toate rezultatele din acea rundă și impune adoptarea unor măsuri riguroase de
prevenire a contaminării. În cazul metodelor manuale este posibilă utilizarea unor controale
distincte doar pentru etapa de PCR (no template control, NTC) sau și pentru cea de extracție
(control negativ cu matrice similară cu probele dar fără acidul nucleic țintă). În cazul metodelor

17
de tip point-of–care (POC), care permit testarea unei singure probe clinice, este necesară testarea
periodică a unui control negativ.

Control/controale pozitive
Controlul pozitiv atestă că testul poate detecta ținta în condițiile stabilite de producător, deci
verifică etapele de extracție, amplificare - detecție. În cazul testelor calitative este obligatorie
includerea în fiecare rundă de testare a unui control pozitiv, indiferent dacă extracția și pregătirea
reactivilor se fac automat sau manual și indiferent dacă metoda este comercială sau validată de
laborator (in-house). Lipsa amplificării controlului pozitiv invalidează toate rezultatele din acea
rundă. În cazul testelor cantitative este obligatorie utilizarea a minim două controale pozitive, de
concentrații diferite (de nivel jos și de nivel înalt). În cazul metodelor manuale este posibilă
utilizarea unor controale distincte doar pentru etapa de PCR (secvența ADN țintă) sau și pentru
cea de extracție (control pozitiv cu matrice similară cu probele și cu secvența țintă la o concentrație
cunoscută). Un control pozitiv este de obicei inclus în componența majorității truselor comerciale.
În caz contrar sunt disponibile materiale de referință și control comerciale corespunzătoare țintei
pentru majoritatea microorganismelor de interes medical.

Control intern
Degradarea acizilor nucleici țintă în cursul etapei de extracție poate duce la rezultate fals
negative. De asemenea, prezența inhibitorilor în probă la sfârșitul etapei de extracție poate
determina inhibarea PCR și obținerea de rezultate fals negative. Există mai multe metode pentru
monitorizarea inhibării amplificării, cea mai folosită fiind utilizarea unui control intern în fiecare
probă. Acest control intern este de același tip cu ținta (ADN sau ARN) și este introdus în reacție
de la începutul etapei de extracție. În unele truse comerciale controlul intern utilizează aceeași
pereche de primeri cu ținta dar este detectat diferit, în alte truse controlul intern are o secvență
diferită și este recunoscut de primeri diferiți.

Interpretarea și raportarea rezultatelor

Interpretarea rezultatelor testelor moleculare necesită cunoașterea caracteristicilor și
limitelor acestor tehnici și diferă de interpretarea testelor convenționale de diagnostic
microbiologic.
Interpretarea absenței produșilor de amplificare (rezultat negativ) trebuie să aibă în vedere
momentul recoltării, calitatea probei, sensibilitatea testului, eficiența extracției acizilor nucleici și
eficiența amplificării țintei. Deficiențe privind oricare dintre acești factori pot să determine
rezultate fals negative, de aceea măsuri de monitorizare și control a acestor factori trebuie aplicate
constant. Variația secvenței țintă (de exemplu prin mutații, deleții etc.), poate afecta cuplarea
primerilor sau probelor, fiind o altă sursă posibilă de rezultate fals-negative.
Interpretarea prezenței produșilor de amplificare (rezultat pozitiv) trebuie să țină cont de
specificitatea testului și de riscul contaminării. Specificitatea testului depinde de condițiile de
reacție și de primerii și sondele utilizate pentru amplificare, respectiv detecție. Dacă primerii sau
sondele pot interacționa cu secvențe ale altor microorganisme este posibilă obținerea unui rezultat
fals pozitiv. O altă cauză de rezultat fals pozitiv este contaminarea, care poate să survină în oricare
etapă, de la recoltarea probei până la repartizarea eluatului obținut în urma extracției (vezi 3.1. și
3.2). În cazul testelor multiplex interpretarea trebuie să țină cont de numărul de ținte potențial
18
detectabile dar și de sensibilitatea testului pentru fiecare țintă. Detecția simultană a două sau mai
multe microorganisme (codetecția) nu semnifică obligatoriu coinfecție, deoarece prezența
anumitor microorganisme în proba clinică poate fi consecința altor factori, ca de exemplu
contaminare sau infecție latentă. Testele multiplex care includ între țintele detectabile și unii
markeri de rezistență trebuie interpretate având în vedere mai multe aspecte. De exemplu în unele
situații mai multe mecanisme pot fi responsabile de rezistența fenotipică, de aceea lipsa detecției
unui singur marker nu corespunde obligatoriu cu sensibilitatea fenotipică. După cum nici prezența
genelor pentru un mecanism de rezistență nu semnifică neapărat rezistență, ci doar prezența acelui
mecanism cu riscurile epidemiologice respective.
Evaluarea performanțelor analitice ale unui test depinde și de performanțele testului de
referință. Testele moleculare au de multe ori o sensibilitate superioară testelor bazate pe cultivare,
ceea ce determină ca un rezultat pozitiv la un test molecular să fie interpretat în mod discutabil fals
pozitiv dacă testul bazat pe cultivare, considerat ca referință, este negativ. În această situație se
recomandă ca referința să fie un set extins de criterii care să includă și date clinice, imagistice sau
un alt test molecular.
Detecția secvenței țintă nu depinde de viabilitatea microorganismului de la care provine acea
secvență. Aceasta reprezintă un avantaj în stabilirea diagnosticului la pacienți pretratați, la care
metodele bazate pe cultivare eșuează dar acidul nucleic microbian persistă și în consecință poate
fi detectat un anumit timp după începerea tratamentului adecvat. Persistența acidului nucleic
microbian provenit de la microorganisme neviabile poate reprezenta un dezavantaj al utilizării
testelor moleculare calitative în evaluarea răspunsului la tratament în infecțiile acute. Însă în unele
infecții virale cronice (produse de HIV, HBV, HCV, CMV) testele moleculare cantitative
reprezintă metoda de referință pentru monitorizarea răspunsului la tratamentul specific.
Raportarea rezultatelor testelor calitative este în general simplă, rezultatul fiind de obicei
„ADN (sau după caz, ARN) detectat sau nedetectat”. Alte informații care pot fi raportate sunt
genele țintă, metoda utilizată, limita de detecție. Raportarea rezultatelor testelor cantitative este
mai complexă și necesită explicarea mai multor parametri. Rezultatele testelor cantitative se pot
exprima în unități de măsură (unități internaționale, copii sau ng), raportate la un parametru definit
(mililitru plasmă sau sânge, gram de țesut, număr de leucocite). Valorile încărcăturii virale pot fi
raportate în numere întregi și/ sau transformate în log 10. Rezultatele exprimate în log10 permit
aprecierea mai bună a variațiilor semnificative clinic ale concentrației microorganismelor. Alți
parametri care definesc testele cantitative sunt: domeniul de măsurare lineară, limita inferioară de
cuantificare, limita superioară de cuantificare, limita de detecție. În cazul unor valori superioare
limitei de detecție și mai mici decât limita inferioară de cuantificare rezultatul raportat trebuie să
fie „detectat, < limita inferioară de cuantificare”. În raport trebuie de asemenea specificate tipul de
probă și metoda de amplificare, deoarece rezultatele obținute prin metode diferite pot să nu fie
similare, fiind necesară aplicarea unui factor de corecție.

IV. Metode bazate pe detecția proteinelor

Identificarea și caracterizarea microorganismelor pe baza detecției unor proteine specifice
prin spectrometrie de masă (MS) constituie un progres important în dezvoltarea microbiologiei
clinice. Spectrometria de masă (MS) este o tehnologie care măsoară două proprietăți ale unui
analit: masa moleculară (m) și sarcina electrică (z). Un spectrometru de masă are trei componente:

19
sursa de ioni (transformă analitul în ioni), analizorul de ioni (separă ionii în funcție de
comportamentul lor diferit într-un câmp electric, deci în funcție de raportul m/z) și detectorul de
ioni (măsoară numărul ionilor cu același m/z). Se obține un spectru de mase, care se compară
digital cu spectrele dintr-o bază de date, astfel fiind realizată identificarea.
Analiza proteinelor (predominant ribozomale) prin MALDI-TOF, adică ionizarea prin
MALDI (matrix-assisted laser desorption ionization) și diferențierea prin TOF (time-of-flight),
este din ce în ce mai utilizată în laboratoarele de microbiologie, deoarece permite identificarea
rapidă a bacteriilor sau fungilor izolați în cultură. Principalele avantaje ale acestei metode sunt
durata mult mai redusă (minute) comparativ cu metodele convenționale, posibilitatea identificării
din cultura primară, cost/test redus, procedură simplă, existența unor protocoale standardizate și a
unor truse disponibile comercial. În afara necesității achiziționării unui echipament MALDI-TOF
și a modulelor software necesare pentru interpretare, principalele limite sunt necesitatea testării
bacteriilor izolate în cultură pură (>105 UFC/ml), lipsa unor protocoale standardizate pentru
anumite aplicații, dificultatea diferențierii unor genuri înrudite (de exemplu Escherichia și
Shigella). Identificarea se poate face la nivel de familie, gen sau specie, în funcție de scorul
calculat, adică de gradul de similitudine dintre spectrul obținut în urma analizei și spectrele din
baza de date.
Metode care utilizează MALDI-TOF pentru detecția rezistenței la antibiotice sunt descrise
în literatură și progresează rapid, chiar dacă protocoalele de lucru nu sunt încă standardizate. Există
trei strategii principale de detecție a rezistenței prin MALDI-TOF: măsurarea modificărilor
antibioticului ca rezultat al acțiunii enzimelor bacteriene, detecția proteinelor bacteriene asociate
rezistenței și evaluarea semicantitativă a multiplicării bacteriene în prezența antibioticului. Prima
strategie este folosită pentru detecția acțiunii β-lactamazelor (inclusiv ESBL sau carbapenemaze),
a unor enzime implicate în rezistența enterobacteriilor la fluorochinolone sau în rezistența la
aminoglicozide atât la Gram pozitivi cât și la Gram negativi, iar a doua poate fi utilă pentru detecția
meticilino-rezistenței, a β-lactamazelor, a porinelor. Folosite cu precauție aceste metode bazate pe
MALDI-TOF pot să ofere rapid la un cost scăzut informații preliminare utile.

V. Bibliografie
1. Herrmann JL, Poljak M - Molecular methods in microbiology in European Manual Of
Clinical Microbiology, 1st edition, 2012
2. Nolte F S. Molecular Microbiology - in Manual of Clinical Microbiology, 11th Edition,
Edited by Jorgensen JH et al., Wiley 2015 https://doi.org/10.1128/9781555817381.ch6

20
 Testarea sensibilității la antibiotice

I. Scopul documentului
Acest document descrie metodele de rutină pentru testarea sensibilității la antibiotice a
bacteriilor izolate în mod uzual în laboratoarele clinice. Metoda de testare recomandată prin acest
ghid național este metoda difuzimetrică EUCAST (EUCAST disk diffusion method).
Pentru metoda diluțiilor, metoda gradient și metoda punctelor de ruptură se vor urma
indicațiile din insert-ul testelor comerciale utilizate.

II. Introducere
Testarea sensibilității bacteriilor față de antibiotice reprezintă un obiectiv esențial în
diagnosticul microbiologic. Această testare se poate realiza prin metoda difuzimetrică, metode
cantitative (metoda microdiluțiilor, teste gradient) și prin metode moleculare.
Metoda difuzimetrică este una dintre cele mai vechi abordări ale testării sensibilității la
antibiotice și rămâne una dintre cele mai larg folosite metode pentru testarea de rutină a
sensibilității la antibiotice în laboratoarele clinice. Este potrivită pentru testarea majorității
patogenilor bacterieni, incluzând cele mai comune bacterii pretențioase, este versatilă din punct de
vedere al numărului agenților antimicrobieni ce pot fi testați și nu necesită echipament special.
Punctele de ruptură ale diametrelor zonelor de inhibiție utilizate în cadrul metodei
EUCAST sunt calibrate și armonizate cu punctele europene de ruptură ale CMI publicate de
EUCAST și sunt disponibile gratuit pe pagina web a EUCAST
(https://www.eucast.org/clinical_breakpoints/).
Ca pentru orice metodă standardizată, tehnica descrisă trebuie respectată fără excepții
pentru a obține rezultate fiabile.
Metodele cantitative permit determinarea concentrației minime inhibitorii. Pentru unele
bacterii sau antibiotice metoda microdiluțiilor reprezintă singura metodă acceptabilă (de ex.
testarea sensibilității față de colistin, testarea Streptococcus pneumoniae față de penicilină).
Metodele moleculare detectează prezența unor markeri genetici asociați rezistenței și pot
fi teste preliminare sau complementare testelor fenotipice.

III. Definirea noțiunilor utilizate în standardul EUCAST

Categoriile de sensibilitate
Sensibil la doze standard: un microorganism este clasificat ca ”sensibil, regim de dozare
standard” atunci când există o probabilitate mare de succes terapeutic folosind un regim de dozare
standard al antibioticului.

21
 Sensibil, expunere crescută (vechea categorie intermediar): un microorganism este încadrat
”Sensibil, expunere crescută” când există o mare probabilitate de succes terapeutic dacă expunerea
la antibiotic este crescută prin ajustarea regimului de dozare sau prin concentrarea antibioticului
la locul infecției. Expunerea se referă la felul în care modul de administrare, doza, intervalul de
dozare, timpul de perfuzie, precum și distribuția, metabolismul și excreția agentului antimicrobian
influențează microorganismul infectant la locul infecției. Pe buletinul de analize se va adăuga
comentariul referitor la doze (vezi tabelele VII-XVIII din subcapitolul XII Comentarii privind
fenotipurile de rezistență, dozele de antibiotice recomandate, rezistențele naturale și posibilități
de extrapolare a rezultatelor).
Diferența dintre categoria de ”Sensibil, doză standard” și ”Sensibil, expunere crescută”
constă în cantitatea de antibiotic de la locul infecției. În acest scop este important de specificat
dozele corespunzătoare categoriei ”Sensibil, expunere crescută”, deoarece în lipsa unei înțelegeri
temeinice a schimbării semnificației simbolului ”I” există riscul evitării utilizării antibioticelor
care se încadrează în această categorie și astfel restrângerea opțiunilor terapeutice.
Rezistent: un microorganism este încadrat Rezistent când există o probabilitate mare de
eșec terapeutic chiar și atunci când există o expunere crescută.

Zonele de incertitudine tehnică (area of technical uncertainty - ATU)

Zonele de incertitudine tehnică reprezintă avertizare pentru laborator cu privire la
incertitudinea rezultatului. ATU sunt listate în tabelele EUCAST și sunt definite de valoare CMI
sau de un diametru.
Laboratorul trebuie să își definească o strategie cu privire la atitudinea față de ATU.
Pot fi luate următoarele măsuri în cazul ATU:
- Se repetă testul - numai dacă se suspectează o eroare tehnică
- Se efectuează un test alternativ (CMI, PCR, test pentru a determina mecanismul de rezistență)
– acest lucru este relevant atunci când testul alternativ este concludent (PCR pentru a detecta
o genă vanA sau vanB la enterococi, un test Bla la H. influenzae)
- Se modifică categoria de susceptibilitate: din S în I, din I în R sau S în R
- Rezultatul se raportează ca „incert” – acest lucru poate fi realizat lăsând interpretarea
necompletată + comentariu. Sau aplicarea unui asterix (în loc de un S, I sau R) care se referă
la un comentariu care explică incertitudinea
- Se raportează rezultatele „R”. Dacă există mai multe alternative pentru terapie pe
antibiogramă, aceasta poate fi cea mai ușoară și mai sigură opțiune.
- Se discută rezultatele cu medicul clinician

IV. Prepararea și depozitarea mediilor

Agarul Mueller-Hinton (MH) se prepară în conformitate cu indicațiile producătorului, cu
suplimente pentru microorganismele pretențioase indicate în documentele disponibile pe
www.eucast.org. Prepararea și adăugarea suplimentelor sunt descrise în detaliu pe pagina web
https://www.eucast.org/ast_of_bacteria/media_preparation/.
Mediul trebuie să aibă o înălțime de 4 ± 0,5 mm (aproximativ 25 mL într-o placă circulară
cu diametrul de 90 mm, 31 mL într-o placă circulară de 100 mm, 71 mL într-o placă circulară cu

22
diametrul de a 150 mm, 40 mL într-o placă pătrată cu latura de 100 mm). Volumul trebuie calculat
corect în raport cu dimensiunile plăcii Petri utilizate. Dimensiunile plăcii pot varia în funcție de
producător.
Pentru plăcile cu agar disponibile comercial sau preparate ”in house”, depozitate în pungi
de plastic sau în containere ermetice, poate fi necesară uscarea plăcilor înainte de utilizare. Această
precauție este necesară pentru evitarea umidității excesive, care poate avea ca efect apariția unor
zone de inhibiție difuze sau a unui văl în interiorul zonelor de inhibiție.
Suprafața agarului trebuie să fie uscată înainte de utilizare. Nu trebuie să se observe picături
de apă pe suprafață, sau în interior, pe capac. Plăcile se usucă la 20-25°C peste noapte, sau la 35°C,
înlăturând capacul timp de 15 minute. Plăcile nu vor fi uscate prea mult.
Plăcile preparate ”in house” se depozitează la 4-8°C.
Pentru plăcile preparate ”in house”, uscarea plăcilor, condițiile de depozitare și păstrare
trebuie incluse în programul laboratorului de asigurare a calității .
Plăcile preparate după cerințele comerciale trebuie depozitate după recomandările
producătorului și folosite până la termenul de expirare indicat.

V. Tehnica metodei difuzimetrice

Prepararea inoculului
Se folosește metoda suspensionării directe a coloniilor pentru a prepara o suspensie
bacteriană în soluție salină fiziologică cu o densitate corespunzătoare ca turbiditate standardului
0,5 McFarland, ceea ce corespunde cu o concentrație de aproximativ 1-2 x 108 UFC/mL pentru
Escherichia coli.
Metoda suspensionării directe a coloniilor este potrivită pentru toate microorganismele,
inclusiv microorganismele pretențioase.
Se folosește o ansă sterilă sau un tampon steril pentru a repica colonii dintr-o cultură pe un
mediu de cultură neselectiv, incubată peste noapte. Se repică câteva colonii cu morfologie
asemănătoare (dacă este posibil) pentru evitarea selectării unei variante atipice. Se suspendă
coloniile în soluție salină fiziologică și se amestecă până la omogenizare.
Se ajustează densitatea suspensiei corespunzător standardului 0,5 McFarland, adăugând
mai mult ser sau mai multe colonii bacteriene. Un inocul mai dens va avea ca efect zone de inhibiție
mai mici, iar un inocul cu densitate mai mică va avea un efect opus.
Este recomandată utilizarea unui dispozitiv spectrofotometric pentru ajustarea densității
suspensiei. Dispozitivul trebuie calibrat față de un standard 0,5 McFarland în conformitate cu
indicațiile producătorului.
Ca alternativă, densitatea suspensiei poate fi comparată vizual cu un standard 0,5
McFarland. Pentru a ușura compararea vizuală, se compară testul pe un fundal alb cu linii negre.
Streptococcus pneumoniae este de preferință suspensionat de pe o placă cu agar- sânge la
o densitate corespunzătoare standardului 0,5 McFarland. Când S. pneumoniae este suspensionat

23
de pe o placă cu agar chocolat, inoculul trebuie să aibă densitatea echivalentă cu un standard
McFarland de 1,0.
Suspensia trebuie folosită în 15 min până la 60 de minute de la preparare, parte a regulii
15-15-15 minute: însămânțarea inoculului în 15 minute de la preparare, aplicarea discurilor în 15
minute de la însămânțare, incubarea plăcilor la 15 minute de la aplicarea discurilor.

Inocularea plăcilor cu agar

Plăcile cu agar trebuie să atingă temperatura camerei înainte de inoculare.
Se folosește inoculul ajustat într-un interval optim de 15 min de la preparare. Suspensia
trebuie întotdeauna folosită în maxim 60 de minute de la preparare.
Se introduce un tampon steril în suspensie.
Pentru a evita supra-inocularea bacteriilor Gram-negative, se șterge excesul de fluid
apăsând și rotind tamponul în interiorul tubului.
Pentru bacteriile Gram-pozitive nu se apasă și nu se rotește tamponul în interiorul tubului.
Când sunt inoculate mai multe plăci cu agar din aceeași suspensie, se repetă procedura
pentru fiecare placă.
Plăcile pot fi inoculate fie prin însămânțare în trei direcții, fie utilizând un dispozitiv
automat. Se dispersează inoculul uniform pe întreaga suprafață a agarului asigurând că nu există
spații libere între striuri (în mod deosebit pentru bacteriile Gram-pozitive).
Se aplică discurile în 15 min de la inoculare.
Dacă plăcile inoculate sunt lăsate la temperatura camerei pentru un timp îndelungat înainte
ca discurile să fie aplicate, microorganismul poate să înceapă să se dezvolte înainte de aplicarea
discurilor, rezultând zone de inhibiție eronate prin reducerea diametrelor de inhibiție.

Aplicarea discurilor cu antibiotic

Cerințele privind conținutul discurilor sunt listate în tabelele cu Punctele de ruptură şi
Controlul calității pe https://www.eucast.org/clinical_breakpoints/. Metoda este standardizată
pentru discuri de hârtie cu diametrul de 6 mm.
Discurile vor fi lăsate să ajungă la temperatura camerei înainte de a desigila cartușele sau
containerele utilizate pentru depozitarea discurilor. Această precauție este necesară pentru a
preveni apariția condensului ce poate conduce la deteriorarea rapidă a unora dintre agenții
antimicrobieni.
Discurile se aplică ferm pe suprafața agarului inoculat în 15 minute de la inoculare.
Discurile trebuie sa fie în contact strâns și uniform cu suprafața agarului şi nu trebuie mutate odată
ce au fost aplicate, deoarece difuzia antibioticului începe imediat.
Numărul discurilor de pe o placă trebuie să fie limitat pentru a evita suprapunerea zonelor
de inhibiție și interferarea agenților antimicrobieni. Este important ca diametrele zonelor de
inhibiție să fie măsurate exact. Numărul maxim de discuri depinde de microorganism și de
selectarea discurilor. În mod normal sunt aplicate maximum 6 discuri pe o placă circulară cu
diametrul de 90 mm şi maximum 12 discuri pe o placă circulară cu diametrul de 150 mm.

24
 Pentru a putea depista rezistența inductibilă la clindamicină a stafilococilor și
streptococilor, discurile cu eritromicină și clindamicină trebuie plasate la o distanță de 12-20 mm
între margini pentru stafilococi și 12-16 mm între margini pentru streptococi.
Pierderea potenței agenților antimicrobieni per disc are ca rezultat reducerea diametrelor
zonelor de inhibiție și este o sursă de eroare comună. Următoarele aspecte sunt esențiale:
Depozitarea discurilor, inclusiv cele din dispenser, se face în containere sigilate care conțin
un desicant și ferite de lumină (unii agenți ca metronidazolul, cloramfenicolul, fluorochinolonele
sunt inactivate de expunerea îndelungată la lumină.)
Rezervele de discuri se depozitează în conformitate cu indicațiile producătorului. Unii
agenți sunt mult mai labili decât alții (ex. amoxicilină-acid clavulanic, cefaclor şi carbapenemele)
şi pot exista indicații specifice ale producătorului.
Discurile de lucru se depozitează conform indicațiilor producătorului. După ce au fost
desigilate containerele cu discuri, discurile trebuie utilizate în limitele de timp specificate de
producător.
Discurile se aruncă la data de expirare indicată de producător.
Controlul calității se face frecvent, (vezi capitolul Controlul de calitate), pentru materialele
de lucru pentru a verifica dacă discurile cu antibiotice nu și-au pierdut potența pe durata depozitării.

Incubarea plăcilor
Plăcile cu agar se întorc cu capacul orientat în jos având grijă ca discurile să nu cadă de pe
suprafața agarului. Plăcile se incubează în maxim 15 minute după ce au fost aplicate discurile cu
antibiotic. Dacă plăcile sunt lăsate la temperatura camerei după ce discurile au fost aplicate,
antibioticele pot difuza în mediu înainte de incubare (predifuzie), rezultând zone de inhibiție mărite
în mod eronat.
Stivuirea plăcilor în incubator poate influența rezultatele din cauza încălzirii neuniforme.
Eficiența incubatoarelor variază, așadar controlul incubării, incluzând numărul optim de plăci
dintr-un teanc, trebuie inclus în programul de asigurare a calității al laboratorului. Pentru cele mai
multe incubatoare numărul potrivit de plăci într-un teanc este de maximum 5.
Condițiile de incubare sunt specificate în tabelele cu punctele de ruptură
https://www.eucast.org/clinical_breakpoints/
Depășirea limitelor recomandate pentru timpul de incubare trebuie evitată, deoarece poate
rezulta creșterea coloniilor în zona de inhibiție și raportarea izolatelor ca rezistente.
Pentru testele de sensibilitate la glicopeptide în cazul Enterococcus spp. coloniile rezistente
pot să nu fie vizibile decât după ce plăcile au fost incubate timp de 24 h. Totuși, plăcile pot fi
examinate după 16-20 h și se poate raporta orice semn de rezistență, dar plăcile cu izolate ce par a
fi sensibile trebuie reincubate și recitite la 24h.
Un inocul preparat corect și inocularea corectă a plăcilor trebuie să determine apariția unui
strat de creștere confluent.
Dacă se pot observa colonii izolate, inoculul are o densitate prea mică și testul trebuie
repetat.

25
 Creșterea trebuie să fie dispusă egal pe toată suprafața agarului pentru ca marginile zonelor
de inhibiție obținute să fie uniforme și circulare (nezimțate).

Măsurarea zonelor de inhibiție și interpretarea sensibilității

Se verifică dacă zonele de inhibiție obținute în cazul tulpinilor utilizate pentru controlul
calității se încadrează în limitele acceptate
(vezi https://www.eucast.org/ast_of_bacteria/quality_control/ )
Pentru toți agenții antimicrobieni (dacă nu există alte specificații), diametrul zonei trebuie
citit din punctul unde există inhibiție completă, apreciată cu ochiul liber, ținând plăcuța la 30 cm
față de ochi.
Plăcile cu agar nesuplimentat sunt citite dinspre partea posterioară a plăcii, pe un fond
închis, în lumină reflectată.
Plăcile cu agar suplimentat se citesc înlăturând capacul, în lumină reflectată.
Nu va fi folosită lumina transmisă (cu placa îndreptată spre lumină), sau lupa, dacă nu este
specificat în alt fel.
Se măsoară diametrul zonei de inhibiție până la ultimul mm, folosind o riglă gradată.
Dacă se folosește un cititor automat, acesta trebuie calibrat la citirea manuală.
Diametrele zonelor de inhibiție sunt încadrate în categorii de sensibilitate, în conformitate
cu tabelele cu puncte de ruptură de pe pagina web https://www.eucast.org/clinical_breakpoints/
Dacă se folosesc șabloane pentru interpretarea zonelor de inhibiție, plăcuța este plasată
peste șablon și zonele sunt interpretate în conformitate cu punctele de ruptură EUCAST marcate
pe șablon. Punctele de ruptură folosite trebuie să fie în concordanță cu ultima versiune a tabelelor
EUCAST cu puncte de ruptură. Un program pentru realizarea șabloanelor este disponibil gratuit
pe pagina de web http://bsac.org.uk/susceptibility/template-program .

În Ghidul de citire disponibil pe pagina de web (vezi

https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Disk_test_documents/2021_m
anuals/Reading_guide_v_8.0_EUCAST_Disk_Test_2021.pdf ) există câteva exemple de imagini
care explică citirea diametrelor zonelor de inhibiție. Acest document include și instrucțiuni de
citire pentru diferite asocieri specifice de agent antimicrobian-microorganism.

Instrucțiuni specifice de citire:

În cazul apariției zonelor duble de inhibiție, sau a coloniilor izolate în zona de inhibiție, se
verifică puritatea culturilor și se repetă testul dacă este necesar. Dacă culturile sunt pure, coloniile
izolate trebuie luate în considerare atunci când se măsoară diametrul zonei de inhibiție.
Pentru trimetoprim și trimetoprim-sulfametoxazol, poate fi prezentă o creștere slabă până
lângă disc, datorită antagoniștilor din mediu, aceasta trebuind ignorată. Măsurarea diametrului
zonei de inhibiție trebuie să se facă începând din cea mai evidentă margine a zonei de inhibiție.

26
 Pentru testarea tulpinilor de Enterobacterales la ampicilină, ampicilină-sulbactam și
amoxicilină-acid clavulanic se ignoră creșterea bacteriană ce se poate prezenta ca un film subțire,
care produce o zonă de inhibiție internă pe unele loturi de agar Mueller-Hinton.
Se ignoră coloniile izolate din aria zonei de inhibiție în cazul testării unei tulpini de
Escherichia coli la mecilinam.
Pentru Achromobacter xylosoxidans și Burkholderia pseudomallei cu trimetoprim-
sulfametoxazol, un izolat care prezintă orice urmă de zonă de inhibiție mai mare sau egală cu
punctul de ruptură pentru categoria Sensibil trebuie să fie raportat ca sensibil. De reținut că poate
exista o creștere substanțială în interiorul zonelor de inhibiție. În aceeași situație, tulpinile de
Stenotrophomonas maltophilia se raportează sensibil la expunere crescută.
Se citește ca absența zonei de inhibiție doar dacă există o creștere până la disc și nu există
urme de zonă de inhibiție.
Pentru enterococi și vancomicină, se examinează marginea zonei cu atenție din partea din
față a plăcii cu placa ținută la lumină (lumină transmisă). Marginile neclare ale zonei de inhibiție
și coloniile din interior indică rezistența la vancomicină și investigația trebuie să fie continuată.
Izolatele nu trebuie raportate sensibile înainte de 24 de ore de incubație.
Pentru Haemophilus influenzae și agenții beta-lactamici, se citește marginea exterioară a
zonelor acolo unde există o zonă de creștere în jurul unei zone de inhibiție altfel clară.
În cazul Proteus spp. se ignoră fenomenul de invazie și se măsoară cu exactitate diametrul
zonei de inhibiție a creșterii
Pentru testarea sensibilității Staphylococcus aureus la benzilpenicilină, se examinează
marginea zonei de inhibiție de aproape, cu placa orientată spre lumină (lumină transmisă).
Izolatele cu zonele de inhibiție mai mari ca punctul de ruptură pentru sensibilitate, dar cu margini
precise ale zonei de inhibiție trebuie considerate rezistente.
Când se folosește testarea la cefoxitin pentru evidențierea rezistenței la meticilină a S.
aureus, se măsoară zona evidentă și se examinează cu atenție placa, în lumină, pentru a decela
dacă există colonii izolate în interiorul zonei de inhibiție. Acestea pot fi fie expresia unei
contaminări, fie a rezistenței heterogene la meticilină.
Pentru testarea sensibilității enterococilor la vancomicină, se examinează marginea zonei
de inhibiție cu placa orientată către lumină (lumină transmisă). Marginile difuze și coloniile
crescute în aria zonei de inhibiție indică rezistență la vancomicină și necesită investigații
suplimentare. Izolatele nu trebuie declarate sensibile înainte de scurgerea a 24 de h de la incubare.
Pentru testarea sensibilității la antibiotice pentru tulpini hemolitice de streptococ pe agar
Mueller-Hinton suplimentat, se citește diametrului zonei de inhibiție și nu al zonei de hemoliză.
Hemoliza de tip 𝛽 este de obicei independentă de creștere, în timp ce hemoliza de tip α și creșterea
bacteriană de obicei coincid. Se înclină placa înainte și înapoi pentru a diferenția mai bine hemoliza
de creștere.
În cazul testării tulpinilor de Escherichia coli la fosfomicină coloniile izolate din aria zonei
de inhibiție se ignoră și se citește începând de la marginea zonei. .

27
VI. Detectarea mecanismelor de rezistență prin metode
fenotipice
https://www.eucast.org/resistance_mechanisms/
Trebuie remarcat faptul că unele mecanisme de rezistență nu conferă întotdeauna rezistență
clinică. Acest fapt s-ar putea datora mecanismelor care nu sunt exprimate sau exprimate doar la un
nivel scăzut, ceea ce nu va da naștere rezistenței fenotipice. Prin urmare, în timp ce detectarea
acestor mecanisme poate fi relevantă pentru controlul infecțiilor și sănătatea publică, este posibil
să nu fie necesară în scopuri clinice. În consecinţă, pentru unele mecanisme, în special β-
lactamazele cu spectru extins și carbapenemazele produse de bacili Gram-negativi, detectarea
mecanismului nu conduce automat la clasificarea izolatului ca rezistent clinic.

Enterobacterales producătoare de carbapenemaze

Carbapenemazele sunt β-lactamaze care hidrolizează penicilinele, în cele mai multe cazuri
cefalosporine și în diferite grade carbapeneme și monobactame (acestea din urmă nu sunt
hidrolizate de metalo-β-lactamaze).
Carbapenemazele sunt o sursă de îngrijorare deoarece pot conferi rezistență practic tuturor
β-lactaminelor și sunt ușor transferabile. Mai mult, tulpinile producătoare de carbapenemază
posedă frecvent mecanisme de rezistență la o gamă largă de agenți antimicrobieni și infecțiile cu
Enterobacterales producătoare de carbapenemaze sunt asociate cu rate ridicate de mortalitate.

Metode recomandate pentru detectarea carbapenemazelor la

Enterobacterales

Screening pentru producția de carbapenemază

CMI-urile la carbapeneme pentru Enterobacterales producătoare de carbapenemaze pot fi
sub valoarea punctelor de ruptură clinice. Cu toate acestea, pot fi utilizate valorile ECOFF definite
de EUCAST pentru a detecta producătorii de carbapenemaze. Meropenem oferă cel mai bun
compromis între sensibilitate și specificitate în ceea ce privește detectarea producătorilor de
carbapenemază. Ertapenem este cel mai sensibil carbapenem, dar are specificitate redusă, în
special la specii precum Enterobacter spp., datorită stabilității relativ reduse la β-lactamazele cu
spectru extins (ESBL) și β-lactamazele AmpC în combinație cu pierderea porinelor (Tabelul 1).

Tabelul 1. Valorile de alertă pentru detectarea enterobacteriilor producătoare de

carbapenemaze
Carbapenem Cut-off pentru screening Cut-off pentru screening
CMI (mg/L) Diametru (mm) pentru discuri de
10 ug
Meropenem > 0.125 < 28
Ertapenem > 0.125 < 25

28
 Metoda de testare a discurilor combinate
Această metodă este disponibilă comercial de la mai mulți producători și a fost primul test
fenotipic care a devenit disponibil (MAST, Marea Britanie; Rosco, Danemarca) (18-20). Discurile
sau comprimatele conțin meropenem ± diverși inhibitori. Pe scurt, acidul boronic inhibă
carbapenemazele din clasa A, acidul dipicolinic și acidul etilendiaminotetraacetic (EDTA) inhibă
carbapenemazele din clasa B. Mai mult, OXA-48 este inhibat de avibactam, care până acum nu a
fost inclus în testele fenotipice. Cloxacilina, care inhibă β-lactamazele AmpC, a fost adăugată
testelor pentru a diferenția între hiperproducția AmpC plus pierderea de porină și producția de
carbapenemază.

Testul Hodge
Utilizarea testului de trifoi modificat (Hodge) nu este recomandată în prezent, deoarece
rezultatele sunt dificil de interpretat, specificitatea este slabă și, în unele cazuri, sensibilitatea este,
de asemenea, scăzută.

Teste biochimice – colorimetrice

Testul CarbaNP este un test rapid (<2 ore) pentru detectarea hidrolizei carbapenemului,
care dă naștere la o modificare a pH-ului rezultând o schimbare a culorii de la roșu la galben cu
soluție roșie de fenol.
Testul Carba NP a fost validat cu colonii bacteriene crescute pe plăci de agar Mueller-
Hinton, plăci cu agar din sânge, plăci cu agar tripticază-soia și cele mai multe medii selective
utilizate în screeningul producătorilor de carbapenemaze. Testul Carba NP nu trebuie efectuat cu
colonii bacteriene cultivate pe plăci de agar Drigalski, CLED sau McConkey. Diferitele etape ale
metodei trebuie să fie respectate întocmai pentru a obține rezultate reproductibile.
Un derivat al testului CarbaNP, testul Blue-Carba (BCT) este un test biochimic rapid (<2
ore) pentru detectarea producției de carbapenemaze. Se bazează pe hidroliza in vitro a
imipenemului prin creștere bacteriană (inoculare directă fără liză prealabilă), care este detectată
prin modificări ale pH-ului, evidențiate de indicatorul albastru bromtimol (albastru spre verde /
galben sau verde spre galben). Într-o evaluare amplă efectuată de Pasteran și colab., dar efectuat
într-un singur laborator, testul s-a dovedit a avea o sensibilitate excelentă pentru enzimele de clasă
A și B, dar sensibilitate scăzută pentru detectarea enzimelor OXA-48.
Un al treilea test biochimic este testul β CARBA ™, care poate fi efectuat și în mai puțin
de 2h. Testul este realizat prin amestecarea a 1 până la 3 colonii în reactiv. Citirile trebuie făcute
după maximum 30 min de incubație. Schimbarea culorii de la galben la portocaliu, roșu sau violet
indică o reacţie pozitivă. Testul β Carba ™ a arătat performanțe excelente pentru a detecta CPE,
și mai ales OXA-48. Cu toate acestea, capacitatea de a detecta alte carbapenemaze de clasa A
trebuie verificată în continuare și unele rezultate fals pozitive au apărut cu alte β-lactamaze, cum
ar fi supraproducția de K1 β-lactamaza în Klebsiella oxytoca.

Metoda de inactivare a carbapenemului

Principiul acestei metode este de a detecta hidroliza enzimatică prin incubarea unui
carbapenem cu o suspensie bacteriană. Testul utilizează discuri de testare a sensibilității la
antibiotice ca substrat. După două ore de incubare a unei anse de cultură bacteriană cu un disc de
meropenem, discul este plasat pe un agar inoculat cu Escherichia coli ATCC 25922. Inactivarea

29
enzimatică nu va produce nicio zonă, în timp ce lipsa activității carbapenemazice se va evidenția
prin prezența unei zone de inhibiție, semn că meropenemul din disc nu a fost hidrolizat. Testul a
avut performanțe variabile în diferite studii, dar rămâne o alternativă posibilă, deși valoarea
predictivă negativă a testului nu este încă clară. Un dezavantaj principal al acestei tehnici este că
necesită de obicei cel puțin 18 ore pentru a obține rezultatele.

Detectarea hidrolizei carbapenemului cu MALDI-TOF

Principiul este de a detecta într-un dispozitiv de spectrometrie de masă (MALDI-TOF)
scăderea sau dispariția anumitor vârfuri specifice de carbapeneme într-un spectru de masă după o
incubare cu carbapenem.

Test imunocromatografic
Testul se bazează pe captarea imunologică a epitopilor enzimei carbapenemază, folosind
nanoparticule de aur coloidale legate de o membrană de nitroceluloză într-un dispozitiv cu flux
lateral. Principiul testului este că anticorpii monoclonal anti-carbapenemază sunt selectați ca
reactivi de captare specifici, pentru identificarea directă a enzimei. Testul durează aproximativ
patru minute și a fost evaluat atât din culturi bacteriene cât și din flacoane de hemocultură pozitive.

Enterobacterales producătoare de β-lactamază cu spectru extins

(ESBL - extended-spectrum β-lactamases )
ESBL sunt enzime care hidrolizează majoritatea penicilinelor și cefalosporinelor, inclusiv
compușii oximino-βlactamici (cefuroximă, cefalosporine din a treia și a patra generație și
aztreonam), dar nu afectează cefamicinele și carbapenemele. Majoritatea ESBL aparțin clasei
Ambler A a β-lactamazelor și sunt inhibate de inhibitori de β-lactamază (acid clavulanic,
sulbactam și tazobactam) și de diazabiciclooctanone (avibactam).
Marea majoritate a ESBL sunt enzime dobândite, codificate de gene plasmidice. Cele
dobândite sunt exprimate la diferite niveluri și diferă semnificativ în ceea ce privește
caracteristicile biochimice, cum ar fi activitate împotriva β-lactaminelor specifice (de exemplu,
cefotaximă, ceftazidimă, aztreonam). Nivelul de expresie și proprietățile unei enzime și prezența
simultană a altor mecanisme de rezistență (alte β-lactamaze, eflux activ, permeabilitate modificată)
duc la o mare varietate de fenotipuri de rezistență observate printre izolatele ESBL-pozitive.

Tabelul 2. Metode de screening ESBL pentru Enterobacterales

Metodă Antibiotic Necesită confirmare dacă
Diluții în agar sau în bulion Cefotaximă/ceftriaxonă CMI >1 mg/L pentru oricare din
ȘI ele
Ceftazidimă
Cefpodoximă CMI >1 mg/L
Difuzimetrie cu disc Cefotaximă (5 ......................... μg) Zona de inhibiție <21 mm
SAU
Ceftriaxonă (30 μg) Zona de inhibiție <23 mm
ȘI................................................
Ceftazidimă (10 μg) Zona de inhibiție <22 mm
Cefpodoximă (10 µg) Zona de inhibiție <21 mm

30
 În multe zone, detectarea și caracterizarea ESBL este necesară pentru controlul infecțiilor.
Strategia recomandată pentru detectarea ESBL la Enterobacterales se bazează pe lipsa sensibilității
la oxiimino-cefalosporine indicator, urmată de teste de confirmare fenotipice (și în unele cazuri
genotipice) (Tabelul 2, Figura 1).

Metode de confirmare fenotipice

Există patru metode fenotipice bazate pe inhibarea in vitro a activității ESBL de către acidul
clavulanic recomandate pentru confirmarea ESBL: testul pe disc cu și fără acid clavulanic (CDT),
testul de sinergie dublu disc (DDST), testul de gradient ESBL și testul de microdiluție în bulion
(tabelele 2 și 3).

Testul pe disc cu și fără acid clavulanic (combination disk test – CDT)

Se utilizează discuri care conțin cefalosporină singură (cefotaximă, ceftazidimă, cefepimă)
și în combinație cu acid clavulanic. Zona de inhibare din jurul discului cu cefalosporină combinată
cu acid clavulanic este comparată cu zona din jurul discului cu cefalosporină singură. Testul este
pozitiv dacă diametrul zonei de inhibiție este ≥ 5 mm cu acid clavulanic decât fără.

Testul de sinergie dublu disc (double-disk synergy test DDST)

Discurile care conțin cefalosporine (cefotaximă, ceftazidimă, cefepimă) sunt aplicate pe
plăci lângă disc cu acid clavulanic (amoxicilină-acid clavulanic). Un rezultat pozitiv este indicat
atunci când zonele de inhibiție din jurul oricărui disc de cefalosporină sunt mărite sau există o
„gaură de cheie” sau ”dop de șampanie” în direcția discului care conține acid clavulanic. Distanța
dintre discuri este critică, cea de 20 mm între centrele celor două discuri s-a dovedit a fi optimă
pentru discurile cu 30 µg cefalosporină.

Testul de gradient ESBL

Testele de gradient specifice pentru evidențierea ESBL sunt configurate, citite și
interpretate în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Testul este pozitiv dacă se observă o
reducere de 8 ori în CMI a combinației cefalosporină cu acid clavulanic în comparație cu CMI a
cefalosporinei singure sau dacă apare ca o fantomă în zona de inhibiție sau există o deformare a
elipsei (a se vedea instrucțiunile producătorului pentru ilustrații).
Rezultatul testului este nedeterminat dacă banda nu poate fi citită din cauza creșterii
dincolo de gama de diluții a benzii. În toate celelalte cazuri, rezultatul testului este negativ. Potrivit
producătorului, testul gradientului ESBL trebuie utilizat numai pentru confirmarea producției
ESBL și nu este fiabil pentru determinarea CMI.

Microdiluții în bulion
Microdiluțiile se realizează cu bulion Mueller-Hinton ajustat pentru cationi care conține
diluții seriale duble de cefotaximă, ceftazidimă și cefepimă la concentrații cuprinse între 0,25 și
512 mg/L, cu și fără acid clavulanic la o concentrație fixă de 4 mg/L. Testul este pozitiv dacă se
observă o reducere de 8 ori în CMI a oricăreia dintre cefalosporinele combinate cu acid clavulanic
comparativ cu CMI a cefalosporinei singure. În caz contrar rezultatul testului este interpretat ca
fiind negativ.

31
 Considerații speciale în interpretare
Testele de confirmare ESBL care utilizează cefotaxima ca indicator al cefalosporinei pot
fi fals pozitive pentru tulpini de Klebsiella oxytoca cu hiperproducție a β-lactamazelor K1
cromozomiale (de tip OXY). Un fenotip similar poate fi întâlnit și la Proteus vulgaris, Proteus
penneri, Citrobacter koseri și Kluyvera spp. și la unele specii din grupul C. koseri precum C.
sedlakii, C. farmeri și C. amalonaticus, care au β-lactamaze cromozomiale care sunt inhibate de
acid clavulanic. O altă cauză posibilă a rezultatelor fals pozitive este hiperproducția de β-lactamaze
cu spectru larg asemănător cu SHV-1-, TEM-1- sau OXA-1 combinate cu permeabilitate
modificată. Probleme similare cu rezultatele testelor fals pozitive pentru K. oxytoca care produce
K1 sau pentru E. coli producător de OXA-1 pot apărea, de asemenea, atunci când se utilizează
teste de confirmare bazate numai pe cefepimă.

Detectarea fenotipică a ESBL în prezența altor β-lactamaze care

maschează sinergia
Testele neconcludente (metode gradient) și testele fals negative (CDT, DDST, metode
gradient și microdiluții în bulion) pot rezulta din expresia la nivel înalt a β-lactamazelor AmpC,
care maschează prezența ESBL. Tulpinile cu exprimare la nivel înalt a β-lactamazelor tip AmpC
de obicei prezintă o rezistență clară la cefalosporinele de generația a treia. În plus, rezistența la
cefamicine, de exemplu CMI la cefoxitină > 8 mg/L, poate indica o exprimare la nivel înalt a β-
lactamazelor AmpC, cu rara excepție a β-lactamazelor ACC, care nu conferă rezistență la
cefoxitină.
Prezența ESBL poate fi, de asemenea, mascată de carbapenemaze, cum ar fi MBL sau KPC
(dar nu enzime OXA-48-like) și/sau defecte severe ale permeabilității. Dacă detectarea ESBL este
considerată relevantă, în astfel de cazuri ar trebui utilizate metode moleculare pentru detectarea
ESBL.

Confirmare genotipică
Pentru confirmarea genotipică a prezenței genelor ESBL există o serie de posibilități
disponibile variind de la PCR și secvențiere, până la secvențierea genomului întreg, urmată de
cartografierea în silico a genelor de rezistență. Există, de asemenea, diferite sisteme microarrays
disponibile.

Enterobacterales producătoare de AmpC β-lactamază

Cefalosporinazele de tip AmpC sunt β-lactamaze Ambler clasa C. Hidrolizează
penicilinele, cefalosporinele (inclusiv a treia generație, dar în general nu a patra generație) și
monobactami. În general, enzimele de tip AmpC sunt slab inhibate de inhibitori clasici ai ESBL,
în special acidul clavulanic.
Numeroase Enterobacterales și alți bacili Gram-negativi produc AmpC naturale, fie
constitutiv la un nivel jos (de exemplu, E. coli, Shigella spp.), fie inductibil (de exemplu,
Enterobacter spp., Citrobacter freundii, Morganella morganii, Pseudomonas aeruginosa).
Depresarea sau hiperproducția AmpC-urilor naturale se datorează diferitelor modificări genetice
și conferă rezistență la nivel înalt la cefalosporine și la combinațiile penicilinelor cu inhibitori ai
β-lactamazei.

32
 Metode recomandate pentru detectarea AmpC dobândită la
Enterobacterales
Un CMI la cefoxitină > 8 mg/L (diametrul zonei <19 mm) combinat cu rezistența fenotipică
la ceftazidimă și/sau cefotaximă (așa cum este definită de punctele de ruptură) poate fi utilizată
drept criteriu fenotipic pentru investigarea producției de AmpC la Enterobacterales din grupa 1,
deși această strategie nu va detecta ACC-1, o AmpC mediată de plasmide care nu hidrolizează
cefoxitina. Trebuie remarcat faptul că rezistența la cefoxitină se poate datora și deficitului de
porine.

Rezistența bacililor Gram-negativi la polimixina B

Rezistența dobândită la polimixină la Enterobacterales a apărut în ultimii ani în întreaga
lume.
Este în special îngrijorătoare apariția rezistenței mediate de plasmide atât la animale,
produse alimentare și oameni, deoarece există o tendință accentuată spre diseminare orizontală.
Laboratoarele trebuie să utilizeze întotdeauna metoda microdiluțiilor în bulion pentru
testarea susceptibilității la colistin și să utilizeze întotdeauna sulfat de colistină. Mai exact,
difuzimetria cu disc și testele de gradient nu trebuie utilizate, deoarece acestea sunt asociate cu un
risc ridicat de erori mari și foarte mari (”major error” și ”very major error”).
Controlul calității trebuie efectuat atât cu o tulpină de control sensibilă (E. coli ATCC
25922 sau P. aeruginosa ATCC 27853) și E. coli rezistent la colistină NCTC 13846 (mcr-1
pozitiv). Pentru E. coli NCTC 13846, valoarea țintă a CMI este de 4 mg/L și doar ocazional poate
fi 2 sau 8 mg/L.

Staphylococcus aureus rezistent la meticilină (MRSA)

Definiție – tulpini de S. aureus cu o proteină auxiliară de legare a penicilinei
(PBP2a/PBP2c codificată de mecA sau gene mecC) pentru care agenții β-lactamici au afinitate
scăzută, cu excepția noii clase de cefalosporine cu activitate anti-MRSA (ceftarolină și
ceftobiprol).
Unele izolate exprimă rezistență la nivel scăzut la oxacilină, dar sunt mecA și mecC
negative și nu produc PBP alternative [S. aureus sensibile la limită (Borderline oxacillin-resistant
S. aureus - BORSA)]. Aceste tulpini sunt relativ rare și mecanismul de rezistență este slab
caracterizat, dar poate include hiperproducția β-lactamazelor sau alterarea PBP preexistente.

Detectare prin determinarea CMI sau difuzimetrie cu disc

Expresia heterogenă a rezistenței afectează în special CMI la oxacilină, care poate apărea
sensibilă. Disc difuzia utilizând oxacilină este descurajată și diametrul zonei interpretative nu este
inclus în tabelul punctelor de ruptură EUCAST din cauza corelației slabe cu prezența mecA (cu
excepția Staphylococcus pseudointermedius, Staphylococcus schleiferi și Staphylococcus
coagulans).
Tulpinile de S. aureus, S. lugdunensis și S. saprophyticus la care valoarea CMI la oxacilină
este mai mare de 2 mg/L sunt foarte probabil meticilino-rezistente datorită prezenței genei mecA

33
sau mecC. Pentru stafilococii coagulazo-negativi, alții decât S. saprophyticus și S. lugdunensis
valoarea CMI la oxacilină pentru izolatele meticilino-rezistente este mai mare de 0,25 mg/L.
Cefoxitina este un marker foarte sensibil și specific al mecA/mecC inclusiv la tulpinile cu
exprimare heterogenă.

Microdiluție în bulion:
Se utilizează metodologia standard (ISO 20776-1) și tulpinile cu CMI la cefoxitină > 4
mg/L sunt raportate ca rezistente la meticilină.

Difuzimetrie cu disc
Se utilizează metoda EUCAST. Tulpinile cu diametrul zonei de inhibiție la cefoxitină (disc
de 30 µg) <22 mm trebuie raportate ca rezistente la meticilină.

Detectarea cu metode genotipice și latex-aglutinare

Detectarea genotipică a genelor mecA și mecC prin PCR sau detectarea proteinei PBP2a
cu kituri de aglutinare din latex este posibilă folosind teste comerciale. PBP2c nu este detectată de
majoritatea testelor comerciale.

Staphylococcus aureus rezistent la vancomicină

VRSA: S. aureus rezistent la vancomicină: S. aureus cu rezistență la nivel înalt la
vancomicină (CMI> 8 mg/L).
VISA: S. aureus intermediar la vancomicină: S. aureus cu rezistență scăzută la
vancomicină (CMI 4 - 8 mg/L).
hVISA: S. aureus heterogen intermediar la vancomicină: S. aureus sensibil la vancomicină
(CMI ≤2 mg/L), dar cu populații minoritare (1 din 106 celule) cu CMI la vancomicină >2 mg/L,
observat prin analiza profilului populației bacteriene.
Trebuie remarcat faptul că, deși acești termeni se utilizează în continuare, toate categoriile
menționate mai sus trebuie considerate rezistente din punct de vedere clinic.
CMI trebuie determinat întotdeauna atunci când se utilizează vancomicină pentru a trata
un pacient cu infecție severă cu S. aureus. În cazuri selectate, de ex. când este suspectat eșecul
terapeutic, în special în infecții sistemice, testarea pentru hVISA poate fi, de asemenea, justificată
(prezența hVISA este considerat factor de prognostic pentru o evoluție nefavorabilă) . Datorită
complexității confirmării hVISA, supravegherea antimicrobiană este axată pe detectarea VISA și
VRSA.

Metode recomandate pentru detectarea rezistenței la vancomicină

Difuzimetria cu disc nu poate fi utilizată pentru a detecta hVISA, VISA, sau VRSA.
Determinarea CMI - Metoda microdiluțiilor în bulion recomandată de EUCAST (ISO
20776-1) este standardul de aur.
Trebuie remarcat faptul că rezultatele obținute prin metoda gradientului pot fi cu 0,5-1
diluții duble mai mari decât rezultatele obținute prin microdiluția în bulion. Punctul de ruptură

34
EUCAST pentru rezistența la vancomicină la S. aureus este CMI > 2 mg/L. Izolatele cu CMI
confirmat >2 mg/L (conform metodei microdilutiei în bulion) trebuie trimise la un laborator de
referință.
Fenotipul hVISA nu poate fi detectat prin determinarea CMI.

Enterococcus faecium și Enterococcus faecalis rezistent la

vancomicină
Definiție: Enterococcus faecium sau Enterococcus faecalis cu rezistență la vancomicină
(VRE) având CMI la vancomicină > 4 mg/L.
Enterococii, în special E. faecium, sunt în general rezistenți la antibioticele disponibile.
Prin urmare, tratamentul infecțiilor cauzate de enterococi rezistenți la vancomicină (VRE) este
dificil, cu puține opțiuni de tratament.

Tabelul 3. Valorile concentrației minime inhibitorii ale glicopeptidelor la tulpinile de VRE

(enterococi vancomicino-rezistenți) în funcție de substratul genetic
Glicopeptide CMI (mg/L)
VanA VanB
Vancomicină 64 – 1024 4 – 1024
Teicoplanină 8 – 512 0.06 – 1

Alte specii de enterococi (E. raffinosus, E. gallinarum și E. casseliflavus) pot conține vanA,
vanB sau alte gene van care codifică enzimele enumerate mai sus, dar aceste tulpini sunt relativ
rare. Enzimele VanC codificate cromozomial se găsesc la toate izolatele de E. gallinarum și E.
casseliflavus. VanC mediază rezistența la vancomicină de nivel scăzut (CMI 4-16 mg/L), dar acest
lucru, în general, nu ar trebui să fie considerat important din punct de vedere al controlului
infecției.
Rezistența la vancomicină poate fi detectată prin determinarea CMI, difuzimetrie cu disc
și metoda punctelor de ruptură în agar. Pentru toate cele trei metode, este esențial ca plăcile să fie
incubate timp de 24 de ore. Toate cele trei metode detectează cu ușurință rezistența mediată de
vanA. Detectarea rezistenței mediată de vanB este mai dificilă. Determinarea CMI prin diluții în
agar sau în bulion nu este întotdeauna fiabilă pentru vanB.
Atunci când se interpretează rezultatele testului CMI sau difuzimetrie cu disc, este
importantă verificarea că izolatul nu este E. gallinarum sau E. casseliflavus, care pot fi identificați
în mod eronat ca E. faecium.
Determinarea CMI poate fi efectuată prin diluții în agar, microdiluții în bulion sau
gradient CMI. Microdiluția în bulion se realizează conform standardului ISO 20776-1, așa cum
este recomandat de EUCAST.
Pentru difuzimetrie cu disc, metoda specificată de EUCAST trebuie urmată întocmai. Se
inspectează zonele pentru margini neclare și/sau microcolonii cu lumină transmisă. Tulpinile la
care diametrul este mai mare decât punctul de ruptură și marginile zonei de inhibiție sunt clar
delimitate pot fi raportate ca fiind sensibile la vancomicină. Izolatele cu marginile zonei de

35
inhibiție neclare sau colonii în interiorul zonei sunt rezistente indiferent de dimensiunea zonei și
nu se raportează sensibile fără confirmare prin determinarea CMI. Difuzimetria cu disc este
efectuată în conformitate cu metodologia EUCAST pentru organismele non-fastidioase. Este
nevoie de incubare pentru 24 de ore pentru a detecta rezistența.
Metoda diluțiilor în agar utilizează agar infuzie cord-creier și 6 mg/L vancomicină.
Plăcile pot fi obținute de la producători comerciali sau preparate în laborator. Testul se realizează
prin aplicarea a 1 x 105 - 1 x 106 UFC (10 µl dintr-o suspensie de 0,5 McFarland) pe agarul infuzie
cord-creier suplimentat cu vancomicină. Este necesară incubarea timp de 24 de ore la 35 ± 1°C în
atmosferă aerobă pentru a detecta rezistența la izolatele cu rezistență inductibilă. Creșterea mai
multor colonii este considerată ca test pozitiv.
Testarea genotipică - rezistența la vancomicină poate fi detectată de asemenea prin
utilizarea PCR care vizează genele vanA și vanB folosind metode interne ”in house” sau
comerciale.

Recomandări de efectuare a testelor fenotipice rapide pentru

detectarea mecanismelor de rezistență
1. Determinarea tipurilor de carbapenemază prin teste fenotipice rapide
Se includ: izolatele clinice semnificative, cu rol cert în infecție
 infecții invazive (la hemoculturi atenție la izolatele provenite din recoltări prin catetere în
lipsa creșterii din probele de la periferie)
 creștere semnificativă din produse calitativ bune ale tractului respirator inferior
 urocultură - pacient cu ITU (nu în bacteriurii asimptomatice)
 colecții purulente recoltate prin aspirare/biopsie
Se testează în funcție de posibilitățile laboratorului:
 izolatele provenite din screening
 colonizanții
 izolatele obținute din leziuni superficiale, cu rol incert în infecție
Momentul efectuării testului
 Hemocultură:
 direct din flacon (se utilizează teste specific dezvoltate pentru acest scop, atenție la
recomandările producătorului) - după consultare cu clinicianul în cazul în care
pacienții au risc crescut pentru infecții cu bacterii MDR:
- pacient plurispitalizat
- pozitivarea hemoculturii la pacienți tratați cu antibiotice cu spectru larg
- secție cu endemicitate crescută cu CPE
 din cultura bacteriană
- înainte de antibiogramă
o când există certitudinea că izolatul este semnificativ clinic
o pacientul provine de la o secție cu endemicitate mare de CPE

36
 În cazul prezenței criteriilor de alertă pentru carbapenemază
o alte izolate semnificative
 Din cultură, în cazul prezenței criteriilor de alertă

2. Determinarea prezenței PBP2a la Staphylococcus aureus

a.La toate izolatele obținute din infecții invazive - din cultură, înainte de efectuarea antibiogramei
(dacă nu sunt disponibile metode moleculare)
Rezultatul preliminar se comunică telefonic
b.La alte izolate semnificative de S. aureus
 În cazul în care există probleme de interpretarea diametrului din jurul discului de
cefoxitină
 În caz de urgență (în urma consultării cu clinicianul) înaintea efectuării antibiogramei -
rezultatul se comunică

VII. Rezistența predictibilă și fenotipuri neobișnuite. Reguli

EXPERT.
https://www.eucast.org/expert_rules_and_intrinsic_resistance/
Scopul tabelelor ”Rezistențe predictibile și fenotipuri neobișnuite” este de a servi ca
instrument pentru validarea identificării speciilor și/sau a rezultatelor testelor de susceptibilitate.
Absența rezistenței predictibile sau prezența unui fenotip neobișnuit indică faptul că laboratorul ar
trebui să verifice identificarea speciilor, rezultatele testului de sensibilitate sau ambele.
https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Expert_Rules/202
3/Expected_Resistant_Phenotypes_v1.2_20230113.pdf
https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Expert_Rules/202
2/Expected_Susceptible_Phenotypes_Tables_v1.1_20220325.pdf
„Regulile EXPERT” sunt sfaturi generale privind susceptibilitatea sau rezistența unei
specii (sau a unui grup de specii) împotriva unuia sau mai multor agenți, care pot fi deduse de la
nivelul de rezistență sau susceptibilitate la unul sau mai mulți agenți sau de la identificarea unui
mecanism de rezistență. Cel mai adesea regulile indică când să se evite utilizarea antimicrobienelor
care pot duce la eșecul tratamentului. În plus, oferă sfaturi cu privire la modul de gestionare a
situațiilor care sunt în prezent controversate sau nerezolvate.

VIII. Controlul calității

Se utilizează tulpinile de referință pentru controlul calității indicate în documentele
disponibile pe https://www.eucast.org/ast_of_bacteria/quality_control/ pentru a evalua
performanțele testului. Principalele tulpini recomandate pentru control sunt sensibile, dar se pot

37
utiliza și tulpini rezistente pentru a confirma dacă metoda va detecta rezistența prin mecanisme
cunoscute.
Pentru a verifica componenta inhibitorie a discurilor cu asocieri β-lactam - inhibitor de β-
lactamază se recomandă utilizarea unor tulpini producătoare de β-lactamaze. Acest aspect trebuie
să facă parte din controlul de rutină al calității. Compusul activ, antibioticul, este testat utilizând o
tulpină sensibilă.
Tulpinile de control se stochează în condiții care să le asigure viabilitatea și păstrarea
caracteristicilor. Stocarea pe bile de sticlă la -70°C în bulion cu glicerol, (sau un echivalent
comercial) reprezintă o metodă convenabilă. Organismele nepretențioase pot fi păstrate la -20°C.
Trebuie păstrate două tuburi cu fiecare tulpină de control, unul pentru utilizare, iar altul de rezervă,
pentru înlocuirea celui în uz, la nevoie.
În fiecare săptămână, trebuie subcultivată o bilă din tubul utilizat, pe un mediu neselectiv
și verificată puritatea.
Când se face subcultivarea unei tulpini de control, se utilizează mai multe colonii pentru a
evita selectarea unei colonii mutante.
Se verifică dacă rezultatele obținute pentru tulpinile de control se încadrează în limitele
acceptabile înscrise în tabelele de control EUCAST de pe pagina de web http://www.eucast.org.
În tabelele de control al calității EUCAST sunt indicate atât limitele de acceptabilitate cât
și valorile țintă. Repetarea testării tulpinilor de control EUCAST trebuie să genereze rezultate
aleatorii încadrate în limitele recomandate. Dacă numărul de teste este ≥10, media diametrelor
zonelor de inhibiție trebuie să fie apropiată de valoarea țintă (la o diferență de ±1 mm față de
valoarea țintă).
Se folosesc tulpinile de control recomandate pentru a monitoriza performanțele testului.
Testele de control trebuie efectuate și verificate zilnic, sau de cel puțin 4 ori pe săptămână
pentru antibioticele ce fac parte din panelul utilizat pentru testarea de rutină.
În fiecare zi în care se efectuează testări, se verifică rezultatele ultimelor 20 de teste
consecutive. Examinează rezultatele pentru a observa tendințele și rezultatele care sunt constant
sub sau peste valoarea țintă. Dacă două sau mai multe rezultate din 20 de teste sunt în afara
limitelor, este necesară investigarea cauzelor.
Dacă două teste consecutive sunt în afara intervalului sau dacă mai multe discuri sunt în
afara intervalului într-o zi, se investighează cauzele înainte de a raporta rezultatele testelor de
susceptibilitate pentru izolatele de la pacienți. Este posibil să fie necesar ca testele să fie repetate.
Dacă rezistența unei tulpini de control rezistente nu este recunoscută, atunci se suprimă
rezultatele testelor de susceptibilitate pentru izolatele clinice, se investighează și se retestează.
Atunci când sunt investigate posibile surse de erori în difuzia discului, se iau în
considerare probleme legate de discuri antimicrobiene, medii de cultură, condiții de testare și
calitatea tulpinilor de control.
Pe lângă efectuarea controlului calității de rutină, se testează fiecare lot nou de agar
Mueller-Hinton pentru a se asigura că toate zonele de inhibiție sunt în interiorul limitelor.

38
 Aminoglicozidele pot indica o variație inacceptabilă a cationilor divalenți în mediu.
Tigeciclina poate indica o variație a magneziului, trimetoprim-sulfametoxazol va decela probleme
ale concentrației de timină, iar eritromicina un pH inadecvat.
Adâncimea agarului mai mare sau mai mică decât limitele acceptabile vor avea ca rezultat
diametre de zonă mai mici sau mai mari, respectiv.
Zone de inhibiție pentru aminoglicozide cu P. aeruginosa ATCC 27853 sub sau peste
limitele de control al calității pot indica concentrații mari sau scăzute de cationi divalenți (Ca2 +,
Mg2 +).
Excesul de timină și timidină poate fi indicat de zonele de inhibiție pentru trimetoprim-
sulfametoxazol și E. faecalis ATCC 29212 sub limitele de control.

IX. Seturile de antibiotice recomandate pentru testare

Tabelul nr. 1 Enterobacterales*
Lista standard Lista complementară
Ampicilina Tobramicină (pentru administrare locală)
Amoxicilină / acid clavulanic Levofloxacină
Piperacilină / tazobactam Cloramfenicol (pentru administrare locală)
Cefuroximă Tigeciclina (difuzimetric se testează doar pentru
Cefoxitină Escherichia coli)
Cefotaximă sau ceftriaxonă Colistin (doar microdiluții)
Ceftazidimă Azitromicina (Salmonella Typhi, Shigella spp.)
Cefepim Ceftazidimă/avibactam
Imipenem Ceftolozan/tazobactam
Meropenem Aztreonam
Ertapenem Imipenem/relebactam
Amikacin
Gentamicina Izolate urinare
Ciprofloxacină Norfloxacină
Trimetoprim/sulfametoxazol Nitrofurani
Fosfomicină

Infecții cu punct de plecare urinar (E. coli și

Klebsiella spp, excepție Klebsiella aerogenes):
Cefazolina
*pentru situații particulare de testare în funcție de fenotipul de rezistență consultați capitolul X.

Tabelul nr. 2: Pseudomonas aeruginosa

Lista standard Lista complementară
Piperacilină - tazobactam Aztreonam
Ceftazidimă Levofloxacină
Cefepim Colistin**
Imipenem Fosfomicină
Meropenem Ceftazidimă-avibactam**
Tobramicină (pentru administrare locală) Ceftolozan-tazobactam**
Amikacin Imipenem/relebactam
Ciprofloxacină
Colistin*

39
 Ceftazidimă-avibactam* **în cazul altor izolate decât cele menționate la lista
Ceftolozan-tazobactam* standard
*în cazul izolatelor din tractul respirator, hemocultură
sau LCR
*pentru situații particulare de testare în funcție de fenotipul de rezistență consultați capitolul X.

Tabelul nr. 3: Acinetobacter spp.

Lista standard Lista complementară
Imipenem
Gentamicina
Tobramicină
Amikacin
Ciprofloxacină
Levofloxacină
Meropenem
Trimetoprim/sulfametoxazol
Colistin
*pentru situații particulare de testare în funcție de fenotipul de rezistență consultați capitolul X.

Tabelul nr. 4: Stenotrophomonas maltophilia

Lista standard
Trimetoprim/sulfametoxazol

Tabelul nr. 5: Burkholderia pseudomallei

Lista standard
Amoxicilină - acid clavulanic
Ceftazidime
Meropenem
Imipenem
Tetraciclină
Trimetoprim-sulfametoxazol

Tabelul nr. 6: Staphylococcus spp.

Lista standard Lista complementară
Penicilina G Ceftarolina - doar la MRSA
Cefoxitină (citire interpretativă, se raportează Daptomicina - doar la MRSA și doar prin determinare
oxacilină + fenotip) CMI
Gentamicină Vancomicină - algoritm de testare în capitolul X
Eritromicină Teicoplanin
Clindamicină Kanamicină (pentru administrare locală, determinarea
Norfloxacină (screening pentru sensibilitate la sensibilității față de amikacină)
fluorochinolone, rezultatul testării pentru norfloxacină Tobramicină (pentru administrare locală)
nu se raportează) Tetraciclină
Tigeciclina
Acid fusidic Linezolid
Trimetoprim/sulfametoxazol Levofloxacină
Rifampicină Moxifloxacină
Ciprofloxacină
Nitrofurantoina (pentru infecţii urinare)
Mupirocin (pentru administrare locală)
Fosfomicină (pentru infecţii urinare)

40
 Tabelul nr. 7: Enterococcus spp.
Lista standard Lista complementară
Ampicilina Imipenem
Gentamicina concentrație crescută Ciprofloxacină (infecții urinare)
Vancomicină Nitrofurantoina (infecții urinare)
Teicoplanin Tigeciclina
Linezolid
Fosfomicină

Tabelul nr. 8: Streptococcus pneumoniae

Lista standard Lista complementară
Oxacilina (pentru penicilina screening) Penicilina G (CMI)
Eritromicina Cefotaximă sau ceftriaxonă (CMI)
Clindamicina Ampicilina sau amoxicilina(CMI)
Tetraciclină Alte beta-lactamine
Norfloxacină (screening) Levofloxacină sau moxifloxacină
Vancomicina sau teicoplanina Doxiciclina
Cloramfenicol
Pentru izolatele invazive se determină CMI la Rifampicină
penicilina G (CMI), cefotaximă sau ceftriaxonă (CMI) Trimetoprim/sulfametoxazol
Gentamicina

Tabelul nr. 9: Streptococi grup A, B, C

Lista standard Lista complementară
Eritromicină Penicilina G (infecții invazive)
Clindamicină Norfloxacină (doar screening - nu se raportează)
Tetraciclină Fluorochinolone (dacă screening-ul cu norfloxacină
este pozitiv se testează moxifloxacină și
levofloxacină)
Vancomicină
Teicoplanin
Tigeciclina
Trimetoprim/sulfametoxazol
Cloramfenicol
Linezolid
Rifampicină
Nitrofurantoina (infecții urinare SGB)

Tabelul nr. 10: Alți streptococi

Lista standard Lista complementară
Penicilina G Alte beta-lactame
Ampicilina Moxifloxacină (CMI)
Cefotaximă sau ceftriaxonă Vancomicină
Eritromicina Teicoplanin
Clindamicina Tigeciclina
Trimetoprim/sulfametoxazol
Cloramfenicol
Linezolid
Rifampicină

41
 Tabelul nr. 11 Listeria monocytogenes
Lista standard
Penicilina G
Ampicilină
Meropenem
Eritromicina
Trimetoprim/sulfametoxazol

Tabelul nr. 12 Corynebacterii

Lista standard Lista complementară
Penicilina G
Clindamicina
Ciprofloxacină
Tetraciclină
Vancomicină
Moxifloxacină
Rifampicină
Linezolid

Tabelul nr. 13 Haemophilus spp.

Lista standard Lista complementară
Penicilina G (screening) Cefixime (dacă screeningul cu penicilină este pozitiv)
Ampicilina Cefotaxime, ceftriaxonă (dacă screeningul cu
Amoxicilină - acid clavulanic penicilină este pozitiv)
Tetraciclină Meropenem (dacă screeningul cu penicilină este
Trimetoprim/sulfametoxazol pozitiv)
Acid nalidixic (screening) Cloramfenicol
Rifampicină
Moxifloxacină, ciprofloxacină, levofloxacină (dacă
screeningul de acid nalidixic este pozitiv)
Gentamicina
Doxiciclină (numai prin metode cantitative)

Tabelul nr. 14 Moraxella catarrhalis

Lista standard Lista complementară
Amoxicilină - acid clavulanic Cefixime
Eritromicina Cefotaxime
Tetraciclină Cloramfenicol
Trimetoprim/sulfametoxazol Ciprofloxacină
Acid nalidixic (screening)

Tabelul nr. 15 Pasteurella multocida

Lista standard Lista complementară
Penicilina G Cefotaximă
Amoxicilină - acid clavulanic
Tetraciclină
Trimetoprim/sulfametoxazol
Acid nalidixic (screening)

Tabelul nr. 16 Helicobacter pylori

Lista standard Lista complementară
Amoxicilină Tetraciclină
Claritromicină Rifampicină

42
 Levofloxacină
Metronidazol

Tabelul nr. 17 Campylobacter spp.

Lista standard
Eritromicină
Ciprofloxacină
Tetraciclină

X. Recomandări de testare a antibioticelor de rezervă în

funcție de fenotipul de rezistență și situațiile clinice în care
pot fi utilizate
Tabelul 1. Recomandări de testare a antibioticelor ”vechi” în funcție de fenotipuri de
rezistență

Antibioticele CRAB BLSE CRPA CRE - CRE –CRE – CRE -Indicații

“vechi” non-MBL non-CP KPC OXA48 MBL

Polimixine da da da da da da da infecții cu Gram-

(colistin) negativi la
pacienți cu
opțiuni limitate

Aminoglicozide ± ± ± ± ± ± ±

Fosfomicina i.v. Nu da ± ± ± ± ± infecții cu Gram-

negativi la
pacienți cu
opțiuni limitate
(determinare
CMI - excepție
E. coli)

43
 Aztreonam nu nu ± nu nu nu ± Infecții cu Gram-
negativi sensibili
la aztreonam

Tigeciclina* - da nu da da da da SSTIc , IAI

*testare doar în cazul tulpinilor de Escherichia coli și Citrobacter koseri

Indicații pentru determinarea CMI la colistin

a. Enterobacterales CPE
i. Izolate semnificative clinic
ii. Se exclud izolatele screening și cele care au relevanță clinică îndoielnică
b. Pseudomonas aeruginosa
i. Izolate MDR semnificative clinic
ii.Toate izolatele provenite din hemoculturi
c. Acinetobacter baumannii
i. Izolatele provenite din hemoculturi
ii. Alte izolate semnificative, asociate cu infecție

Determinarea CMI la vancomicină în cazul tulpinilor de Staphylococcus

spp. se impune pentru
a. Toate izolatele provenite din infecții invazive
i. rezultatul se comunică doar în cazul fenotipului meticilino-rezistent sau în urma
discuției cu clinicianul, în situații clinice care justifică utilizarea vancomicinei
(de ex. alergie la antibiotice beta-lactamice)
b. Izolate non-invazive cu fenotip meticilino-rezistent semnificative clinic
c. Izolate non-invazive cu fenotip meticilino-sensibil semnificative clinic în cazul alergiei
la beta-lactamine

Testarea antibioticelor și a combinațiilor de antibiotice ”noi”

(aprobate recent)
La pacienții cu infecții severe (infecții complicate de tract urinar, infecții intraabdominale
complicate, pneumonie nosocomială, pneumonie de ventilație, infecții invazive, infecții
complicate ale pielii și țesuturilor moi) de la care se izolează bacterii cu rezistențe extinse se
recomandă testarea antibioticelor și combinațiilor de antibiotice noi, recent introduse în tratamente.
Rezultatul testării la acestea se va comunica exclusiv în situațiile în care nu există alte
antibiotice cu activitate păstrată.

44
Tabelul 2. Spectrul de activitate al antibioticelor ”noi” față de bacteriile Gram-negative rezistente la carbapeneme, în funcție de
indicațiile aprobate și activitate in vitro documentată

Antibioticele CRAB BLSE CRPA CRE - CRE - CRE – CRE - Indicații

“noi” non nonCP KPC OXA48 MBL
MBL

Ceftolozan/ Nu da da nu nu nu nu ITUc, IAIc, HAP, VAP

tazobactam

Ceftazidimă/ nu da da ± da da nu ITUc, IAIc, HAP, VAP, infecții cu

avibactam Gram-negativi la pacienți cu opțiuni
limitate

Meropenem/ Nu da nu ± da nu nu ITUc, HAP, VAP, infecții cu Gram-

vaborbactam negativi la pacienți cu opțiuni limitate

Imipenem/ Nu da da ± da nu nu ITUc, IAIc, HAP, VAP, BSI cu origine

relebactam respiratorie, infecții cu Gram-negativi
la pacienți cu opțiuni limitate

Cefiderocol da da da da da da da ITUc, HAP, VAP, infectii cu Gram-

negativi la pacienți cu opțiuni limitate

45
Prescurtări: CRAB - Acinetobacter baumannii rezistent la carbapeneme, BLSE - beta-lactamaze cu spectru extins, CRPA non MBL -
Pseudomonas aeruginosa rezistent la carbapeneme neproducător de metalo-beta-lactamaze, CRE - nonCP - enterobacterii rezistente la
carbapeneme neproducătoare de carbapenemaze, CRE - KPC - enterobacterii rezistente la carbapeneme producătoare de enzime KPC,
CRE – OXA48 - enterobacterii rezistente la carbapeneme producătoare de enzime OXA-48, CRE - MBL - enterobacterii rezistente la
carbapeneme producătoare de metalo-beta-lactamaze.

ITUc - infecții complicate de tract urinar, IAIc – infecții intraabdominale complicate, HAP – pneumonie dobândită în spital, VAP
pneumonie de ventilatie, BSI – infectii invazive, SSTIc – infecții complicate ale pielii și țesuturilor moi

46
Opțional pot fi testate și antibioticele noi indisponibile deocamdată în scop terapeutic în România
(ex. cefiderocol sau meropenem/vaborbactam), pentru documentarea activității antimicrobiene.

XI. Raportarea antibiogramelor

Principii de raportare selectivă a rezultatelor testării

sensibilității
În vederea limitării (descurajării) prescrierii antibioticelor cu spectru larg în cazul izolatelor
sălbatice (fără mecanism de rezistență), rezultatele antibiogramelor se raportează selectiv.
În cazul izolatelor ce au mecanisme de rezistență se raportează toate antibioticele
semnificative față de care se obține rezistență și la nevoie se extinde lista antibioticelor cu
sensibilitate raportate.
În cazul în care sunt izolate mai multe specii bacteriene semnificative dintr-un produs, setul
antibioticelor raportate se lărgește în așa fel, încât să se faciliteze alegerea antibioticelor active pe
ambele specii bacteriene.
În funcție de specia bacteriană izolată, în caz de sensibilitate păstrată se vor raporta
următoarele antibiotice:

Tabelul 1. Antibiotice raportate selectiv în cazul izolatelor bacteriene fără mecanisme de

rezistență
Antibiotice raportate Observații
Enterobacterii
Ampicilină
Cefuroximă
Gentamicină
Nitrofurantoin Se raportează doar pentru E. coli în ITU necomplicat
Fosfomicină Cu administrare orală, se raportează doar pentru E. coli
în ITU necomplicat
Norfloxacin Se raportează doar în ITU necomplicat
Trimetoprim-sulfametoxazol Se raportează doar în ITU
Pseudomonas aeruginosa
Ceftazidimă
Piperacilină/tazobactam
Amikacină
Ciprofloxacină Doar în ITU
Staphylococcus spp:
Penicilină
Oxacilină
Eritromicină
Clindamicină
Trimetoprim+sulfametoxazol
Nitrofurantoină Se raportează doar în ITU
Enterococcus faecalis

47
 Ampicilină
Ciprofloxacină Se raportează doar în ITU necomplicat
Nitrofurantoină Se raportează doar în ITU necomplicat
Enterococcus faecium
Se raportează integral
Ciprofloxacină Se raportează doar în ITU necomplicat
Acinetobacter baumannii
Imipenem
Meropenem
Gentamicină
Streptococcus pneumoniae
Penicilină
Eritromicină
Trimetoprim+sulfametoxazol
Streptococi de grup viridans
Penicilină În endocardită se comunică și valoarea CMI
Ampicilină
Haemophilus spp.
Ampicilină
Trimetoprim+sulfametoxazol
ITU - infecție de tract urinar; CMI - concentrația minimă inhibitorie

XII. Comentarii privind fenotipurile de rezistență, dozele de

antibiotice recomandate, rezistențele naturale și posibilități
de extrapolare a rezultatelor
Comentariile privind principalele fenotipuri de rezistență, dozele de antibiotice
recomandate de către EUCAST, rezistențele naturale mai importante și posibilitățile de extrapolare
a rezultatelor sunt sumarizate în tabelul 2.

Tabelul 1. Comentarii generale

Condiții Comentariu

Antibiogramă raportată selectiv Antibiogramă selectivă! La nevoie, vă

rugăm să contactați laboratorul pentru mai
multe informații legate de antibiogramă.

Tulpina rezistentă la cel puțin un reprezentant din Tulpină MDR

cel puțin 3 clase de antibiotice

Tulpină sensibilă numai la 1- 2 clase de antibiotice Tulpină XDR

Tulpină la care se constată lipsa sensibilității la Tulpină PDR

toate clasele de antibiotice

48
 Încadrarea bacteriilor în fenotipuri de rezistență MDR, XDR sau PDR se va aplica în cazul
bacteriilor din ordinul Enterobacterales (cu excepția Salmonella, Shigella), Pseudomonas
aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Staphylococcus aureus și Enterococcus faecalis,
Enterococcus faecium, în funcție de criteriile stabilite în tabelele II-VI.

Tabelul 2. Criterii de încadrare în categoriile MDR, XDR, PDR a tulpinilor de

Staphylococcus aureus:
Pentru MDR: se aplică un criteriu dintre următoarele:
- MRSA (tulpinile MRSA întotdeauna se vor considera MDR)
- rezistență față de cel puțin un antibiotic din cel puțin 3 clase de antibiotice
Pentru XDR: tulpina este sensibilă la cel mult două clase de antibiotice.
Pentru PDR: tulpina este rezistentă față de toate antibioticele testate. Această categorie poate fi
stabilită doar în situația testării tuturor categoriilor de antibiotice din tabel.
Clasă antibiotic Antibiotic

Aminoglicozide Gentamicină

Ansamicine Rifampicina

Beta-lactamine antistafilococice Oxacilina

Beta-lactamine anti-MRSA Ceftarolina

Fluorochinolone Screening pozitiv cu norfloxacin

Inhibitori ai metabolismului folaților Trimetoprim/sulfametoxazol

Fucidani Acid fusidic

Glicopeptide Vancomicina (determinare CMI)

Glicilcicline Tigeciclina

Lincosamide Clindamicina

Lipopeptide Daptomicina (determinare CMI))

Macrolide Eritromicina

Oxazolidinone Linezolid

Acizi fosfonici Fosfomicina (determinare CMI)

Tetracicline Tetraciclină

49
Tabelul 3. Criterii de încadrare în categoriile MDR, XDR, PDR a tulpinilor de Enterococcus
faecalis, Enterococcus faecium
Pentru MDR: rezistență față de cel puțin un antibiotic din cel puțin 3 clase de antibiotice (nu se iau
în calcul antibioticele față de care specia are rezistență predictibilă)
Pentru XDR: tulpina este sensibilă la cel mult două clase de antibiotice.
Pentru PDR: tulpina este rezistentă față de toate antibioticele testate. Această categorie poate fi
stabilită doar în situația testării tuturor categoriilor de antibiotice din tabel.
Clasă antibiotic Antibiotic Rezistență
predictibilă

Aminoglicozide (excepție: streptomicina) Gentamicină - rezistență de

nivel crescut

Aminoglicozide (streptomicina) Streptomicină - rezistență

de nivel crescut

Carbapeneme Imipenem E. faecium

Fluorochinolone (raportate doar la Ciprofloxacină

izolatele urinare) Levofloxacină
Moxifloxacină

Glicopeptide Vancomicina

Glicilcicline Tigeciclina

Peniciline Ampicilina

Oxazolidinone Linezolid

Tabelul 4. Criterii de încadrare în categoriile MDR, XDR, PDR a reprezentanților ordinului

Enterobacterales:
Pentru MDR: rezistență față de cel puțin un antibiotic din cel puțin 3 clase de antibiotice (nu se iau
în calcul antibioticele față de care specia are rezistență predictibilă)
Pentru XDR: tulpina este sensibilă la cel mult două clase de antibiotice.
Pentru PDR: tulpina este rezistentă față de toate antibioticele testate. Această categorie poate fi
stabilită doar în situația testării tuturor categoriilor de antibiotice din tabel.
Tulpinile de bacterii care sunt sensibile doar la antibioticele din categoria celor noi +/- colistin se
vor încadra obligatoriu la XDR.
Clasă antibiotic Antibiotic Rezistență predictibilă

Aminoglicozide Gentamicină

Tobramicina

50
 Amikacina

Carbapeneme Ertapenem

Imipenem Morganellaceae (Morganella spp.

Providencia spp. Proteus spp)

Meropenem

Cefalosporine cu spectrul Cefazolina Citrobacter freundii, Klebsiella

îngust aerogenes, Enterobacter cloacae,
Hafnia alvei, Morganella
morganii, Proteus penneri,
Proteus vulgaris, Providencia
rettgeri, Providencia stuartii,
Serratia marcescens

Cefuroxima M. morganii, P. penneri, P.

vulgaris, S. marcescens

Cefalosporine cu spectrul Cefotaxima sau

extins ceftriaxona

Ceftazidima

Cefepima

Cefalosporine generația 5 Ceftarolina

Antibiotice noi, Cefiderocol indisponibil în România

combinații noi (beta-
lactamine cu inhibitori de Ceftazidimă/avibactam
beta-lactamază)
Notă: Aceste antibiotice se
raportează pe Ceftolozan/tazobactam
antibiograme doar în
cazul tulpinilor XDR Meropenem/vaborbactam indisponibil în România

Imipenem/relebactam

Fluorochinolone Ciprofloxacina

51
 Glicilcicline (testare doar Tigeciclina
în cazul tulpinilor de
Escherichia coli și
Citrobacter koseri)

Inhibitori ai metabolismului Trimetoprim/

folaților sulfametoxazol

Monobactami Aztreonam indisponibil în România

Peniciline Ampicilină Citrobacter koseri, C. freundii, E.

cloacae,
Escherichia hermanii, H. alvei,
Klebsiella spp., M. morganii, P.
penneri,
P. vulgaris, P. rettgeri, P. stuartii,
S. marcescens

Peniciline cu inhibitori de Amoxicilină/acid C. freundii, K. aerogenes, E.

beta-lactamază clavulanic cloacae, H. alvei,
M. morganii, P. rettgeri, P.
stuartii, S. marcescens

Ampicilină/sulbactam C. freundii, C. koseri, K.

aerogenes, E. cloacae,
H. alvei, P. rettgeri, S. marcescens

Peniciline anti- Piperacilină/tazobactam E. hermanii

Pseudomonas cu inhibitori
de beta-lactamază

Acizi fosfonici (determinare Fosfomicina

CMI)

Polimixine Colistin Morganellaceae, Serratia spp.

Tabelul 5. Criterii de încadrare în categoriile MDR, XDR, PDR a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa:
Pentru MDR: rezistență față de cel puțin un antibiotic din cel puțin 3 clase de antibiotice (nu se iau
în calcul antibioticele față de care specia are rezistență predictibilă)
Pentru XDR: tulpina este sensibilă la cel mult două clase de antibiotice.
Pentru PDR: tulpina este rezistentă față de toate antibioticele testate. Această categorie poate fi
stabilită doar în situația testării tuturor categoriilor de antibiotice din tabel.
Tulpinile care sunt sensibile doar la antibioticele din categoria celor noi +/- colistin se vor încadra
obligatoriu la XDR.

52
Clasă antibiotic Antibiotic

Aminoglicozide Amikacină

Tobramicina

Carbapeneme Meropenem

Imipenem

Cefalosporine Ceftazidima

Cefepima

Combinații noi de antibiotice, (Cefiderocol) - indisponibil în România

antibiotice noi
Ceftazidimă/avibactam

Ceftolozan/tazobactam

Imipenem/relebactam

(Meropenem/vaborbactam) - indisponibil în
România

Fluorochinolone Ciprofloxacina

Levofloxacină

Monobactami Aztreonam

Peniciline anti-Pseudomonas cu Piperacilină/tazobactam

inhibitori de beta-lactamază

Polimixine Colistin

53
Tabelul 6. Criterii de încadrare în categoriile MDR, XDR, PDR a speciilor din complexul
Acinetobacter baumannii
Pentru MDR: rezistență față de cel puțin un antibiotic din cel puțin 3 clase de antibiotice (nu se iau
în calcul antibioticele față de care specia are rezistență predictibilă)
Pentru XDR: tulpina este sensibilă la cel mult două clase de antibiotice.
Pentru PDR: tulpina este rezistentă față de toate antibioticele testate. Această categorie poate fi
stabilită doar în situația testării tuturor categoriilor de antibiotice din tabel.
Clasă antibiotic Antibiotic

Aminoglicozide Amikacină

Gentamicină

Tobramicina

Carbapeneme Meropenem

Imipenem

Cefalosporine siderofor (Cefiderocol) - indisponibil în România

Inhibitori ai metabolismului folaților Trimetoprim/sulfametoxazol

Fluorochinolone Ciprofloxacina

Levofloxacină

Polimixine Colistin

Comentariile interpretative din tabelele VII-XVIII vor fi adăugate pe buletinul de antibiogramă în

funcție de condiția (din coloana 2) întâlnită (dacă se utilizează antibiotice pentru care nu sunt
menționate dozele în acest tabel se vor consulta tabelele EUCAST)
Situațiile și dozele menționate pot suferi modificări, de aceea este importantă verificarea acestora
în ultima versiune EUCAST

54
Tabelul 7. Comentarii pentru bacteriile din ordinul Enterobacterales
Antibiotice/specii Condiție Comentarii
bacteriene

Familia Morganellaceae În toate situațiile Rezistență naturală față de colistin și

(Morganella spp., Proteus tigeciclină
spp., Providencia spp.)

Serratia spp. În toate situațiile Rezistență naturală față de colistin

Ampicilină În toate situațiile Testarea la ampicilină este valabilă și

pentru amoxicilină

Aminoglicozide Sensibilitate Aminoglicozidele se utilizează doar în

raportată asociere cu alte intervenții terapeutice
(izolate alte decât (asociere de antibiotice, intervenții
cele urinare) chirurgicale, etc.).

Amikacină Sensibilitate Sensibilitatea fata de amikacină se poate

raportată obține numai la doze de antibiotic: 1 x
(izolate alte decât 25-30 mg/kg iv/zi.
cele urinare)

Gentamicină Sensibilitate Sensibilitatea față de gentamicină se

raportată poate obține numai la doze de
(izolate alte decât antibiotic: 1 x 6-7 mg/kg iv/zi.
cele urinare)

Colistin Sensibilitate În infecții sistemice este necesară

raportată în caz de asocierea colistinului cu alte intervenții
infecții sistemice terapeutice (asocieri de agenți
antimicrobieni, eliminarea sursei, etc).

Colistin Sensibilitate Se recomandă administrarea colistinului

raportată în caz de în combinație cu alți agenți
alte infecții decât antimicrobieni cu scopul de a potența
cele sistemice efectul sau de a lărgi spectrul de
activitate.

Cefuroximă – doar la E. coli, Alte infecții cu Numai cu administrare intravenoasă!

Klebsiella spp. (excepție K. excepția ITU Sensibilitatea față de cefuroximă se
aerogenes), Proteus necomplicat poate obține numai la doze crescute de
mirabilis Sensibil, expunere antibiotic (de exemplu, 3 x 1,5 g iv/zi
crescută sau alte regimuri de dozare care să

55
 asigure concentrații similare la locul
infecției).

Cefuroximă – doar la E. coli, ITU necomplicat În ITU necomplicat se poate administra

Klebsiella spp. (excepție K. oral.
aerogenes), Proteus Sensibilitatea față de cefuroximă în ITU
mirabilis necomplicat se poate obține la doze de 2
x 0,25 g po/zi.

Ampicilină ITU necomplicat Administrare orală doar în ITU

necomplicat

Amoxicilină ITU necomplicat 3 x 0,5 g po/zi

Amoxicilină+acid clavulanic ITU necomplicat 3 x (0,5 g amoxicilină + 0,125 g

Atenție: sunt valori clavulanat) po/zi
de interpretare
diferite în caz de
ITU față de cele
sistemice

Ampicilină, amoxicilină Alte izolate decât Testarea este valabilă în caz de

cele din ITU administrare intravenoasă.
necomplicat

Cefadroxil ITU necomplicat 2 x 0,5-1 g po/zi

Cefalexină ITU necomplicat 2-3 x 0,25-1 g po/zi

Cefiximă ITU necomplicat 2 x 0,2-0,4 g po/zi

Cefuroximă ITU necomplicat 2 x 0,25 g po/zi

Izolate, altele decât Sensibilitatea față de cefuroximă se

cele din urină, poate obține numai la doze crescute de
sensibilitate la antibiotic (de exemplu, 3 x 1,5 g iv/zi
expunere crescută sau alte regimuri de dozare care să

56
 asigure concentrații similare la locul
infecției).

Trimetoprim/sulfametoxazol ITU 2 x (0,16 g trimetoprim + 0,8 g

sulfametoxazol) po/zi

Sensibilitate la Sensibilitatea la
expunere crescută trimetoprim/sulfametoxazol se poate
obține numai la doze crescute de
antibiotic - de exemplu, 2 x (0,24 g
trimetoprim + 1,2 g sulfametoxazol)
po/zi sau alte regimuri de dozare care să
asigure concentrații similare la locul
infecției.

Norfloxacină ITU necomplicat 2 x 0,4 g po/zi

Cefotaximă Izolate, altele decât Sensibilitatea la cefotaximă se poate

cele din LCR, obține numai la doze crescute de
sensibilitate la antibiotic (de exemplu, 3 x 2 g iv/zi sau
expunere crescută alte regimuri de dozare care să asigure
concentrații similare la locul infecției)

Ceftazidimă Izolate, altele decât Sensibilitatea la ceftazidimă se poate

cele din LCR, obține numai la doze crescute de
sensibilitate la antibiotic (de exemplu, 3 x 2 g iv/zi sau
expunere crescută 6 x 1 g iv/zi sau alte regimuri de dozare
care să asigure concentrații similare la
locul infecției) .

Ceftriaxonă Izolate, altele decât Sensibilitatea la ceftriaxonă se poate

cele din LCR, obține numai la doze crescute de
sensibilitate la antibiotic (de exemplu, 2 x 2 g/zi sau 4
expunere crescută x 1 g iv/zi sau alte regimuri de dozare
care să asigure concentrații similare la
locul infecției): .

Imipenem Sensibilitate la Sensibilitatea la imipenem se poate

expunere crescută obține numai la doze crescute de
antibiotic (de exemplu, 4 x 1 g în
perfuzie de 30 minute /zi sau alte
regimuri de dozare care să asigure
concentrații similare la locul infecției)

57
Meropenem Izolate, altele decât Sensibilitatea la meropenem se poate
cele din LCR, în caz obține numai la doze crescute de
de sensibilitate la antibiotic (de exemplu, 3 x 2 g în
expunere crescută perfuzie de 3 ore /zi sau alte regimuri de
dozare care să asigure concentrații
similare la locul infecției) .

Levofloxacină Sensibilitate la Sensibilitatea la levofloxacină se poate

expunere crescută obține numai la doze crescute de
antibiotic (de exemplu, 2 x 0,5 g /zi po
sau 2 x 0,5 g iv/zi sau alte regimuri de
dozare care să asigure concentrații
similare la locul infecției) .

Ciprofloxacină Sensibilitate la Sensibilitatea la ciprofloxacină se poate

expunere crescută obține numai la doze crescute de
antibiotic (de exemplu, 2 x 0,75 g iv/zi
po sau 3 x 0,4 g iv/zi sau alte regimuri
de dozare care să asigure concentrații
similare la locul infecției) .

Enterobacter spp., K. Sensibil la În cazul monoterapiei cu cefalosporine

aerogenes, Citrobacter cefalosporine de de generația 3 sau în cazul utilizării
freundii complex (C. generația III combinației acestora cu aminoglicozide
freundii, C. youngae, C. există riscul selectării rezistenței.
braakii, C. werkmanii, C.
gillenii, C. murliniae and C.
pasteurii), Hafnia alvei

Serratia spp., Morganella Sensibil la În cazul monoterapiei cu cefalosporine

spp., Providencia spp. cefalosporine de de generația 3 există riscul selectării
generația III rezistenței.

58
Tabelul 8. Comentarii pentru Pseudomonas aeruginosa
Antibiotice/specii Condiție Comentarii
bacteriene

Aminoglicozide Sensibilitate Aminoglicozidele se utilizează doar în

(amikacină, tobramicină) raportată (izolate asociere cu alte intervenții terapeutice
altele decât cele (asociere de antibiotice, intervenții
din urină) chirurgicale, etc.).

Amikacină Sensibilitate Sensibilitatea față de amikacină se poate

raportată obține numai la doze de antibiotic: 1 x
(izolate altele 25-30 mg/kg iv/zi.
decât cele din
urină)

Colistin Sensibilitate În infecții sistemice este necesară

raportată în caz de asocierea colistinului cu alte intervenții
infecții sistemice terapeutice (asocieri de agenți
antimicrobieni, eliminarea sursei, etc).

Colistin Sensibilitate Se recomandă administrarea colistinului

raportată în caz de în combinație cu alți agenți
alte infecții decât antimicrobieni cu scopul de a potența
cele sistemice efectul sau de a lărgi spectrul de
activitate.

Piperacilină/tazobactam Sensibilitate la Sensibilitatea față de

expunere crescută piperacilină/tazobactam se poate obține
raportată numai la doze crescute de antibiotic (de
exemplu, 4 x (4 g piperacilină + 0.5 g
tazobactam)/zi în perfuzii de câte 3 ore
sau alte regimuri de dozare care să
asigure concentrații similare la locul
infecției) .

Cefepimă Sensibilitate la Sensibilitatea la cefepimă se poate

expunere crescută obține numai la doze crescute de
raportată antibiotic (de exemplu, 3 x 2 g iv/zi sau
alte regimuri de dozare care să asigure
concentrații similare la locul infecției) .

59
Ceftazidimă Sensibilitate la Sensibilitatea la ceftazidimă se poate
expunere crescută obține numai la doze crescute de
raportată antibiotic (de exemplu, 3 x 2 g iv/zi sau
6 x 1 g iv/zi sau alte regimuri de dozare
care să asigure concentrații similare la
locul infecției) .

Ciprofloxacină Sensibilitate la Sensibilitatea la ciprofloxacină se poate

expunere crescută obține numai la doze crescute de
raportată antibiotic (de exemplu, 2 x 0,75 g po/zi
sau 3 x 0,4 g iv/zi sau alte regimuri de
dozare care să asigure concentrații
similare la locul infecției)

Imipenem Sensibilitate la Sensibilitatea la imipenem se poate

expunere crescută obține numai la doze crescute de
raportată antibiotic (de exemplu, 4 x 1 g în
perfuzie de 30 minute /zi sau alte
regimuri de dozare care să asigure
concentrații similare la locul infecției)

Levofloxacină Sensibilitate la Sensibilitatea la levofloxacină se poate

expunere crescută obține numai la doze crescute de
raportată antibiotic (de exemplu, 2 x 0,5 g po/zi
sau 2 x 0,5 g iv /zi sau alte regimuri de
dozare care să asigure concentrații
similare la locul infecției) .

Meropenem Izolate, altele Sensibilitatea la meropenem se poate

decât cele din obține numai la doze crescute de
LCR, în caz de antibiotic (de exemplu, 3 x 2 g în
sensibilitate la perfuzie de 3 ore /zi sau alte regimuri de
expunere crescută dozare care să asigure concentrații
similare la locul infecției) .

60
Tabelul 9. Comentarii pentru Acinetobacter baumannii
Antibiotice/specii bacteriene Condiție Comentarii

Meropenem Izolate, altele Sensibilitatea la meropenem se poate

decât cele din obține numai la doze crescute de antibiotic
LCR, în caz de (de exemplu, 3 x 2 g în perfuzie de 3 ore
sensibilitate la /zi sau alte regimuri de dozare care să
expunere crescută asigure concentrații similare la locul
infecției) .

Imipenem Sensibilitate la Sensibilitatea la imipenem se poate obține

expunere crescută numai la doze crescute de antibiotic(de
raportată exemplu, 4 x 1 g în perfuzie de 30 minute
/zi sau alte regimuri de dozare care să
asigure concentrații similare la locul
infecției).

Colistin Sensibilitate În infecții sistemice este necesară

raportată în caz de asocierea colistinului cu alte intervenții
infecții sistemice terapeutice (asocieri de agenți
antimicrobieni, eliminarea sursei, etc).

Colistin Sensibilitate Se recomandă administrarea colistinului în

raportată în caz de combinație cu alți agenți antimicrobieni cu
alte infecții decât scopul de a potența efectul sau de a lărgi
cele sistemice spectrul de activitate.

Ciprofloxacină Sensibilitate la Sensibilitatea la ciprofloxacină se poate

expunere crescută obține numai la doze crescute de antibiotic
raportată (de exemplu, 2 x 0,75 g po/zi sau 3 x 0,4
g iv/zi sau alte regimuri de dozare care să
asigure concentrații similare la locul
infecției) .

Levofloxacină Sensibilitate la Sensibilitatea la levofloxacină se poate

expunere crescută obține numai la doze crescute de antibiotic
raportată (de exemplu, 2 x 0,5 g po/zi sau 2 x 0,5 g
iv /zi sau alte regimuri de dozare care să
asigure concentrații similare la locul
infecției) .

61
Aminoglicozide (amikacină, Sensibilitate Aminoglicozidele se utilizează doar în
gentamicină, tobramicină) raportată ((izolate asociere cu alte intervenții terapeutice
altele decât cele (asociere de antibiotice, intervenții
din urină) chirurgicale, etc.).

Amikacină Sensibilitate Sensibilitatea față de amikacină se poate

raportată obține numai la doze de antibiotic: 1 x 25-
(izolate altele 30 mg/kg iv/zi.
decât cele din
urină)

Gentamicină Sensibilitate Sensibilitatea față de gentamicină se poate

raportată obține numai la doze de antibiotic: 1 x 6-7
(izolate altele mg/kg iv/zi.
decât cele din
urină)

Trimetoprim/sulfametoxazol Sensibilitate la Sensibilitatea la trimetoprim/

expunere crescută sulfametoxazol se poate obține numai la
doze crescute de antibiotic (de exemplu, 2
x (0,24 g trimetoprim + 1,2 g
sulfametoxazol) po/zi sau alte regimuri de
dozare care să asigure concentrații
similare la locul infecției) .

Tabelul 10. Comentarii pentru Stenotrophomonas maltophilia

Antibiotice/specii bacteriene Condiție Comentarii

S. maltophilia În toate situațiile Trimetoprim/sulfametoxazol este singurul

antibiotic eficient in vivo ce se poate testa
in vitro. În caz de rezistență la acest
antibiotic, conform literaturii de
specialitate, în terapie ar mai putea fi
utilizate levofloxacina, ceftazidima,
ticarcilina/acid clavulanic, tigeciclina.

Trimetoprim/sulfametoxazol Sensibil la Sensibilitatea la

expunere crescută trimetoprim/sulfametoxazol se poate
obține numai la doze crescute de antibiotic
(de exemplu, 2 x (0,24 g trimetoprim + 1,2
g sulfametoxazol) po/zi sau alte regimuri
de dozare care să asigure concentrații
similare la locul infecției) .

62
Tabelul 11. Comentarii pentru Staphylococcus aureus și stafilococi coagulazo-negativi
Antibiotice/specii Condiție Comentarii
bacteriene

Oxacilină Screening cefoxitină Tulpina cu fenotip meticilino-sensibil

negativ neproducătoare de beta-lactamază.
NU se raportează Tulpina este sensibilă la
rezultatul testării la betalactaminele utilizate în tratamentul
cefoxitin! infecțiilor stafilococice inclusiv la
și penicilină, ampicilină, amoxicilină. A
Penicilină sensibil se evita cefotaxima și ceftriaxona, dacă
se alege în terapie se indică doar în
doză crescută; nu se utilizează:
ceftazidimă, cefiximă, ceftibuten și
ceftolozan/tazobactam.

Oxacilină Screening cefoxitină Tulpina cu fenotip meticilino-sensibil

negativ producător de beta-lactamază,
NU se raportează rezistentă la penicilină, amoxicilină,
rezultatul testării la ampicilină.
cefoxitin! Tulpina este sensibilă la
și betalactaminele utilizate în tratamentul
Penicilină rezistent infecțiilor stafilococice (oxacilină,
cefazolina). A se evita cefotaxima și
ceftriaxona, dacă se alege în terapie se
indică doar în doză crescută); nu se
utilizează: ceftazidimă, cefiximă,
ceftibuten și ceftolozan/tazobactam.

Oxacilină Screening cefoxitină MRS - stafilococ meticilino-rezistent -

pozitiv tulpina este rezistentă la toate
NU se raportează antibioticele beta lactamice: peniciline,
rezultatul testării la cefalosporine și carbapeneme, inclusiv
cefoxitin! la cele combinate cu inhibitori de beta-
lactamază.

63
Penicilină SCN
Nu se raportează
(Majoritatea
tulpinilor sunt
rezistente fie prin
producere de beta-
lactamază, fie prin
modificarea PBP.
Metodele existente
nu detectează în
toate situațiile
producerea de beta-
lactamază).

Clindamicină Rezistență *Clindamicina se poate totuși utiliza în

inductibilă – izolate terapia de scurtă durată a infecțiilor
din infecții de părți ușoare și medii ale țesuturilor moi,
moi de severitate deoarece dezvoltarea rezistenței
medie sau ușoară constitutive este improbabilă în cazul
Se raportează acestor terapii.
rezistent*!

Rezistență
inductibilă – izolate
din alte infecții
decât cele de părți
moi.
Se raportează
rezistent.

Oxacilină Sensibil În infecții severe sau în cazul

concentrării inadecvate a antibioticului
la locul infecției se recomandă
administrarea oxacilinei în doză
crescută: 6 x 1 g iv sau chiar 6 x 2 g iv.

Eritromicină Testarea la eritromicină este valabilă și

Screening negativ pentru claritromicină și azitromicină.

Tetraciclină Sensibil Testarea la tetraciclină este valabilă și

pentru doxiciclină și minociclină.

64
Levofloxacină Sensibil la expunere Sensibilitatea la levofloxacină se poate
crescută obține numai la doze crescute de
antibiotic (de exemplu, 2 x 0,5 g po/zi
sau 2 x 0,5g iv/zi sau alte regimuri de
dozare care să asigure concentrații
similare la locul infecției) .

Ciprofloxacină Sensibil la expunere Sensibilitatea la ciprofloxacină se poate

crescută obține numai la doze crescute de
antibiotic (de exemplu, 2 x 0,75 g iv/zi
po sau 3 x 0,4 g iv/zi sau alte regimuri
de dozare care să asigure concentrații
similare la locul infecției) .

Aminoglicozide Sensibilitate Aminoglicozidele se utilizează doar în

raportată asociere cu alte intervenții terapeutice
(izolate altele decât (asociere de antibiotice, intervenții
cele din urină) chirurgicale, etc.)

Kanamicină Sensibilitatea se Sensibilitatea față de amikacină se

raportează la poate obține numai la doze de
amikacină antibiotic: 1 x 25-30 mg/kg iv/zi.
(izolate sistemice și
izolate altele decât
cele din urină)

Gentamicină Sensibilitate Sensibilitatea față de gentamicină se

raportată poate obține numai la doze de
(izolate sistemice și antibiotic: 1 x 6-7 mg/kg iv/zi.
izolate altele decât
cele din urină)

Sensibilitate la Sensibilitatea la
Trimetoprim/sulfametoxazol expunere crescută trimetoprim/sulfametoxazol se poate
obține numai la doze crescute de
antibiotic (de exemplu, 2 x (0,24 g
trimetoprim + 1,2 g sulfametoxazol)
po/zi sau alte regimuri de dozare care
să asigure concentrații similare la locul
infecției)

65
Tabelul 12. Comentarii pentru enterococi
Antibiotice/specii Condiție Comentarii
bacteriene

Enterococcus spp În toate situațiile Enterococii prezintă rezistență naturală

față de cefalosporine, clindamicină,
trimetoprim/sulfametoxazol și rezistență
de nivel redus față de aminoglicozide.

Ampicilină Sensibil Testarea la ampicilină este valabilă și

pentru amoxicilină și
piperacilină/tazobactam.

Gentamicină 30 ug Test sinergism Tulpină cu rezistență de nivel crescut la

pozitiv aminoglicozide (HLAR - high level
aminoglycoside resistance).
Aminoglicozidele nu sunt eficiente nici
în asociere cu alte antibiotice.

Test sinergism Gentamicina poate fi utilizată în terapia

negativ infecțiilor grave, însă numai asociată cu
Nu se raportează beta-lactaminele sau glicopeptidele
sensibil la active față de enterococi (sinergism
gentamicină! păstrat).

E. faecalis sau E. faecium Rezistență la VRE – enterococ vancomicino - rezistent

vancomicină

66
Tabelul 13. Comentarii pentru streptococi beta-hemolitici
Antibiotice/specii Condiție Comentarii
bacteriene

Penicilină Sensibil Testarea penicilinei este valabilă pentru

peniciline, cefalosporine, carbapeneme.
Adăugarea unui inhibitor de beta-
lactamază nu aduce niciun beneficiu
terapeutic.

Eritromicină Sensibil Testarea la eritromicina este valabilă și

pentru claritromicină și azitromicină.

Clindamicină Rezistență *Clindamicina se poate totuși utiliza în

inductibilă. terapia de scurtă durată a infecțiilor
Clindamicina se ușoare și medii ale țesuturilor moi,
raportează deoarece dezvoltarea rezistenței
rezistent*. constitutive este improbabilă în cazul
acestor terapii.
Rezistență
inductibilă – izolate
din alte infecții
decât cele de părți
moi.
Clindamicina se
raportează rezistent.
Tetraciclină Sensibil Testarea la tetraciclină este valabilă și
pentru doxiciclină și minociclină.

Levofloxacină Sensibil la expunere Sensibilitatea la levofloxacină se poate

crescută obține numai la doze crescute de
antibiotic (de exemplu, 2 x 0,5 g po/zi
sau 2 x 0,5g iv/zi sau alte regimuri de
dozare care să asigure concentrații
similare la locul infecției) .
Trimetoprim/sulfametoxazol Sensibilitate la Sensibilitatea la trimetoprim
expunere crescută /sulfametoxazol se poate obține numai
la doze crescute de antibiotic (de
exemplu, 2 x (0,24 g trimetoprim + 1,2
g sulfametoxazol) po/zi sau alte
regimuri de dozare care să asigure
concentrații similare la locul infecției) .

67
Tabelul 14. Comentarii pentru Streptococcus pneumoniae
Antibiotice/specii Condiție Comentarii
bacteriene

Oxacilină screening Screening negativ În funcție de situația clinică se

raportează selectiv sensibil față de
penicilină, ampicilină, amoxicilină,
amoxicilină cu acid clavulanic,
cefuroximă po și iv, ceftriaxonă,
cefotaximă, cefepimă, cefpodoximă,
carbapeneme (în meningită a se folosi
doar meropenem dintre carbapeneme).

Oxacilină screening Screening pozitiv

Vezi algoritmul
diagnostic din
EUCAST

Penicilină Sensibilitate în caz de Sensibilitatea la penicilină în cazul

meningită meningitei se poate obține la doze
crescute de antibiotic (de exemplu, 6 x
4 M UI iv/zi sau alte regimuri de dozare
care să asigure concentrații similare la
locul infecției) .

Pneumonie, CMI Sensibilitatea la penicilină se poate

>0,06 și <=0,5 mg/L obține la doze crescute de antibiotic (de
exemplu, 4 x 2M UI iv/zi sau alte
regimuri de dozare care să asigure
concentrații similare la locul infecției) .

Pneumonie, CMI Sensibilitatea la penicilină se poate

>0,5 și <=1 mg/L obține la doze crescute de antibiotic (de
exemplu, 4 x 4M UI iv/zi sau 6 x 2M
UI iv/zi sau alte regimuri de dozare care
să asigure concentrații similare la locul
infecției).

Pneumonie, CMI >1 Sensibilitatea la penicilină se poate

și <=2 mg/L obține la doze crescute de antibiotic (de
exemplu, 6 x 4M UI iv/zi sau alte
regimuri de dozare care să asigure
concentrații similare la locul infecției) .

Ceftriaxonă Meningită Sensibilitatea la ceftriaxonă în caz de

meningită se poate obține la doze
crescute de antibiotic (de exemplu, 2 x

68
 2 g iv/zi sau 4 x 1 g iv/zi sau alte
regimuri de dozare care să asigure
concentrații similare la locul infecției) .

Cefotaximă Meningită Sensibilitatea la cefotaximă în caz de

meningită se poate obține la doze
crescute de antibiotic (de exemplu, 4 x
2 g iv/zi sau alte regimuri de dozare
care să asigure concentrații similare la
locul infecției) .

Eritromicină Sensibil Testarea la eritromicină este valabilă și

pentru claritromicină și azitromicină.

Clindamicină Rezistență inductibilă

Clindamicina se
raportează rezistent.

Levofloxacină Sensibil la expunere Sensibilitatea la levofloxacină se poate

crescută obține numai la doze crescute de
antibiotic(de exemplu, 2 x 0,5 g po/zi
sau 2 x 0,5g iv/zi sau alte regimuri de
dozare care să asigure concentrații
similare la locul infecției) .

Norfloxacină screening Screening negativ: Sensibilitatea la levofloxacină se poate

se raportează sensibil obține numai la doze crescute de
față de moxifloxacină antibiotic (de exemplu, 2 x 0,5 g po/zi
și sensibil la sau 2 x 0,5g iv/zi sau alte regimuri de
expunere crescută dozare care să asigure concentrații
față de levofloxacină similare la locul infecției) .
(cu menționarea
dozelor adecvate).

Screening pozitiv: se
raportează rezistență
față de moxifloxacină
și levofloxacină.

Tetraciclină Sensibil Testarea la tetraciclină este valabilă și

pentru doxiciclină și minociclină.

69
Tabelul 15. Comentarii pentru streptococii din grupul viridans
Antibiotice/specii Condiție Comentarii
bacteriene

Penicilină Screening negativ Tulpina este sensibilă la penicilină,

Se raportează selectiv ampicilină, amoxicilină.
în funcție de situația
clinică (localizarea
infecției)

Screening pozitiv
Se testează individual
beta-lactaminele
pentru care există
diametre
interpretative și se
raportează conform
rezultatului testării.

Moxifloxacină Endocardită Nu există criterii interpretative ale

Este necesara testare sensibilității față de moxifloxacină. Cu
prin metode toate acestea, moxifloxacina este
cantitative folosită în tratamentul endocarditei
pentru trecerea la terapia po. O valoare
de sub 0,5 mg/L a CMI indică un
fenotip sălbatic (exclude prezența unui
mecanism de rezistență).

Tabelul 16. Comentarii pentru Haemophilus influenzae

Antibiotice/specii Condiție Comentarii
bacteriene

Penicilină Screening negativ Tulpina este sensibilă la ampicilină,

(nu se raportează amoxicilină.
penicilina!)

Screening pozitiv
Vezi algoritmul
diagnostic din
EUCAST
Cefuroximă În toate situațiile Pentru tratament po se recomandă
doză crescută (de exemplu, 2 x 0,5 g
po/zi sau alte regimuri de dozare care
să asigure concentrații similare la
locul infecției) .

70
 Sensibilitate la Sensibilitatea la cefuroximă se poate
expunere crescută obține numai la doze crescute de
antibiotic (de exemplu, 3 x 1,5 g iv/zi
sau alte regimuri de dozare care să
asigure concentrații similare la locul
infecției).
Amoxicilină cu acid În toate situațiile Pentru tratament po se recomandă
clavulanic doză crescută (de exemplu, 3 x (0.875
g amoxicilina + 0.125 acid clavulanic)
po/zi sau alte regimuri de dozare care
să asigure concentrații similare la
locul infecției) .
Acid nalidixic Screening negativ:
se raportează selectiv
(la nevoie): sensibil
la moxifloxacină,
levofloxacină,
ofloxacină.

Screening pozitiv:
se testează individual
fluorochinolonele de
interes.

Trimetoprim/sulfametoxazol Sensibilitate la Sensibilitatea la

expunere crescută trimetoprim/sulfametoxazol se poate
obține numai la doze crescute de
antibiotic (de exemplu, 2 x (0,24 g
trimetoprim + 1,2 g sulfametoxazol)
po/zi sau alte regimuri de dozare care
să asigure concentrații similare la
locul infecției) .
Tetraciclină Sensibil Testarea la tetraciclină este valabilă și
pentru doxiciclină și minociclină.

Sensibil la expunere Sensibilitatea față de tetraciclină se

crescută poate obține numai la doze crescute de
antibiotic (de exemplu, 4 x 0,5 g po/zi
sau alte regimuri de dozare care să
asigure concentrații similare la locul
infecției) .

71
Tabelul 17. Comentarii pentru Moraxella catarrhalis
Antibiotice/specii Condiție Comentarii
bacteriene

Ceftriaxonă Sensibilitate la Sensibilitatea la ceftriaxonă se poate

expunere crescută obține numai la doze crescute de
antibiotic (de exemplu, 2 x 2 g/zi sau
4x1 g iv/zi sau alte regimuri de dozare
care să asigure concentrații similare la
locul infecției) .

Cefuroximă În toate situațiile Pentru tratament po se recomandă

doză crescută (de exemplu, 2 x 0,5 g
po/zi sau alte regimuri de dozare care
să asigure concentrații similare la locul
infecției) .

Sensibilitate la Sensibilitatea la cefuroximă se poate

expunere crescută obține numai la doze crescute de
antibiotic (de exemplu, 3 x 1,5 g iv/zi
sau alte regimuri de dozare care să
asigure concentrații similare la locul
infecției).

Acid nalidixic Screening negativ:

se raportează selectiv
(la nevoie): sensibil
la moxifloxacină,
levofloxacină,
ofloxacină.

Screening pozitiv:
Se testează individual
fluorochinolonele de
interes.

Trimetoprim/sulfametoxazol Sensibilitate la Sensibilitatea la

expunere crescută trimetoprim/sulfametoxazol se poate
obține numai la doze crescute de
antibiotic (de exemplu, 2 x (0,24 g
trimetoprim + 1,2 g sulfametoxazol)
po/zi sau alte regimuri de dozare care
să asigure concentrații similare la locul
infecției).

72
 Eritromicină Sensibil sau rezistent Testarea la eritromicină este valabilă și
(izolatele rezistente pentru claritromicină și azitromicină.
la eritromicină pot fi
testate individual la
claritromicină sau
azitromicină sau pot
fi raportate ca
rezistente)

Tabelul 18. Comentarii pentru Campylobacter jejuni/coli

Antibiotice/specii Condiție Comentarii
bacteriene

Ciprofloxacină Sensibil la expunere Sensibilitatea la ciprofloxacină se poate

crescută obține numai la doze crescute de
antibiotic (de exemplu, 2 x 0,75 g iv/zi
po sau3 x 0,4 g iv/zi sau alte regimuri de
dozare care să asigure concentrații
similare la locul infecției) .

XII. Bibliografie
Documentele EUCAST de pe site-ul: www.eucast.org
Dintre documentele EUCAST au fost traduse:
- EUCAST guidelines for detection of resistance mechanisms and specific resistances of clinical
and/or epidemiological importance, version 2.0, 2017.
https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Resistance_mechanisms/E
UCAST_detection_of_resistance_mechanisms_170711.pdf
- Antimicrobial susceptibility testing EUCAST disk diffusion method . version 10.0, 2022.
https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Disk_test_documents/2022
_manuals/Manual_v_10.0_EUCAST_Disk_Test_2022.pdf
"These documents have been produced in part under ECDC service contracts and made available by EUCAST at no cost
to the user and can be accessed on the EUCAST website www.eucast.org. EUCAST recommendations are frequently updated and
the latest versions are available at www.eucast.org."

Magiorakos AP, Srinivasan A, R. Carey RB, et al: Multidrug-resistant, extensively drug-

resistant and pandrug-resistant bacteria: an international expert proposal for interim standard
definitions for acquired resistance. Clin Microbiol Infect 2012; 18: 268–281.

73
Ghid de asigurarea calității rezultatelor în laboratorul
de microbiologie

I. Controlul intern de calitate

Controlul intern al calității se referă la toate procedurile întreprinse de un laborator pentru
evaluarea continuă a activității sale. Principalul obiectiv este de a asigura coerența rezultatelor de
zi cu zi și conformitatea lor cu criterii definite.
Este necesar un program de verificări periodice pentru a demonstra că variabilitatea (adică
diferența între analiști, între echipamente sau reactivi etc.) este sub control. Trebuie să fie acoperite
toate testele incluse în lista laboratorului. Programul de control intern al calității poate implica:
- utilizarea materialelor de referință (inclusiv materiale de testare a schemei de testare
a competenței);
- testări de repetabilitate, inclusiv numărarea coloniilor de către doi analiști,
utilizarea materialelor de control din kit-urile comerciale, conform indicațiilor din
insertul trusei.
Opțional, programul de control intern mai poate să conțină:
- utilizarea eșantioanelor cu niveluri variabile de contaminare, inclusiv
microorganisme țintă și flora de însoțire;
- utilizarea eșantioanelor contaminate natural din diferite tipuri de matrice.
Programul trebuie să fie adaptat la frecvența efectivă a testelor de laborator efectuate. Este
recomandat ca, acolo unde este posibil, testele de rutină să includă controale pentru monitorizarea
performanței. De asemenea, este recomandat ca datele rezultate din analiza materialelor de
referință și a eșantioanelor să fie analizate pentru a ajuta la evaluarea tendințelor.
În cazuri speciale, pentru teste care sunt solicitate foarte rar, poate fi mai potrivită o schemă
de demonstrare a performanței care se realizează în paralel cu testarea probelor de pacienți.

Utilizarea materialelor de referință

Sunt necesare tulpini de referință trasabile pentru stabilirea performanței acceptabile a
mediilor de cultură (inclusiv truse de testare), pentru validarea metodelor și pentru evaluarea
continuă a performanței. Ca să demonstreze trasabilitatea, laboratoarele trebuie să utilizeze tulpini
de referință obținute direct dintr-o colecție națională sau internațională recunoscută, acolo unde
acestea există. Dacă nu sunt disponibile tulpini de referință trasabile, pot fi utilizate derivatele
comerciale trasabile acestora.
Utilizarea materialului de referință adecvat împreună cu procedura de testare este esențială
pentru a se asigura calitatea rezultatelor. Sunt necesare controale adecvate pentru a se asigura că
testul funcționează în limite definite. Dacă materialul de referință nu reușește să dea un rezultat
pozitiv sau negativ (după caz) pentru testul pentru care este utilizat, atunci validitatea rezultatelor
este discutabilă. În acest caz, trebuie să fie investigat motivul pentru care rezultatul controlului
intern nu este cel așteptat și, dacă este necesar, testul trebuie să fie repetat. Trebuie realizată și o

74
verificare a procedurii respective de testare. Utilizarea controalelor este recunoscută ca o bună
practică de laborator și este parte a oricărui proces de acreditare.
Este indicată efectuarea pasajelor săptămânale ale tulpinilor de referință, atât pentru a
menține caracteristicile microorganismelor, precum și pentru a înregistra toate subculturile pe un
formular de evidență. Este important să verificați și să vă asigurați că microorganismele de control
dau rezultatele corecte înainte de utilizarea de rutină. Orice rezultat eronat trebuie să fie investigat.

Subcultura repetată a culturii stoc de lucru

Cultura stocului de lucru nu trebuie subcultivată decât dacă acest lucru este definit printr-
o metodă standard sau dacă laboratoarele pot furniza dovezi documentate că nu a existat nici o
modificare a caracteristicilor biologice relevante. Cu toate acestea, trebuie menționat că stocurile
de lucru nu trebuie să fie subcultivate pentru a înlocui stocurile de referință. Derivatele comerciale
ale tulpinilor de referință pot fi utilizate numai pentru obținerea culturilor de lucru, din ele nu se
pot face subculturi pentru a obține stocuri de referință.
Modul de lucru
- Materialul de referință trebuie rehidratat imediat după primire, în conformitate cu
recomandările producătorului (ATCC, NCTC sau echivalent). Laboratoarele trebuie să aibă în
vedere că unele materiale de referință pot avea instrucțiuni specifice producătorului, care
trebuie să fie luate în considerare.
- Materialul de referință trebuie subcultivat pe un mediu de cultură non-selectiv adecvat și
incubarea să se facă la temperatura și atmosfera corecte.
- În cazul în care cultura (care este prima generație directă a materialului de referință) trebuie să
fie depozitată pentru utilizare ulterioară, acest lucru trebuie făcut în așa fel încât să se asigure
un nivel optim de recuperare. Se sugerează utilizarea criotuburilor cu perle de tip Cryovials ™
sau similar, care conțin un crioconservant.
Aceste criotuburi trebuie să fie inoculate cu o cultură tânără (de 18-24 de ore) la un standard
de aproximativ de 3-4 McFarland.
Flaconul trebuie închis ermetic și răsturnat de 4-5 ori pentru suspensionarea
microorganismelor. Nu se vortexează.
- Excesul de lichid crioconservant trebuie aspirat cu o pipetă sterilă prin înclinarea bilelor, astfel
încât să se extragă cât mai mult lichid. Închideți din nou flaconul.
- Etichetați flaconul cu numărul de stocare corespunzător, ATCC, NCTC (sau echivalent)
numărul, numele și data. Aceste mărgele constituie stocurile de mărgele de referință și sunt
depozitate la -70 sau -80 °C.
- În condiții aseptice, se deschide criotubul și cu un ac sau o pensă sterilă, se scoate o perlă. Perla
poate fi descărcată direct prin rostogolire pe un mediu de cultură adecvat. Plăcile trebuie să fie
etichetate clar cu numele microorganismului, data subculturii și numărul ATCC, NCTC (sau
echivalent). Culturile pe plăci trebuie preparate săptămânal sau la fiecare două săptămâni după
procedura de mai sus.
- În fiecare săptămână subcultivați o bilă din flaconul în uz pe un mediu de cultură neselectiv
corespunzător și verificați puritatea.
- Din această cultură pură, pregătiți câte o subcultură pentru fiecare zi a săptămânii.
- Pentru organismele pretențioase care nu vor supraviețui pe plăci timp de o săptămână,
subcultivați tulpina în serie de la o zi la alta.

75
- Tulpinile QC pot fi subcultivate pentru maxim șase zile, apoi aruncați plăcile și pregătiți o
nouă placă din flaconul congelat.
- Când flaconul în uz este epuizat, subcultivați din flaconul de stoc și pregătiți un alt flacon în
uz din subcultură.
- Când subcultivați, utilizați mai multe colonii pentru a evita selectarea unui mutant.
Această placă proaspăt preparată este „cultura stocului de lucru”. Trebuie remarcat faptul
că stocurile de lucru nu trebuie subcultivate pentru a înlocui stocurile de referință.

Controlul de calitate al reactivilor și al mediilor de cultură

Trebuie ținută evidența reactivilor utilizați în laborator, cu înregistrarea condițiilor de
păstrare, termene de garanție, utilizarea în ordinea termenelor de valabilitate.
Laboratoarele trebuie să se asigure că reactivii utilizați au calitatea necesară pentru testul
pentru care sunt utilizați.
Fiecare lot de reactivi trebuie verificat, atât inițial cât și în timpul perioadei sale de
valabilitate, pentru reacțiile pozitive și negative, folosind microorganisme de control din colecții
recunoscute național sau internațional.

Mediile de cultură preparate în laborator

Performanța adecvată a mediilor de cultură, diluanții și alte lichide utilizate pentru
suspensionare preparate in-house trebuie verificate, în legătură cu:
- recuperarea sau menținerea supraviețuirii microorganismelor țintă;
- inhibarea sau suprimarea microorganismelor non-țintă;
- proprietăți biochimice (diferențiale și diagnostice);
- proprietăți fizice (de exemplu, pH, volum și sterilitate).
Materiile prime (medii comerciale deshidratate și constituenți individuali) trebuie să fie
depozitate în condiții adecvate, de ex. la rece, ferit de umiditate și întuneric.
Toate recipientele, în special cele pentru medii deshidratate, trebuie să fie etanșe.
Mediile deshidratate care sunt solidificate, recipient crăpat sau prezintă o schimbare de culoare,
nu trebuie să fie utilizate. Pentru prepararea mediilor de cultură trebuie utilizate, cu excepția
cazului în care metoda de testare specifică altfel, apă distilată, apă deionizată sau produsă prin
osmoză inversă, liberă de substanțe bactericide, inhibitori sau substanțe care pot interfera cu testul
respectiv.

Medii de cultură gata turnate

Toate mediile de cultură, inclusiv diluanții și alte lichide de suspensie procurate gata de
utilizare sau parțial, necesită evaluarea performanței înainte de utilizare la fel ca mediile de cultură
preparate in-house.
În cazul în care producătorul este acoperit de un sistem de calitate recunoscut (adică ISO
9000) și prezintă informații relevante (certificate) privind controlul de calitate conform ISO 11133,
mediile de cultură și soluțiile trebuie să fie verificate pentru acceptabilitate, dar nu este necesară
repetarea controlului de calitate. Procedurile de verificare ale laboratorului utilizator pot include

76
doar verificări inițiale de acceptabilitate pentru fiecare producător nou și verificări indirecte prin
procedurile interne de control al calității (în timpul procedurilor de utilizare a tulpinilor de
referință).
Laboratorul trebuie să își stabilească propriile criterii de acceptabilitate care să se bazeze
pe informațiile cuprinse în certificatele de calitate:
- numele componentei de bază și lista componentelor, inclusiv orice suplimente;
- termenul de valabilitate și criteriile de acceptabilitate aplicate;
- condiții de depozitare;
- verificarea sterilității;
- verificarea creșterii controlului țintă cu criterii de acceptabilitate;
- verificări fizice cu criteriile de acceptabilitate.
Utilizatorul trebuie să se asigure că va fi notificat de către producător pentru orice
modificare a specificațiilor de calitate.

Tabelul 1. Recomandări privind testarea mediilor de cultură şi reactivilor

Reactivul Condiții urmărite Frecvența Observații
Medii de cultură cu Sterilitate, pH, Fiecare șarjă Se vor utiliza tulpini
aditivi după proprietăți nutritive, de control, martor
sterilizare eficiență selectivă, pozitiv și martor
reacții de negativ
identificare
Medii de cultură fără pH, proprietăți Fiecare șarjă Se vor utiliza tulpini
aditivi după nutritive, eficiență preparată în de control, martor
sterilizare selectivă, reacții de laborator, fiecare lot pozitiv și martor
identificare comercial negativ
Coloranți și colorații Diferențierea Fiecare lot și Se vor utiliza tulpini
afinităților colorație de control, martor
tinctoriale pozitiv și martor
negativ
Reactivi pentru Fiecare lot Conform ghidului
antibiograme, EUCAST
mediul Mueller
Hinton
Microcomprimate cu Diametrul zonelor Fiecare testare Conform ghidului
antibiotice de inhibiție pentru EUCAST
tulpinile de referință
Reactivi organici, Reacția urmărită Fiecare lot Martor pozitiv și
anorganici martor negativ

Truse comerciale Se vor respecta Fiecare lot sau la Conform

instrucțiunile din deschiderea fiecărei instrucțiunilor
insert referitoare la truse producătorului
controlul intern de
calitate

77
 Etichetare
Laboratoarele trebuie să se asigure că toți reactivii (inclusiv soluții stoc), medii de cultură,
diluanți și alte lichide de suspensionare sunt etichetate în mod corespunzător, pentru a evidenția,
după caz, identitatea produsului, concentrația, condițiile de depozitare, data deschiderii, data
preparării, data de expirare și/sau timpul de depozitare recomandat. Persoana responsabilă de
prepararea reactivului trebuie să fie identificabilă din înregistrări.

Testarea discurilor de antibiotice

La implementare se recomandă o perioadă de 2 luni de instruire și testare.
Pentru o perioadă de cel puțin 1 lună de la implementare se înregistrează toate valorile și
se efectuează histogramele care să fie comparate cu diagramele de distribuție disponibile pe site-
ul EUCAST.
Principalele tulpini de control recomandate sunt tulpinile tipice sensibile, dar este necesar
să fie folosite și tulpini rezistente pentru a confirma că metoda va detecta rezistența mediată de
mecanisme de rezistenţă cunoscute. Pentru a controla componenta inhibitoare a discurilor
combinate β-lactame-inhibitor, se recomandă tulpini specifice producătoare de β-lactamaze.
Se utilizează zilnic sau de cel puțin 4 ori pe săptămână pentru antibioticele incluse în
seturile de rutină. Se testează identic cu tulpinile izolate de la pacienți. Testele de control trebuie
citite și evaluate înainte de raportarea rezultatelor testelor de sensibilitate pentru izolatele clinice.
În fiecare zi în care sunt efectuate testări de control, examinați rezultatele ultimelor 20
consecutive teste. Examinați rezultatele pentru tendințe și zone care se încadrează constant peste
sau sub țintă.
Dacă două teste non-consecutive sunt în afara intervalului pe aceeași parte a țintei,
rezultatele testelor de susceptibilitate pentru izolate clinice pot fi raportate, dar se impune
investigarea cauzei.
Dacă două teste consecutive sunt în afara intervalului sau dacă mai multe discuri sunt în afara
intervalului într-o zi, investigați înainte de a raporta rezultatele testelor de sensibilitate pentru
clinice izolate. Este posibil să fie necesară repetarea testelor.
Dacă nu este recunoscută rezistența unei tulpini de control rezistente, atunci suprimați rezultatele
testelor de sensibilitate pentru izolate clinice, investigați și retestați.
Când investigați posibilele surse de erori, luați în considerare probleme legate de discuri
antimicrobiene, medii de cultură, condiții de testare și calitatea tulpinilor de control.
În plus față de testarea de rutină QC, testați fiecare lot nou de agar Mueller-Hinton. Pentru
fiecare lot nou de agar, măsurați și adâncimea agarului pentru a vă asigura că se află în limite
acceptabile.
Aminoglicozidele pot dezvălui variaţii inacceptabile ale cationilor divalenţi în mediu,
tigeciclina poate dezvălui variații ale magneziului, trimetoprim/sulfametoxazolul va dezvălui
probleme cu conținutul de timină și timidină, eritromicina poate dezvălui un pH inacceptabil. O
adâncime a agarului deasupra sau sub limitele acceptabile vor avea ca rezultat diametre de inhibiție
mai mici sau, respectiv, mai mari.

78
 Zone de inhibiție pentru aminoglicozide cu P. aeruginosa ATCC 27853 sub sau peste
limitele de control al calității pot indica concentrații mari sau scăzute de cationi divalenți (Ca 2+,
Mg2+).
Excesul de timină și timidină poate fi indicat prin zone de inhibiție pt trimetoprim-
sulfametoxazol și E. faecalis ATCC 29212 sub limitele de control.

Echipamentele: întreținere, calibrare și verificarea performanței

Întreținerea echipamentelor
Întreținerea echipamentelor esențiale trebuie să fie efectuată la intervale specificate,
determinate de factori precum frecvența de utilizare. Trebuie păstrate înregistrări detaliate.
Trebuie să se acorde atenție evitării contaminării încrucișate care se datorează
echipamentelor, de exemplu:
- echipamentul de unică folosință trebuie să fie curat și steril atunci când este cazul;
- sticlăria refolosită trebuie curățată corespunzător și sterilizată atunci când este cazul;
- în mod ideal, laboratoarele ar trebui să aibă o autoclavă separată pentru decontaminare; cu
toate acestea, o singură autoclavă este acceptabilă cu condiția să fie luate măsuri de precauție
pentru separarea ciclurilor de decontaminare și sterilizare și să existe un program de curățare
documentat.
În mod uzual următoarele echipamente vor fi întreținute prin curățare și întreținere,
verificarea deteriorării, prin verificarea generală și, după caz, sterilizarea:
- echipamente pentru servicii generale – aparate de filtrare, recipiente din sticlă sau plastic
(sticle, eprubete), cutii Petri din sticlă sau plastic, instrumente de prelevare, anse (platină,
nichel/crom sau plastic de unică folosință);
- băi de apă, incubatoare, hote microbiologice, autoclave, omogenizatoare, frigidere,
congelatoare;
- echipamente volumetrice - pipete, dozatoare automate;
- instrumente de măsurare - termometre, temporizatoare, balanțe, pH-metre, numărătoare de
colonii.

Calibrare și verificarea performanței

Laboratorul trebuie să îşi stabilească un program pentru calibrarea și verificarea
performanței echipamentelor care au o influență directă asupra rezultatelor testării. Frecvența unei
astfel de calibrări și verificarea performanței va fi determinată prin experiență documentată, bazată
pe nevoie, tipul și performanța anterioară a echipamentului.
Intervalele între calibrări și verificări trebuie să fie mai scurte decât intervalul de timp
observat în care echipamentul iese în afara limitelor acceptabile.

Dispozitive de măsurare a temperaturii

În cazul în care temperatura are un efect direct asupra rezultatului unei analize sau este
esențială pentru funcționarea corectă a echipamentului, dispozitivele de măsurare a temperaturii
(de exemplu termocupluri și termometre de platină cu rezistență (PRT) utilizate în incubatoare și

79
autoclave) trebuie să fie de o calitate adecvată pentru a atinge acuratețea necesară. Este de preferat
din motive de siguranță să nu fie utilizate în laborator termometrele cu mercur și toluen lichid-în-
sticlă.
Calibrarea acestor dispozitive trebuie să fie trasabilă la standardele naționale sau
internaționale pentru temperatură. Cu toate acestea, dacă cerințele de precizie permit, pot fi
utilizate și dispozitivele de măsurare la care se poate demonstra că se conformează unor cerințe
naționale sau internaționale (însoțite de certificate care să ateste acest lucru). Astfel de dispozitive
pot, de exemplu, să fie utilizate pentru monitorizarea frigiderelor și congelatoarelor și, de
asemenea, pentru termostate și băi de apă acolo unde toleranța acceptabilă în jurul temperaturii
țintă permite. Este necesară verificarea performanței acestor dispozitive.

Incubatoare, băi de apă

Stabilitatea temperaturii, uniformitatea distribuției temperaturii și timpul necesar pentru a
atinge condiții de echilibru în termostate, băi de apă, camere cu temperatură controlată vor fi
stabilite inițial și apoi periodic, la o frecvență documentată. Constanța caracteristicilor înregistrate
în timpul validării inițiale a echipamentului se verifică și se înregistrează după fiecare reparare sau
modificare semnificativă. Laboratoarele trebuie să monitorizeze zilnic sau în funcție de utilizare,
temperatura de funcționare a acestui tip de echipament și să păstreze înregistrări.

Greutăți și balanţe
Greutățile și balanțele trebuie calibrate în mod trasabil la intervale regulate (în conformitate
cu scopul pentru care sunt utilizate).

Echipamente volumetrice
Echipamentele volumetrice, cum ar fi dozatoare automate, dozatoare/diluatoare, pipetele
manuale sau mecanice și pipetele de unică folosință pot fi utilizate în laboratorul de microbiologie.
Laboratoarele trebuie să efectueze verificarea inițială a echipamentului volumetric și apoi se fac
verificări periodice pentru a se asigura că echipamentul funcționează în limitele de specificație
cerute. Verificarea nu este necesară pentru sticlăria care este însoţită de certificat în care se
precizează o toleranţă anume.
Echipamentul trebuie să fie verificat pentru precizia volumului obţinut față de volumul
setat (pentru mai multe setări diferite în cazul instrumentelor cu volum variabil) și trebuie măsurată
precizia volumelor măsurate în mod repetat.
Pentru echipamentele volumetrice de unică folosință, laboratoarele ar trebui să se
aprovizioneze de la producători care lucrează într-un sistem de calitate. După validarea inițială a
adecvării echipamentului, se recomandă efectuarea unor verificări aleatorii asupra preciziei. Dacă
furnizorul nu are un sistem de calitate recunoscut, laboratoarele ar trebui să verifice fiecare lot de
echipamente pentru adecvare.

Alte echipamente:
Conductometre, oxigenometre, pH-metre și alte instrumente similare trebuie verificate în
mod regulat sau înainte de fiecare utilizare. Soluțiile tampon utilizate pentru verificare trebuie
stocate în condiții adecvate și trebuie să fie marcate cu o dată de expirare. Acolo unde umiditatea

80
este importantă pentru rezultatul testului, higrometrele trebuie să fie calibrate, calibrarea fiind
trasabilă la standarde naționale sau internaționale.
În cazul în care în procedurile de testare sunt utilizate centrifugi, trebuie făcută o evaluare
a influenței forței centrifuge. Acolo unde forța de centrifugare este critică, centrifuga necesită
calibrare.

II. Evaluarea externă a calității

Laboratoarele trebuie să participe în mod regulat la testarea competenței (proficiency
testing - PT), relevantă pentru domeniul lor de aplicare. Schemele de testare a competenței trebuie
să utilizeze matrici adecvate, corespunzătoare cu testele efectuate de rutină în laborator.
Pentru verificarea competenței privind testarea sensibilității la antibiotice, laboratorul
trebuie să participe la scheme care evaluează capacitatea sa de a depista mecanisme de rezistență.
În acest scop în schema de testare să fie incluse tulpini bacteriene care prezintă diverse mecanisme
de rezistență cu relevanță clinică, de exemplu:
- tulpini de enterobacterii producătoare de ESBL, AmpC,
- tulpini de enterobacterii producătoare de carbapenemaze,
- bacili Gram-negativi rezistenți la colistin,
- enterococi rezistenți la glicopeptide,
- Streptococcus pneumoniae cu sensibilitate scăzută față de penicilină,
- Staphylococcus aureus rezistent la meticilină.
Frecvența recomandată este de cel puțin o participare pe an pentru fiecare mecanism de
rezistență din cele enumerate.
Prelucrarea materialelor de control trebuie să se facă în mod similar cu prelucrarea probelor
de pacienți, cu respectarea criteriilor de implicare etiologică și alegerea setului de antibiotice în
funcție de matrice și de sindromul infecțios investigat.

81
 Anexa nr. 1. Schemă privind pregătirea și depozitarea
tulpinilor de referință

Tulpină de referință din colecție recunoscută internațional

Reconstituită și subcultivată o singură dată

Stocul de referință liofilizat sau congelat la -80oC (păstrat în condiții specificate, într-un
interval de timp recomandat) - disponibil comercial

Reconstituire
O singură subcultivare

Cultura de lucru (păstrată în anumite condiții, pentru un interval

de timp specificat)

Utilizare în testările de rutină

82
III. Bibliografie
Buiuc D, Negut M: Tratat de microbiologie clinică. Ediția III, Editura Medicală, 2017.
Eleftheriadou M, Tsimillis KC: Eurachem guide, Accreditation for Microbiological
Laboratories, Second edition (2013), ISBN: 978-91 -87017-92-6. Available from
ww.eurachem.org
Public Health England. (2019). Example reference strains for UK SMI test procedures. UK
Standards for Microbiology Investigations. TP 1 Issue 3. https://www.gov.uk/uk-standards-for-
microbiology-investigations-smi-quality-and-consistency-in-clinical-laboratories
SR EN ISO 15189:2013 Laboratoare medicale. Cerințe pentru calitate și competență.

83
 Diagnosticul microbiologic al infecțiilor sistemice -
hemocultura

I. Introducere
Hemocultura permite identificarea agenților patogeni care determină bacteriemii sau
fungemii și testarea sensibilității acestora față de antimicrobiene. Hemocultura se efectuează în
regim de urgență și este una dintre cele mai importante analize efectuate în cadrul laboratorului de
microbiologie. Indicațiile hemoculturii:
- Sepsis, şoc septic;
- Endocardită infecţioasă
- Infecţii care se pot asocia cu bacteriemie (pneumonie, meningită, pielonefrite acute, infecţii
puerperale, angiocolecistite, artrite septice, infecţii ale arsurilor şi plăgilor);
- Neutropenia febrilă;
- Febră la pacienți imunocompromiși;
- Stări febrile asociate cateterelor intravasculare, protezelor, hemodializei;
- Febră la persoanele care se întorc din călătorii în zone cu risc epidemiologic crescut pentru
germeni specifici;
- Sindrom sugestiv pentru infecții cu germeni specifici (febră enterică – Salmonella Typhi,
Salmonella Paratyphi, bruceloză, leptospiroză);
- Investigarea febrei de cauză necunoscută
- În cazul nou-născuților se recomandă hemocultura la cele mai mici semne clinice ale unei
infecții.
- La sugarii sub vârsta de 3 luni hemocultura este indicată în toate cazurile de suspiciune de
sepsis, meningococemie, febră fără focar cunoscut, investigarea unei stări febrile prelungite,
infecție de tract urinar. La vârste între 3-36 de luni hemocultura poate fi luată în considerare în
cazul stărilor febrile (>39°C) cu sursă necunoscută în lipsa unei imunizări complete
antipneumococice.

Cerințe minime în vederea unui diagnostic microbiologic eficient

Se recomandă utilizarea unui aparat de hemocultură de capacitate potrivită mărimii și
specificului spitalului.
Intervalul de timp de la recoltarea probei până la eliberarea rezultatului (TAT, turnaround
time, în concepție mai largă ”time from vein to brain”), trebuie să fie cât mai scurt. Acesta este
recomandat a fi între 2-5 zile, dar poate fi depășit în cazul unor specii fungice sau bacteriene cu
creștere lentă sau în cazul endocarditelor.
Trebuie asigurate condițiile ca hemoculturile să fie preluate în orice oră a zilei și în orice
zi a săptămânii și să fie incubate în cel mult 2 ore de la recoltare. După declanșarea semnalului
pozitiv, hemoculturile trebuie descărcate imediat și procesul de prelucrare demarat fără întârziere.
Pe parcursul diagnosticului se informează clinicianul despre pozitivarea hemoculturilor, despre
caracterele morfotinctoriale ale microorganismului și alte date considerate utile din punct de
vedere clinic.

84
Aparate de hemocultură și flacoane utilizate
Aparatele de hemocultură BactAlert și Bactec depistează creșterea bacteriană prin
urmărirea nivelului de CO2 în flaconul însămânțat.
VersaTREK monitorizează creșterea bacteriană prin detectarea schimbărilor de presiune
din flaconul însămânțat.
Aceste sisteme folosesc flacoane de hemocultură speciale, compatibile doar cu aparatul
propriu având compoziție specifică a mediului de cultură ce permite o bună recuperare a
bacteriilor, inclusiv a celor pretențioase și a unor levuri.
Avantajul lor față de metodele clasice este că evidențiază creșterea în flacoanele
însămânțate fără a fi nevoie de deschiderea, manevrarea lor, prevenind astfel contaminarea
hemoculturilor în laborator. Pe de altă parte în unele situații scurtează durata diagnosticului,
întrucât în prezența unei încărcături bacteriene crescute se pot pozitiva după doar câteva ore de
incubare.
Tipurile de flacoane și mediile de cultură folosite variază în funcție de producător: există
flacoane aerobe, anaerobe, pentru fungi (Bactec), pentru cultivarea Mycobacterium tuberculosis,
flacoane pediatrice și flacoane ce conțin inhibitori de antibiotice (rășini).
Între volumul mediului de cultură și a sângelui recoltat trebuie să existe un raport de cca
15:1 pentru a inhiba efectul antimicrobian al sângelui uman. Acest raport poate fi redus la 5:1 sau
10:1 în cazul în care la mediu se adaugă polyanetholsulfonat de sodiu (SPS). În vederea obținerii
acestui efect trebuie respectate strict volumele recomandate de producător. Flacoanele au presiune
negativă, de aceea trebuie avută grijă să se evite supraîncărcarea flacoanelor, ceea ce poate duce
la erori diagnostice.

II. Recoltarea și transportul probelor

Momentul recoltării
Hemocultura are șanse reale de pozitivare doar dacă recoltarea se face la debutul bolii și
înaintea administrării antibioticelor. Omiterea recoltării la debut (la internare), înaintea începerii
tratamentului antibiotic are ca și consecință pierderea diagnosticului etiologic. Recoltările
ulterioare în cazul evoluției nefavorabile duc la izolarea unor patogeni cu mecanisme de rezistență.
Astfel de obiceiuri de recoltare selectivă duc la distorsionarea spectrului de etiologie și a ponderii
tulpinilor rezistente implicate în infecții invazive.
Antibioticele administrate influențează rezultatul, chiar și în situația recoltării după
administrarea unei singure doze. Dacă acest lucru nu poate fi evitat, recoltarea trebuie făcută
înaintea dozei următoare de antibiotic, când nivelurile serice sunt cele mai joase și se vor utiliza
flacoane de hemocultură care conțin inhibitori de antibiotice.
În prezența febrei, hemoculturile trebuie recoltate cât mai repede. Lipsa febrei nu este o
contraindicație pentru recoltarea hemoculturilor.

Tehnica recoltării
Pregătirea personalului responsabil cu recoltarea include: igiena mâinilor cu soluții
alcoolice, echiparea cu mănuși nesterile și mască chirurgicală. Ușa salonului să fie închisă.

85
 Recoltarea se face preferabil prin puncție venoasă. Recoltarea prin catetere trebuie evitată
din cauza riscului crescut de rezultate fals pozitive. Sângele arterial nu este superior din punctul
de vedere al succesului izolării microorganismelor comparativ cu sângele venos și nu se
recomandă.

Pregătirea pacientului în vederea recoltării

Antisepsia tegumentelor în zona de puncție se va efectua riguros, fiind de importanță
majoră în prevenirea contaminării probelor.
Recomandarea standard este utilizarea unei soluții alcoolice de 70% urmată de tinctură de
iod 1-2% sau iod povidon. Alternativ, se recomandă utilizarea unui antiseptic pe bază de
clorhexidină gluconat 0,5% în soluție alcoolică.
Iodul povidon are timp de contact lung, 1-2 minute care trebuie respectat în vederea
obținerii efectului antimicrobian dorit. Se aplică în cercuri concentrice pornind din punctul de
inserție.
Soluțiile pe bază de alcool, tinctura de iod și clorhexidina au timp de contact mai redus (30
de secunde), astfel șansele de respectare a timpilor de contact sunt mai mari. Aceste soluții se
aplică prin frecare viguroasă. Atenție la indicațiile producătorului, de exemplu pentru flacoanele
Bactec este interzisă utilizarea soluțiilor pe bază de iod.
După antisepsia tegumentelor nu se palpează vena. În cazul în care este neapărată nevoie,
se va schimba mănușa.
Recoltarea se face cu ac și seringă, în seringi de volum potrivit (10-20 ml, mai mici pentru
flacoanele pediatrice). După îndepărtarea capacului hemoculturii, dopul de cauciuc se
dezinfectează. Pentru transferul sângelui se folosește un dispozitiv special. În lipsa acestuia
sângele se transferă în flacoane cu un ac schimbat. Cu acesta se inoculează ambele flacoane ale
setului. Nu se schimbă acul pentru a reduce riscurile de accidente prin înțepare. Dacă setul conține
un flacon anaerob (recomandat), prima dată se inoculează flaconul aerob și după aceea cel anaerob.
Este important să se evite aerisirea flaconului anaerob.
Pot fi folosite de asemenea sisteme de recoltare cu circuit închis, utilizând adaptoare
speciale pentru flacoanele de hemocultură și trusă de transfer. Această metodă necesită atenție
sporită pentru încărcarea flacoanelor cu volumele corecte de sânge. Flacoanele fiind vidate, uneori
cauzează colabarea venelor.
După transferul sângelui în flacon, se amestecă cu mediul prin agitare ușoară.
Dacă puncția venei eșuează, acul trebuie schimbat.
Pe flacoane se notează numele pacientului, locul recoltării și se lipește eticheta cu codul de
identificare. Specificarea locului anatomic de recoltare (și dacă este prin cateter sau venă) este
importantă în interpretarea rezultatului hemoculturii, a stabilirii semnificației izolatului.

Seturile de hemocultură
Setul de hemocultură se definește ca proba recoltată printr-o singură puncție. Aceasta, în
cazul adulților, se repartizează într-un flacon aerob și un flacon anaerob. Deși germenii strict
anaerobi sunt implicați în mai puțin de 10% din bacteriemii, utilizarea de rutină a flacoanelor
pentru anaerobi este recomandată și din cauza faptului că mediul bogat nutritiv al acestora
favorizează creșterea bacteriilor facultativ anaerobe, uneori fiind unicul flacon pozitivat al setului
de hemocultură. Când ambele flacoane se pozitivează, în cazul enterobacteriilor flaconul anaerob
frecvent se pozitivează mai repede. Ocazional este acceptabil ca setul de hemocultură să fie alcătuit

86
din două flacoane aerobe, decizie ce se poate stabili de fiecare laborator/spital în parte în funcție
de particularitățile locale.
Într-un episod bacteriemic este nevoie de cel puțin două seturi de hemoculturi (2x2
flacoane), ideal 3 seturi, pentru creșterea șansei izolării germenului, recoltate din puncții diferite.
În cazul unor urgențe, când inițierea antibioterapiei trebuie făcută fără întârziere, acestea pot fi
recoltate imediat unul după celălalt. Altfel, cele două seturi pot fi recoltate la interval de 30-60 de
minute.
Seturile multiple recoltate prin puncții cu localizări diferite permit stabilirea semnificației
izolatului bacterian, când acesta este un comensal obișnuit al tegumentelor (de ex. stafilococi
coagulază negativi, coryneformi, Cutibacterium acnes). izolarea aceleiași tulpini din ambele seturi
de hemocultură susține rolul etiologic al acesteia. Izolarea dintr-un singur set a unui comensal
tegumentar semnifică de regulă contaminare.

Repetarea recoltării (hemoculturi de monitorizare)

Nu este nevoie de repetarea hemoculturii dacă în episodul bacteriemic inițial s-a recoltat
numărul de seturi recomandate. Repetarea recoltării (fără indicații, nejustificate) crește riscul unor
rezultate fals pozitive prin contaminare, ceea ce duce la investigații suplimentare și tratamente
antibiotice inadecvate. Excepție în cazul endocarditei infecțioase, în care repetarea recoltării poate
crește șansa izolării agentului etiologic.
Se indică repetarea hemoculturii la 2-4 zile de la pozitivarea primelor seturi în cazul izolării
Staphylococcus aureus, deoarece acesta are tendința de a cauza bacteriemii persistente. Reizolarea
lui indică eșecul asanării focarului. Negativarea hemoculturilor la 2-4 zile după primul set pozitiv,
alături de alte criterii clinice permite administrarea unui tratament antimicrobian mai scurt.
Hemoculturile de monitorizare (de control) se recomandă și în cazul infecțiilor sistemice
cauzate de Candida spp. În acest caz hemoculturile de monitorizare obiectivează sfârșitul
candidemiei, ceea ce permite optimizarea duratei tratamentului.
Poate fi luată în considerare recoltarea repetată în cazul bacteriemiilor cauzate de Gram-
negativi, în special în prezența unor factori de risc microbiologici sau clinici (hemodializă, sepsis
asociat cateterelor, în cazul utilizării empirice a unor antibiotice necorespunzătoare agentului
etiologic identificat, sepsis cu Serratia spp sau Pseudomonas aeruginosa). Unele studii arată rată
de mortalitate scăzută în situația recoltării hemoculturilor de monitorizare și optimizării
tratamentului antimicrobian în cazul bacteriemiilor cu Gram-negativi.

Volumul de sânge recoltat

Într-un flacon pentru adulți se recoltează 8-10 ml de sânge. În flacoanele pediatrice pot fi
introduse 0,5-4 ml de sânge. Depășirea volumelor maxim admise, supraîncărcarea flacoanelor
poate duce la rezultate fals negative datorită alterării raportului optim dintre mediul de cultură din
flacon și sânge.
Volumul de sânge total recoltat este cel mai important factor de care depinde pozitivarea
hemoculturilor. În cursul unei bacteriemii numărul de bacterii circulante este mic (<10 3 UFC/L la
adulți). Cu cât volumul total recoltat este mai mare, cu atât șansele de diagnostic sunt mai mari.
La adulți se recomandă recoltarea a 20-30 ml sânge per set, în total 40-60 ml.
La copii volumul de sânge necesar depinde de greutatea corporală. Flacoanele pediatrice
se utilizează doar la copii cu o greutate de sub 12,8 kg. Inclusiv la copii, de la o greutate de peste
1,1 kg se recoltează seturi multiple, conform tabelului nr. 1.

87
Tabelul 1. Volumul de sânge recomandat la copii, în funcție de greutatea corporală

Greutate Volumul de sânge de recoltat (ml) Volum total de % din volumul

corporala recoltat pentru total sânge
(kg) Recoltare 1 Recoltare 2 cultivare (ml) circulant

≤1 0,5-2* - - - 0,5-2 4

1,1-2 2* - 2* - 4 4

2,1-12,7 4* - 2* - 6 3

12,8-36,3 10** - 10** - 20 2.5

>36,3 10** 10*** 10** 10*** 40 1.8

*flacon pediatric
** flacon aerob pentru adulți
*** flacon anaerob pentru adulți

Transportul hemoculturilor
Înainte de a trimite hemoculturile la laborator se va verifica dacă:
- Flacoanele sunt corect înscripționate și este lipit codul de cerere;
- Este menționat locul recoltării;
- Volumul de sânge recoltat a fost corect. Se va menționa în documentul ce însoțește flaconul la
laborator sau în cel electronic dacă s-a recoltat o cantitate mai mică decât cea recomandată.
Hemoculturile trebuie să ajungă cât mai repede la laborator și în cel mult 2 ore de la
recoltare trebuie incubate în aparatul de hemocultură. Flacoanele nu se refrigerează. Flacoanele nu
se agită pentru a nu produce spumă (Bactec).
În cazul sistemelor de hemocultură colorimetrice (BactAlert), dacă apar întârzieri, se va
verifica culoarea indicatorului înainte de introducerea flaconului în aparat. Flacoanele semnalizate
de către sistem ca fiind pozitive pentru creștere bacteriană vor fi procesate imediat.

Preluarea hemoculturilor
La preluarea probei se verifică flacoanele, prezența codului de bare și datele despre locul
recoltării. Dacă apar probleme de identificare a probei, se anunță imediat medicul curant și se
repetă recoltarea.
Flacoanele se verifică pentru integritate și eventuala prezență a sângelui în exterior.
Flacoanele se manipulează doar cu mănuși. În cazul în care se observă sânge pe exteriorul
flaconului, se dezinfectează înainte de incubare în aparat.

88
 Dacă flacoanele preluate sunt expirate, acest lucru se va menționa ca și posibilă sursă de
eroare și se va lua legătura cu secția pentru atenționare (să se descarce flacoanele expirate).
Laboratorul trebuie să monitorizeze datele de expirare ale flacoanelor.
Volumele incorecte (prea mari sau prea mici) se notează pe rezultat.
În cazul în care se trimit seturi singulare, se va formula o atenționare la eliberarea
rezultatului.

III. Examenul microbiologic

Incubarea flacoanelor de hemocultură

Hemoculturile se incubează la temperatura de 37°C timp de 5 zile. În cazul endocarditei
prelungirea la 14-21 de zile nu mai este recomandată, căci microorganismele țintite prin incubarea
prelungită cresc adecvat și în 5 zile în mediile actuale.

Prelucrarea hemoculturilor pozitive și comunicarea rezultatelor

intermediare
După emiterea semnalului pozitiv flacoanele se scot cât mai repede din aparat și se începe
prelucrarea fără întârziere. Monitorizarea continuă a aparatelor de hemocultură este o cerință de
bază care trebuie îndeplinită în fiecare laborator.
Pentru deschiderea flacoanelor de hemocultură se recomandă folosirea acelor de ventilație.
În lipsa acestora se vor folosi ace de seringă.
Este recomandat ca puncționarea cu ace a flacoanelor să se facă sub hotă, deoarece uneori poate
exista presiune pozitivă în flacoane, ceea ce expulzează lichidul în momentul puncționării și astfel
se contaminează mediul și/sau persoana.
Se efectuează un frotiu colorat Gram iar rezultatul examenului microscopic se comunică
clinicianului de îndată. Este primul feed-back pe care laboratorul îl poate da și este esențial pentru
ajustarea tratamentului pacientului.
În funcție de caracterele morfo-tinctoriale ale microorganismului se alege un set de medii
pe care cu cea mai mare probabilitate se poate obține o creștere bacteriană. Incubarea se face de
asemenea conform necesităților bacteriei suspectate.

Identificare convențională
În lipsa altor metode, identificarea se bazează pe metodele de identificare convenționale,
de care dispune laboratorul.
Este important ca laboratorul care efectuează hemoculturi să aibă capacitatea de a identifica
majoritatea patogenilor la nivel de gen și specie.
Această etapă poate avea o durată de timp variată, în care informațiile trebuie comunicate
clinicianului imediat ce devin disponibile.

89
Teste rapide, metode de identificare rapidă
Unele truse de aglutinare permit detectarea antigenelor bacteriene din hemocultura
pozitivată. Astfel se poate obține o identificare rapidă, înainte de cultivarea propriu-zisă a bacteriei.
Există truse de aglutinare pentru detectarea antigenelor de Streptococcus pneumoniae, anumite
serogrupuri de Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae serotip b. În aceste cazuri trebuie
urmărite recomandările producătorului testului.
Există diferite metode de detectare rapidă a principalelor mecanisme de rezistență, bazate
pe metode imunocromatografice sau colorimetrice. Acestea pot fi utilizate din cultura bacteriană
sau direct din flaconul de hemocultură. Prin aceste metode se poate detecta meticilino-rezistența
la Staphylococcus aureus, producerea de ESBL (beta-lactamaze cu spectru extins) sau
carbapenemaze la enterobacterii.
Identificarea utilizând MALDI-TOF permite de asemenea accelerarea diagnosticului prin
identificarea direct din flaconul pozitiv sau din subcultura efectuată pe medii solide a
microorganismului.

Identificare moleculară
Majoritatea testelor moleculare pot identifica patogenul doar din hemocultura pozitivată.
Testele multiplex permit identificarea unui număr de patogeni bacterieni și/sau fungici. Unele truse
identifică și prezența unor gene de rezistență importante (diverse gene bla care codifică beta-
lactamaze, genele mecA, mecC responsabile de meticilino-rezistență și genele vanA/B pentru
identificarea VRE).

Interpretarea hemoculturilor
Orice creștere microbiană poate să fie semnificativă, însă această semnificație trebuie
stabilită pentru fiecare izolat în parte. Mediile de cultură au fost mult îmbunătățite în ultimii ani și
permit o creștere mai bună nu doar a patogenilor, ci și a contaminanților.

Contaminarea hemoculturilor
Cea mai mare problemă în interpretarea rezultatului hemoculturii o constituie
contaminarea, care poate avea cauze diverse. Cel mai frecvent bacteria contaminantă provine din
flora tegumentară, în cazul unei antisepsii defectuoase.
Hemoculturile sunt de asemenea frecvent contaminate în cazul recoltării prin catetere
intravasculare, acestea având o rată de contaminare mai mare decât în cazul venopuncțiilor. Riscul
cel mai mare pentru rezultate fals pozitive există în cazul recoltării prin catetere intravasculare
inserate în artera sau vena femurală. În cazul recoltărilor prin catetere, hemocultura se poate
contamina nu doar cu bacterii din flora comensală, ci și cu patogeni obișnuiți (Staphylococcus
aureus, enterobacterii, Pseudomonas aeruginosa, etc.). Aceștia de obicei provin din porturile
contaminate ale cateterelor. Raportarea acestora ca și patogeni semnificativi poate avea consecințe
nedorite asupra pacientului, a costurilor spitalizării și a datelor de incidență a IAAM.
Eliberarea rezultatului complet cu antibiogramă în cazul unui germen contaminant are
impact clinic deosebit, cu aplicarea unor tratamente antibiotice incorecte sau chiar inutile. S-a
arătat că în urma raportării stafilococilor coagulazo-negativi contaminanți se prescriu inutil
antibiotice, între care și vancomicina pe o durată prelungită.

90
 Bacteriile cu probabilitate mare să fie contaminanți sunt:
- Stafilococii coagulazo-negativi
- Coryneformii
- Micrococcus spp.
- Cutibacterium acnes (fost Propionibacteium acnes)
- Bacillus spp. (alte specii, decât B. anthracis)
Aceste bacterii vor fi considerate contaminanți cu excepția situațiilor în care aceeași tulpină
se izolează din seturi succesive și există criterii clinice și de laborator, factori favorizanți care să
susțină implicarea lor în infecția sistemică.
O serie de alți patogeni pot avea semnificație clinică sau să fie contaminanți, după caz:
- enterococi
- streptococi de grup viridans
Următoarele bacterii se consideră semnificative (sunt foarte rari contaminanți):
- Staphylococcus aureus
- Streptococcus pneumoniae
- Streptococi beta-hemolitici
- Listeria monocytogenes
- Escherichia coli și alte specii din Ordinul Enterobacterales
- Pseudomonas aeruginosa
- Acinetobacter baumannii
- Neisseria meningitidis
- Haemophilus influenzae
- bacili Gram-negativi anaerobi (Bacteroides spp., Fusobacterium spp.),
- Candida spp.

Hemoculturile polimicrobiene
Infecțiile sistemice real polimicrobiene sunt rare. Sunt posibile în contextul unei
translocații bacteriene din intestin, mucoase. În toate cazurile în care se izolează mai multe bacterii,
trebuie cântărită posibilitatea implicării acestora în infecție, sau dacă sunt de fapt contaminări.
Când alături de germeni patogeni se izolează specii ale florei comensale se ridică semne
de întrebare privind toate izolatele, inclusiv privind patogenii reali și acest dubiu trebuie comunicat
clinicianului. Nu se prelucrează extensiv aceste izolate, însă se pot păstra pentru eventualitatea în
care vreuna dintre aceste specii se izolează din seturi ulterioare.

Diagnosticul microbiologic în situații clinice particulare

Sepsisul asociat cateterelor

În cazul sepsisului asociat cateterelor sursa este reprezentată de cateterul intravascular. Se
suspicionează în cazul unor infecții invazive care se dezvoltă în prezența cateterelor intravasculare,
în absența altor surse evidente de infecție. Febra este parametrul clinic cel mai sensibil, însă cu
specificitate redusă. Prezența inflamației și a exudatului la locul inserției cateterului are
specificitate crescută (94-99%) pentru sepsisul asociat cateterului, însă are sensibilitate redusă.
Pentru susținerea diagnosticului acestei infecții este nevoie de evidențierea agentului
etiologic în relație cu cateterul incriminat.

91
 Există două posibilități de abordare a diagnosticului: cu îndepărtarea sau cu păstrarea
cateterului.
1. Proceduri recomandate cu păstrarea cateterului
Metodele de diagnostic conservative includ: examenul bacteriologic al locului inserției în
prezența inflamației și/sau a exudatului și recoltarea hemoculturilor.
Pentru examenul bacteriologic al locului inserției se șterge tegumentul din jurul inserției
cu un tampon. Se recomandă în prezența inflamației și/sau a prezenței exudatului.
Pentru hemoculturi se recomandă recoltarea în paralel a unui set prin cateter și a unui al
doilea set prin puncție venoasă.
Izolarea aceleiași tulpini din ambele seturi, în plus, pozitivarea cu cel puțin două ore mai
devreme a setului recoltat prin cateterul intravascular considerat sursa sepsisului, susțin
diagnosticul de sepsis asociat cateterului. În situația în care se recoltează 2 seturi de hemoculturi
în paralel, un set prin cateter și al doilea set prin puncție venoasă, se va nota ora pozitivării pentru
fiecare flacon, pentru a documenta infecția de cateter.
În cazul în care doar setul recoltat prin cateter se pozitivează, se consideră contaminare din
cateter. În cazul în care doar setul recoltat prin venopuncție se pozitivează cu un germen din flora
tegumentară, se consideră contaminare.
2. Proceduri ce implică îndepărtarea cateterului
Sepsisul asociat cateterului se confirmă în cazul în care se evidențiază prezența aceluiași
germen pe capătul distal al unui cateter și în hemoculturile recoltate prin puncție percutană.
Interpretarea se face întotdeauna în corelare cu rezultatul hemoculturii. Examenul bacteriologic al
vârfului de cateter NU se face de rutină, doar în prezența semnelor de sepsis și când se exclud alte
surse de infecție.
Metoda semicantitativă a lui Maki s-a dovedit a fi la fel de eficientă ca și metodele
cantitative pentru diagnosticul sepsisului asociat cateterelor utilizate pe durată scurtă. Fiind o
metodă foarte practică este preferată în cadrul diagnosticului de rutină al acestor infecții. Cateterul
se îndepărtează după antisepsia zonei de inserție. După extragere se taie aseptic 4 cm din capătul
distal al cateterului, folosind o foarfecă sterilă. Fragmentul se introduce într-un recipient steril și
se trimite fără întârziere la laborator. În caz de întârziere, produsul poate fi păstrat la temperatura
frigiderului (nu influențează semnificativ izolarea patogenilor).
Fragmentul se rostogolește pe un agar sânge. După incubare se numără coloniile dezvoltate
pe placă. Creșterea este semnificativă în cazul în care se obține un număr de germeni de ≥15
UFC/placă. Nu se prelucrează mai mult de două specii bacteriene cu creștere semnificativă.
În cazul cateterelor de lungă durată, metoda Maki are sensibilitate mai mică, deoarece la
aceste catetere colonizarea are loc în special intraluminal. Pentru acestea se recomandă tehnici
cantitative cu determinarea numărului de germeni obținuți după sonicare sau după irigarea
lumenului cu ser fiziologic steril.
Nu se recomandă îmbogățirea fragmentelor în medii lichide. Aceasta permite doar
determinarea calitativă a prezenței germenilor, însă nu permite diferențierea între colonizanți,
contaminanți sau agenți etiologici ai unui sepsis asociat cateterului.

92
 Tabelul 2. Prelucrarea hemoculturii în sepsisul asociat cateterului

Situația Produsul Medii de Condiţii de incubare Citirea Microorganis-

clinică recoltat cultură culturii me ţintă
standard
Temp Atmosferă Timp
o
C h

Bacteriemie Vârf de Agar sânge 35-37 Aerobă 24-48 Zilnic ≥15 UFC /placă
sau sepsis cateter Orice creștere de
asociat levuri
cateterului

Bacteriemie Tampon - Agar sânge 35-37 Aerobă 24-48 Zilnic Staphylococcus

sau sepsis locul de aureus
asociat inserție a Stafilococi
cateterului și cateterului coagulazo-
în prezența negativi
semnelor Coryneformi
locale de Enterobacterii
infecție Enterococi
Pseudomonade
Streptococi
Bacillus spp.
Levuri

Endocardita infecțioasă
În cazul endocarditei bacteriemia este continuă. Pozitivarea seturilor succesive
documentează bacteriemia continuă. Se recomandă recoltarea a 3 seturi de hemoculturi preferabil
în decurs de 6-8 ore (6 flacoane în total) dar nu mai mult de 24 de ore. Convențional seturile
cuprind un flacon aerob și unul anaerob. Alternativ pot fi recoltate două seturi de hemoculturi
alcătuite din 2 flacoane aerobe și un flacon anaerob (în total tot 6 flacoane).
În cazul suspiciunii de endocardită și sepsis se recomandă recoltarea a 2 seturi de
hemoculturi la interval de 1 oră.
Semnificația izolatului bacterian este determinat de:

93
- Tipul microorganismului izolat (stafilococii coagulazo-negativi se asociază mai frecvent
endocarditelor pe proteze valvulare; streptococii de grup viridans sunt mai frecvent implicați
în endocardite pe valve native)
- Izolarea aceleiași tulpini din seturi succesive
- Pozitivare rapidă după incubare

Testarea sensibilității față de antibiotice

Antibiograma directă
În anul 2019 EUCAST a stabilit un protocol pentru efectuarea antibiogramelor directe din
hemoculturile pozitivate. (Rapid AST in blood culture
https://www.eucast.org/rapid_ast_in_blood_cultures/)
Implementarea acestei metode impune validare în fiecare laborator.

Antibiograma
Antibiograma se efectuează conform standardului EUCAST, cu caracterizarea, descrierea
fenotipului de rezistență.

IV. Raportarea rezultatelor

Dacă nu s-au recoltat cel puțin două seturi de hemoculturi în cursul episodului bacteriemic,
se va da o atenționare: Set unic! Cantitate insuficientă de sânge! În vederea unui rezultat corect
se recomandă recoltarea a cel puțin două seturi de hemoculturi (4 flacoane în total) prin două
venopuncții diferite.
În cazurile de hemoculturi pediatrice se va urmări de asemenea volumul sângelui total
recoltat. În cazul în care acesta este sub cel recomandat, se va da atenționare: ”volum insuficient,
vă rugăm să consultați manualul recoltării pentru a adapta volumul de sânge la greutatea
corporală a pacientului”.
Dacă se trimit probe în flacoane expirate, acestea se preiau cu mesaj de atenționare privind
posibila sursă de eroare și se ia legătura cu secția pentru a se elimina flacoanele expirate rămase.
Rezultate negative: Flacon aerob și anaerob: negativ
Rezultate pozitive: se comunică specia.
Rezultatele parțiale (examen microscopic din flacon pozitiv, cultura pozitivă, teste rapide
de rezistență bacteriană) se comunică telefonic și se introduc în SIL imediat ce sunt disponibile.

94
Tabelul 3. Semnificația izolatelor în funcție de numărul flacoanelor pozitivate și raportarea rezultatului
Specia izolată Numărul Numărul seturilor Informații Raportarea
flacoanelor clinice rezultatului/comentarii/
pozitive recomandări

Stafilococi coagulazo-negativi 1 sau 2 ale Cel puțin două seturi Fără factori de Contaminant, nu se continuă
(SCN) aceluiași set risc pentru diagnosticul
infecție cu SCN

Pacient cu
factori de risc Se comunică: SCN, posibil
(boală onco - contaminant.
hematologică, Se testează sensibilitatea la
terapie intensivă, solicitarea clinicianului.
imunosupresie,
CVC)

Set unic De fiecare dată Se comunică: ”Stafilococ

coagulazo- negativ;
Set unic! Cantitate insuficientă
de sânge! În vederea interpretării
corecte se recomandă recoltarea
a cel puțin 2 seturi de
hemocultură din venopuncții
diferite.”
Decizia de a identifica la nivel
de specie și testarea sensibilității
se face în urma consultării cu
clinicianul și explicarea
rezultatului neinterpretabil.

95
Specia izolată Numărul Numărul seturilor Informații Raportarea
flacoanelor clinice rezultatului/comentarii/
pozitive recomandări

Aceleași Cel puțin două seturi De fiecare data Se identifică la nivel de specie și
tulpini izolate se testează sensibilitatea la
din seturi antibiotic;
diferite Rezultatul se comunică în cazul
în care profilul de sensibilitate
este identic.

Tulpini sau Oricâte De fiecare data SCN - contaminare

specii de
SCN diferite
în același
flacon sau în
mai multe
seturi

Doar flaconul 2 seturi (un set Suspiciune de SCN - contaminare

recoltat prin recoltat prin cateter, sepsis asociat
cateter un set recoltat prin cateterului
venopuncție)

Doar flaconul 2 seturi (un set Suspiciune de SCN – contaminare din flora
recoltat prin recoltat prin cateter, sepsis asociat tegumentară
venopuncție un set recoltat prin cateterului
venopuncție)

96
Specia izolată Numărul Numărul seturilor Informații Raportarea
flacoanelor clinice rezultatului/comentarii/
pozitive recomandări

Coryneformi, Bacillus spp., Mai multe Cel puțin 2 Se comunică specia izolată cu
Micrococcus spp., streptococi flacoane din antibiogramă (pentru speciile
grup viridans seturi care au standardizare)
succesive

Un singur Cel puțin 2 În orice context Contaminant

flacon

Un singur Set unic Nu se identifică la nivel de

flacon specie. Se comunică genul/
categoria microscopică, cu
mențiunea: posibil contaminant
și atenționare pentru setul unic.

97
Specia izolată Numărul Numărul seturilor Informații Raportarea
flacoanelor clinice rezultatului/comentarii/
pozitive recomandări

Staphylococcus aureus ≥1 Orice număr În orice context Se comunică specia izolată cu

Streptococcus pneumoniae, clinic antibiogramă (pentru speciile
Streptococi beta-hemolitici care au standardizare)
Enterococcus spp.
Enterobacterii,
Pseudomonas aeruginosa,
Acinetobacter baumannii,
Candida albicans
Anaerobi
Neisseria meningitidis
Haemophilus spp.
Listeria monocytogenes
HACEK
Campylobacter spp.
Pasteurella spp.
Brucella spp.

98
 Comunicarea rezultatelor în cazul prelucrării vârfului de cateter și/sau a probei din
jurul inserției cateterului

Vârf de cateter:
Rezultat pozitiv: comunică germenul cu creșterea peste pragul de semnificație (≥15 UFC
/placă) cu adăugarea unui comentariu interpretativ: poate fi asociat cu sepsis sau este un
colonizant/contaminant - verifică rezultatul hemoculturilor!
În cazul creșterii sub 15 colonii/placă: creștere sub prag de semnificație clinică.
Rezultat negativ: fără creștere microbiană.

V. Criterii de performanță
Hemoculturile sunt printre cele mai importante analize microbiologice care permit
stabilirea etiologiei în cazul unor infecții severe, amenințătoare de viață. Datele obținute în urma
acestor investigații sunt deosebit de importante pentru tratamentul corect al pacientului, pentru
utilizarea judicioasă a antibioticelor, dar în același timp și din punctul de vedere al urmăririi
germenilor implicați în aceste infecții și a schimbărilor survenite de-a lungul timpului în rezistența
lor antimicrobiană.
Una dintre problemele frecvent întâlnite în spitalele cu resurse limitate este recoltarea
selectivă a hemoculturilor: recoltarea hemoculturilor doar în cazurile în care evoluția pacientului
este nefavorabilă sub tratament empiric cu spectru larg. Pe lângă subevaluarea incidenței unor
patogeni comunitari sensibili (cum ar fi Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, șa),
aceste obiceiuri de recoltare duc la supraestimarea rezistenței și la abuz de antibiotice, din cauza
absenței frecvente a unei etiologii demonstrate, cu amplificarea fenomenului rezistenței bacteriene.
În vederea unei evaluări corecte privind implicarea microorganismelor în infecții sistemice și a
rezistenței lor antimicrobiene este importantă respectarea indicațiilor recoltării hemoculturilor.
Omiterea diagnosticului poate să ducă și la subraportarea IAAM. (Numărul de hemoculturi
efectuate la 1000 paturi-zile de spitalizare este considerat indicator de calitate al unității sanitare
în unele țări).
Hemoculturile au o rată redusă de pozitivare, depinzând în mare măsură de patologia de
bază. Aceasta este puternic influențată de volumele de sânge, numărul de seturi recoltate.
Laboratorul trebuie să semnalizeze de fiecare dată când volumele și numărul seturilor sunt
insuficiente.
De asemenea, trebuie urmărită supraîncărcarea flacoanelor cu sânge și data expirării
flacoanelor. Unele sisteme de hemoculturi urmăresc acest aspect în mod automat.
Una dintre cele mai frecvente probleme întâlnite în cursul prelucrării hemoculturilor este
contaminarea. Pentru interpretarea corectă a hemoculturilor este foarte importantă respectarea
recomandării de recoltare a seturilor succesive din locuri de puncție diferite. De asemenea,
personalul de recoltare trebuie reinstruit periodic despre tehnica de recoltare. Trebuie evitat ca și
antiseptic iodul povidon și încurajată folosirea soluțiilor alcoolice pe bază de clorhexidină.
Contaminările pe de o parte generează costuri inutile laboratorului prin reactivii și munca
suplimentară depusă pentru clarificarea semnificației acestor izolate, pe de altă parte induc
tratamente greșite sau inutile precum și un consum crescut de antibiotice.

99
 În vederea îmbunătățirii calității acestui diagnostic, se impune urmărirea în timp a unor
indicatori de calitate, cum ar fi: durata transportului, durata de la preluarea probei și incubarea ei,
TAT, rata de recoltare, rata de contaminare, procentul flacoanelor supraîncărcate, rata seturilor
unice, rata de pozitivare (Tabelul 4).

Rata de recoltare
Pe baza acestui parametru se poate stabili dacă se recoltează suficiente hemoculturi (sau
dacă se recoltează în exces). Se determină numărul de seturi de hemocultură raportate la 1000
pacienți-zile de spitalizare. Acest parametru trebuie monitorizat de către fiecare instituție și poate
sta la baza unor decizii de management.

Rata de contaminare
Rata de contaminare reprezintă procentul de seturi de hemoculturi din care se izolează un
contaminant din numărul total de seturi hemoculturi. Conform recomandărilor ghidurilor rata de
contaminare trebuie să fie sub 3%. Se analizează separat rata de contaminare a hemoculturilor
recoltate prin puncție venoasă și separat cea a hemoculturilor recoltate prin catetere intravasculare.
Unele secții, datorită specificului, au de obicei rate mai mari de contaminare (de exemplu secții de
urgență, pediatrie, terapie intensivă, COVID-19), se recomandă ca rata de contaminare să se
urmărească defalcat pe secții pentru a putea da feed-back țintit, conform problemelor observate.

Rata de pozitivare
Rata de pozitivare a hemoculturilor a fost estimată la 7,7% în urma unui audit național
efectuat în SUA. Dacă rata de pozitivare scade sub 5%, poate fi un indiciu al recoltărilor în exces.
O rată de pozitivare ce depășește 15% poate fi un indiciu al recoltării selective și al contaminării
la o rată excesivă.

Rata seturilor unice

Se monitorizează de către laborator și se comunică coordonatorilor secțiilor în vederea
adoptării unor măsuri la nevoie.

Procentul hemoculturilor recoltate după începerea tratamentului

antibiotic
Este unul dintre factorii care influențează rata de pozitivare. Se monitorizează de către
laborator și se comunică coordonatorilor secțiilor în vederea adoptării unor măsuri la nevoie.

Rata supraîncărcării flacoanelor de hemocultură

Observarea repetării acestui fenomen impune reinstruirea personalului privind regulile de
recoltare.

100
Tabelul 4. Frecvența urmăririi indicatorilor de calitate
Indicator de calitate Frecvența Măsuri recomandate

Rata recoltării Anual Training privind indicațiile

recoltării hemoculturilor
(secțiile la care recoltările
sunt în număr redus)

Rata contaminării Lunar Reinstruirea personalului care

recoltează, dacă rata
depășește 5%

Rata supraîncărcării Lunar Comunicarea către secții

Rata seturilor unice La fiecare probă inițial, Menționarea în rezultat;

după aceea lunar și odată Se comunică coordonatorilor
cu obținerea unei secțiilor
stabilități se poate trece la
evaluări anuale

TAT, durata timpului de Lunar Reinstruirea personalului

încărcare a flacoanelor

Durata timpului de la Periodic, eventual în Reinstruirea personalului

pozitivarea hemoculturii cazul unor reclamații
și anunțarea rezultatului (plângeri) din partea
frotiului clinicienilor

VI. Bibliografie
Amipara R, Winders HR, Justo JA et al: Impact of follow up blood cultures on outcomes
of patients with community-onset gram-negative bloodstream infection. EClinicalMedicine 2021,
34:100811.
Baron JE, Weinstein MP, Dunne WM Jr, et al: Cumitech 1C, Blood cultures IV.
Coordinating editor Baron JE, 2005, ASM Press, Washington DC.
Doern GV,Carroll KC, Diekema DJ et al.: A Comprehensive Update on the Problem of
Blood Culture Contamination and a Discussion of Methods for Addressing the Problem. Clin
Microbiol Rev 2020, 33:e00009-19.
Grohs P, Mainardi JC, Podglajen I et al: Relevance of Routine Use of the Anaerobic Blood
Culture Bottle. J Clin Microbiol 2007, 45:2711–2715.
Karch et al: Proposing an empirically justified reference threshold for blood culture
sampling rates in intensive care units. J Clin Microbiol, 2015:53:648
Lafaurie, M., d’Anglejan, E., Donay, J.L. et al.: Utility of anaerobic bottles for the
diagnosis of bloodstream infections. BMC Infect Dis 20, 142 (2020).

101
 Liesman RM, Pritt BS, Maleszewski JJ, Patel R. 2017. Laboratory diagnosis of infective
endocarditis. J Clin Microbiol 55:2599 –2608
Miller M, Binnicker MJ, Campbell S et al: Guide to Utilization of the Microbiology
Laboratory for Diagnosis of Infectious Diseases: 2018 Update by the Infectious Diseases Society
of America and the American Society for Microbiology
Public Health England: Investigation of blood cultures (for organisms other than
Mycobacterium species). UK Standards for Microbiology Investigations. 2019. B 37.
Sharp, S. E., A. Robinson, M. Saubolle,et al : Sending repeat cultures: is there a role in the
management of bacteremic episodes? (SCRIBE study). BMC Infect Dis 2016
Thaden JT, Cantrel S, Dagher M et al: Association of Follow-up Blood Cultures With
Mortality in Patients With Gram-Negative Bloodstream Infections A Systematic Review and
Meta-analysis. JAMA Network Open. 2022;5(9):e2232576.

102
 Diagnosticul microbiologic al infecțiilor sistemului
nervos central

I. Introducere
Infecțiile sistemului nervos central (SNC), deși mai rare comparativ cu infecțiile cu alte
localizări, prezintă un risc crescut de morbiditate, mortalitate și sechele pe termen lung, de aceea
diagnosticul precoce și inițierea rapidă a terapiei antimicrobiene țintite sunt esențiale. Aceste
infecții pot fi cauzate de variate microorganisme (în special virusuri sau bacterii, mai rar fungi sau
paraziți) și pot afecta diferite componente ale SNC (ex. meningite, ventriculite, encefalite, abcese
cerebrale, mielite), uneori fiind afectate concomitent mai multe componente (ex.
meningoencefalita). În funcție de durată se descriu infecții acute, subacute și cronice, iar în funcție
de origine pot fi comunitare sau asociate îngrijirilor medicale.
Meningita bacteriană acută este o infecție invazivă a SNC, caracterizată prin inflamația
meningelui, determinată de un agent bacterian, care se definește clinic prin prezența simptomelor
meningiene (febră, cefalee, redoarea cefei, alterarea stării de conștiență până la comă etc.) și
prezența în LCR a unui număr crescut de leucocite (pleiocitoza).
Agenții etiologici ai meningitei bacteriene acute la adult sunt, în ordinea frecvenței:
Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, bacili Gram-negativi (Haemophilus
influenzae, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae), Staphylococcus
spp., alte specii din genul Streptococcus, Listeria monocytogenes etc.
Meningita meningococică se deosebește de meningitele bacteriene de alte etiologii prin
potențialul său de a determina epidemii pe scară largă. În țările dezvoltate boala endemică este
cauzată, în general, de serogrupurile B și C.

Meningita determinată de H. influenzae se produce, cel mai adesea, la copiii sub 5 ani,
majoritatea cazurilor fiind determinate de serotipul capsular “b” .

Meningita cauzată de Streptococcus pneumoniae se întâlnește mai frecvent la grupele

extreme de vârstă (copii, vârstnici, dar și la tineri cu asplenie, hemoglobinopatii, comorbidități
care asociază imunodepresie, terapie imunosupresoare etc.).

Meningita determinată de Streptococcus agalactiae apare cel mai frecvent la nou- născuți
(care se pot infecta în timpul nașterii naturale de la mama colonizată vaginal), vârstnici și pacienții
cu status imunitar precar.

Listeria monocytogenes determină meningite la nou-născuți și vârstnici, precum și la bolnavi

cu alte afecțiuni cronice, alcoolici, persoane cu imunitate scăzută.
Diagnosticul microbiologic al infecțiilor SNC constă în efectuarea în paralel a mai multor
teste complementare, alese în funcție de datele clinice, paraclinice și epidemiologice, de aceea este
esențială o bună colaborare între infecționist și microbiolog. Majoritatea acestor examene
microbiologice se realizează din proba de lichid cefalo-rahidian (LCR), obiectivele diagnosticului
microbiologic fiind :
- orientarea rapidă a terapiei adecvate

103
- confirmarea diagnosticului de infecției și stabilirea etiologiei (bacteriene, virale sau fungice)
- stabilirea profilului de sensibilitate la antibiotice a izolatului bacterian și ajustarea
tratamentului de primă intenție în cazul infecțiilor bacteriene sau oprirea acestuia, în cazul
infecțiilor virale
- dacă este cazul, oferirea de informații necesare autorităților de sănătate publică.
Meningita acută bacteriană evoluează rapid spre deces în absența tratamentului, de aceea
identificarea cauzei acestei infecții este o urgență, iar proba de LCR de la un pacient suspect de
meningită trebuie prelucrată imediat. Recoltarea probei înainte de începerea terapiei
antimicrobiene crește sensibilitatea metodelor de diagnostic. Temporizarea transportului sau a
procesării probei întârzie obținerea diagnosticului și alterează calitatea probei (scad numărul PMN
și viabilitatea bacteriilor fragile).
LCR este normal steril și, prin urmare, orice microorganism izolat în cultură este potențial
agent etiologic și trebuie raportat imediat către medic. Deoarece în unele meningite numărul de
organisme din LCR poate fi < 103 UFC / ml, concentrarea acestora prin centrifugarea LCR crește
sensibilitatea diagnosticului rapid prin examenul frotiului Gram.
Meningita bacteriană este cauzată frecvent de bacterii aerobe. Bacteriile anaerobe pot fi
prezente în LCR când există un proces infecțios adiacent meningelui, ca de exemplu în abcese
cerebrale, ventriculite sau infecții ale șuntului ventricular, meningită post otită medie complicată.
Inocularea LCR în medii anaerobe nu este recomandată în meningita comunitară. În infecțiile de
șunt este recomandată inocularea probei și în bulion pentru a crește șansele izolării de aerobi și
anaerobi.
Testarea directă antigenică poate fi utilă în unele situații. Sensibilitatea metodei este redusă
pentru probele LCR cu examen microscopic negativ. Sensibilitatea testării este redusă pentru
anumite serogrupuri de Neisseria meningitidis, în timp ce pentru Haemophilus influenzae
serogrupul b este ridicată, dar boala este rară în țările cu programe de vaccinare neonatală extinsă.
Pentru meningite neonatale streptococice sau cu Escherichia coli, frotiul Gram este de obicei
pozitiv, cu excepția unor cazuri de meningită pretratată. În această ultimă situație testarea ar putea
avea un beneficiu.
Testele moleculare bazate pe PCR din LCR sunt deosebit de utile în diagnosticul rapid al
meningitelor, în special atunci când microorganismele sunt prezente în număr redus în probă sau
sunt dificil de cultivat, și mai ales atunci când pacientul este pretratat cu antimicrobiene. Testele
multiplex cresc eficiența diagnosticului microbiologic, scurtează intervalul de timp necesar
diagnosticului etiologic, permit reducerea duratei de administrare a tratamentului mixt
antiviral/antibiotic, contribuie la scurtarea duratei de spitalizare.

II.1. Recoltarea, transportul și recepția probelor

II. 1. 1. Recoltarea probelor - tipuri de probe

Recoltarea probelor se face cât mai precoce, pe cât posibil înainte de începerea terapiei
antimicrobiene, pentru a crește sensibilitatea metodelor de diagnostic. În funcție de tipul infecției
se aleg probele care oferă cele mai bune șanse de diagnostic etiologic.

104
 Meningite, meningoencefalite
La orice pacient cu suspiciune de meningită trebuie recoltat LCR, cu excepția situațiilor în
care puncția lombară este contraindicată. Din proba de LCR, recoltată ideal înainte de inițierea
terapiei antibiotice, se vor efectua:
- examen citologic cantitativ și calitativ
- teste biochimice (glucoză, proteine, lactat)
- examene microbiologice (examen microscopic, cultivare, teste antigenice, teste moleculare).
Se recoltează și hemoculturi (ideal înaintea administrării de antibiotice) și probe de sânge
pentru:
- hematologie (hemogramă completă; în cazul unei erupții purpurice sau peteșiale și teste de
coagulare)
- teste biochimice (glicemie, ionogramă).
În cazul unei erupții purpurice biopsia din leziunile cutanate poate să fie luată în considerare,
identificarea N. meningitidis prin cultivare sau mai ales prin PCR având o sensibilitate bună chiar
și după inițierea terapiei antibiotice.
Infecții de șunt ventricular
Șunturile ventriculare sunt dispozitive utilizate pentru drenarea LCR, care au un capăt
proximal plasat într-unul dintre ventriculii cerebrali și un capăt distal internalizat sau externalizat.
Cele internalizate drenează obișnuit în cavitatea peritoneală (șunt ventriculo-peritoneal), mai rar
în atriu sau spațiul pleural. Cele externalizate au capătul distal într-un rezervor. Infecțiile
dispozitivelor asociate SNC sunt în majoritatea cazurilor rezultatul colonizării intraoperatorii sau
postoperatorii a dispozitivului cu microbiota tegumentului. În suspiciunea de infecție de șunt
ventricular se recoltează LCR (preferabil prin puncție direct din șunt sau, dacă nu este posibil, prin
puncție lombară sau din rezervor, percutan) și probe de sânge.

a) Lichidul cefalorahidian
Prelevarea LCR se realizează prin puncție lombară, o tehnică invazivă care trebuie
efectuată de către personal cu experiență, fiind de competența exclusivă a specialiștilor
infecționiști, neurologi, neurochirurgi, pediatri.
Puncția lombară are o indicație majoră în suspiciunea de meningită.
Contraindicațiile sunt:
- Edem papilar (face parte din triada hipertensiunii intracraniene),
- Proces expansiv intracranian (tumoră, abces, malformație vasculară) demonstrate imagistic,
- Pierderea constienței (neinvestigată imagistic sau oftalmologic),
- Tulburări de coagulare, trombocitopenie sau alte diateze hemoragice,
- Suspiciune de abces epidural spinal sau infecție la locul puncției.
- Hemoragii intracraniene neinvestigate angiografic.

Procedura

Recoltarea LCR se efectuează la patul bolnavului, prin rahicenteză, în condiții stricte de

asepsie, pentru a se preveni atât producerea unei infecții iatrogene la pacient, cât și contaminarea
probei cu microbiota cutanată. Se recomandă ca recoltarea să fie realizată cât mai aproape de
debutul simptomelor și, de preferat, înaintea începerii tratamentului antibiotic.

105
 Se decontaminează suprafața cutanată cu tinctură de iod, betadină, clorhexidină etc., la nivelul
spațiului intervertebral L3-L4, L4-L5, L5- S1 sau (în situații speciale) suboccipital,
transfontanelar. Se introduce un ac cu stilet în interspațiul L3-L4, L4-L5 sau L5-S1. Când se ajunge
în spațiul subarahnoidian, se scoate mandrenul și se observă apariția LCR. Se recoltează un volum
de 5-10 mL la adulți, respectiv 2-5 mL la copii, repartizat în 3 tuburi sterile, fără anticoagulant, cu
capac:

- 2-5 mL pentru microbiologie și citologie (0,5 – 1 mL pentru teste moleculare, minim 1 mL

pentru cultivare în sistem automat, 1 mL pentru detecție antigene bacteriene libere prin latex
aglutinare); cantitatea minimă necesară, doar pentru teste microbiologice, este de 2 ml.
- 2- 3 mL pentru teste biochimice,
- 0,5-1 mL pentru teste imunologice.

b) Hemoculturi
Se recoltează în condiții de asepsie, conform procedurii descrise la capitolul Infecții
sistemice (hemocultura).

c) Lichidul de șunt ventricular

Se curăță locul rezervorului cu soluție antiseptică înainte de recoltarea lichidului pentru a
preveni contaminarea. Se scoate lichidul din rezervor și se transferă într-un tub steril.

d) Biopsie cutanată (în suspiciunea de meningococemie):

După decontaminarea suprafeței cutanate se puncționează leziunea purpurică.

II.1.2. Transportul probelor

Probele trebuie să fie etichetate cu informații despre pacient, data și ora recoltării. Probele
trebuie să fie însoțite de o cerere cu informații necesare pentru procesarea adecvată a probei,
informații referitoare la:

- pacient: date de identificare, vârsta, diagnostic, status imun, context clinic sau epidemiologic
(purpură, convulsii, risc de expunere profesională, istoric de călătorie, existența unor cazuri
familiale, intervenții chirurgicale SNC, traumatisme cranio-cerebrale etc.), tratament antibiotic
administrat
- probă: tipul, data și ora recoltării, modul recoltării.

După prelevarea probei de LCR, se realizeaza transportul imediat după recoltare și se anunță
laboratorul.

Transportul probelor la laborator și prelucrarea lor trebuie să se realizeze cât mai curând
posibil, ideal în 10-15 min. Transportul LCR se face fără refrigerare. Condițiile improprii de
transport afectează speciile sensibile (H. influenzae, Neisseria meningitidis, Streptococcus
pneumoniae - care suferă fenomenul de autoliză) și leucocitele PMN.

106
 II.1.3. Criterii de acceptarea a probelor și de alegere a testelor
Se verifică datele pacientului atât pe etichetă, cât și pe cerere.
Probele de LCR sunt prețioase fiind obținute printr-o procedură invazivă. Probele din tuburi
cu scurgeri trebuie procesate, dar se avertizează medicul despre posibilitatea contaminării.
Dacă proba are un volum insuficient se apelează medicul pentru a stabili prioritatea testelor
cerute.
Mycobacterium tuberculosis este mai bine diagnosticat prin PCR comparativ cu alte metode
rapide.

III. Procedura de lucru

Proba se procesează imediat ce a fost primită. Se va utiliza hota pentru biosiguranță pentru
prevenirea contaminării probei sau a culturii, precum și pentru protecția personalului laboratorului.
Examenul microbiologic al LCR rămâne metoda de referință pentru diagnosticul
meningitei bacteriene acute. Această procedură este una dintre cele mai urgente determinări
microbiologice din practica medicală, dată fiind gravitatea deosebită a infecțiilor sistemului nervos
central (SNC), sensibilitatea agenților etiologici bacterieni la variațiile factorilor de mediu extern
(temperatură); precum și necesitatea începerii tratamentului antimicrobian, cât mai rapid, țintit și
corect.
LCR-ul normal: fluid steril, incolor și clar “ca apa de stâncă”, ce conține 3-5 celule nucleate/
mmc, 50- 70 mg/dl glucoză (⅔ din glicemie), 15- 40 mg/dl proteine; 680- 730 mg/ dl cloruri.

III.1. Examen macroscopic

Se înregistrează volumul LCR și aspectul macroscopic (transparență, culoare).
Aspectul LCR poate fi modificat în condiții patologice de cauză infecțioasă sau
neinfecțioasă, în funcție de prezența în concentrații semnificative a leucocitelor, hematiilor,
bacteriilor și/ sau proteinelor, astfel:

*Transparența:
- LCR normal: incolor și clar “ca apa de stâncă”,
- LCR clar: meningite virale, tuberculoase, micotice, lues.
- LCR opalescent: conținut ridicat de celule (PMN, limfocite, hematii); opalescența se
evidențiază la > 200 PMN/ mmc, > 400 limfocite/ mmc sau > 700- 800 eritrocite/ mmc
- LCR tulbure, purulent (crem gălbui, verzui ca “zeama de varză”) în meningite bacteriene
acute, abces cerebral.

*Culoare:
- LCR sanguinolent: accident de puncție, hemoragie meningeană, meningita hemoragică
(meningita cărbunoasă, meningita leptospirotică sau cu Listeria monocytogenes)
- LCR roșu transparent, aspect “lacat”: în hemoragii meningiene mai vechi,
- LCR xantocromic (cu diferite nuanțe de galben, datorită prezenței methemoglobinei sau
bilirubinei): în hemoragie cerebrală, icter.

107
 *Fluiditatea:
- LCR normal: fluid ca apa,
- LCR purulent: vâscos, filant,
- LCR care poate coagula sau forma văl (meningita tuberculoasă).

III.2. Examenul citologic cantitativ

Este necesar pentru probele de LCR clar, opalescent sau tulbure. Se efectuează cât mai
repede posibil, pentru a evita scăderea numărului PMN (cu 50% după o oră la temperatura camerei,
respectiv cu 68% după două ore).
Procedură
Se omogenizează proba și se aspiră aseptic un volum mic pentru camera de numărat.
Se numără leucocitele. Numărul acestora depinde de mai mulți factori: cauza meningitei,
stadiul infecției, caracterele LCR. Astfel, în caz de LCR cu cheag sau văl, numărul obținut prin
citire este redus de absorbția celulelor pe fibrină, iar în caz de LCR hemoragic trebuie aplicată o
corecție a numărului leucocitelor în funcție de numărul de hematii. Există mai multe formule de
corecție, de ex. scăderea unui leucocit la 700 de hematii.
Numărătoarea elementelor nucleate în LCR:
- se face din LCR necentrifugat,
- se exprimă în număr elemente nucleate/ mmc,
- se realizează în camera Fuchs- Rosenthal, sistem automat de hemogramă (cu program pentru
citire LCR) sau ambele.
*Lichid opalescent: într-o eprubetă sterilă se amestecă o cantitate mică de LCR + 1 picătură ac.
acetic glacial (pentru lizarea eventualelor hematii). Se așteaptă 1-2 min . Se agită bine pentru
omogenizare. Se prelevă aseptic cu pipeta Pasteur o cantitate mică de lichid , suficientă pentru a
umple camera de numărat Fuchs-Rosenthal, cu grijă, să nu se formeze bule de aer. Se asigură
aderența lamelei. Se numără elementele nucleate pe 5 rânduri (delimitate de linii triple), cu obiectiv
de 10×. Pe un pătrat mic: se numără celulele de pe latura stângă, latura superioară, apoi restul
suprafeței; în zona laturilor se numără numai celulele care intră cu mai mult de jumătate în aria
pătratului.
*Lichid tulbure, purulent: se efectuează diluții decimale cu ser fiziologic steril: 1/10; 1/100;
1/1000, la care se adaugă 1 picătură ac. acetic glacial, pentru liza eventualelor hematii. Nr.de
elemente se înmulțește cu diluția.
*Lichid hemoragic: se efectuează diluții decimale, la care se adaugă ac. acetic glacial (funcție de
intensitatea hemoragiei); numărul de elemente se înmulțește cu diluția.
Interpretare:
Creșterea numărului de leucocite în LCR poate să apară în inflamații de cauză infecțioasă sau
neinfecțioasă. Determinarea numărului de leucocite permite confirmarea suspiciunii clinice de
meningită și orientarea cu privire la etiologia bacteriană sau virală, dar interpretarea semnificației
este îmbunătățită prin corelarea cu rezultatele altor teste (examenul biochimic al LCR - glicorahie,
raportul glicorahie/glicemie, proteinorahia, etc.). Interpretarea este mai dificilă în cazul suspiciunii
de infecție de șunt, deoarece inflamația este mai redusă comparativ cu cea din meningita
bacteriană și este dificil de diferențiat de inflamația postoperatorie.
Numărul leucocitelor în LCR crește variabil în funcție de natura și stadiul evolutiv al meningitei:
- 10³ celule nucleate/mm³ în meningitele acute bacteriene;

108
- 50-1000/mm³ în meningitele virale;
- 50-500/mm³ în meningita tuberculoasă.
În meningitele bacteriene de debut sau în cele “decapitate” prin terapie antimicrobiană oarbă,
numărul celulelor din LCR poate fi redus, iar citologia este mixtă.

III.3. Examenul biochimic al LCR

Se realizează în paralel cu examenele microbiologice, rezultatele fiind utile pentru
diagnosticul meningitei. Modificări ale parametrilor biochimici ai LCR pot să apară în boli
infecțioase sau neinfecțioase.

a) Determinarea proteinorahiei:
Creșterea albuminorahiei se întâlnește în: meningită, meningoencefalită, neurolues, abcese
cerebrale, hemoragii subarahnoidiene, tumori intracraniene, traumatism cranio-cerebral, scleroză
multiplă.
b) Determinarea glucozei în LCR
În mod normal glicorahia are o valoare cuprinsă între 50-70% din glicemia pacientului. În
meningita bacteriană glicorahia este scăzută (<40 mg/ dl). Hipoglicorahia poate fi mai dificil de
identificat în contextul unei hiperglicemii, de aceea raportul glicorahie/ glicemie poate fi mai util.
Hiperglicorahia este întâlnită în tumori cerebrale, afecțiuni hipotalamice.

Hipoglicorahia este întâlnită în meningite bacteriene (inclusiv tuberculoase), meningite

fungice, meningite neoplazice (carcinomatoase, limfomatoase, leucemice).

c) Determinarea clorurorahiei: concentrația clorului în LCR este superioară cu 15% celei

plasmatice. Clorurorahia este dependentă de valoarea cloremiei, precum și de cea a proteinorahiei.
Este un parametru chimic foarte important în diagnosticul etiologic diferențial al meningitelor cu
LCR clar:
● meningita tuberculoasă: hipocloremie, hipoclorurorahie și hiperproteinorahie.
● meningite virale: ușoară hiperproteinorahie și nivel normal al clorurilor.

109
 Tabelul 1. Profilul citologic și biochimic al LCR în diferite tipuri de meningită
Parametru Meningita Meningita Meningită Meningita
bacteriană tuberculoasă fungică virală

Nr elemente 103 - 104 50-500 100-500 50-1000

nucleate/mmc

tip celule PMN >80% Mononucleare Mononucleare Mononucleare

>80-90% (până la 100%)*

Proteinorahie mult crescută crescută crescută ușor crescută

(150-500 mg/dL) (100-200 mg/dL) (<100 mg/dl)

Glicorahie scăzută scăzută scăzută normală

(<40 mg/dL) (<40 mg/dL) (<40 mg/dL)

Clorurorahie scăzută scăzută normală

PMN - polimorfonucleare
*la debut predomină PMN

III.4. Realizarea frotiurilor pentru examenul citologic calitativ și

bacterioscopic
Procedură
Frotiurile pentru aceste examene se realizează din sedimentul obținut prin centrifugarea
probei, în cazul probelor de LCR clar, opalescent sau tulbure; prin citocentrifugare se
îmbunătățește sensibilitatea examenului microscopic.
În cazul probelor purulente se folosește proba necentrifugată.
a. Dacă LCR este clar, opalescent sau tulbure se centrifughează tubul la 1500 g, 10-15 min (în
suspiciunea de meningită tuberculoasă 15 min la 3000 g). Se efectuează mai multe frotiuri.
Etalarea sedimentului pe lamă se face în zona centrală a acesteia, efectuând cu ansa un frotiu în
formă de spirală, cu spire care nu se suprapun, pentru a obține un frotiu în strat unicelular
(permit evidențierea unei morfologii și tinctorialitate celulară corectă).
b. Dacă LCR este purulent sau volumul de probă nu este suficient pentru concentrare se face frotiul
punând 1-2 picături de LCR pe o lamă degresată și decontaminată în prealabil cu alcool. Nu se
etalează frotiul în spirală, nu se dispersează picăturile de LCR.
c. În suspiciunea de meningită cu Cryptococcus spp., se realizează preparat umed între lamă și
lamelă, din sediment LCR, în tuș India sau suspensie nigrozină.

Se usucă lamele la aer într-o hotă de biosiguranță sau acoperite pe un aparat de încălzit lame.
Se fixează frotiurile și se colorează albastru de metilen și Gram. În suspiciunea de meningită
tuberculoasă un frotiu se colorează Ziehl-Neelsen.
Se examinează imediat frotiurile colorate Gram (examen bacterioscopic) și albastru de metilen
(examen citologic calitativ și bacterioscopic). Examenul are sensibilitate mai bună la pacienții care
nu au primit tratament antibiotic.

110
 Frotiul colorat Giemsa permite examenul citologic: se apreciază procentual categoriile
celulare: leucocite polinucleate, limfocite, monocite, macrofage, hematii, notându-se aspectul lor,
gradul de maturizare, aspectul reactiv sau cronic al limfocitelor (limfocite mici, picnotice, cu zona
de citoplasma foarte îngustă, aproape invizibilă).
Interpretare Orice bacterie observată este considerată semnificativă. Cu toate acestea,
bacteriile văzute doar într-unul sau două câmpuri se confirmă cu un al doilea frotiu. Dacă examenul
este pozitiv se anunță imediat medicul. Un rezultat negativ nu exclude infecția, mai ales la pacienții
care au primit tratament.

III. 5. Teste rapide

Teste moleculare
Testele moleculare, bazate obișnuit pe PCR, în special cele în format point-of-care, pot să
ofere rapid (30-90 min) informații importante atât pentru clinician cât și pentru microbiolog. În
funcție de echipamentele și trusele disponibile aceste teste pot detecta un singur microorganism
sau mai multe (virusuri, bacterii mai frecvent implicate). Testele moleculare reprezintă metoda de
elecție pentru investigarea cauzei meningitelor virale.

Teste de detecție a antigenelor

Testul de detecție antigenică este deosebit de util în suspiciunea de meningită cu
Cryptococcus deoarece are o sensibilitate mare (>90%). În cazul altor etiologii trusele de detecție
a antigenelor bacteriene libere în LCR (latex-aglutinare) au specificitate foarte bună dar o
sensibilitate moderată, de aceea absența reacției nu exclude prezența unor bacterii. Această metodă
nu poate substitui colorația Gram și cultura. Dacă avem la dispoziție o cantitate foarte mică de
LCR, frotiul colorat Gram și cultura trebuie să aibă prioritate față de detectarea antigenelor
bacteriene.

III.6. Cultivarea

Inocularea mediilor și incubarea

Se aspiră cu o pipetă sterilă lichid din partea inferioară a tubului. Alternativ se poate folosi
sedimentul obținut după centrifugare. Se inoculează câte 2 sau 3 picături pe mediile de cultură
(uzual agar sânge și agar chocolat). Se epuizează în cadrane folosind o ansă separată pentru fiecare
placă sau o ansă sterilizată în flacără. Dacă este disponibil mai mult de 1 ml pentru cultura de
rutină se inoculează 1 ml în bulion de îmbogățire (mediul BHI, medii pentru hemocultură). În cazul
probelor de la imunodeprimați pentru izolarea fungilor se inoculează în bulion Sabouraud un
volum mare de probă pentru a crește randamentul cultivării Cryptococcus și Coccidioides. În cazul
suspiciunii de meningită cu anaerobi (traumatisme ale extremității cefalice, neurochirurgie,
chirurgie ORL) se inoculează pe medii și se incubează în atmosferă pentru anaerobi.
Se incubează la 35-37°C plăcile în atmosferă cu 5-10% CO2 și bulioanele în aerul ambiant.

Examinarea culturii
Se examinează toate mediile la 24 h pentru observarea macroscopică a creșterii bacteriene.
Dacă după 24 h nu se observă o creștere vizibilă pe mediile de cultură, se reincubează.
a. Se citesc zilnic plăcile timp de 4 zile.

111
b. Dacă frotiul Gram este pozitiv și nu există creștere bacteriană pe plăci sau a fost solicitată
cultura fungică, se incubează toate plăcile timp de cel puțin 1 săptămână.
c. Se examinează bulionul zilnic timp de 4 zile și se ține timp de 7 zile înainte de eliminare.
Dacă se observă o cultură:
a. Se anunță medicul despre caracterele culturii pozitive.
b. Se identifică toate microorganismele, utilizând teste rapide: examen microscopic, teste
biochimice, teste antigenice; dacă este disponibilă, identificarea prin MALDI-TOF este utilă
pentru identificarea rapidă a izolatelor.
c. Se efectuează antibiograma pentru izolatele cu semnificație.
d. Nu se efectuează identificarea completă sau antibiograma dacă izolatul este în mod clar un
contaminant. Izolatele de stafilococi coagulazo-negativi sau Corynebacterium sunt probabil
contaminanți în infecțiile comunitare dar pot fi o cauză de infecție în infecțiile de șunt și cele
post traumatice.

Interpretare
În general, o cultură pozitivă indică infecția cu microorganismul respectiv.
Lipsa leucocitelor în LCR nu exclude infecția, în special în rombencefalita cu Listeria
monocytogenes. Prezența bacteriilor în număr mare în lipsa reacției inflamatorii poate fi întâlnită
la pacienții imunocompromiși.
Cultura negativă din LCR dar izolarea din hemocultură la un pacient cu meningită confirmă
diagnosticul.

Limite
Rezultate fals pozitive pot rezulta din contaminarea probei cu microbiota pielii.
Rezultatele fals negative pot fi cauzate de un prezența unui număr redus de organisme, de
administrarea tratamentului antibiotic anterior recoltării sau de natura fastidioasă a
microoorganismului.

III.7. Testarea sensibilității la antibiotice

Testarea sensibilității la antibiotice se poate face direct din proba de LCR dacă microscopia
a fost pozitivă, dar confirmarea rezultatului prin metoda difuzimetrică sau prin determinarea CMI
trebuie făcută din inocul standardizat obținut din cultură.

IV. Raportarea rezultatelor

Se raportează rezultatul examenelor citologic cantitativ, citologic calitativ și bacterioscopic
(frotiul Gram) cât mai curând posibil, de obicei în termen de 1 oră de la primirea probei.
Se raportează imediat rezultatul testelor moleculare, dacă au fost efectuate.
Se raportează identitatea izolatului (genul și specia probabilă de îndată ce testele
preliminare sunt finalizate) sau absența cultivării.
Se comunică rezultatul la testarea sensibilității la antibiotice.
Se înregistrează notificarea medicului cu privire la rezultatele pozitive.

112
V. Bibliografie
Buiuc D, Neguţ M - Tratat de microbiologie clinică. Ediția a III-a, Editura Medicală,
2017
Cornaglia G, Courcol R et al. European Manual of Clinical Microbiology, 1st ed, 2011
Garcia L S., Isenberg HD. Clinical Microbiology Procedures Handbook, 2nd Edition,
ASM Press 2007
He T, Kaplan S et al. Laboratory Diagnosis of Central Nervous System Infection. Curr
Infect Dis Rep. 2016; 18(11): 35.
McGill F., Heyderman R.S. et al. The UK joint specialist societies guideline on the
diagnosis and management of acute meningitis and meningococcal sepsis in
immunocompetent adults. J Infect 2016; 72:405-438
Public Health England. (2017). Investigation of Cerebrospinal Fluid. UK Standards for
Microbiology Investigations. B 27 Issue 6.1.
Vandepitte J, Verhaegen J et al. Basic laboratory procedures in clinical bacteriology.
2nd ed. World Health Organization, 2003

113
 Investigarea bacteriologică a tractului respirator
superior și a cavităților conexe

I. Introducere
Infecțiile de tract respirator superior (ICRS) sunt printre cele mai frecvente îmbolnăviri
pentru care pacienții se adresează medicului.
Majoritatea ICRS sunt de origine virală și sunt autolimitate, tratamentul fiind doar
simptomatic. Solicitările de examen bacteriologic excesive duc la supramedicalizarea cazurilor,
creșterea costurilor, dar în același timp, nu oferă informații concludente care să contribuie la un
tratament mai bun. În cele mai multe situații nevoia tratamentului antibiotic se decide pe criterii
clinice, iar alegerea antibioticului se face empiric pe baza recomandărilor ghidurilor clinice.
Diagnosticul bacteriologic efectuat fără indicații reale, duce frecvent la izolarea unor colonizanți
cu atribuirea de rol etiologic si cu testarea sensibilității la antibiotice a acestora, ceea ce, de cele
mai multe ori, conduc la tratamente antibiotice abuzive.
Factorul limitativ cel mai însemnat al examenului bacteriologic, din această sferă de
patologie, este prezența în mod normal a unei flore bacteriene variate, inclusiv a unor potențial
patogeni. De cele mai multe ori este practic imposibil de stabilit când o bacterie izolată este într-
adevăr implicată în procesul infecțios. Este de accentuat că portajul bacteriilor cu potențial patogen
nu justifică tratament antibiotic decât în situații foarte rare. De aceea examenul bacteriologic
trebuie să se limiteze la situațiile în care se pot genera rezultate concludente. Astfel, analizele
relevante și cu valoare informativă certă sunt:
- examenul bacteriologic al exsudatului faringian pentru stabilirea etiologiei streptococice a
anginei acute,
- examenul bacteriologic al puroiului sinusal recoltat prin aspirare sau cu tampon de la
nivelul meatului sinusal,
- examenul bacteriologic al puroiului otic aspirat,
- screeningul portajului de S. aureus (în anumite situații, detaliate mai jos)
- examenul bacteriologic al secreției nazofaringiene pentru detectarea Bordetella pertussis.

Flora microbiană a căilor respiratorii superioare

Căile respiratorii superioare prezintă o floră bacteriană bogată și variată. Componența
acesteia poate fi influențată de factori multipli. Se pot observa variații în funcție de vârstă, de
patologii asociate, de expunerea la antibiotice, spitalizări anterioare, statusul imun, vaccinările
aplicate (în urma introducerii vaccinului împotriva Streptococcus pneumoniae se observă o
schimbare a serotipurilor colonizante).
La persoanele sănătoase, deși există o variație de la persoană la persoană, flora microbiană
a orofaringelui este în general dominată de streptococi din grupul viridans, stafilococi coagulazo-
negativi, micrococi, coryneformi, neisserii nepatogene, Haemophilus spp, Moraxella catarrhalis.
Sunt prezente în număr important bacteriile strict anaerobe, dintre care cel mai bine reprezentate
sunt speciile din genul Porphyromonas, Prevotella, Fusobacterium, speciile anaerobe streptococi,
Veillonella, Actinomyces. Specii de Candida și alte levuri pot fi, de asemenea, prezente în număr

114
redus. În flora cavității nazale predomină stafilococii coagulazo-negativi, coryneformii. În
regiunea subglotică și în sinusurile paranazale nu sunt prezente bacterii în mod normal. La pacienții
intubați și ventilați mecanic și la pacienții cu afecțiuni pulmonare cronice se poate detecta o floră
colonizantă a regiunii subglotice.
Pe lângă flora normală a căilor respiratorii superioare, pot fi prezente pentru o perioadă
variabilă de timp, specii bacteriene potențial patogene, de exemplu: Staphylococcus aureus,
Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, acestea colonizând
nazo- și/ sau orofaringele persoanelor sănătoase. De asemenea, la pacienți cu spitalizări recente se
poate detecta prezența unor bacterii Gram-negative.
Spațiul sublaringeal, sinusurile, urechea medie și internă nu sunt populate, în general, de
bacterii. În mod obișnuit, virusurile nu fac parte din flora microbiană, deși uneori pot fi izolate și
de la persoane asimptomatice.
Prezența potențialilor patogeni în flora normală a persoanelor sănătoase este un fenomen
comun. Aproximativ 10-40% a populației este colonizată cu S. aureus, în colectivitățile de copii
poate ajunge la rate mai înalte, până la 50-70%. Streptococcus pneumoniae, Haemophilus
influenzae, Moraxella catarrhalis sunt bacterii care, ocazional, pot fi implicate în infecții ale
tractului respirator și sunt foarte frecvent prezente la copiii asimptomatici din colectivități.
Datorită prezenței colonizării bacteriene, examenul bacteriologic al secreției nazale în
infecțiile tractului respirator superior, nu este concludent din punct de vedere al diagnosticului
etiologic și, în consecință, există riscul unui tratament antibiotic abuziv.
De asemenea, nu este justificat screeningul acestora la persoane sănătoase – cu excepția
screeningului portajului nazal în anumite situații (vezi mai jos), pentru că detectarea acestora nu
are nicio relevanță clinică, nu necesită tratament antibiotic și nu necesită măsuri speciale.

II. Examenul bacteriologic al exudatului faringian

Context clinic

Diagnosticul faringitei acute streptococice

S. pyogenes (streptococ beta-hemolitic grup A) este agentul etiologic principal al faringitei
acute bacteriene. Simptomele comune sunt febra, odinodisfagia, adenomegalia laterocervicală de
regulă dureroasă. Diferențierea clară între faringita streptococică și cea virală nu este posibilă pe
baza simptomatologiei, este nevoie de examen bacteriologic pentru confirmarea etiologiei.
Afectarea respiratorie difuză poate fi totuși un argument în favoarea etiologiei virale. Faringitele
virale fiind mult mai frecvente, se recomandă utilizarea unor scoruri clinice pentru a efectua
diagnostic bacteriologic, doar în acele cazuri în care etiologia streptococică este probabilă.
Utilizând aceste scoruri se exclud de la analize cazurile în care probabilitatea infecției virale este
mare, evitând prelucrările inutile și eficientizând diagnosticul bacteriologic. Analizele
bacteriologice inutile în contextul faringitelor virale cresc riscul depistării portajelor streptococice,
cărora li se vor atribui în mod fals rol etiologic.
Cel mai cunoscut este scorul Centor modificat, prin care se atribuie câte un punct pentru:
- prezența adenopatiei cervicale
- prezența exsudatului pe amigdale
- lipsa tusei

115
- febră (temperatură peste 38°C)
La acestea se adaugă un punct în cazul pacienților cu vârsta între 3-14 ani și se scade un
punct la cei peste 45 de ani.
Un scor ≤0 reprezintă un risc de infecție cu S. pyogenes de 1-2,5%. Scorul 1 este asociat
cu un risc de 5-10%, cel de 2 cu 11-17%, cel de 3 cu 28-35%, cel de ≥ 4 cu 51-53% risc de infecție
cu S. pyogenes.
Examenul bacteriologic se recomandă la scor de 2-3 puncte și opțional la 1 punct, în cazul
în care se obțin cel puțin 4 puncte tratamentul antibiotic empiric poate fi început și în lipsa
diagnosticului etiologic.
Rolul altor bacterii cum ar fi streptococii grup C și G este justificat de asemenea în situația
prezenței simptomatologiei. Nu există date care să susțină rolul streptococilor grup B și F în
etiologia faringitei.

Diagnosticul bacteriologic în situații particulare

Arcanobacterium haemolyticum poate să determine faringită însoțită de rash, sinuzită,
celulită, septicemie.
La pacienții cu transplant și/sau hematologici se impune testarea pentru Pseudomonas
aeruginosa, enterobacterii și Candida spp.
La pacienții cu fibroză chistică se urmărește portajul de P. aeruginosa și S. aureus.
Angina Plaut-Vincent sau angina ulcero-necrotică este determinată de asocierea a 2 specii
bacteriene strict anaerobe: Fusobacterium necrophorum si Borrelia vincentii. Asocierea fuso-
spirilară este evidențiată în frotiuri colorate Gram din secrețiile tonsilare.
În cazul prezenței pseudomembranelor la nivelul faringelui trebuie luată în considerare
implicarea Corynebacterium diphtheriae sau mononucleoza infecțioasă, cu sau fără suprainfecție
bacteriană.
Neisseria meningitidis colonizează mucoasa tractului respirator superior. Rata de
colonizare crește în special în sezonul rece. Depistarea acestui germen din tractul respirator
superior nu are valoare clinică.
Neisseria gonorrhoeae poate cauza forme ușoare de faringită. Urmărirea acesteia se va
face la cererea clinicianului în prezența unor factori de risc sau anamneză sugestivă.
Mycoplasma pneumoniae se asociază statistic cu istoric de faringită recurentă. Detecția
prin cultivare nu se efectuează de rutină. Chlamydophila pneumoniae poate fi implicată în faringite
acute însă diagnosticul de rutină nu se adresează acesteia.
În epiglotită agenții etiologici mai frecvent implicați sunt Haemophilus influenzae și
Haemophilus parainfluenzae urmați de Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus,
Streptococcus pyogenes. Recoltarea exsudatului faringian în epiglotită poate induce spasm cu
obstrucția căilor respiratorii, din acest motiv trebuie evitată. Pe de altă parte prezența portajul
frecvent al germenilor mai sus menționați îngreunează stabilirea etiologiei infecției. Deoarece
epiglotita poate fi însoțită de bacteriemie, se poate efectua hemocultură în vederea unui diagnostic
etiologic.
La pacienții cu abces amigdalian se va avea în vedere identificarea următoarelor
microorganisme: S. pyogenes, H. influenzae, S. aureus, bacterii anaerobe (Prevotella spp,
Fusobacterium necrophorum, Bacteroides fragilis, Peptostreptococcus spp, Porphyromonas spp)
iar recoltarea nu se va face cu tamponul, ci din puroiul drenat.

116
 În amigdalita cronică examenul bacteriologic este neconcludent. Procesul infecțios are loc
în profunzimea criptelor amigdaliene, iar flora de pe suprafața amigdalelor accesibilă recoltării
este diferită de cea din profunzime.
Portajul de Staphylococcus aureus din exudatul faringian se va urmări doar în cazul
pregătirii preoperatorii (chirurgie cardiovasculară, ortopedie), preferabil pe lângă examinarea
secreției nazale.

Indicații
Cea mai importantă indicație a examenului bacteriologic al exsudatului faringian este
confirmarea etiologiei streptococice a faringitei acute. În anumite situații clinice particulare pot fi
urmărite și alte bacterii, conform tabelului nr. 1.
Persoanele asimptomatice nu trebuie testate prin teste rapide sau cultură deoarece un
anumit procent din populație sunt purtători faringieni persistenți de streptococi fără efecte negative
pentru sănătate.
Screeningul portajului asimptomatic de S. pyogenes nu se recomandă nici în cazul apariției
faringitei streptococice sau a scarlatinei în colectivități de copii. Se va testa portajul asimptomatic
doar în cazul contacților unor pacienți cu istoric de febră reumatismală. De asemenea, poate fi
luată în considerare testarea membrilor de familie a copiilor care au faringită streptococică
recurentă de cel puțin 3 ori în decurs de 3 luni.

Recoltare și transport
Proba trebuie recoltată înaintea începerii terapiei antibiotice locale sau generale. Pentru
recoltare se utilizează tampoane poliester Dacron sau alginat de calciu; se apasă limba iar cu
tamponul se șterge bine aria amigdaliană și peretele posterior al faringelui. Se va evita atingerea
limbii și a uvulei. O sensibilitate mai mare pentru detecția streptococilor beta-hemolitici s-a
observat utilizând tampoane de nylon ”flocked”. Există câteva recomandări speciale pentru
recoltare:
- În prezența ulcerațiilor sau a exudatului recoltarea se va face de la acel nivel.
- În cazul suspiciunii de difterie recoltarea se va face de la periferia pseudomembranelor sau de
sub acestea.
- Pentru N. gonorrhoeae este recomandata utilizarea unui mediu de transport adecvat.
- Pentru Candida spp proba se recoltează de pe limbă, palat, partea internă a obrajilor.
- În cazul abcesului tonsilar se va recolta puroi prin aspirare.
Proba recoltată se transportă în maxim 2 ore la laborator. Dacă intervalul de timp pentru
transport se prelungește atunci se va utiliza mediu de transport Amies și proba poate fi păstrată
până la 24 h la frigider sau la temperatura camerei.

Prelucrare bacteriologică

Examen microscopic
Examenul microscopic se efectuează si are semnificatie doar în cazul anginei Vincent
pentru evidențierea asocierii fuzo- spirilare. Frotiul colorat Gram din secretiile recoltate cu
tampoanele faringiene nu are valoare diagnostică pentru faringita streptococică, datorită prezenței
streptococilor comensali.

117
 Cultivare
Tamponul se rulează pe cca 1/6 din suprafața plăcii cu mediul de cultură apoi cu ajutorul
ansei se face dispersia în 4 cadrane. Se fac câteva înțepături cu ansa în mediul de cultură, într-o
arie neînsămânțată, pentru evidențierea hemolizei complete beta, în cazul tulpinilor de
Streptococcus pyogenes, producătoare de hemolizină oxigen-labilă. Pentru obținerea coloniilor
izolate este importantă diseminarea pe o placă întreagă a produsului. Însămânțarea a două sau mai
multe probe pe aceeași placă este inacceptabilă.
În funcție de solicitarea primită la laborator și de datele clinice se utilizează mediile de
cultură prezentate în tabelul 1.

Identificare
Atenție! – se vor lua în considerare doar coloniile „mari” beta-hemolitice (> 0,5 mm);
pentru coloniile mici betahemolitice care aglutinează cu grupul A, C sau G (și care pot fi bacterii
comensale de tip streptococi din grupul anginosus) se vor efectua obligatoriu teste de confirmare:
PYR (care este pozitiv pentru S. pyogenes, S. porcinus, S. iniae, enterococi) și VP (care este negativ
pentru S. dysgalactiae subsp. equisimilis și S. equi subsp. zooepidemicus), sisteme comerciale de
identificare. MALDI-TOF oferă o identificare rapidă și precisă.
Streptococii de grup A sunt sensibili la bacitracină în procent de 95% iar unele tulpini de
streptococi grup B, C și G pot să fie și ele sensibile la bacitracină. Streptococii grup C și G sunt
sensibili la trimethoprim-sulfamethoxazol (SXT) iar streptococii grup A și B sunt rezistenți.
Atenție! Testarea sensibilității la bacitracină și SXT trebuie efectuate pe subculturi pure și
nu pe însămânțarea primară. Conținutul discului de bacitracină trebuie să fie de 0,04 UI, în cazul
utilizării unor discuri cu conținut de bacitracină mai mare se obține sensibilitate la mai mulți
streptococi grup non-A.
În cazul în care pe frotiul Gram se evidențiază bacili Gram-pozitivi se va efectua testul
catalazei și testul CAMP. A. haemolyticum este catalază negativ și revers CAMP pozitiv cu tulpina
de referință S. aureus ATCC 25923. Atenție: A. haemolyticum poate aglutina cu seruri anti-
streptococ de grup A, B, C, G, F, examenul microscopic fiind esențial pentru stabilirea morfologiei
bacteriene.
Pentru prelucrarea streptococilor β-hemolitici și identificarea Arcanobacterium
haemolyticum se vor urma algoritmii din figurile 1 și 2.
În cazul izolării Corynebacterium diphteriae (de la persoane care călătoresc sau provin
din zone endemice de difterie, simptomatici sau purtători) se impune identificarea tulpinilor
toxinogene (cel mai rapid, prin metode PCR). Necesită confirmare într-un laborator de referință.

118
Tabelul 1. Mediile de cultură, condițiile de incubare și microorganismele urmărite din secreția faringiană și alte produse
biologice relevante în funcție de situația clinică
Context clinic/ Proba biologică Mediu de Condiții de incubare Microorganisme
solicitare cultură Temperatura Atmosfera Timp țintă

Faringita amigdalita Exsudat faringian Agar sânge 35-37°C Aerobă 18 – 48 h Streptococi beta-
berbec hemolitici grup
5-10% CO2 Lancefield A, C, G
Sau anaerobioză
(crește detecția
beta- hemolizei)
Prezența de false Exsudat faringian Agar sânge 35-37°C Aerobă 18 – 48 h Corynebacterium
membrane, călătorie în si nazal de berbec diphteriae
zone cu risc sau contact sau și de dorit (cazurile suspecte se
cu persoane confirmate Exsudat medii trimit la spitalele de
cu infecție nazofaringian speciale: boli infecțioase unde
OST, se realizează și
Agar examenul
Loeffler, microbiologic)
Mediu
Tinsdale
modificat

Portaj S. aureus Exsudat nazal Agar sânge 35-37°C Aerobă 18 – 24 h Staphylococcus

Pregătire preoperatorie Exsudat faringian berbec aureus
Sau agar
cromogen /
selectiv

119
Context clinic/ Proba biologică Mediu de Condiții de incubare Microorganisme
solicitare cultură Temperatura Atmosfera Timp țintă

Gonoree Exsudat faringian Agar 35-37°C 5-10% CO2 40 – 48-72 Neisseria

chocolat și h gonorrhoeae
Agar selectiv
GC,
Sau Agar
Thayer-
Martin, Agar
Martin-Lewis
Eșecul tratamentului sau Exsudat faringian Agar sânge 35-37°C 5-10% CO2 48-96 h Arcanobacterium
amigdalita recurentă berbec haemolyticum

Diabet, Exsudat faringian Agar 35-37°C Aerobă 40-48 h Fungi

imunodeprimațicandidoz sau orofaringian Sabouraud
a orală Raclat lingual sau agar
cromogen
pentru fungi
Durere sau amigdalită Aspirat din Agar 35-37°C Anaerobă 5 – 7 zile Fusobacterium
persistentă colecție purulentă anaerobi necrophorum
Boala Lemierre Fragment țesut cu acid
necrotic nalidixic
și
vancomicină

120
Figura 1. Algoritm de diagnostic în faringita acută (coci Gram-pozitivi)
Colonii β-hemolitice (>0,5 mm)

Morfologic: coci Gram-pozitivi

Catalază negativ

S la bacitracină (0,04 UI) și S la bacitracină (0,04 UI) și Rezistent la bacitracină (0,04 UI)

R la SXT S la SXT

Aglutinare pentru
Aglutinare pentru Aglutinare cu seruri Aglutinare cu seruri
grup A -
grup A + anti grup C sau G + anti grup C sau G -

Prezent Streptococ Prezent streptococ grup C sau G Streptococ grup C sau G

streptococ grup A grup A nedetectat nedetectat

121
Figura 2. Algoritm de diagnostic în faringita acută (bacili Gram-pozitivi)

Colonii β-hemolitice

Morfologic: bacili Gram-pozitivi

Catalază negativ

Arcanobacterium haemolyticum

Testarea sensibilității față de antibiotice

Nu se va efectua de rutină, toate tulpinile de S. pyogenes și streptococii de grup C, G sunt
sensibile la penicilină. Se va testa sensibilitatea la antibiotice alternative (macrolide, clindamicina)
în cazul alergiei la penicilină. Antibiogramele se vor efectua conform recomandărilor standardului
EUCAST.

Teste rapide de diagnostic

Testele rapide imunocromatografice de detecție a antigenului Streptococcus pyogenes,
direct din exsudatul faringian, sunt teste de screening, „point-of-care”. Sunt recomandate
pacienáilor cu scor Centor 3-4. Ele prezintă avantajul scurtării intervalului de timp până la
diagnosticul etiologic, dar trebuie ținut cont de posibilele rezultate fals-negative (în situația unei
cantități mici de bacterii, posibil ca urmare a unei recoltări neadecvate) sau fals-pozitive (prezența
S. anginosus). Testele rapide nu evidențiază streptococii beta-hemolitici de grup C și G. Testele
rapide au o sensibilitate de 70-90% și o specificitate de 98% față de cultură. Un test rapid negativ
la un pacient adult nu justifică cultura de control decât în cazul în care sensibilitatea testului este
sub 80%. Se recomandă confirmarea prin cultură a testelor rapide negative la pacienții pediatrici.
Nu se vor confirma rezultatele pozitive indiferent de vârsta pacientului. Clinicianul este cel care
alege dacă apelează la test rapid sau la cultură în funcție de datele clinice și de ghidurile de
diagnostic și tratament.

Teste serologice
Titrul ASLO crește după 4-5 săptămâni de la infecție astfel testarea nu are rost în
diagnosticul faringitei.
Important! Trebuie descurajată efectuarea testului ASLO în faringita acută deoarece
rezultatele obținute în acest context pot fi derutante, au valoare informativă clinică limitată și pot
genera utilizarea excesivă a antibioticelor.

Raportarea rezultatului

Examenul microscopic
Se raportează prezența fuzospirililor (angina Vincent).
Timp de raportare – cât de repede posibil, până la maxim 24 h de la primirea solicitării.

122
 Cultivare:
Negativă: „streptococ beta-hemolitic grup A, C sau G nedetectat”; în cazul solicitărilor
speciale (suspiciune difterie, gonoree, etc.) se va comunica „nu s-a izolat Corynebacterium
diphtheriae sau Neisseria gonorrhoeae etc.”
Pozitivă: se raportează specia bacteriană izolată însoțită de o apreciere a cantității (prezența
culturii în primul cadran = cultură săracă, sau până în al patrulea cadran = cultură bogată)
Observații:
- Pentru streptococi beta-hemolitici dacă sunt < 10 colonii pe aria de însămânțare se adaugă
comentariul: „prezent streptococ beta-hemolitic grup A, C sau G în cultură săracă – posibil
purtător sănătos; se va interpreta în context clinic”;
- Pentru N. gonorrhoeae se raportează prezența indiferent de cantitatea izolată
- Pentru A. haemolyticum se raportează prezența
- Pentru alte microorganisme izolate se adaugă comentariul „posibil colonizare, se va interpreta
în context clinic”.
- Pentru Candida spp. se raporteaza prezența doar dacă sunt > 25 colonii pe aria de însămânțare
(sub 25 colonii se consideră că face parte din flora normală)
Timp de raportare – raport preliminar la 16-24 de ore, raport scris în 48-72 ore
Limitele metodei
Un rezultat negativ pentru cultură poate fi urmarea dezvoltării în exces a florei normale,
sau lipsa hemolizei β în culturile incubate aerob.
Rezultatele fals pozitive sunt urmarea interpretării greșite a testelor de identificare

III. Examenul bacteriologic al secreției nazale

Context clinic
Camera nazală anterioară este colonizată preferențial de către S. aureus. Pe lângă S. aureus
pot fi regăsiți și alți potențiali patogeni, ca de exemplu S. pyogenes.
Bacteriile prezente în secrețiile nazale nu reprezintă factor predictiv pentru infecții ale
sinusurilor, infecții otice, infecții de tract respirator inferior și superior. Nu se vor efectua culturi
pentru microorganisme anaerobe. Din acest motiv prelucrarea secreției nazale în aceste situații
duce la rezultate neconcludente.

Indicații
Portajul MRSA se urmărește la pacienții la risc pentru infecții asociate asistenței medicale.
Fiecare unitate decide categoriile de pacienți la care să se efectueze screeningul, în funcție de
specificul unității și a situației epidemiologice locale, conform recomandărilor ghidului național
”Diagnosticul, profilaxia și tratamentul infecțiilor determinate de Staphylococcus aureus
meticilino-rezistent (MRSA)”. Portajul MSSA poate fi urmărit la pacienții la risc pentru infecții
postoperatorii (chirurgie cardiovasculară, ortopedie) sau la pacienți cu patologii cutanate cronice,
furunculoze recurente.
Atenție! Solicitarea examenului bacteriologic în afara situațiilor mai sus menționate
reprezintă cereri nejustificate din punct de vedere medical. Orice rezultat pozitiv generat în acest
context este neconcludent, contribuie la abuzul de antibiotice și în consecință la selectarea

123
rezistenței antimicrobiene. Astfel laboratorul de microbiologie are dreptul și obligația de a refuza
examenul bacteriologic al secreției nazale recoltate în afara indicațiilor descrise mai sus.

Recoltare și transport
Se recoltează pe tampon alginat de calciu umectat în prealabil cu soluție salină sterilă. Se
introduce tamponul în narinele anterioare și se rotește timp de 5 secunde în fiecare narină. Se
utilizează mediu de transport Amies și se transportă în maxim 24 h, cu păstrare la temperatura
camerei.
Sensibilitatea metodei de detecție a portajului de MRSA crește prin recoltarea
concomitentă de tampoane și din alte zone ale corpului, respectiv axilă, regiunea inghinală, rect.

Prelucrare bacteriologică

Cultivare
Tamponul se rulează pe 1/4 din suprafața plăcii cu mediul de cultură după care se epuizează
cu ansa. Mediile de cultură și condițiile de cultivare sunt prezentate în tabelul 2.

Tabelul 2. Mediile de cultură, condițiile de incubare și microorganismele urmărite din

secreția nazală
Context Proba Mediu de cultură Condiții de incubare Microorganisme
clinic / biologică Temperatura Atmosfera Timp țintă
solicitare
Portaj Secreție Agar sânge berbec 35-37°C Aerobă 24 – 48 h S. aureus
S. aureus nazală Sau agar selectiv
manitol-sare
Sau agar cromogen
MRSA

Testarea sensibilității la antibiotice

În cazul screeningului pentru determinarea portajului de MRSA la pacienții cu risc la
infecții asociate asistenței medicale nu se va testa sensibilitatea la antibiotice.
În cazul în care screeningul se face în cadrul pregătirii preoperatorii sau la pacienții cu boli
cutanate cronice sau recurente, în urma discuției cu medicii curanți, se pot testa antibiotice utilizate
în cadrul regimului de eradicare a colonizării (de ex. mupirocin, acid fusidic)

Raportarea rezultatului:
Timp de raportare – raport preliminar cât de rapid posibil, raportul scris în 16-72 ore
- Rezultat pozitiv: pozitiv pentru MRSA/MSSA
- Rezultat negativ: MSSA/MRSA nedetectat

124
IV. Examenul microbiologic al secreției nazo-faringiene
Se recomandă în cazul suspiciunii de tuse convulsivă (Bordetella pertussis și Bordetella
parapertussis). Tamponul nazofaringian se recoltează și pentru diagnosticul gripei și alte virusuri
cu tropism respirator (nu se acceptă tampon nazal).

Recoltarea tamponului nazofaringian

Metoda de recoltare trebuie să evite contaminarea cu floră orală sau faringiană. Recoltarea
se va face cu un tampon subțire care se va introduce în nas spre nazofaringe până la jumătatea
distanței între ureche și baza nasului. Se rotește tamponul, se lasă 10-15 secunde pentru a absorbi
microorganismele apoi se retrage și se introduce în mediul de transport. Tamponul nu se
refrigerează și se transportă rapid la laborator.
În cazul diagnosticului molecular în gripă tamponul recoltat se introduce în mediul de
transport lichid și se poate păstra la frigider 24 ore.

Examen microbiologic
Testele moleculare multiplex sunt utile pentru că pot detecta simultan și rapid variate
microorganisme implicate în infecții respiratorii, în principal virusuri (gripale, v. respirator
sincițial, v. paragripale, adenovirusuri, coronavirusuri, inclusiv SARS-CoV2,
metapneumovirusuri, rinovirusuri) dar și unele bacterii (Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila
pneumoniae, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis). Rapiditatea obținerii acestor
rezultate permite adoptarea eficientă a unor decizii terapeutice (reducerea duratei de administrare
nejustificată a antibioticelor) sau de control al infecțiilor.
Teste moleculare pentru diagnosticul infecțiilor respiratorii diferă prin numărul de
microorganisme detectabile, durata până la obținerea rezultatelor, complexitatea testării și
echipamentul necesar, performanțe.

V. Examenul bacteriologic al puroiului sinusal

Context clinic - rinosinuzite acute, cronice

Analizele bacteriologice nu sunt indicate în cazul unei rinosinuzite acute bacteriene
deoarece microorganismele implicate sunt bine caracterizate în cazul pacienților
imunocompentenți. Se recomandă prelucrarea aspiratului sinusal obținut endoscopic de la pacienții
cu afecțiuni persistente, forme supurative, pacienți imunosupresați, pacienți cu infecții asociate
asistenței medicale. Tratamentul antibiotic se recomandă agenților patogeni cel mai frecvent izolați
atât la copii cât și la adulți H. influenzae, S. pneumoniae, M. catarrhalis, S. pyogenes.
Microorganismele asociate cu sinuzita cronică sunt cele din sinuzita acută plus anaerobi
(Peptostreptococcus spp, Fusobacterium spp, Prevotella spp), S. aureus, iar la pacienți diabetici,
imunosupresați fungii pot invada sinusurile. (Mucor spp, Aspergillus spp, etc). În 40% dintre
cazuri nu se cultivă niciun microorganism. Acest lucru se poate datora utilizării de antibiotice,
deficiențelor de recoltare, transport, prelucrare probă sau se poate suspiciona implicarea

125
Mycoplasma pneumoniae și Chlamydophila pneumoniae. Bacili Gram-negativi (enterobacterii și
nonfermentativi) frecvent multirezistenți la antibiotice pot fi implicați în sinuzita asociată
asistenței medicale, în special la pacienți intubați, la cei cu sondă nazogastrică sau la cei cu
intervenții la nivelul sinusurilor.

Recoltare și transport
Probele biologice sunt reprezentate de secreția sinusală obținută prin: aspirare, lavaj
sinusal, chiuretaj sau biopsie. Recoltarea se va face de către un specialist ORL. Nu se acceptă:
tampon nazal sau nazofaringian, sputa, saliva.

Prelucrare bacteriologică

Examen microscopic
Se face colorația Gram; se urmărește prezența leuococitelor și categoriile microscopice
bacteriene; leucocitele frecvente sau în cantitate moderată susțin diagnosticul de sinuzită,

Cultivare
Se însămânțează câte 1 probă pe placă, se face dispersia cu ansa pentru obținerea de colonii
izolate (Tabelul 3.).

Interpretare
- Cultura pozitivă pentru H. influenzae, S. pneumoniae, M. catarrhalis, S. pyogenes indică
infecție cu acest microorganism.
- Cultura pozitivă cu bacili Gram negativi sau S. aureus poate să nu reprezinte infecție.
- Cultura mixtă fără să predomine un microorganism în general indică o recoltare incorectă.
- Cultura negativă nu exclude sinuzita, adesea patogenii nu se pot cultiva.
Limite:
- Rezultatele inadecvate pot fi rezultatul contaminării probelor cu flora orală normală.
- Rezultatele fals negative sunt urmarea întârzierii în prelucrare.
- Rezultatele fals pozitive sunt urmarea suprainterpretării rezultatelor culturii.

Raportarea rezultatului
Timp de raportare – telefonic cât mai rapid posibil a rezultatelor preliminare, raportul scris
în 16-72 ore.

Examenul microscopic
Se raportează prezența leucocitelor și a categoriilor microscopice observate cu referire la
aspectul cantitativ (rare, frecvente).

Cultura
Se raportează:

126
- Specia bacteriană izolată, la care s-a stabilit semnificația clinică prin asocierea semnificativă a
leucocitelor cu aceeași categorie microscopică cu organismul izolat în cultură.
- „Absența creșterii”

Tabelul 3: Mediile de cultură, condițiile de incubare și microorganismele urmărite din

puroiul sinusal
Context Proba Mediu de cultura Condiții de incubare Microorganisme
clinic/ biologică Tempe Atmosfera Timp țintă
solicitare ratura

Sinuzita Puroi Agar chocolat 35- 5-10% CO2 40-48 H. influenzae

sinusal 37°C h M. catarrhalis
S. pneumoniae
alte
microorganisme
în
cultură pură care
pot fi
semnificative
Agar sânge berbec 35- Aerobă 40 – Streptococci beta-
37°C 48 h hemolitici grup A
S. aureus
Agar sânge berbec 35- 5-10% CO2 40 – M. catarrhalis
37°C 48 h S. pneumoniae

Agar anaerobi 35- Anaerobă 48 h Anaerobi

37°C

Agar CLED sau 35- Aerobă 16 - Enterobacterales

MacConkey 37°C 24 h Pseudomonas
(dacă se observă spp.
bacili Gram-negativi
pe frotiul direct sau
în cazul sinuzitei
nozocomiale)
agar Sabouraud 35°C Aerobă
40 – Candida spp
25°C 48 h
Aspergillus și alți
15 fungi
zile

127
- „Creștere microbiană fără semnificație patogenă” cu precizarea speciilor bacteriene care au
fost căutate dar nu au fost izolate (se declară capabilitatea laboratorului pentru a izola și
identifica microorganismele ținta).

VI. Examenul bacteriologic al puroiului otic

Context clinic
Infecții ale canalului auditiv extern sunt determinate de P. aeruginosa (otita externă
malignă), S. aureus, S. pyogenes, enterobacterii, anaerobi, Candida spp, Aspergillus niger.
Microorganismele izolate de rutină în otita medie sunt S. pneumoniae, H. influenzae, M.
catarrhalis, Alloiococcus otitidis. Pot să apară infecții localizate cu S. aureus și S. pyogenes.
Infecții cronice sunt determinate în general de fungi, micobacterii, Nocardia. Flora tegumentară
reprezentată de stafilococi și corinebacterii nu are semnificație clinică.

Indicații
În otita acută medie și otita medie recurentă recoltarea se va face de către un specialist ORL
după curățarea și uscarea canalului auditiv extern. Se incizează/ perforeaza membrana timpanică
cu seringa, se aspiră cu pompa sau se recoltează cu un tampon fin (interzis tamponul de bumbac).
În cazul copiilor în lichidul din urechea medie se pot identifica alături de bacterii anumite virusuri
dar diagnosticul virusologic nu este recomandat deoarece nu există terapie specifică.

Recoltare și transport
Produsul biologic este reprezentat de secreție otică din conductul auditiv extern recoltată
pe tampon (produs calitativ inferior) sau secreție purulentă recoltată prin aspirare sau prin
procedură chirurgicală din urechea medie. Pentru investigarea unei etiologii fungice se recoltează
scuame din conductul auditiv extern. Probele se transportă cât mai repede posibil la laborator. Este
de preferat ca tampoanele să fie introduse în mediu de transport Amies. Probele lichide vor fi
transferate din seringă în recipient steril. Pentru etiologia anaerobă probele vor fi transportate în
mediu de transport special pentru anaerobi.
Dacă transportul probelor se întârzie peste 2 ore, probele vor fi refrigerate cu excepția celor
pentru anaerobi care vor fi păstrate la temperatura camerei.

Prelucrare bacteriologică

Examenul microscopic
Se prepară frotiuri din exsudatul recoltat din urechea medie. În cazul recoltării cu tamponul,
se vor recolta 2 probe, una va fi folosită la efectuarea unui frotiu, iar cealaltă pentru efectuarea
însămânțărilor. Frotiurile efectuate se colorează Gram.

128
 Cultivare
Se însămânțează câte 1 probă pe placă, se face dispersia cu ansa pentru obținerea de colonii
izolate (Tabelul 4).

Tabelul 4: Mediile de cultură, condițiile de incubare și microorganismele urmărite în otita

externă și cea medie
Context Proba Mediu de Condiții de incubare Microorganisme
clinic/ biologică cultura Temperatura Atmosfera Timp țintă
solicitare
Otita Secreții Agar 35-37°C 5-10% CO2 40-48H. influenzae
externă recoltate pe chocolat h M. catarrhalis
tampon S. pneumoniae
alte
microorganisme
în
cultură pură care
pot fi
semnificative
Agar sânge 35-37°C Aerobă 40 – Streptococci
berbec 48 h betahemolitici
grup A
S. aureus
Otita Secreție Agar sânge 35-37°C 5-10% CO2 40 – M. catarrhalis
medie purulentă berbec 48 h S. pneumoniae
recoltată
prin Agar 35-37°C Anaerobă 48 h Anaerobi
aspirare sau anaerobi
prin
procedură Agar CLED 35-37°C aerobă 16 - Enterobacterales
chirurgicală sau 24 h Pseudomonas
din urechea MacConkey spp.
medie.
Agar 22-30 °C aerobă Fungi
Sabouraud 15
zile

Bacterii cu rol etiologic posibil:

- Alloiococcus otitidis crește lent și dezvoltă colonii punctiforme umede de culoare galbenă și
nu crește pe agar chocolat. Pe frotiul Gram nu se poate diferenția de stafilococi. Testele de
identificare sunt: catalază negativ, PYR pozitiv, LAP (leucin aminopeptidază) pozitiv,
sensibilitate la vancomicină.
- Turicella otitidis poate fi agent etiologic al otitei medii.

129
 Interpretare
Cultură pozitivă pentru bacili Gram-negativi, streptococi beta-hemolitici sau S. aureus în
otită externă în general indică prezența infecției.
Cultură pozitivă pentru S. pneumoniae, H. influenzae, M. catarrhalis, Alloiococcus otitidis
în otită medie în general indică prezența infecției.
Cultura negativă nu poate exclude otita medie (în infecțiile cronice adesea cultura este
negativă).

Limite
- Rezultatele fals negative pot fi urmarea cultivării excesive a florei normale cutanate.
- Rezultatele fals pozitive pot fi urmarea supradiagnosticului.
- Alloiococcus otitidis este dificil de cultivat.

Raportarea rezultatului:
Timp de raportare – raport preliminar telefonic cât de rapid posibil, raportul scris în 16-72
ore.

Examenul microscopic
Se raportează prezența leucocitelor și a categoriilor microscopice observate cu referire la
aspectul cantitativ (rare, frecvente).

Cultura
Se raportează:
- specia bacteriană izolată, la care s-a stabilit semnificația clinică prin asocierea semnificativă a
leucocitelor cu aceeași categorie microscopică cu organismul izolat în cultură.
- „Absența creșterii” sau ”Fără creștere bacteriană”
- „Creștere microbiană fără semnificație patogenă” cu precizarea speciilor bacteriene care au
fost căutate dar nu au fost izolate (se declară capabilitatea laboratorului pentru a izola și
identifica microorganismele țintă).

Mulțumiri
La realizarea acestui capitol a contribuit dr. Mirela Maria Magdalena Flonta de la Spitalul Clinic
de Boli Infecțioase, Cluj-Napoca.

VII. Bibliografie
Chen AF, Heyl AE, Xu PZ, Rao N, Klatt BA: Preoperative decolonization effective at
reducing staphylococcal colonization in total joint arthroplasty patients. J Arthroplasty. 2013,
28:18-20.

130
 Choby BA: Diagnosis and treatment of streptococcal pharyngitis. Am Fam Physician,
2009, 79:383-390.
Ieven M, Vu-Thien H: Upper respiratory tract infections. in European Manual of Clinical
Microbiology, editors Cornaglia G, Courcol R, Herrmann JL, Kahlmeter G, Publisher SFM, 2012:
145-152.
Leber A: Respiratory Tract Cultures, 3.11.1.1-9.4. In Clinical Microbiology Procedures
Handbook, 2016, Fourth Edition. ASM Press, Washington DC.
Malcolm TL, Robinson LD, Klika AK et al: Predictors of Staphylococcus aureus
colonization and results after decolonization. Interdiscip Perspect Infect Dis. 2016; 2016: 4367156.
Metodologia de urmărire a scarlatinei în România – Institutul Național de Sănătate Publică
https://cnscbt.ro/index.php/metodologii/scarlatina/451-metodologie-de-supraveghere-scarlatina-
2016-01-08-2016/file
Miller JM, Miller SA: A guide to specimen management in clinical microbiology, Third
Edition, ASM Press, 2017
Moroski NM, Woolwine S, Schwarzkopf R: Is preoperative staphylococcal decolonization
efficient in total joint arthroplasty. J Arthroplasty. 2015, 30:444-6
Ng CY, Huang YH, Chu CF, Wu TC, Liu SH: Risks for Staphylococcus
aureus colonization in patients with psoriasis: a systematic review and meta-analysis. Br J
Dermatol. 2017, 177:967-977
Pelucchi C, Grigoryan L, Galeone C,S: Guideline for the management of acute sore throat.
Clin Microbiol Infect, 2012, 18(suppl 1):1-27
Public Health England (2015). Investigation of throat related specimens. . UK standards
for microbiology investigations:
https://www.gov.uk/government/uploads/system/uploads/attachment_data/file/423204/B_9i9.pdf
Public Health England. (2015). Investigation of Nasal Samples. UK Standards for
Microbiology Investigations. B 5 Issue 7.1. https://www.gov.uk/uk-standards-for-microbiology-
investigations-smi-quality-and-consistency-in-clinical-laboratories
van den Bergh MR, Biesbroek G, Rossen JWA, de Steenhuijsen Piters WAA, Bosch
AATM, et al. (2012) Associations between pathogens in the upper respiratory tract of young
children: interplay between viruses and bacteria. PLoS ONE 7(10): e47711.
Waites, K. B., M. A. Saubolle, D. F. Talkington, S. A. Moser, and V. Baselski. 2006.
Cumitech 10A, Laboratory Diagnosis of Upper Respiratory Tract Infections. Coordinating ed. S.
E. Sharp. ASM Press, Washington, D.C.

131
 Diagnosticul microbiologic al infecțiilor tractului
respirator inferior

I. Introducere
Acest document descrie izolarea din spută, lavaj bronhoalveolar și alte tipuri de probe
asociate, a bacteriilor și fungilor care pot determina infecții respiratorii.
Diferențierea între colonizarea traheobronșică și infecția pulmonară adevărată este dificilă.
Izolarea și recunoașterea microorganismelor implicate în etiologia pneumoniei depinde de:
- Recoltarea probei adecvate din tractul respirator inferior
- Evitarea contaminării cu flora din tractul respirator superior
- Utilizarea tehnicilor microscopice și de cultivare corecte
- Cunoașterea tratamentelor anterioare și curente cu antibiotic.

Pneumonia
Pneumonia poate fi clasificată ca fiind comunitară sau asociată asistenței medicale
(survenită la mai mult de 48 ore de la internare), respectiv primară sau secundară. Etiologia
pneumoniilor variază în funcție de aceste aspecte.
Există mai mulți factori care se asociază cu un risc crescut de pneumonie. Cei mai frecvenți
sunt: afecțiuni pulmonare cronice precum BPOC, diabetul zaharat, insuficiența cardiacă sau renală
și imunosupresia (congenitală sau dobândită). Nivelul scăzut de conștiență precum și diminuarea
reflexelor faringian sau de tuse sunt factori de risc pentru pneumonia de aspirație. Infecții recente
cu virusuri respiratorii, în particular cu virusuri gripale reprezintă de asemenea un factor de risc.
Evaluarea severității pneumoniei se face cu ajutorul semnelor clinice și a datelor de
laborator, prezența unora din acestea fiind predictivă pentru riscul de deces.
Etiologia pneumoniei variază în funcție de modul de apariție (comunitară sau de spital) și
de factorii de risc existenți. Multe din bacteriile care colonizează tractul respirator superior sunt
implicate în etiologia pneumoniilor. Tratamentul antibiotic și spitalizarea favorizează colonizarea
cu bacili Gram-negativi aerobi.
Acești factori afectează sensibilitatea și specificitatea sputoculturii iar rezultatele trebuie
interpretate în baza datelor clinice. Rezultatele sputoculturii sunt frecvent înșelătoare, iar
sensibilitatea culturii este mică pentru mulți patogeni. Singura excepție este reprezentată de
probele de spută de la pacienții cu exacerbări severe ale BPOC.

Pneumonia comunitară
Principala etiologie a pneumoniei comunitare este Streptococcus pneumoniae, responsabil
de până la 60% din cazuri și care poate fi multirezistent. Poate afecta indivizii la orice vârstă,
inclusiv cei cu factori de risc cunoscuți. În prezența unor factori de risc cunoscuți și alți agenți
bacterieni pot determina pneumonie. Pacienții cu BPOC și cei infectați cu HIV prezintă în plus,
risc de pneumonie cu Haemophilus influenzae și Moraxella catarrhalis. Pneumonia cu
Staphylococcus aureus survine fie în contextul unei infecții virale recente, fie (mai rar) ca rezultat
al unei însămânțări pe cale hematogenă de la un focar la distanță, BPOC sau prin aspirație. Bacilii

132
gram-negativi aerobi reprezintă o cauză rară de pneumonie comunitară. Ocazional, Klebsiella
pneumoniae determină pneumonia severă necrotizantă, (“pneumonia Friedländer”) la pacienții
reprezentati de persoanele fără adăpost și cu un istoric de abuz de alcool.
O serie de alți patogeni determină pneumonii atipice. Mycoplasma pneumoniae determină
pâna la 20% din pneumoniile comunitare, pe locul 2 după S. pneumoniae. Infecțiile cu
Mycoplasma pneumoniae au tendința de a apărea în epidemii, la 4-5 ani și afectează grupele de
vârstă tinere. Chlamydophila pneumoniae este un patogen exclusiv uman. Mult mai rar pneumonia
este determinată de Chlamydophila psittaci sau Coxiella burnetii și apare la indivizi la care există
un context relevant de contact cu păsări sau animale de fermă. Legionella pneumophila este o
cauză rară de pneumonie comunitară, asociată cu un istoric de călătorie recentă sau alți factori
favorizanți (expunere la aerosoli generați de diverse instalații de apă, grădinărit). Virusurile
respiratorii, precum virusul respirator sincițial (RSV), virusurile gripale și adenovirusurile pot
determina pneumonia virală.

Pneumonia de spital
Pneumonia de spital se situează pe primele locuri în rândul infecțiilor asociate asistenței
medicale (IAAM). Riscul crescut este reprezentat de afecțiuni preexistente și de diferitele
intervenții și proceduri. Ventilația mecanică este un factor de risc major. Pacienții cu afecțiuni
critice, care necesită ventilație mecanică prelungită, sunt expuși infecțiilor cu Pseudomonas
aeruginosa și cu specii de Acinetobacter multirezistente (de ex. Acinetobacter baumannii). Bacilii
Gram-negativi aerobi, inclusiv membri ai ordinului Enterobacterales (precum Klebsiella și
Enterobacter spp) și P. aeruginosa sunt implicați în până la 60% din cazuri. Prezența cateterelor
intravasculare și a portajului nazal sunt factori de risc pentru pneumonia determinată de S. aureus
meticilino-rezistent (MRSA). Speciile de Legionella sunt de asemenea o cauză ocazională de
pneumonie de spital.

Pneumonia de aspirație
Pneumonia de aspirație se produce atunci cand conținutul orofaringian pătrunde în tractul
respirator inferior. Factorii de risc sunt reprezentați de nivelul redus de conștiență, de exemplu în
urma unui traumatism cranio-cerebral sau supradoza de droguri, precum și reflex diminuat de tuse
și/ sau reflex de deglutiție slab în urma unui accident vascular cerebral sau altă boală neurologică.

Abcesul pulmonar
Abcesul pulmonar se poate dezvolta secundar unei pneumonii de aspirație, în care caz cea
mai des afectată este zona de mijloc a plămânului. Microorganisme ca: S. aureus și K. pneumoniae
pot duce la dezvoltarea unor abcese multifocale și prezența de microabcese (<2 cm diametru) Este
prezentat uneori ca pneumonie necrotizantă. Nocardioza, aproape întotdeauna survenită pe un fond
de imunodepresie, se poate prezenta sub forma de abces pulmonar. Abcesele sunt rezultatul
diseminării hematogene de la un focar situat la distanța, așa cum se întâmplă în cazul endocarditei
infecțioase.
Burkholderia pseudomallei poate determina abces pulmonar sau pneumonie necrotizantă
la persoane care au călătorit în zone endemice (în special Asia de sud-est și Australia de nord) si
în prezența diabetului.
Sindromul Lemièrre sau necrobaciloza debutează ca o infecție acută orofaringiană.
Tromboflebita infecțioasă a venei jugulare poate duce la embolie septică și infecții metastatice.
133
În mod frecvent este implicat și plămânul; se pot dezvolta abcese multifocale. La pacienții cu acest
sindrom diagnosticul etiologic se bazează pe hemocultură, cel mai frecvent patogen izolat fiind
Fusobacterium necrophorum.

Fibroza chistică
Monitorizarea microbiologică a colonizării pulmonare, în cadrul managementului
pacienților cu fibroză chistică, este esențială. Primele specii implicate sunt Haemophilus influenzae
și/ sau Staphylococcus aureus, care preced colonizarea cu Pseudomonas aeruginosa și alți bacili
Gram negativi nefermentativi.
Colonizarea cu Pseudomonas aeruginosa, fenotip mucos (producător de alginat, implicat
în formarea de biofilm), combinată cu evoluția cronică a bolii, reprezintă o etapă critică în cadrul
acesteia. Pot fi izolate tulpini de P. aeruginosa cu sensibilități diferite la antibiotic, din aceeași
probă. Variantele de tip “colonii mici” ale speciei Staphylococcus aureus, asociate cu formele de
dezvoltare intracelulară, cu evoluția cronică a bolii și, mai rezistente la terapia cu antibiotice,
trebuie recunoscute în culturile bacteriene.
Pot fi prezenți, de asemenea, anaerobi, specii de Aspergillus și micobacterii non-
tuberculoase (MOTT - mycobacteria other than Mycobacterium tuberculosis).
Transmiterea bacteriilor din complexul Burkholderia cepacia între pacienți poate duce la
decesul prin "sindromul B. cepacia ", care este o pneumonie fulminantă uneori însoțită de
septicemie.
Micobacteriile non-tuberculoase reprezintă o problemă în creștere pentru pacienții din
acest grup; M. abscessus este mai frecvent decât alții.
Rezistența la antibiotice, în mod special pentru Burkholderia spp., Stenotrophomonas
maltophilia și P. aeruginosa, limitează opțiunile de tratament.
Alte microorganisme precum Ralstonia, Achromobacter și Pandoraea sunt patogeni
emergenți în boala cronică pulmonară. Pot fi, de asemenea, implicate și virusuri.

Pleurezia
Pleurezia este inflamația pleurei, a membranelor seroase care acoperă plămânii și fața
interioară a cavității toracice.

II. Recoltarea și transportul probelor biologice

Diagnosticul microbiologic se face în caz de infecție acută, exacerbarea unei infecții
cronice (bronșita cronică, fibroza chistică etc.) sau pneumonia de ventilație.
Conform ghidurilor tratamentul de primă intenție al pneumoniei îngrijite la domiciliu este
empiric. Investigarea microbiologică se face doar dacă după 72 h de tratament nu există o evoluție
favorabilă, pentru formele severe ce necesită internare la terapie intensivă sau când există risc
crescut pentru infecție cu germeni rezistenți (Pseudomonas aeruginosa, MRSA).
Diagnosticul infecției pulmonare se bazează pe următoarele criterii:
- Clinice: istoric de infecție, semne fizice, generale și funcționale.
- Examinari imagistice sugestive.
- Biologice: hemoleucograma, VSH, CRP, procalcitonina
- Microbiologice:

134
 - examenul microbiologic al secrețiilor din tractul respirator, hemocultura, lichid pleural,
- detecția de anticorpi în sânge,
- detecția de antigene în urină
- Histologice: biopsie pulmonară sau pleurală pentru diagnostic diferențial (tuberculoză sau
cancer)
Sputa este ușor de recoltat dar dificil de interpretat, secrețiile bronșice recoltate prin lavaj
bronho-alveolar, aspirare bronșică sau lavaj protejat sunt mai dificil de recoltat dar mai ușor de
interpretat.
Tipurile de probe recoltate: spută, lavaj bronhoalveloar, aspirat bronșic, aspirat
transtoracic, periaj bronșic, spălătură bronșică, secreții tub endotraheal, probe recoltate pe cateter
protejat, lichid pleural.
Este foarte importantă etichetarea corectă a tipului de probă, deoarece prelucrarea lor în
laborator este diferită.

Probe biologice recoltate în infecțiile tractului respirator inferior

(TRI)

Proba de spută expectorată

Probele de spută au mari probleme de contaminare. Trebuie obținută proba de spută de
dimineață (devreme) deoarece conține secrețiile adunate din cursul nopții, în care este o mai mare
probabilitate să se concentreze bacteriile patogene.
Pneumonia asociată asistenței medicale implică o mortalitate ridicată dar este dificil de
diagnosticat clinic și microbiologic. Criteriile de diagnostic microbiologic rămân dificil de
interpretat. Sensibilitatea și specificitatea mică a culturii din spută în diagnosticul pneumoniei
asociate asistenței medicale a determinat dezvoltarea unor tehnici de recoltare a secrețiilor din
tractul respirator inferior, unele din ele implicând utilizarea bronhoscopului.
De regulă se recoltează numai o probă de spută în interval de 24 de ore, aceasta fiind prima
de dimineață. Excepție fac probele recoltate cu ajutorul bronhoscopului. Acestea din urmă sunt
cele mai bune probe care pot fi obținute prin tuse profundă.
Probele de spută cu o cantitate mai mică de 2 ml nu trebuie procesate, cu excepția celor
care au aspect purulent.
Probele de spută se obțin foarte greu de la pacienții pediatrici. În plus copiii pot fi colonizați
cu H. influenzae, S. pneumoniae sau Neisseria meningitidis.

Aspiratul traheal
Aspiratul traheal se recoltează prin tubul endotraheal cu un dispozitiv special care permite
captarea secrețiilor din trahee într-un recipient. Se recoltează cca 10 ml de secreții. Are aceleași
limitări ca și probele de spută.

135
 Aspiratul bronșic
Aspiratele bronșice sunt recoltate prin aspirarea directă a materialului din bronhii cu
ajutorul unui bronhoscop flexibil.

Lavajul bronhoalveolar
Probele de BAL se recoltează din bronhiolele distale și alveole după ce bronhoscopul a
fost fixat în lumenul căilor respiratorii distale sau în unul sau mai multe segmente pulmonare, în
funcție de extinderea infecției.
(1) bronhoscopul se introduce transnazal sau transoral la pacienții neintubați sau prin tubul
endotraheal la pacienţii intubaţi.
(2) se recoltează probele de BAL prin fixarea cu grijă a vârfului bronhoscopului într-un lumen al
căilor respiratorii și instilând un volum cât mai mare de 0,85% ser fiziologic fără acțiune
antibacteriană (25 până la 30 ml pentru adulți și 5 până la 10 ml pentru copii). Se pot face instilări
repetate în același loc, pentru a spăla alveolele și pentru a colecta lichid suficient pentru toate
testele necesare.
(3) se aspiră ușor lichidul recuperat într-un recipient steril înainte de administrarea următoarei
cantități de lichid. În general, 50 până la 75% din soluția salină instilată este recuperată în lichidul
de lavaj.
(4) lichidul inițial se aruncă, fiind contaminat, restul este trimis la laborator.
NOTĂ: În laborator, probele din același loc pot fi combinate pentru culturi și frotiuri, dar probele
recoltate din locuri separate (de exemplu, lobul superior drept și lobul inferior drept) pot fi
combinate numai după consultarea medicului care a efectuat recoltarea.
Este o metodă de încredere în diagnosticul etiologic al pneumoniei și a altor infecții
pulmonare.

MiniBAL - lavajul bronhoalveolar orb

MiniBAL nu necesită bronhoscop, însă este nevoie de un dispozitiv special, mai lung decât
cel cu care se obține aspiratul endotraheal, cu care se ajunge în părțile distale ale tractului
respirator. Prin dispozitiv se introduce ser fiziologic steril, după care se aspiră într-o seringă.

Periajul bronșic
Tehnica periajului bronșic folosește un cateter cu perie protejată (o perie între doua catetere
sigilate la capăt cu un dop de polietilenglicol) pentru a obține material din căile respiratorii
inferioare.
Se consideră că un număr de bacterii de peste 103 UFC/ml în produsul de periaj obținut
bronhoscopic se corelează cu diagnosticul histologic de pneumonie.

Spălătura bronșică
Probele de spălătură bronșică sunt colectate din bronhiile mari, inclusiv bronhia principală,
la bifurcație și bronhiile din dreapta și din stânga în funcție de extinderea leziunilor. Această
procedură este cel mai frecvent utilizată pentru diagnosticul cancerului la pacienții cu leziuni
bronșice. Testele de diagnostic pentru infecție pot fi făcute concomitent pentru a elimina infecția,
mai ales dacă există obstrucție bronșică și pneumonie secundară acestei complicații.
(1) bronhoscopul se introduce transnazal sau transoral la pacienții neintubați sau prin sonda
endotraheală la pacienţii intubaţi.

136
(2) se injectează steril soluție sterila 0,85% NaCl fără acțiune antibacteriană (în general 20 până
la 30 ml la adulți și 5 ml la copii).
3) se aspiră lichidul de spălare bronșică într-un recipient steril. Deoarece volumul de soluție salină
introdus este mai mic decât în cazul lavajului bronhoalveolar, proba primită la laborator este în
cantitate mai mică comparativ cu BAL.
(4) Probe de spălătură bronșică recoltate din zone diferite din plămâni (de exemplu, bronhiile din
dreapta și din stângi) nu trebuie amestecate.
Metoda are utilitate scăzută în diagnosticul pneumoniei, cu excepția anumitor agenți
patogeni, cum ar fi M. tuberculosis, Legionella, fungi endemici.
A nu se eticheta ca BAL (lavaj bronhoalveolar), acest tip de produs nu poate fi prelucrat
pentru a obține culturi cantitative.

Probe recoltate pe cateter protejat

Materialul este recoltat din plămân prin bronhoscop într-un mod similar cu periajul bronsic.
Se utilizează un cateter interior și exterior cu dop din polietilen glicol la capăt pentru a preveni
contaminarea din nazofaringe.

Aspiratul transtoracic
Probele de aspirat toracic se obțin prin puncția peretelui toracic cu un ac introdus prin
spațiul intercostal. Această procedură poate fi utilizată pentru a recolta din leziuni focale accesibile
precum aspergilomul, abcesul.

Revărsatul pleural
Revărsatul pleural este acumularea de lichid între straturile interioare și exterioare
(viscerale și parietale) ale pleurei.
Revărsatul se produce la debutul pneumoniei, reprezentând răspunsul pleural la o reacție
inflamatorie în plămânul adiacent. Bacteriile ajung în spațiul pleural pe diferite căi: răspândirea
dintr-o zonă adiacentă a pneumoniei, chirurgia toracică sau drenaj, bacteriemia, traumatismul
toracic sau prin transmiterea transdiafragmatica din infecția intraabdominală.
Revărsatul pleural tuberculos apare de obicei ca o extensie a infecției dintr-un focar
subpleural. În revărsat se găsește un număr mic de bacili (produs paucibacilar) și, ca rezultat,
microscopia este rareori pozitivă. Prin urmare, sunt preferate alte teste de confirmare, de exemplu:
utilizarea sistemelor automate de incubare, timp de 42 zile, metode PCR de detecție ADN
Mycobacterium tuberculosis, testele cutanate sau radiografia toracică.

Empiemul
Empiemul toracic este o colecție de puroi în cavitatea pleurală. Cel mai adesea apare ca o
complicație a infecției bacteriene a parenchimului pulmonar: pneumonie sau abces pulmonar.
Deși cea mai frecventă cauză este S. pneumoniae, orice microorganism poate fi izolat din
lichidul pleural, în special microorganismele asociate cu infecția tractului respirator inferior și
microorganismele dobândite prin aspirarea florei orofaringiene, inclusiv streptococii și anaerobii
orali.

137
 Microorganismele asociate în special cu empiemul, la pacienții cu sindromul
imunodeficienței dobândite (SIDA) includ: Cryptococcus neoformans, Mycobacterium avium-
intracellulare, M. tuberculosis și Nocardia asteroides.
Alte microorganisme care pot provoca infecții la acest grup de pacienți includ
Pneumocystis jirovecii și Rhodococcus equi.

Urină pentru detectarea antigenelor de Legionella pneumophila și

Streptococcus pneumoniae
Se recoltează urină în recipient fără substanțe de conservare și se trimit imediat la laborator.

Recoltarea
Probele trebuie să fie proaspete și recoltate înainte de începerea tratamentului cu antibiotic.
Sputa presupune recoltarea secrețiilor din tractul respirator inferior (subglotic), obținute în urma
unui efort de tuse profundă. Dacă tusea este neproductivă se poate stimula producerea secrețiilor
prin fizioterapie, drenaj postural sau inhalarea de aerosoli (soluție hipersalină). Recoltarea de
salivă sau secreții nazale nu este acceptată.
Pentru diagnosticul infecției cu Mycobacterium tuberculosis se recomandă recoltarea
sputei de dimineață în 3 zile consecutive.

Probe din tractul respirator

Tehnici invazive
- Lavaj bronho-alveolar – are 2 componente: fracția bronșică (50 ml) și fracția alveolară (150-
200 ml) – proba se contaminează totuși cu flora din căile aeriene superioare.
- Recoltare distală protejată – este metoda gold standard pentru stabilirea etiologiei microbiene
pentru pneumopatii – metoda Wimberley – capătul cateterului utilizat este tăiat cu foarfeca
sterilă și introdus în recipient cu 1 ml soluție salină sterilă; se agită lângă patul pacientului și
se trimite la laborator în maxim 2 ore.
- Lichid pleural: în mod ideal, un volum minim de 1 ml, în seringi spălate cu heparină
- Aspirat endotraheal – proba este recoltată în orb și are un risc ridicat de contaminare cu flora
salivară.

Tehnici non-invazive:
- Sputa – se evaluează acceptabilitatea pe criterii citologice – este foarte rar de ajutor în
diagnosticul etiologic al pneumoniei comunitare; recoltarea corectă este foarte importantă.

Alte probe
- Sânge pentru hemocultură (2 seturi)
- Urina pentru detecție antigene Legionella pneumophila sau Streptococcus pneumoniae
- Sânge pentru detecție de anticorpi în pneumopatii atipice (Chlamydophila pneumoniae,
Chlamydia psittaci, Mycoplasma pneumoniae, L. pneumophila)
- Probe de la nivelul epiteliului respirator (nas, trahee, bronhii) – se recoltează pentru teste
virusologice cât mai devreme după debutul bolii, se utilizează mediu de transport special.

138
Transportul probelor
Transportul probelor se face în maxim 2 ore de la recoltare. În situații excepționale dacă
transportul este întârziat, proba poate fi păstrată la 4℃ până la 24 h.
Dacă se suspectează o infecție acută și rezultatul poate afecta managementul medical,
probele recoltate se procesează cât mai rapid iar rezultatul examenului microscopic se pune la
dispoiție în decurs de 2 ore de la preluarea probei.

III. Prelucrarea produselor biologice

Produsele din tractul respirator inferior pot avea aspect macroscopic de tip salivar,
mucosalivar, mucoid, mucopurulent, purulent, hemoragic.

Pregătirea produsului
- Sputa – se fluidifică și omogenizează cu o soluție mucolitică (N-acetilcisteina, ditiotreitol).
- Aspiratul traheal este tratat la fel ca sputa. Este necesar ca pe cererea de analize să se precizeze
scopul investigației: pentru screening sau pentru diagnostic, deoarece prelucrarea probei este
diferită în cele două situații. Pentru diagnostic este necesară interpretarea cantitativă, pentru
care se pot face diluții.
- Lavajul bronhoalveolar: se pot face culturi cantitative. Se centrifughează 10 min la 1200 xg,
se resuspendă sedimentul în 0,5 ml supernatant. Din probele mucoide se depune pe lamă în
strat subțire o porțiune purulentă sau sanguinolentă; din probele nemucoide se face un frotiu
în strat subțire din sedimentul obținut după centrifugare. Se vor identifica și testa maxim 2
patogeni aerobi. Peste 3 germeni izolați implicarea etiologică este greu de realizat (cu excepția
situației când unul din cei 3 este un patogen clar, ex. Mycobacterium tuberculosis).
Lavajul bronhoalveolar este cel mai indicat pentru diagnosticul bolilor pulmonare atipice
(Nocardia, Legionella, Actinomyces) și pentru diagnosticul infecțiilor la imunodeprimați
(Pneumocystis, Aspergillus).
- Proba recoltată distal cu cateter protejat – se utilizează 1 ml ser fiziologic steril; se prepară
frotiuri după centrifugare.
- Toate probele din cavitatea pleurală trebuie centrifugate în recipiente ermetic închise și
prelucrate în condiții de nivel 2+ de biosiguranță, indiferent dacă este necesară sau nu
examinarea speciilor de Mycobacterium.
- Lichidul pleural - pentru toate probele, cu excepția celor coagulate sau foarte vâscoase: se
centrifughează într-un recipient steril, cu capac, cu fund conic, la 1200 x g pentru 5-10 minute;
Notă: Dacă se solicită, de asemenea, investigația pentru speciile Mycobacterium, timpul de
centrifugare poate fi mărit la 15-20 minute; același sediment poate fi utilizat pentru insamantare
Mycobacterium, precum și pentru microscopia de rutină.
Se transferă supernatantul, cu excepția ultimilor 0,5 ml, folosind o pipetă sterilă într-un alt
recipient rezistent la scurgeri, plasat într-o pungă de plastic sigilată, pentru testare suplimentară,
dacă este necesar (de exemplu, virusologie).
Cultivarea lichidului pleural pentru specii non- tuberculoase: se suspendă sedimentul în
lichidul rămas.

139
 Se inoculează fiecare placă de agar și bulionul de îmbogățire cu sediment rezultat din
centrifugarea lichidului pleural, folosind o ansă sterilă. Pentru izolarea coloniilor individuale, se
dispersează inoculul cu o ansă sterilă.
În suspiciune de empiem cu etiologie multiplă, pentru izolarea Mycobacterium
tuberculosis, se practică decontaminarea lichidului de puncție (aceeași metodă ca pentru
decontaminarea sputei).
Dacă se utilizează flacoane pentru hemocultură, inocularea se va face cu proba
necentrifugată, în mod ideal la „patul bolnavului”.
Probele coagulate:
- Dacă este posibil, cheagul trebuie rupt cu o ansă sterilă și o porțiune folosită pentru a face un
frotiu pentru colorația Gram.
- Se inoculează fragmentele de cheag pe plăcile de agar și bulionul de îmbogățire.
- Dacă proba conține doar un cheag mic, acesta trebuie inclus fie în bulionul de îmbogățire, fie
inoculat pe placa de agar chocolat. Porțiunea necoagulată a probei trebuie cultivată în mod
normal așa cum este descris mai sus.

Examenul microscopic:
Pe frotiul Gram se poate face aprecierea calității sputei și evidențierea categoriilor
microscopice pentru posibilii patogeni implicați (Tabelul 1).
Aprecierea calității sputei se face prin raportarea numărului de polimorfonucleare la
numărul de celule epiteliale la mărire de 100x. Probele purulente vor fi prelucrate pentru
însămânțare iar probele nepurulente sau contaminate cu celule epiteliale pot fi respinse.
Prezența macrofagelor și a celulelor bronșice certifică proveniența probei din TRI. Pentru
Legionella și micobacterii criteriile calitative și cantitative nu se aplică, simpla lor prezență
semnifică infecție (nu există purtători sănătoși). Nu se resping: probele pentru depistarea
Mycobacterium tuberculosis sau provenite de la pacienți imunodeprimați, neutropenici.

Pot fi folosite și alte scoruri care permit aprecierea calității probei (de ex. scorul Q).
Examinarea lamelor colorate Gram se face pentru a evidenția prezența unei singure
categorii microscopice predominante, asociată cu leucocitele polimorfonucleare și care nu aderă
la celulele epiteliale.
Prezența unei singure categorii microscopice în asociere cu leucocitele (categoriile D și E)
pot fi utile în prezicerea agenților patogeni pulmonari și ar trebui raportate.
Probele acceptabile sunt observate cu mărire 1.000 x I.U. Se pot întâlni următoarele situații:
A. Nu se observă microorganisme
B. Floră mixtă; niciuna din categoriile microscopice nu depășește 10 microorganisme / câmp
cu I.U.
C. Floră mixtă cu două sau mai multe categorii microscopice cu peste 10 microorganisme /
câmp I.U.
D. o singură categorie microscopică cu mai puțin de 10 microorganisme / câmp I.U.
E. o singură categorie microscopică cu mai mult de 10 microorganisme / câmp I.U.

140
Tabelul 1. Aprecierea calității probelor de spută - Scorul de calitate Bartlett
Scor de calitate Număr celule pe camp
(metoda Bartlett)
Celule epiteliale Leucocite

1 > 25 < 10

2 > 25 10 – 25

3 > 25 > 25

4 10 – 25 > 25

5 < 10 > 25

Probele cu scor 1, 2 și 3 sunt intens contaminate cu salivă și nu trebuie cultivate. Doar probele cu
scor 4 și 5 sunt acceptabile, cele cu scor 5 sunt optime. Probele cu scor 4 și 5 și cu prezență de
microorganisme monomorfe au o valoare înalt predictivă.

La examinarea frotiului Gram se va ține cont de informațiile legate de prezența

tratamentului cu antibiotic. În această situație microorganismele evidențiate pe frotiu pot să nu fie
viabile.
La solicitare specială se fac colorații specifice:
- Ziehl-Neelsen pentru micobacterii
- Giemsa pentru Pneumocystis jirovecii
Pentru fungi se examinează preparat umed între lamă și lamelă cu KOH.

Numărătoarea diferențială a leucocitelor din lichid pleural

Se efectuează diferențierea dintre leucocitele polimorfonucleare și leucocitele
mononucleare.
1. Metoda camerei de numărare: recomandată pentru numărul mai scăzut de leucocite.
a) Eșantioane fără sânge sau ușor hemoragice
- colorați fluidul necentrifugat cu soluție de colorare 0,1%, cum ar fi toluidină, metilen sau
albastru de nil. Aceasta colorează nucleele leucocitelor, ajutând astfel diferențierea celulelor
- factorul de diluare trebuie luat în considerare la calcularea numărului final de celule
- numărați și înregistrați numerele fiecărui tip de leucocit
- exprimă numărul de leucocite ca număr de celule pe unitatea de volum (μl, ml, mmc, etc.)
b) Probe intens hemoragice
- diluați proba cu lichid de diluare și lăsați-l timp de 5 minute înainte de a încărca camera de
numărare. Aceasta va liza celulele roșii din sânge și va colora nucleele leucocitelor pentru
diferențiere.

141
- numărați și înregistrați numărul fiecărui tip de leucocit. Factorul de diluare trebuie luat în
considerare la calcularea numărului final de celule.
- exprimă numărul de leucocite ca număr de celule pe unitatea de volum (μl, ml, mmc, etc.)
2. Metoda colorării
Recomandată pentru valori foarte mari de globule roșii unde diferențierea în camera de
numărare este dificilă:
- pregătiți o lamă din sedimentul centrifugat ca pentru colorația Gram, dar lăsați să se usuce la
aer
- se fixează în alcool și se colorează cu o colorație potrivită pentru morfologia leucocitelor
Notă: Fixarea la căldură distorsionează morfologia celulară
- numărați și înregistrați numărul fiecărui tip de leucocit ca procent din total.
3. Metoda automată - pe analizor de hematologie cu modul special pentru lichide de
puncție;

Cultivarea
Sputa: se inoculează câte 10 μl din probă omogenizată pe fiecare mediu de cultură.
Lavaj bronhoalveolar:
- Metoda calitativă: se inoculează cu ansa din sedimentul obținut după centrifugare pe fiecare
mediu de cultură.
- Metoda semicantitativă: se inoculează 10 µl cu ansa calibrată sau 100 µl cu o pipetă Pasteur.
În final numărul de colonii obținute se vor înmulți cu inversul diluției pentru a calcula numărul
de UFC/ml. Pentru diagnostic se utilizează pragul de 103 UFC/ml pentru probe obținute prin
periaj protejat, și 104 UFC/ml pentru lavaj bronhoalveolar (Tabelul 2).
Aspirat traheal
- Pentru diagnostic se utilizează pragul de 106 UFC/ml

Limita pentru diagnostic poate să nu fie atinsă în caz de: infecție recentă, bronșiolită,
tratament cu antibiotic. Pragurile de semnificație clinică se aplică în cazurile fără tratament
antibiotic prealabil.

Tabelul 2. Diluțiile recomandate pentru o apreciere cantitativă în funcție de tipul probei

Tipul de probă Diluția Pragul de semnificație
clinică (UFC/ml)

Lavaj bronhoalveolar și 10-2, 10-4 ≥ 104

bronșic
Recoltare prin periaj protejat 10-2 ≥103

Aspirat endotraheal 10-3, 10-5 ≥105-106

142
 Principalele microorganisme implicate în etiologia infecțiilor de tract respirator inferior
sunt:
- Streptococcus pneumoniae
- Staphylococcus aureus
- Pseudomonas aeruginosa
- Enterobacterales
- Haemophilus sp.
- Moraxella catarrhalis
- Neisseria meningitidis
Izolarea S. pneumoniae, H. influenzae sau S. aureus necesită o evaluare atentă deoarece ei
pot fi comensali în orofaringe.

În cazul suspiciunii de infecție cu fungi filamentoși:

- Pacienții fără fibroză chistică, imunodeprimați și alții: după tratare cu un agent mucolitic, dacă
este necesar, se centrifughează proba. Se examinează o parte din sediment cu KOH și colorație
cu calcofluor iar restul se însămânțează.
- Pacienții cu fibroză chistică: după tratarea cu un agent mucolitic se însămânțează pe câte o
placă cu mediu de cultură un eșantion de 10 µL și un eșantion de 100 µL cu dispersie pe
suprafața întregii plăci. Produsul rămas se centrifughează și se examinează o parte din sediment
cu KOH și colorație cu calcofluor iar restul se însămânțează.

Medii de cultură utilizate și condiții de incubare

Mediile de cultură utilizate sunt în funcție de categoria microscopică observată sau în
funcție de contextul clinic, cu incubare 24 – 48 h la 35oC cu și fără CO2 sau cu incubare până la
20 zile pentru Nocardia spp., Actinomyces spp. (tabelele 3-5).

Tabelul 3. Mediile de cultură folosite, condițiile de incubare recomandate și

microorganismele urmărite în cazul lavajului bronhoalveolar
Detalii clinice Medii de cultură Condiții de incubare Microorganism
țintă
Temperatura Atmosfera Timp
o
C

Agar sânge 35-37 5-10% CO2 40 - 48 H. influenzae

Exacerbări Agar chocolat ore M. catarrhalis
BPOC simplu, opțional S. aureus
cu disc de S. pneumoniae
Pneumonie bacitracină sau
comunitară bacitracină Sau alte
incorporată în microorganism
Pneumonie de mediul de cultură izolate in cultură
spital pură

143
 Agar Sabouraud 35 Aer 5 zile Fungi

Agar CLED sau 35 Aer 40 - 48 Enterobacterales

MacConkey ore Pseudomonade
Acinetobacter spp.

Pentru următoarele situații se adaugă:

Detalii Medii de Condiții de incubare Microorganism
clinice cultură țintă
Temperatură Atmosferă Timp
o
C

Bronșiectaz Agar manitol 35-37 aer 40-48 S. aureus

ie (Chapman) ore

Fibroză
chistică

Fibroza MacConkey sau 35 aer 48 ore Burkholderia

chistică mediu special cepacia complex
pentru
Burkholderia
cepacia

Pneumonie Agar selectiv 35 Aer Până Legionella specie

sugestivă și/sau atmosferă la 10
pentru neselectiv de umedă zile
legioneloză Legionella
cu test de
antigene
urinare de
Legionella
negative

144
Tabelul 4. Mediile de cultură folosite, condițiile de incubare recomandate și
microorganismele urmărite în cazul sputei
Detalii Medii de Condiții de incubare Microorganisme
clinice cultură țintă
Temperatura Atmosfera Timp

Exacerbări Agar sânge 35-37 oC 5-10% CO2 40-48 ore H. influenzae

BPOC Agar chocolat M. catarrhalis
simplu, opțional S. aureus
Pneumonie cu disc de S. pneumoniae
bacitracină sau
bacitracină Sau alte
incorporată în microorganisme
mediul de cultură izolate in cultură
pură

Pentru următoarele situații se adaugă

Detalii Medii de Condiții de incubare Microorganism
clinice cultură țintă
Temperatura Atmosfera Timp
o
C

Bronșiectazie Agar manitol 35-37 Aer 40-48 ore S. aureus

(Chapman)
Fibroza
chistică

Pacienți Agar CLED sau 35 Aer 40-48 ore Enterobacterales

imunodeprim MacConkey
ați sau din Pseudomonade
ATI

Agar Sabouraud 35 Aer 40-48 ore Fungi

145
Fibroza MacConkey sau 35 Aer 48 ore Burkholderia
chistică mediu selectiv cepacia complex
pentru
Burkholderia
cepacia
Pneumonie Agar selectiv 35 Aer Până la Legionella spp.
sau simptome Legionella atmosferă 10 zile
de gripă umedă

Tabelul 5. Mediile de cultură folosite, condițiile de incubare recomandate și

microorganismele urmărite în cazul lichidului pleural
Medii de cultură Condiții de incubare Citirea Microorganisme
culturilor țintă

Temperatu Atmosferă Timp

ră °C

Agar sânge 35-37 5-10% CO2 40-48 zilnic toate

h* microorganismele

Agar anaerobi 35-37 anaerobioză 40-48 ≥40 h Anaerobi

h*

Agar chocolat 35-37 5-10% 40- zilnic toate

CO2 48h* microorganismele

Dacă se utilizează toate

flacoane de 35-37 aerob Monitor N/A microorganismele
hemocultură, atunci izare
acestea pot înlocui continu
necesitatea plăcilor ă
prezentate mai sus, pe
baza evaluării locale a
riscurilor.
Sau bulion anaerob
apoi subcultivat pe
plăcile de mai sus.

Dacă se suspectează o infecție fungică:

Agar Sabouraud 35-37 aerob 21 zile 10 și 21 Fungi

zile

* plăcile pot fi incubate până la 5-7 zile, dacă este necesar, de exemplu dacă se suspectează Nocardia sau Actinomyces

146
Teste moleculare
Diagnosticul etiologic al infecțiilor respiratorii trebuie să cuprindă un număr relativ extins
de microorganisme, deoarece manifestările clinice sunt adesea nespecifice. Utilizarea testelor
moleculare de tip multiplex, care detectează și identifică simultan mai mulți patogeni respiratori
(bacterii, virusuri), furnizează rapid informații utile pentru adoptarea unor decizii terapeutice.
Aceste teste diferă prin numărul de ținte incluse (între 3 și 20 ținte), tipul de probă (de exemplu
exsudat nazo-faringian, spută, aspirat bronșic), durata până la obținerea rezultatelor, complexitatea
testării și echipamentul necesar.

Interpretarea rezultatelor:
- Este important să se compare rezultatele examinării microscopice cu rezultatele culturii
cantitative.
- Sensibilitatea și specificitatea examenului sputei sunt reduse datorită contaminării cu flora
orală – valoarea sa depinde de calitatea recoltării, prelucrării și existența unui morfotip
bacterian predominant la examenul microscopic.
- Unele microorganisme sunt comensale (S. pneumoniae, H. influenzae, S. aureus), de aceea este
important să se țină cont de datele calitative și cantitative: număr de celule epiteliale, număr
de leucocite, prezența/absența florei monomorfe, pragul de semnificație.

IV. Raportarea rezultatelor:

Examenul microscopic:
Dacă pacientul este imunocompetent, se raportează calitatea produsului și în caz de produs
nesatisfăcător se solicită o nouă recoltare dacă există indicație clinică.
- Se raportează prezența leucocitelor, a celulelor epiteliale și a microorganismelor
- Numărul de celule (dacă este solicitat) - Raportați numărul de leucocite x 106 pe litru
- De asemenea, raportați PMN și leucocite mononucleare ca procent din totalul leucocitelor,
dacă vi se solicită.
- Se raportează prezența elementelor fungice (levuri, spori, filamente)
- Se raportează prezența chiștilor de Pneumocystis jirovecii (colorație specifică)
Timpul de raportare a rezultatului examinării microscopice: cât mai curând posibil sau în
funcție de reglementările locale. Rezultatele urgente vor fi comunicate telefonic sau electronic în
maxim 2 ore.

Cultura
Se raportează microorganismele izolate și semnificative clinic, se raportează cantitativ dacă
au fost izolate din lavaj bronho-alveolar sau altă metodă semicantitativă.
În cazul izolatelor de Pseudomonas aeruginosa provenite de la pacienți cu fibroză chistică
se va specifica pe rezultat dacă tulpina are fenotip mucos.
Se raportează altă creștere, de ex: “flora mixtă din tractul respirator superior”, sau ”fără
creștere microbiană”.
Pentru lichidul pleural: raportați organismele izolate sau raportați absența creșterii.
147
 Se raportează eventualele investigații suplimentare.
Timpul de raportare a culturii: în cazul detecției de izolate potențial semnificative clinic se
vor elibera rapoarte intermediare/preliminare imediat ce s-a observat creșterea.
Rezultatele urgente se vor transmite telefonic sau electronic în funcție de protocolul de
raportare stabilit.

Teste moleculare:
- Se eliberează imediat ce sunt disponibile,
- În cazul testelor multiplex se menționează agenții incluși în panelul de testare.
Raportul final scris se va elibera imediat ce este disponibil.

V. Bibliografie
Canton R, Segonds C: Pulmonary infections in cystic fibrosis. In European Manual of
Clinical Microbiology, editors Cornaglia G, Courcol R, Herrmann JL, Kahlmeter G, Publisher
SFM, 2012:153-163-169.
Cumitech 7B, Lower Respiratory Tract Infections. Coordinating ed., S. E. Sharp. ASM
Press, Washington, D.C Miller M, Binnicker MJ, Campbell S et al: Guide to Utilization of the
Microbiology Laboratory for Diagnosis of Infectious Diseases: 2018 Update by the Infectious
Diseases Society of America and the American Society for Microbiology
Freymuth F, Ieven M, Wallet F: Lower respiratory tract infections. In European Manual of
Clinical Microbiology, editors Cornaglia G, Courcol R, Herrmann JL, Kahlmeter G, Publisher
SFM, 2012:153-161.
Kenaa B, Richert ME, Claeys KC et al: Ventilator-Associated Pneumonia: Diagnostic Test
Stewardship and Relevance of Culturing Practices. Current Infect Dis Rep, 2019, 21:50.
Public Health England. (2018). Investigation of Fluids from Normally Sterile Sites. UK
Standards for Microbiology Investigations. B 26 Issue 6.2. https://www.gov.uk/uk-standards-for-
microbiology-investigations-smi-quality-and-consistency-in-clinical-laboratories

148
Diagnosticul microbiologic al infecțiilor cutanate și ale
părților moi

I. Introducere
În acest capitol se descriu:
- Prelucrarea produselor recoltate din diverse leziuni superficiale, inclusiv din plăgi traumatice,
chirurgicale sau de altă natură, care sunt accesibile fără intervenție,
- Prelucrarea probelor de puroi aspirate din abcese, a probelor recoltate din colectii profunde,
- Prelucrarea probelor de fragmente tisulare,
- Diagnosticul microbiologic al infecțiilor arsurilor.

Infecțiile cutanate pot fi:

- Primare - apar pe tegumente intacte (impetigo, furuncul, carbuncul, foliculită).
- Secundare - apar pe fondul unor leziuni tegumentare preexistente (traumatice, afecțiuni
cronice).
În funcție de profunzimea lor, infecțiile cutanate și de părți moi pot fi:
- Profunde și închise,
- Profunde și închise, dar care comunică cu un lumen ce conține floră comensală sau sunt
fistulizate spre tegumente,
- Superficiale, deschise, având floră bacteriană colonizantă bogată.

II. Infecții cutanate și de părți moi

Tipuri de infecții - recoltarea probelor biologice

Eritrasma
Eritrasma este o infecție superficială a pielii ce afectează stratul cornos și este cauzată de
Corynebacterium minutissimum. Apare de obicei în zonele intertriginoase ale pielii. Diagnosticul
este clinic, însă dacă se dorește verificarea etiologiei, pentru examen microbiologic se recoltează
două probe de pe suprafața zonei afectate, cu tampoane umectate în ser fiziologic steril.

Panarițiu
Cel mai frecvent este determinat de Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes,
levuri, germeni anaerobi. Colecția purulentă se aspiră.

149
Infecții superficiale ale tegumentelor (impetigo, foliculită, furuncul,
antrax)
Dacă există pustule intacte sau colecții purulente închise, suprafața acestora se curăță cu
soluție alcoolică. Se deschide leziunea și în funcție de cantitatea colecției purulente, se aspiră într-
o seringă sau se șterge cu un tampon.
Dacă leziunea este acoperită cu crustă, aceasta se îndepărtează și se recoltează de sub ea.
Dacă leziunea este uscată, se folosește tampon umectat cu ser fiziologic steril.

Erizipel
Erizipelul este o infecție superficială a tegumentelor, caracterizată de eritem cu linie de
demarcație clară și edem.
Agentul etiologic principal este Streptococcus pyogenes. Examenul bacteriologic din aria
afectată nu este indicat. În prezența semnelor sistemice se recomandă efectuarea de hemoculturi,
însă acestea au rată de pozitivare redusă.

Plăgi mușcate
Dacă există lichid în leziune, acesta se aspiră. Alternativ, după dezinfecția zonelor
adiacente, se recoltează cu un tampon din adâncimea mușcăturii. Acesta se transportă în mediu de
transport, în vederea protejării bacteriilor anaerobe.

Ulcere gambiere, escare, picior diabetic

Examenul microbiologic este indicat doar în cazul în care există semne locale de infecție
(durere, inflamație) sau generale (febră, adenopatii).
Din escare se recoltează doar dacă leziunea este profundă, străbate fascia.
Vecinătatea leziunilor trebuie dezinfectată. Leziunile trebuie debridate, curățate de secreții
stagnante, spălate cu ser fiziologic steril. Se recomandă recoltarea unui fragment de țesut sau
chiuretarea zonei active a leziunii. Produsul recoltat se plasează în recipient steril. Alternativ, după
curățarea leziunii se recoltează energic cu tamponul (se șterge leziunea rotind tamponul până la
expresia de fluide; dacă este o zonă mai mare se recoltează de pe o suprafață de 1x1cm). În
principiu, recoltarea cu tamponul nu este acceptabilă, deoarece tamponul poate absorbi în vată o
cantitate semnificativă de material biologic și se poate contamina cu flora cutanată de vecinătate.

Fasceita necrozantă
Fasceita necrozantă este o inflamație, cu progresie rapidă a fasciei, asociată cu necroza
țesuturilor subcutanate. Reprezintă o urgență medico-chirurgicală ce impune debridarea leziunilor.
În funcție de agenții etiologici implicați, fasceita necrozantă poate fi de patru tipuri:
- Tipul I este polimicrobian, fiind implicați patogeni strict sau facultativ anaerobi (2-4
specii). Apare de obicei în prezența unor comorbidități (de ex. diabet zaharat), cel mai
frecvent pe trunchi sau perineu.
- Tipul II (monomicrobian) este cauzat de Streptococcus pyogenes și se localizează pe
membre.

150
 - Tipul III are ca și etiologie specii de Clostridium, bacterii Gram-negative, vibrioni sau
Aeromonas hydrophila. Se localizează pe membre, trunchi sau perineu.
- Tipul IV este cauzat de zygomycete, Candida spp. și apare la pacienții imunosupresați,
fiind localizat pe membre, trunchi sau perineu.
Pentru diagnosticul microbiologic probele recoltate pe tampon sunt inacceptabile, este
nevoie de fragmente de țesut și hemoculturi.

Plăgi chirurgicale
În cazul infecțiilor superficiale de plagă chirurgicală se recomandă recoltarea secreției
apărute la nivelul plăgii, preferabil prin aspirare, folosind o seringă. Alternativ se recoltează
biopsie în cursul toaletei/ reintervenției chirurgicale. Recoltarea cu tamponul trebuie evitată,
deoarece calitatea acestor produse este nesatisfăcătoare.

Arsuri
Arsurile inițial sterile se colonizează rapid cu coci Gram-pozitivi de pe tegumentele
învecinate, după aceea cu flora orofaringiană sau gastrointestinală a pacientului și cu germenii din
mediul exterior.
Se disting patru situații:
- Colonizarea - bacteriile sunt prezente pe suprafața arsurii în cantitate redusă (<10 5 UFC/g
țesut).
- Infecția plăgii - un microorganism este prezent în cantitate mare; sunt prezente semne de
infecție locală, dar nu și semne de infecție invazivă (>105 UFC/g țesut).
- Celulita - prezența în cantitate mare a unei specii bacteriene, însoțită de eritem, indurație,
sensibilitate și căldură în zonele învecinate + sepsis.
- Fasceita/infecția necrozantă caracterizată de infecția agresivă a țesuturilor, cu necroză în
țesuturile subcutanate.
Un aspect important în această patologie este că bacteriile sunt întotdeauna detectabile.
Interacțiunile dintre bacterii și pacient sunt esențiale și din acest punct de vedere este importantă
urmărirea cu atenție a plăgilor arse. De ex. Pseudomonas aeruginosa este un colonizant frecvent
al plăgilor arse, care produce un exsudat verzui. Spre deosebire de simpla colonizare, infecțiile
invazive cu acest germen reprezintă urgențe chirurgicale.
Dintr-un set inițial de probe recoltate din jurul arsurilor și din ariile arse se urmăresc
patogenii potențiali. Ulterior se recoltează probe în contextul unor modificări survenite în aspectul
leziunilor (apariția puroiului, exsudat în cantitate crescută, schimbarea culorii plăgii, inflamația
zonelor nearse), în cazul lizei graftului sau apariției semnelor de infecție sistemică.
Probele recoltate cu ajutorul tamponului permit analiza calitativă sau semicantitativă a
colonizării, iar în prezența semnelor unei infecții, permite stabilirea agentului cauzal și a
sensibilității acesteia față de antibiotice.
Fragmentele de țesut permit analiza cantitativă a bacteriilor/gram țesut. Fiind metode
invazive sunt mai rar folosite. Se vor exciza două bucăți de 1,5x1-2 cm (20-50 mg) din marginea
leziunii, care să conțină și țesut sănătos. Un fragment se trimite la examinări histopatologice,
celălalt la examen microbiologic. Fragmentele de țesut sunt adecvate și pentru identificarea
infecțiilor fungice.
Pentru recoltările efectuate cu tamponul, întâi se îndepărtează agenții topici aplicați cu
ajutorul unei comprese sterile îmbibate cu ser fiziologic. Din zona astfel curățată se recoltează

151
proba cu două tampoane: se șterge o suprafață de 2-4 cm2 în zig-zag sau se apasă tamponul pe o
arie a plăgii rotind-o de câteva ori (se apasă energic, dar fără a cauza sângerare).

Abcese, furuncule, carbuncule

Abcesele reprezintă colecții purulente închise ce pot avea diferite localizări (subcutanate
sau în diverse organe).
Carbunculii sunt abcese subcutanate profunde și extinse care implică mai mulți foliculi
piloși și glande sebacee.
Abcesele cutanate pot fi cauzate de bacterii diverse. Cele localizate pe trunchi, axilă și
membre sunt cauzate cel mai frecvent de S. aureus. Cele situate în vecinătatea organelor genito-
urinare și perianal se datorează în principal florei genito-urinare și intestinale.
Diagnosticul microbiologic este recomandat în situațiile în care rezultatul obținut
influențează atitudinea terapeutică.
Pentru diagnostic se recoltează puroiul din abces prin puncție și aspirare (dacă abcesul este
accesibil puncției) după antisepsie locală sau în cursul unei intervenții chirurgicale.
Dacă volumul este mare, se aspiră cca 5-10 ml și se transferă în recipiente sterile pentru
transport. Dacă se transportă în seringi, acestea trebuie închise. Cantitatea minimă recomandată
este 1 mL. În puroaiele voluminoase anaerobii își păstrează viabilitatea mai bine. Probele din care
se cultivă anaerobi nu se refrigerează, trebuie prelucrate cât mai repede.

Micoze superficiale
Micozele superficiale sunt infecții fungice ce afectează stratul cornos al tegumentelor,
firele de păr și unghiile. Pot fi cauzate de dermatofiți, specii de Candida și levuri lipofile (de ex.
Malassezia spp.). Pentru diagnostic se obțin scuame, fir de păr, raclat unghial.

Infecții cutanate produse de bacterii specifice

Antrax
Antraxul cutanat apare în urma contactului cu animale infectate sau produse (piele, blană,
etc.) provenite de la aceste animale. Este caracterizat de dezvoltarea unei leziuni caracteristice,
pustula malignă: ulcerație cu escară neagră, edem periulcerativ.
Suspiciunea clinică de antrax trebuie menționată la solicitarea examenului microbiologic.
În cazul formelor de prezentare veziculare, se recoltează lichid vezicular pe tampon. În
cazul prezenței crustei, se recoltează probă de sub crustă pe tampon umectat. În cazul prezenței
ulcerului, se recoltează proba de la baza leziunii cu un tampon umectat cu ser fiziologic steril.

Infecții produse de Aeromonas spp. și specii de Vibrio non-holerice

Aceste specii produc suprainfecția plăgilor traumatice asociate mediului acvatic (plăgi
contaminate cu apă dulce sau sărată).

152
 Erizipeloid
Este o boală ocupațională, determinată de Erysipelothrix rhusiopathiae, ce se manifestă în
urma contactului cu animale infectate (porcine, bovine, cai, păsări, pești, etc.). Cel mai frecvent
sunt afectați lucrătorii din abatoare, fermieri, veterinari, pescari.
Obișnuit, se dezvoltă o infecție localizată a părților moi, ocazional însă pot apărea și infecții
sistemice, inclusiv endocardită. Bacteria este un bacil Gram-pozitiv pleomorf. Are rezistență
naturală față de vancomicină.

Actinomicoza
Actinomicoza este o infecție supurativă cronică determinată de Actinomyces spp.,
caracterizată prin formare de fistule și eliminarea unei secreții purulente ce conține granule de sulf.
Apariția acestor infecții, de obicei este legată de traumatisme ce implică mucoasa cavității bucale.
Infecțiile pot avea și localizări toracice, abdominale sau pelvine. Se recomandă drenarea puroiului,
colectarea granulațiilor de sulf și/sau obținerea de material biopsic în vederea diagnosticului
bacteriologic.

Nocardioza
Nocardioza cutanată poate fi determinată de diseminarea microorganismului în urma unei
infecții pulmonare. De obicei apare la persoane imunodeprimate.
Nocardioza cutanată primară afectează persoanele imunocompetente și, cel mai adesea,
apare în urma unei leziuni cutanate. Se prezintă într-una din cele trei forme: infecție cutanată
superficială, infecție limfocutanată sau micetoame.

Tabelul 1. Microorganismele cu importanță clinică în funcție de localizarea infecției și

contextul clinic
Tipul leziunii Contextul clinic Microorganismele cu
importanță clinică

Actinomycetoma, Nocardia spp.

nocardioză

Actinomicoza Granule de sulf (sunt Actinomyces israelii

frecvente localizările
cervicofaciale), leziuni
supurative cu tendință la
cronicizare

Angiomatoza bacilară Imunosupresie (SIDA, Bartonella henselae,

cancer, transplant medular) Bartonella quintana

Antrax Bacillus anthracis

Arsuri Staphylococcus aureus,

Pseudomonas aeruginosa,
Enterobacterales,

153
 Streptococcus pyogenes

Celulită/fasceită Staphylococcus aureus,

Streptococi beta-hemolitici
de grup A, B, C, G
Enterobacterales
Pseudomonas aeruginosa
Anaerobi

Celulită cu leziuni buloase, Contact cu fructe de mare Vibrio vulnificus și alți

hemoragice crude, leziuni contaminate vibrioni
cu apă marină

Erizipel Streptococi beta-hemolitici

de grup A, B, C, G

Eritrasma Corynebacterium
minutissimum

Foliculită Asociată cu activități de Pseudomonas aeruginosa

recreere acvatică

Furunculoză Staphylococcus aureus

Hidrosadenită supurativă Staphylococcus aureus,

streptococi,
Enterobacterales,
Pseudomonas aeruginosa,
anaerobi

Impetigo Staphylococcus aureus,

Streptococcus pyogenes
Pseudomonas aeruginosa

Mușcătură (umană, de porc) Streptococi de grup viridans

Anaerobi,
Staphylococcus aureus,
Eikenella corrodens,
stafilococi coagulază
negativi,
Corynebacterium spp.,
Streptococcus pyogenes.
Infecțiile sunt frecvent
polimicrobiene.

Mușcătură de câine, pisică, Virus rabic, streptococi beta-

liliac, etc. hemolitici și de grup
viridans, Staphylococcus

154
 aureus, stafilococi
coagulazo-negativi,
Pasteurella spp., anaerobi,
coryneformi

Mușcătura de șobolan Streptobacillus moniliformis,

Spirillum minus

Panarițiu Staphylococcus aureus,

Streptococcus pyogenes
Pseudomonas aeruginosa

Plagă traumatică, Clostridii

contaminată cu sol

Plagă traumatică Polimicrobian:

suprainfectată (fără contact Staphylococcus aureus,
cu mediu acvatic) streptococi beta-hemolitici
de grup A, B, C, G,
enterobacterii, clostridii

Plagă traumatică Pseudomonas aeruginosa,

suprainfectată (contaminată Aeromonas hydrophila,
cu apă dulce) Burkholderia pseudomallei

Plagă traumatică Vibrio vulnificus

suprainfectată (contaminată
cu apă marină)

Plagă chirurgicală Staphylococcus aureus,

streptococi beta-hemolitici
de grup A,
Enterobacterii,
Pseudomonas aeruginosa

Plagă chirurgicală Staphylococcus aureus,

(intervenție pe tractul streptococi beta-hemolitici
gastrointestinal, tractul de grup A, B, C, G
genital feminin) Enterobacterii,
Pseudomonas aeruginosa
Anaerobi
Enterococi

155
 III. Recoltarea și transportul probelor
Deoarece există o varietate mare a infecțiilor cutanate, este important să se descrie exact
leziunea din care provine proba recoltată, inclusiv localizarea acesteia. Adâncimea leziunii este de
asemenea important de cunoscut, deoarece doar din cele adânci este indicată cultivarea
anaerobilor. Pentru cultivarea anaerobilor se preferă probele aspirate față de probele recoltate pe
tampoane.
Modul de recoltarea se va menționa de asemenea (intraoperator, puncție-aspirație).
Ca principiu de bază, probele recoltate prin aspirare sau probele biopsice (fragmente de
țesut) sunt superioare calitativ probelor recoltate pe tampon. Fragmentele de țesut se transportă în
recipiente sterile acoperite de ser fiziologic steril pentru a evita deshidratarea.
În cazul în care se recoltează cu tampon de pe suprafața unei leziuni deschise, înainte de
recoltare, zona din care urmează să se recolteze se curăță cu ser fiziologic steril, iar zona adiacentă
leziunii se dezinfectează. Tamponul se răsucește energic pe o suprafață de cca 1 cm2 până la
provocarea unei ușoare sângerări.
Examenul microscopic al acestor probe este important, de aceea în cazul probelor recoltate
pe tampon, fie se va recolta și un al doilea tampon pentru efectuarea frotiului, fie se efectuează
frotiu din același tampon după descărcarea pe mediile de cultură.
În cazul infecțiilor bacteriene întotdeauna sunt prezente leucocite. Celulele epiteliale
scuamoase indică probe superficiale și o posibilă contaminare.

Probele trebuie să ajungă la laborator în 2 ore. Depășirea acestei durate impune folosirea
unui mediu de transport.

IV. Prelucrarea probelor

Pregătirea probelor
Probele se prelucrează în hote de siguranță de clasă 2.
Fragmentele tisulare trebuie mojarate, cu excepția situațiilor în care se suspicionează
infecție micotică, deoarece strivirea zigomicetelor duce la pierderea viabilității.

Examenul microscopic al frotiurilor colorate Gram

Se efectuează în cazul infecțiilor profunde, din probe de puroi aspirate sau din probele
recoltate pe tampon.
În cazul fragmentelor tisulare, frotiul se efectuează din produsul omogenizat prin mojarare,
alternativ se fac amprente pe lamă atingând fragmentul de mai multe ori de suprafața lamei.
Fragmentul astfel utilizat pentru efectuarea frotiului nu se folosește pentru cultivare.
Dacă recoltarea s-a făcut cu două tampoane, dintr-unul se efectuează frotiuri, iar celălalt se
însămânțează.
Dacă s-a trimis un singur tampon, din acesta se efectuează frotiuri după însămânțarea pe
mediile de cultură.
Se notează prezența leucocitelor, a celulelor epiteliale și se urmărește prezența bacteriilor,
cantitatea acestora și caracterele lor morfotinctoriale.
156
 Cultivare
Tampoanele se descarcă pe mediile de cultură prin rotire în primul cadran. Se diseminează
cu ansa sterilă.
Probele de puroi aspirate se depun cu pipetă sterilă și se diseminează cu ansa. Se vor
însămânța de asemenea medii de îmbogățire.
Mojaratul obținut din fragmentele de țesut se însămânțează cu ansa de 10 µl sau se depune
o picătură cu pipeta.
Se însămânțează maxim două probe pe o placă.
Dacă se suspicionează antrax, cultivarea se face doar în laboratoarele de nivel 3 de
biosiguranță.

Tabelul 2. Prelucrarea probelor recoltate pe tampon

Entităţi Medii de Condiţii de incubare Citire Microorganisme ţintă
clinice cultură a
standard cultu
Temperatu Atmosfer Timp
rii
ra oC ă h

Probe Agar sânge 35-37 5% CO2 48 Zilnic Streptococi piogeni

recoltate pe Staphylococcus aureus
tampon Și alți germeni în
+/- funcție de tipul
leziunilor

Staphylococcus aureus
Mediu selectiv 35-37 Aerobă 48 Zilnic
pentru
stafilococi
(MSA - Enterobacterii
mannitol Salt Pseudomonade
Agar) 35-37 Aerobă 18-24 >18 (Semnificația clinică
+ trebuie determinată în
CLED/ funcție de patologie)
MacConkey

În următoarele situații se adaugă:

Tampoane Agar sânge 35-37 Anaerob 5 zile La 2 - Anaerobi

recoltate din pentru anaerobi 5 zile
plăgi
profunde

157
Tampoane Mediu 35-37 Aerob 5 zile Orice microorganism
recoltate din tioglicolat
abcese 35-37 Aerob/ 40-48 ≥40 h
Subculturi pe CO2/
agar sânge în Anaerob 5 zile La 2 -
cazul evidenței 5 zile
creșterii
Sau la 5 zile

Celulite la Agar chocolat 35-37 5-10% 40-48 Zilnic Bacterii pretențioase,

copii (poate fi CO2 Haemophilus influenzae
Mușcături selectiv, cu
umane conținut de
bacitracină)

Arsuri Agar 28-30 Aerob Până la Zilnic Levuri

Imunosupresi Sabouraud 14 Fungi filamentoși
e
Diabetici
Panarițiu
(dacă se
observă fungi
pe frotiu)

Tabelul 3. Prelucrarea probelor de puroi aspirat și a fragmentelor biopsice

Entităţi clinice Medii de cultură Condiţii de incubare Citirea Microorganisme

standard culturii ţintă
Temp oC Atmosferă Timp
h

Probe de puroi Agar sânge 35-37 CO2 40-48 Zilnic Orice bacterie
recoltate prin
aspirare CLED sau 35-37 Aerob 18-24 >18
Fragmente de MacConkey Agar
țesut
Agar sânge pentru 35-37 Anaerob 5 zile La 2-5 zile Bacterii strict
anaerobi anaerobe

Bulion tioglicolat 35-37 Aerob 5 zile NA Orice

158
 microorganism
Dacă se observă 35-37 Aerob/CO2 40-48 >40
tulburare se fac
treceri pe mediile Anaerob La 2-5 zile
mai sus
menționate
(exceptie:
MacConkey/
CLED)

În situațiile următoare adaugă:

Abces Agar chocolat 35-37 5-10% CO2 40-48 Zilnic Bacterii

submandibular pretențioase
Abces pulmonar
Abces cerebral
Abces spinal
Abces psoas
Abces hepatic

Pacient Agar Sabouraud 28-30 Aerob 14 z Zilnic Fungi

imunosupresat cu cloramfenicol
sau se observă
fungi pe frotiu

Puroi recoltat în Agar chocolat 35-37 5-10% CO2 40-48 >40 Neisseria
cazul peritonitei selectiv gonorrhoeae
primare la femei,
Abces prostatic

Opțional în cazul Medii selective 35-37 Aerob 40-48 Zilnic Staphylococcus

unor infecții pentru stafilococi/ aureus
mixte (pe baza streptococi Streptococcus spp.
frotiului)

159
 Identificarea microorganismelor izolate
Tabelul 4. Nivelul de identificare a izolatelor din infecții ale părților moi
Bacterii izolate Nivelul minim de identificare

Infecții superficiale Infecții profunde Fragmente de țesut

(probe recoltate pe (puroi aspirat sau
tampon) recoltat pe
tampon)

Anaerobi - Menționarea Menționarea

prezenței prezenței anaerobilor
anaerobilor

Actinomycete Gen Gen

Bacillus spp Specie* - -

Streptococi β- Grup Lancefield Specie Specie

hemolitici

Staphylococcus Specie Specie Specie

aureus

Stafilococi coagulază Coagulazo-negativ Coagulazo- Coagulazo-negativ

negativi negativ

Enterobacterii Coliformi Specie Specie

Specie (plăgi
chirurgicale)

Corynebacterium În funcție de situația - -

spp. clinică:
la nivel de specie
în suspiciunea de
difterie cutanată
Eritrasma

Haemophilus spp. Specie Specie Specie

Levuri Gen Specie Specie

Mucegaiuri Gen Specie Specie

Streptococcus Grup Grup Grup

anginosus grup

Pasteurella spp. și Specie Specie Specie

alți germeni

160
 zoonotici*

Pseudomonade Pseudomonade (la nivel Specie Specie

de specie: foliculita
recreațională, fasceita
necrozantă, arsuri)

Vibrioni Specie - -
*aceste culturi se manipulează doar în laboratoare de biosiguranță de nivel 3

Testarea sensibilității față de antibiotice

Se efectuează conform standardului EUCAST în vigoare. Raportarea sensibilității se va
face selectiv.

V. Raportarea rezultatelor

Examenul microscopic:
Se descrie prezența leucocitelor și a bacteriilor vizualizate. Rezultatul examenului
microscopic se introduce în fișa electronică și se validează imediat ce este disponibil.

Cultivare:
Se menționează:
- Microorganismul semnificativ cu cuantificare (creștere săracă - creștere doar în primul cadran de
însămânțare, moderată sau bogată - creștere până în ultimul cadran al însămânțare)
- Alte creșteri (ex. floră comensală fără semnificație patogenă)
- Absența creșterii.
Se comunică rezultatele pe măsură ce sunt disponibile: prezența culturii cu germeni semnificativi,
eventuale teste rapide de rezistență bacteriană efectuate direct din cultură.

Teste moleculare
Se menționează microorganismul/ microorganismele detectate. În cazul testelor multiplex
se include lista agenților potențial detectabili.

Eliberarea rezultatelor
Se eliberează rezultate parțiale în cazul în care se izolează germeni semnificativi. Rezultatele
urgente se comunică și telefonic. Raportul final se eliberează atunci când sunt disponibile
rezultatele tuturor testărilor efectuate.

161
VI. Bibliografie
Greenhalgh DG, Saffle JR, Holmes JA et al: American Burn Association consensus
conference to define sepsis and infections in burns. J Burn Care Res, 2007, 28:776-790.
Misiakos EP, Bagias G, Patapis P et al: Current concepts in the management of necrotizing
fasciitis. Front Surg, 2014, 1:1-10.
Public Health England. (2018). Investigation of swabs from skin and superficial soft tissue
infections. UK Standards for Microbiology Investigations. B 11 Issue 6.5.
Public Health England. (2018). Investigation of tissues and biopsies from deep-seated sites
and organs. UK Standards for Microbiology Investigations. B 17 Issue 6.3.
Public Health England. (2016). Investigation of pus and exudates. UK Standards for
Microbiology Investigations. B 14 Issue 6.2.
Stevens DL, Bisno AL, Chambers HF et al: Practice guidelines for the diagnosis and
management of skin and soft tissue infections: 2014 update by the Infectious Diseases Society of
America. Clin Infect Dis, 2014, 59:e10-52/

162
 Diagnosticul microbiologic al infecțiilor de tract
urinar

I. Introducere
Protecția împotriva infecției urinare este în mod normal dată de fluxul urinar constant și
unidirecțional prin uretere și de golirea regulată a vezicii urinare. Urina este un mediu nefavorabil
de cultură, sărac pentru multe bacterii datorită acidității sale, concentrației ridicate de uree și
osmolalitate variabilă și, la bărbați, posibil parțial ca urmare a activității antibacteriene a secrețiilor
prostatice. Alterarea acestor factori protectori permite colonizarea căilor urinare, adică persistența
și multiplicarea anumitor microorganisme care se pot adapta condițiilor de la acest nivel.
Infecția tractului urinar (ITU) reprezintă una dintre cele mai frecvente infecții comunitare
și este rezultatul inflamației determinate de prezența si multiplicarea microorganismelor, în una
sau mai multe structuri ale tractului urinar. Acest lucru poate da naștere la o mare varietate de
sindroame clinice. Acestea includ:
- pielonefrita acută și cronică
- cistita
- uretrita
Infecția se poate extinde la țesuturile înconjurătoare (de exemplu, abcesul perinefretic) sau
în circulația sanguină.

Termeni folosiți:
Bacteriuria - implică prezența bacteriilor în urină. Pacientul poate fi sau nu simptomatic.
Bacteriuria asimptomatică - reprezintă prezența bacteriilor în urină în lipsa
simptomatologiei sugestive pentru ITU. Corespunde colonizării căilor urinare, condiție ce necesită
investigare microbiologică doar în sarcină sau înainte de intervenții urologice. Screeningul și
tratamentul bacteriuriei asimptomatice nu sunt recomandate în alte situații.
Piuria este definită ca prezența într-o probă de urină a 10 sau mai multe leucocite pe
milimetru cub, a 3 sau mai multe leucocite pe câmp de mare putere de mărire, sau a unui test
pozitiv pentru esteraza leucocitelor. Este cel mai frecvent asociată cu infecție bacteriană a tractului
urinar superior sau inferior.
Alte afecțiuni care ar putea provoca piuria sunt infecțiile genitale (cum ar fi cea cauzată de
C. trachomatis, N. gonorrhoeae sau virusul herpes simplex și ocazional la femei infecții vaginale
cu Trichomonas vaginalis sau Candida), necroză papilară, diabet, calculi renali, boala Kawasaki
și cancer al vezicii urinare.
Piuria ”sterilă” (adică fără creștere pe mediile de cultură de rutină și prezența persistentă
a leucocitelor în urină) poate fi rezultatul multor factori printre care:
- Tratament anterior cu agenți antimicrobieni;
- Cateterizare la nivelul căilor urinare;
- Litiază sau neoplasm al vezicii urinare;
- Infecţii ale tractului genital;
- Boli cu transmitere sexuală, de exemplu Chlamydia trachomatis sau o infecție cu organism
fastidios,

163
- Infecții urinare cu adenovirusuri
- Tuberculoza renală poate fi, de asemenea, implicată în piuria sterilă, dar este mai puțin
frecventă, deși trebuie luată în considerare dacă este suspiciune clinică.
Hematuria - Găsirea 1-2 eritrocite/câmp la mărire de 400x este considerată normală.
Hematuria poate să apară în stări patologice neinfecțioase ale tractului urinar sau în infecții urinare,
infecții cu micobacterii. Hematuria macroscopică poate fi și rezultatul menstruaţiei (pentru
evitarea acestei situații se recomandă folosirea tamponului intravaginal în cazul recoltării în timpul
menstruației). Eritrocitele pot fi lizate în urina hipertonă sau hipotonă, devenind nedetectabile prin
microscopie.
Pacienții simptomatici pot avea bacteriurie sau nu. La copii și persoanele în vârstă,
simptomele, atunci când sunt prezente, pot fi nespecifice și dificil de interpretat.

II. Manifestări clinice ale ITU

Sindrom uretral acut

Sindromul uretral acut apare la femei și constă în simptome acute ale tractului urinar
inferior în absența infecției urinare (fie cu un număr de bacterii ce nu îndeplinește criteriile de
semnificație, fie fără bacteriurie) sau asociat cu o infecție vulvovaginală.

ITU necomplicată
Infecție sporadică sau recurentă acută, joasă (cistită necomplicată) sau înaltă (pielonefrită
necomplicată) la femei în afara sarcinii, aflate în pre-menopauză, fără anomalii anatomice/
funcționale ale tractului urinar, fără comorbidități.
Se consideră că au infecții urinare recidivante persoanele care au minim trei episoade anual
(minim două episoade în șase luni).

ITU complicată
Apare la pacienții la care există leziuni inflamatorii secundare unei infecții anterioare sau
post explorări instrumentale, obstrucției, calculilor, anomaliilor anatomice sau funcționale ale
tractului urinar. Acestea interferă cu drenarea urinei și favorizează colonizarea prelungită. Pot
apărea recidive cu același microorganism. Exemple de ITU complicată:
- Pielonefrita acută complicată
- Pielonefrita cronică (nefrită interstițială cronică sau nefropatie de reflux)
- ITU la bărbați
- ITU asociat sondei
- urosepsis
· Abces perinefretic
· Pionefroză
· Abces renal.
Spectrul etiologic al ITU complicate este mai larg comparativ cu cel al ITU necomplicate,
iar bacteriile izolate sunt mai frecvent rezistente, în consecință evoluția infecțiilor poate fi mai
severă.

164
III. Aspecte clinice particulare
Incidența ITU este influențată de vârstă, sex sau de factorii predispozanți care afectează o
mare varietate de mecanisme normale de apărare a gazdei.

ITU la copii
Confirmarea ITU la copii depinde de calitatea probei, care este adesea dificil de obținut
curată.
Probele recoltate în pungi sterile speciale aplicate pe organele genitale externe sunt
frecvent contaminate cu flora perineală. Rezultatele obținute prin această metodă au valoare doar
pentru excluderea unei infecții (în lipsa creșterii microbiene). Probabilitatea ITU este crescută prin
izolarea aceluiași organism din două probe de urină.
La copiii care nu cooperează la recoltare este de preferat obținerea probei de urină prin
cateter ”in and out” sau puncție suprapubiană.

Adulți femei
Incidența ITU este cea mai mare la femeile tinere. Aproximativ 10–20% dintre femei vor
face ITU simptomatică la un moment dat. La femeile cu simptome acute, ITU poate să fie asociată
cu prezența unui singur izolat uropatogen chiar și la un nivel redus cantitativ. Cu toate acestea,
interpretarea rezultatelor culturii trebuie făcută cu grijă, luând în considerare factori precum vârsta
și condițiile de păstrare a probei, nivelul de contaminare indicat de prezența celulelor epiteliale
scuamoase și sensibilitatea metodei.
Creșterile de <105 UFC/mL la femeile asimptomatice, care nu sunt însărcinate, sunt rareori
persistente și reprezintă de obicei contaminare.
Urocultura nu este indicată în cazurile de cistită acută la femei peste 15 ani care nu au alți
factori de risc sau comorbidități. Urocultura trebuie indicată în:
- suspiciunea de pielonefrită acută
- în cazul în care simptomele de cistită persistă sau reapar în decurs de o lună de la tratament
- la gravide.

Sarcina
Bacteriuria asimptomatică (colonizarea persistentă a tractului urinar fără simptome
urinare) poate să apară la cca. 4% dintre gravide.
La gravide ITU sunt mai frecvente comparativ cu femeile în afara sarcinii. Se consideră că
20–40% dintre femeile însărcinate cu bacteriurie netratată vor dezvolta pielonefrită. Cu excepția
cazului în care ITU este detectată și tratată devreme, există un risc crescut de naștere prematură și
pielonefrită care poate afecta atât mama cât și fătul. La aproximativ 30% dintre paciente
pielonefrita acută apare în special la momentul nașterii. Se consideră că 20–40% dintre femeile
însărcinate cu bacteriurie netratată vor dezvolta pielonefrită.

Bărbați
Infecțiile urinare la bărbații adulți sunt complicate și de cele mai multe ori sunt legate de
anomalii ale tractului urinar. O incidență scăzută de ITU există și la bărbații tineri sănătoși.
165
Persoanele în vârstă
Incidența ITU crește odată cu vârsta pentru ambele sexe și este una dintre cele mai
frecvente infecții asociate cu această grupă de vârstă. De asemenea, se estimează că 10% dintre
bărbați și 20% dintre femeile cu vârsta peste 80 de ani au bacteriurie asimptomatică. Nu este indicat
niciun tratament pentru pacienții asimptomatici, cu excepția situațiilor care preced procedurile
invazive genito-urinare.

Diabet
Femeile cu diabet au o incidență mai mare a bacteriuriei asimptomatice decât cele fără
diabet. Nu există nicio diferență în prevalența bacteriuriei între bărbații cu diabet și bărbații fără
diabet.

Boli neurologice
Pacienții cu tulburări neurologice ale vezicii urinare congenitale sau dobândite (spina
bifida, leziuni ale măduvei spinării) prezintă un risc crescut de ITU și poate fi o cauză semnificativă
de deces.

Transplantul renal
Majoritatea infecțiilor apar la scurt timp după transplant, de obicei ca rezultat al
cateterizării, prezența unui tub de drenaj ureteral sau a unei UTI anterioare în timpul dializei. Mai
puțin frecvent, infecția poate fi introdusă prin rinichiul donatorului.

Imunosupresia
În general, incidența ITU nu este mai mare la pacienții imunocompromiși.

Cateterizare
Infecțiile tractului urinar dobândite prin cateter reprezintă una dintre cele mai frecvente
infecții asociate îngrijirilor medicale. Cu toate acestea, probele de la pacienții cu catetere pot fi
contaminate și nu reflectă cu precizie adevăratul agent patogen al vezicii urinare și conține adesea
mai multe specii bacteriene. Rezultatele culturii trebuie interpretate cu prudență. Uroculturile pot
să nu reflecte prezența bacteriilor la nivelul vezicii urinare, deoarece organismele izolate din urină
pot fi din biofilme de pe suprafața interioară a cateterului.
Prezența leucocitelor în urină la pacienții cateterizați este constantă și nu are obligatoriu
semnificație de infecție urinară.

166
IV. Recoltarea și transportul probelor

Urina recoltată prin jet mijlociu

Pacienții sunt instruiți să recolteze singuri. Proba de urină va fi recoltată la cel puțin 4 ore
de la micțiunea anterioară. După o spălare atentă a mâinilor și a organelor genitale externe și
meatului uretral, cu o singură mișcare din față spre spate:
- Se elimină primul jet (o cantitate de cca 20 ml de urină), apoi se recoltează următorii 10 ml
într-un recipient steril, având grijă să nu se atingă marginea superioară a flaconului;
- Recipientul este apoi închis etanș, suprafața exterioară este curățată și se spală mâinile
- Se etichetează recipientul cu datele de identificare a pacientului.

Urina recoltată prin cateter ”in situ”

Se recomandă evitarea recoltării prin cateter ”in situ”, se preferă recoltarea prin cateterul
nou introdus. Această probă este reprezentativă pentru bacteriile prezente în vezica urinară și nu
pentru bacteriile care au aderat, eventual, la peretele intern al cateterului.
Când există motive obiective care împiedică schimbarea cateterului se va recolta proba de
urină prin portul cateterului destinate recoltării sau în lipsa acestuia prin puncționarea cateterului.
Se va dezinfecta o porțiune de cateter și se va puncționa direct cateterul. Cu toate acestea, acest tip
de probă nu este reprezentativă pentru speciile bacteriene din vezica urinară, așa cum este aspiratul
suprapubian, tehnica gold-standard de recoltare pentru pacienții cateterizați.
Nu se va lua niciodată urină din punga de colectare, unde există o multiplicare microbiană
considerabilă. Nu se decuplează cateterul de la punga de colectare în vederea recoltării.

Urina recoltată la sugari și copiii mici

Recoltarea urinii din jet mijlociu după dezinfecția atentă a organelor genitale externe este
cea mai bună metodă non-invazivă la copiii care urinează voluntar. Poate fi utilizată și la sugarii
care nu au încă controlul voluntar, deoarece, cu excepția situației în care sunt deshidratați, ei
urinează la fiecare 20-30 min.
Recoltarea cu ajutorul punguței sterile, deși este o metodă controversată, este cea mai
utilizată pentru copiii sub 2-3 ani. Acest dispozitiv de unică utilizare este plasat în poziție după o
atentă antiseptizare a organelor genitale externe. Ea nu trebuie lăsată pe poziție mai mult de 1 oră.
După depășirea acestui interval de timp, în cazul în care copilul nu a urinat, punguța este
îndepărtată și este înlocuită cu una nouă. După ce copilul a urinat, se îndepărtează punga iar urina
este transferată cu grijă într-un recipient steril care este trimis imediat la laborator. Pentru copiii
spitalizați, se poate face cateterizare sau puncție suprapubiană. Cateterizarea se face cu un cateter
flexibil, lubrifiat, cu diametru mic (cateterizare intermitentă ”in and out”). Primele picături de urină
obținute prin cateter se aruncă.

Recoltarea din urostomă

Stoma va fi curățată cu atenție, apoi se atașează o pungă sterilă. În continuare se va proceda
la fel ca la copii.

167
Recoltarea urinii la pacienții cu incontinență
La femei recoltarea urinii prin cateterizare intermitentă, cu un cateter cu diametru mic, este
acceptabilă numai atunci când nu este posibilă recoltarea în timpul micțiunii. Chiar și la femeile
incontinente cateterizarea nu este esențială, și poate fi acceptată și o probă recoltată după o toaletă
atentă a organelor genitale externe.
La bărbați ,pentru a evita apariția prostatitei post-cateterizare, se preferă recoltarea unei
probe printr-o pungă sterilă fixată pe penis sau chiar prin cateterizare supra-pubiană în caz de
retenție urinară.

Cantitatea adecvată și numărul adecvat de probe

La nou-născuți și sugari se recoltează un volum minim de 1 ml într-un recipient steril și
etanș. Un volum de maximum 10 ml este suficient la adulți.
În recipiente cu conservant de acid boric se completează până la linia marcată conform
instrucțiunilor producătorului.

Pentru Mycobacterium tuberculosis se recoltează trei probe consecutive, cantitatea totală a

primei urini de dimineața (dacă nu se poate reține cantitatea totală, este acceptabil jetul mijlociu,
însă această probă este de calitate inferioară).

Transportul și depozitarea probelor de urină

Probele trebuie transportate și procesate în decurs de 2 ore, dacă este posibil, cu excepția
cazului în care se folosește conservant acid boric. În acest caz se mărește timpul maxim permis
pentru transportul la laborator până la 48 h.
Dacă procesarea este întârziată până la 24 de ore, refrigerarea este esențială.
Trebuie remarcat faptul că acidul boric poate fi inhibitor pentru unele organisme și poate
inhiba reacția pentru esteraza leucocitară.
Întârzierile și depozitarea la temperatura camerei permit multiplicarea organismelor, care
generează rezultate care nu reflectă adevărata situație clinică.

V. Prelucrarea probelor de urină

Cultura bacteriană și citologia sunt indicate la persoane simptomatice din următoarele
categorii: copii și bărbați adulți tineri, pacienți cu diabet sau altă boală cronică, imunodeprimați,
sarcină, infecții urinare recurente, pacienți cu malformații ale tractului urinar, pentru investigarea
unei pielonefrite sau în caz de eșec terapeutic.
Următoarele informații, necesare pentru interpretarea rezultatului culturii și citologiei,
trebuie să fie prezente în cererea de analiză :
- vârsta, sexul,
- anomalii anatomice sau funcționale, afecțiuni neurologice, sarcina
- boala renală cronică a tractului urinar
- spitalizări sau intervenții chirurgicale recente
- terapie imunosupresivă, diabet
- tratament anterior cu antibiotic și cu ce antibiotic
168
- semne de pielonefrită: febră, frisoane, dureri lombare
- modul de recoltarea a probei de urină (jet mijlociu sau primul jet, sondă vezicală)
Investigarea de laborator a ITU implică în mod normal microscopie (sau o metodă
alternativă de măsurare a componentelor celulare) și cultura cantitativă cu screening biochimic.

Screening cu dipstick
Poate fi utilizat pentru screeningul persoanelor asimptomatice (de ex. gravide) sau pentru
diagnosticul cistitei acute necomplicate la femei.
Testul detectează prezența esterazei leucocitare și a nitriților. Un rezultat negativ nu
exclude diagnosticul de ITU la pacienți simptomatici.
De exemplu bacteriuria de nivel scăzut (103 – 104 UFC/ml) nu este evidențiată prin testul
nitriților. Reacția la nitriți nu este pozitivă în cazul Staphylococcus saprophyticus, Pseudomonas
spp., Candida spp., Enterococcus spp., Acinetobacter spp., care nu utilizează nitrații.
Nu se face screening cu strip la pacienții:
- cu vezică neurogenă (care au oricum leucociturie)
- cateterizați, care au uzual leucociturie și ITU cu microorganisme care nu utilizează nitrat
reductaza (Pseudomonas spp., Candida spp., Enterococcus spp., Acinetobacter spp.)
- tratați cu anumite medicamente care interferă cu testele de pe strip.

Examenul microscopic
Microscopia este utilizată pentru a identifica prezența de leucocite, eritrocite, celule
epiteliale scuamoase (CES), bacterii și alte componente celulare din urină.
Microscopia (sau examinarea automată a celulelor din urină) este recomandată pentru toate
grupurile de pacienți simptomatici, pentru a ajuta în interpretarea rezultatelor culturii și
diagnosticul ITU.
Urina conține normal < 1000 leucocite/ml.
Aprecierea leucocituriei se face pe camera de numărat! Este recomandată însă numărarea
automată.
La o probă atent recoltată, piuria semnificativă se corelează bine cu bacteriuria și cu
prezența simptomatologiei la majoritatea pacienților pentru a sugera un diagnostic de ITU.
Este definită piuria semnificativă ca mai mult 104 leucocite/ml, deși un număr mai mare de
leucocite există adesea la femeile sănătoase asimptomatice. Un nivel > 10 5 leucocite/ml a fost
sugerat ca fiind mai potrivit în discriminarea infecției.

Efectuarea frotiului Gram – din urina necentrifugată:

Oferă microbiologului o orientare rapidă asupra prezenței bacteriilor în urină, a tipului de
bacterie, prezența celulelor epiteliale (mai ales la femei este semn de recoltare defectuoasă);
prezența lactobacililor este semn de contaminare vaginală
Nu detectează bacterii sub 103 – 104 UFC/ml = sub 1 bacterie/câmp microscopic la
examinare cu imersie.

169
Cultivare
Există mai multe metode de cultură pentru cuantificarea bacteriilor în urină. Cea mai ușoară
și cea mai utilizată este tehnica ansei calibrate.

Metoda ansei calibrate

Amestecați ușor urina pentru a evita spumarea.
Scufundați capătul unei anse sterile calibrate (de exemplu, 1µL sau 10µL) în urină chiar
sub suprafața și îndepărtați-l vertical. Se verifică prezența peliculei de lichid în bucla ansei.
Utilizați ansa pentru a inocula placa cu mediu CLED sau agar cromogen și dispersați în
conformitate cu numărul de specimene. Se recomandă inocularea a maximum două eșantioane pe
placă cu diametrul de 9 cm.
Dacă se utilizează o ansă de 1µL, o colonie este egală cu 1000 UFC/mL, iar dacă se
folosește ansa de 10µL, o colonie este egală cu 100 UFC/mL.
Din probele de urină recoltate din jet mijlociu și cele care provin de la pacienți cu cateter
permanent se însămânțează o cantitate de 1 µL de urină.
Din probele recoltate prin cateter uretral intermitent (cateterizare în vederea recoltării),
cistoscopie, ureterostomă, pielostomă se va însămânța o cantitate de 10 µL. Pentru aceste probe
pragul de semnificație clinică este de ≥ 102 UFC/mL.
Aspiratele suprapubiene, alte probe obținute chirurgical și probele de urină cu bacteriurie
semnificativă de până la 103 UFC/ml necesită un inocul mai mare: 100 uL (0,1 mL). Pentru a
obține colonii izolate se dispersează inoculul cu o ansă sterilă pe întreaga suprafață a plăcii. Nu se
utilizează un tampon steril (va absorbi o mare parte din inocul). În acest caz numărul de germeni
va fi numărul de colonii pe placă x 10 UFC/mL.

Interpretarea culturii
Infecția urinară presupune prezența simptomelor; absența lor semnifică colonizare!
Se ține cont de:
- Circumstanțe epidemiologice (istoric, localizare, infecție de spital/comunitară)
- Factori de risc: cateter, instrumentație pe tract urinar
- Simptome urinare sau febră
- Tratament cu antibiotic curent sau în antecedente
- Nivelul leucocituriei
- Absența florei locale pe frotiul Gram
- Nivelul bacteriuriei și tipul de bacterie izolat
E. coli, S. saprophyticus, Salmonella – sunt semnificative la peste 103 UFC/ml.
S. agalactiae poate fi patogen urinar, mai ales la diabetici. Izolarea sa are semnificație la
femeia gravidă chiar și în cazul probelor contaminate, prezența acesteia se menționează deoarece
indică colonizare și impune aplicarea profilaxiei intrapartum în vederea prevenirii infecției
neonatale cu S. agalactiae;
Stafilococii coagulazo-negativi alții decât S. saprophyticus sunt mai degrabă contaminanți
sau colonizanți.

170
 Tabelul 1. Urocultura - medii de cultură și condiții de incubare
Entităţi clinice Medii de cultură Condiţii de incubare Citirea Microorganisme
standard culturii ţintă
T oC Atmo- Timp
sferă

Agar CLED sau 35–37 Aerob 16–24 >16 ore Enterobacterales

ITU agar cromogen ore
+/- agar sânge Enterococi
Screening în sarcină pt
bacteriurie streptococi Group
asimptomatică (prin B Lancefield
cultură)
Pseudomonade

S. saprophyticus

alți stafilococi
coagulază-negativ

S. aureus

Urina pacienților Agar CLED sau 35–37 Aerob 40-48 >16 ore Enterobacterales
din terapie intensivă, agar cromogen ore
Acinetobacter
Unități de îngrijire spp.
specială pentru copii,
Unități de arși Pseudomonas
Unități de transplant aeruginosa
sau dacă au fost văzuți În plus
fungi la examenul Agar Sabouraud
microscopic Fungi

Agar anaerobi 35–37 anaerob 40-48 ≥40 ore Anaerobi

Piurie sterilă (doar în cazul ore
probelor recoltate Streptococi
prin puncție)
suprapubiană)

Agar chocolat 35–37 5-10% 40-48 ≥40 ore Pretențioși

CO2 ore

171
 Izolarea streptococilor alfa-hemolitici, corynebacterii altele decât C. urealyticum și C.
seminale, stafilococi coagulazo-negativ – pot fi considerati patogeni doar dacă sunt izolați din
proba recoltată prin puncție suprapubiană sau confirmați prin izolare din a doua probă care să nu
fie contaminată cu flora locală.
De asemenea, este necesară creșterea dimensiunilor inoculului la pacienții cu simptome
persistente fără bacteriurie, dacă pacientul are „piurie sterilă” recurentă sau pentru probe la care
sunt de așteptat un număr mai mic, cum ar fi aspiratul suprapubian sau alte probe de urină obținute
chirurgical.

Infecții comunitare:
- La pacienții fără cateter o leucociturie de ≥ 104 leucocite/ml se consideră semnificativă, frecvent
asociată cu hematuria ≥ 104 hematii/ml.
- Leucocituria poate fi absentă în primele ore de la debutul infecției sau la pacienți neutropenici.
- Leucocituria nu are semnificație la pacienți cateterizați sau la cei cu vezică neurogenă.
- Infecțiile comunitare sunt foarte rar polimicrobiene.
- Prezenta lactobacililor la femei semnifică contaminarea probei.
- Cultura negativă în prezența simptomelor și a bacteriilor pe frotiu Gram semnifică fie tratament
cu antibiotic fie microorganism care se cultivă greu (Corynebacterium urealyticum, Haemophilus,
Candida, E. coli dependent de CO2).

Infecțiile de spital
Interpretarea se face în funcție de următoarele criterii:
- Febră, urinare imperioasă, durere suprapubiană,
- Pacient în vârstă cu deteriorarea stării mentale sau dependenței, apariția sau agravarea
incontinenței fără altă cauză,
- Leucociturie ≥104/ml și bacteriurie ≥103 UFC/ml cu cel mult 2 feluri de microorganisme
la pacient fără cateter urinar sau altă abordare a tractului urinar,
- Bacteriurie ≥105 UFC/ml cu cel mult 2 microorganisme diferite la pacient cu cateter urinar
sau altă abordare a tractului urinar cu până la 7 zile înainte de recoltare.

172
 Tabelul 2 – Interpretarea infecțiilor comunitare și infecțiilor asociate asistenței medicale la
pacienți fără cateter
Semne Leucoci- Bacteriurie Număr Comentarii Efectuarea
clinice turie (UFC/ml) de specii antibiogramei
≥ 104 /ml

+ + ≥103 E. coli sau S. ≤ 2 Infecție urinară (cistita Da

saprophyticus acuta)
≥ 105 alte specii Bacteriurie ≥ 104 UFC/ml
pentru pielonefrita acută

+ + < 103 Inflamație fără bacteriurie. N/A

Sub tratament cu
antibiotic.
Investigare pentru bacterii
cu creștere lentă sau
pretențioși nutritiv.
Etiologie non-infecțioasă.

+ - ≥ 105 ≤2 a.pacient Nu
imunocompetent: se repeta
ex citologic si
bacteriologic al urinii
(posibil infecție la debut) Da
b.pacient imunodeprimat
(chimioterapie, transplant)

- Variabil 103 - 104 ≥1 Probabil contaminare la Nu

recoltare

- Variabil > 105 ≥2 Colonizare Nu

variabil - < 103 Nu este infecție sau N/A

colonizare

173
 Tabelul 3 – Interpretare în cazul infecțiilor asociate asistenței medicale la pacienți fără
cateter
Semne Leucociturie Bacteriurie Comentarii Efectuarea
clinice ≥ 104 /ml (UFC/ml), număr antibiogramei
de specii
bacteriene ≤ 2

+ + ≥103 Infecție urinară Da

< 103 Inflamație fără bacteriurie. N/A

Sub tratament cu antibiotic.
Investigare pentru bacterii cu
creștere lentă sau pretențioși
nutritiv.
Etiologie non-infecțioasă.

- Variabil ≥103 Colonizare Nu

<103 Nu este infecție urinară N/A

+ - ≥105 a. pacient imunocompetent: se Nu

repeta examenul citologic si
bacteriologic al urinii (posibil
infecție la debut)
b. pacient imunodeprimat
(chimioterapie, transplant)
Da

174
 Tabelul 4 – Interpretarea infecțiilor urinare la pacienții cu cateter
Semne Leucociturie Bacteriurie ≤ 2 Comentarii Efectuarea
clinice ≥ 104 /mL microrganisme antibiogramei
diferite

+ Fără ≥ 105 UFC/ml Infecție urinară Da

semnificație

< 105 UFC/ml Inflamație fără Nu

bacteriurie.
Sub tratament cu
antibiotic.
Microorganisme cu
crestere lentă sau
pretențioase nutritiv.
Etiologie non-infecțioasă.

- Fără ≥ 103 UFC/ml Colonizare Nu

semnificație

< 103 UFC/ml Nu este infecție urinară NA

sau colonizare

175
 Tabelul 5 – Interpretarea pentru urina recoltată prin cateter ureteral, pielostomă,
ureterostomă, cistoscopie sau aspirație suprapubiană.
Tehnica de Simptome Leucociturie Bacteriurie Număr specii Efectuarea
recoltare (> 104/ml) (UFC/ml) bacteriene antibiogramei

Cateter uretral < 102 Nu

intermitent
+ sau - + sau - 1 sau 2
Cistoscopie,
ureterostomă,
pielostomă Da
≥ 102

Aspirație + sau - + sau - ≥ 10 1 (sau 2) Da

suprapubiană

Nivelul de identificare al izolatelor urinare

Tabelul 6. Nivelul de identificare al izolatelor urinare
Anaerobi “anaerobi”

Streptococi beta-hemolitici Grup Lancefield

Enterobacterales Nivel de specie

Enterococi Nivel de specie
Pseudomonas Nivel de specie “aeruginosa”, “non-
aeruginosa”

Stafilococi coagulazo-negativi “coagulazo-negativ”

Staphylococcus saprophyticus
Staphylococcus aureus Nivel de specie
Salmonella Typhi / Paratyphi (screening Nivel de specie (atentie manipularea culturilor
pentru febră tifoidă) se face în hota de siguranță nivel 3)
Fungi Nivel de specie

176
Testarea sensibilității la antimicrobiene
Se testează sensibilitatea izolatelor semnificative conform ghidului EUCAST.

VI. Raportarea rezultatelor

Examenul microscopic
Se raportează numărul sau tipul de leucocite și hematii pe ml.
Se raportează prezența bacteriilor, celulelor epiteliale, cilindrilor, drojdiilor și Trichomonas
vaginalis.
Se raportează suplimentar, la solicitare, eritrocitele dismorfice.
Toate rezultatele trebuie să fie comunicate clinicianului solicitant de îndată ce sunt
disponibile. Rezultatele urgente trebuie să fie transmise telefonic sau electronic în conformitate cu
politicile locale.

Cultura
Se raportează creșterea bacteriană în unități formatoare de colonii (UFC).
Se includ comentarii acolo unde este cazul.
Se raportează absența creșterii cu precizarea pragului de detecție.
Se raportează creșterea fără semnificație.
Se raportează rezultatele investigațiilor suplimentare.

Eliberarea rezultatelor
Rezultatele intermediare sau preliminare trebuie emise imediat, dacă au semnificație pentru decizia
terapeutică.
Rezultatele urgente trebuie să fie transmise telefonic sau electronic.
Rapoartele finale scrise trebuie să urmeze rezultatelor preliminare și verbale și se transmit cât mai
curând posibil.

VII. Bibliografie
Bonkat G, Bartoletti R, Bruyer F et al: European Association of Urology guidelines on
urological infections. 2021.
Buiuc D: Diagnosticul de laborator al infecțiilor tractusului urinar. In Buiuc D, Neguț M:
Tratat de microbiologie clinică. Ediția a III-a, Editura Medicală, 2017:255-277.
Cavallo JD, Tenke P: Urinary tract infections. In European Manual of Clinical
Microbiology, editors Cornaglia G, Courcol R, Herrmann JL, Kahlmeter G, Publisher SFM,
2012:153-133-143.
Public Health England. (2019). Investigation of urine. UK Standards for Microbiology
Investigations. B 41 Issue 8.7.

177
 Diagnosticul microbiologic al infecțiilor
intraabdominale

I. Introducere
Infecțiile intraabdominale reprezintă o patologie frecventă asociată cu o rată de mortalitate
importantă care necesită stabilirea diagnosticului fără întârziere, intervenții prompte pentru
controlul sursei și antibioterapie adecvată.
Infecțiile intraabdominale cuprind diverse tipuri de infecții întâlnite în practica clinică și
pot fi clasificate după mai multe criterii: comunitare sau asociate asistenței medicale, complicate
sau necomplicate.
Infecțiile necomplicate se referă la acelea care implică un singur organ și nu se extind la
peritoneu. Cele complicate se extind la mai multe organe și în cavitatea peritoneală.
În cazul infecțiilor comunitare pacientul se prezintă cu simptomatologia caracteristică sau
aceasta se dezvoltă în primele 48 de ore de la internare și nu sunt prezente criteriile unei infecții
asociate asistenței medicale.
Microorganismele implicate în infecțiile intraabdominale sunt variate, depinzând de sursa
infecției și de eventualele contacte ale pacientului cu mediul de spital.
Infecțiile comunitare sunt de obicei mixte, cu participarea mai multor germeni enterici, cu
predominanța tulpinilor de Escherichia coli, urmat de alți germeni din ordinul Enterobacterales
(de ex. Klebsiella pneumoniae) sau bacili Gram-negativi nefermentativi (Pseudomonas
aeruginosa). Streptococii din grupul anginosus se întâlnesc de asemenea frecvent. Mai puțin
obișnuită în infecțiile comunitare este prezența enterococilor. Dintre bacteriile strict anaerobe
predomină grupul Bacteroides fragilis. Spectrul etiologic al acestor infecții nu s-a schimbat
semnificativ în ultimii ani, însă se observă o creștere a procentului tulpinilor de enterobacterii
producătoare de 𝛽-lactamaze cu spectru extins.
În cazul infecțiilor asociate asistenței medicale există o varietate mai mare a speciilor
bacteriene implicate. Enterobacteriile predomină și la aceste infecții, însă ponderea tulpinilor de
E. coli este mai redusă, crește incidența altor specii de enterobacterii (de ex. Enterobacter spp,
Serratia spp) și a P. aeruginosa, Acinetobacter spp. Streptococii de grup viridans se izolează mai
rar, în schimb crește ponderea enterococilor. Deși întâlniți rar, pot fi de asemenea izolați
stafilococii coagulazo-negativi sau Staphylococcus aureus. Speciile de Candida pot fi implicate
mai ales la pacienții tratați în antecedente cu antibiotice cu spectru larg.
Germenii implicați în infecțiile asociate asistenței medicale de multe ori sunt cu rezistență
multiplă față de antibiotice, în special în cazul pacienților care au beneficiat de multiple terapii
antibiotice în antecedente.
Infecțiile comunitare la pacienții cu risc scăzut pentru eșec terapeutic sau deces se tratează
empiric cu succes în majoritatea cazurilor, de aceea examenul microbiologic nu este recomandat
de rutină. La aceste infecții eventualul eșec terapeutic se datorează implicării unei enterobacterii
producătoare de ESBL. Documentarea creșterii incidenței acestor izolate în acest context clinic ar
fi un argument pentru stabilirea indicației efectuării examenului microbiologic de rutină. Unde
există resurse suficiente, se recomandă efectuarea examenului microbiologic în scop
epidemiologic, pentru evaluarea circulației enterobacteriilor cu fenotip rezistent în infecții
comunitare la pacienții cu risc scăzut într-o zonă geografică dată.

178
 Examenul microbiologic este recomandat de rutină în cazul infecțiilor intraabdominale
comunitare la pacienții cu risc crescut, respectiv la cele asociate asistenței medicale. Deoarece
probabilitatea implicării unui germen rezistent este mai mare în cazul acestor infecții, tratamentul
antibiotic cu spectru larg inițiat empiric va putea fi ajustat conform rezultatului examenului
microbiologic.

II. Recoltarea și transportul probelor

Sunt valoroase pentru examenul microbiologic probele de lichid peritoneal/bilă/puroi
aspirate, o cantitate de minim 1 ml. Acestea se transferă într-un recipient steril cu închidere etanșă
și se transportă cât mai repede la laborator (în maxim 2 ore) în vederea păstrării viabilității
germenilor strict anaerobi.
Probele recoltate pe tampon trebuie evitate deoarece au calitate inferioară probelor aspirate.
Nu sunt acceptabile probele de puroi recoltate prin tub de dren deschis sau capătul de tub
de dren. Sunt acceptabile probele de puroi recoltate prin aspirare dintr-un sistem de drenaj închis.

III. Prelucrarea microbiologică

Examenul microscopic
Dacă lichidul peritoneal este limpede, se centrifughează și frotiul se efectuează din
sediment. Din probele purulente și din bilă se efectuează un frotiu direct subțire din proba
necentrifugată.
Frotiul se colorează Gram. Se urmărește prezența leucocitelor și a bacteriilor.
În cazul bilei se urmărește și prezența paraziților.

Cultivare
Se depun 2-3 picături de produs (din puroi, bilă sau sedimentul lichidului centrifugat) și se
diseminează cu ansa. Se însămânțează o probă pe placă în cazul probelor de puroi, cel mult două
probe pe placă în cazul sedimentului lichidului centrifugat.

Testarea sensibilității față de antibiotice

Se efectuează conform standardului EUCAST în vigoare.

179
 Tabelul 1. Prelucrarea probelor în infecții intraabdominale
Produs Medii de Condiţii de incubare Citirea Microorganisme
prelucrat, cultură culturii ţintă
situații standard
Temperatură Atmosferă Timp
particular o
C h

Puroi/lichid Agar sânge 35-37 5% CO2 48 Zilnic Orice

peritoneal/bilă + microorganism
recoltate CLED/ 35-37 Aerobă 48 Zilnic
intraoperator MacConkey
sau prin + 35-37 Anaerobă 40-48 ≥40 Strict anaerobe
puncție- Agar pentru
aspirare anaerobi

Bulion 35-37 Aerob 5 zile NA

tioglicolat 35-37 Aerob/ 40-48 >40 Orice germeni
Dacă mediul Anaerob
devine tulbure se
fac treceri pe
medii solide
(agar sânge, agar
pentru anaerobi)

Pentru următoarele situații se adaugă:

Prezența Agar Sabouraud 28-30 Aerobă 14 z Zilnic Fungi

levurilor în cu cloramfenicol
frotiu

Bilă - Bulion selenit 35-37 Aerobă 16-24 NA Salmonella

depistare Subculturi pe 35-37 Aerobă 16-24 >16
portaj/infecție mediul SS sau
Salmonella XLD

IV. Raportarea rezultatelor

Examenul microscopic:
Se descrie prezența leucocitelor și bacteriilor vizualizate. Rezultatul examenului
microscopic se introduce în fișa electronică și se validează imediat ce este disponibil.

180
Rezultatul cultivării:
Se va menționa:
- Microorganismul semnificativ + cuantificare
- Alte creșteri
- Absența creșterii

Eliberarea rezultatelor
Se eliberează rezultate parțiale în cazul în care se izolează germeni semnificativi.
Rezultatele urgente se comunică și telefonic. Raportul final se eliberează când se finalizează toate
testările .

V. Bibliografie
Mazuski JE, Tessier JM, May AK et al: The Surgical Infection Society revised guidelines
on the management of intraabdominal infections
Public Health England. (2018). Investigation of bile. UK Standards for Microbiology
Investigations. B 15 Issue 7.

181
 Diagnosticul microbiologic al infecțiilor
osteoarticulare

I. Introducere
Acest ghid descrie investigarea microbiologică a infecțiilor osului și a țesuturilor moi
asociate cu osteomielită, a biopsiilor și aspiratelor recoltate pentru investigarea infecțiilor
articulare protetice.
Infecțiile osteo-articulare reprezintă o problemă importantă care necesită abordare
multidisciplinară ce include chirurg ortoped, medic infecționist și microbiolog.
Infecțiile osului sunt definite ca fiind acute și cronice. Managementul celor două tipuri de
infecții diferă. În mod similar este diferită și abordarea infecțiilor cu sau fără dispozitiv ortopedic
(proteză, implant, material de osteosinteză).
Osteomielita este o infecție progresivă care are ca rezultat inflamația oaselor și provoacă
distrugerea oaselor, necroză și deformare. La copii localizarea cea mai frecventă a infecției este la
epifizele în creștere ale oaselor lungi, în timp ce la adulți este coloana vertebrală.
Factorii de risc pentru osteomielita la adult (hematogenă) includ anemia falciformă,
deficiențe imune și consum de droguri intravenoase.
Microorganismele izolate cel mai frecvent din infecțiile acute sunt:
- Staphylococcus aureus
- streptococi beta-hemolitici (grup A, C, G)
- streptococi grup B
- Haemophilus influenzae,
- Escherichia coli, Salmonella, alți bacili Gram-negativi din ordinul Enterobacterales, Kingella
kingae. Bacilii Gram-negativi au o importanță clinică majoră datorită fenomenului de
rezistență microbiană.
- micobacterii
- fungi.
În infecțiile cronice diagnosticul microbiologic este mai dificil din următoarele motive:
- poate fi implicată orice specie bacteriană care aparține florei comensale tegumentare
(stafilococi coagulazo-negativi, Cutibacterium acnes)
- prezența biofilmului – polizaharidul secretat de bacterie favorizează aderența bacteriilor la
dispozitivul ortopedic
- prezența așa numitelor ”variante cu colonii mici”
- posibile infecții cu fungi sau micobacterii
- distribuția neomogenă a bacteriilor la locul infecției – necesită recoltare din mai multe puncte
cu țesut afectat.

Diagnosticul infecțiilor protetice este complex și include criterii clinice, biologice,

microbiologice, histopatologice și imagistice.
Infecțiile întârziate sau de grad scăzut sunt cel mai dificil de diagnosticat, în același timp
întârzierea intervenției prin tratament antibiotic corect și abordarea chirurgicală influențează șansa
salvării protezei și a funcțiilor articulației.

182
Tabelul 1. Clasificarea și caracteristicile infecțiilor protetice
Clasificarea infecțiilor Caracteristici
protetice
În funcție de patogeneză
Perioperatorii Inocularea microorganismului în plagă chirurgicală în timpul
operației sau imediat după
Hematogene Prin sânge sau limfă de la un focar distal
Prin contiguitate Transmisă prin traumatism penetrant sau focar adiacent de
infecție (ex osteomielita preexistentă, leziuni ale pielii si
țesuturilor moi)
În funcție de apariția simptomelor după implantare
Precoce (< 3 luni) Dobândită în timpul actului operator sau în următoarele 2-4
zile – de obicei cu organisme înalt virulente: Staphylococcus
aureus, bacili Gram-negativi
Întârziată sau grad scăzut (3-24 Dobândită în timpul intervenției dar cu organisme cu
luni) virulență scăzută: stafilococi coagulazo-negativi,
Cutibacterium acnes
Tardivă (> 24 luni) Predominant prin însămânțare hematogenă de la un focar la
distanță

Osteomielita acută prin inoculare directă sau de vecinătate - microorganismele pot fi

inoculate în momentul traumatismului sau în timpul procedurilor intraoperatorii sau perioperatorii.
Alternativ, ele se pot extinde de la un focar adiacent din țesutul moale. Factorii predispozanți sunt
reprezentați de: reducerea chirurgicală și fixarea fracturilor, dispozitivele protetice, fracturi
deschise și infecții cronice ale țesuturilor moi.
Osteomielita cu focar în vecinătate fără insuficiență vasculară
Plăgi localizate ale piciorului prin intermediul încălțămintei, cum ar fi pantofii de
antrenament, se asociază în mod particular cu osteomielita cu Pseudomonas aeruginosa.
Osteomielita în urma mușcăturilor umane și a infecțiilor mușchilor masticatori care
interesează mandibula este cauzată de anaerobi stricți, de exemplu specii Actinomyces.
La copii infecțiile osoase și articulare cu germeni anaerobi sunt rare.
Osteomielita cu focar în vecinătate cu insuficiență vasculară
Majoritatea pacienților cu osteomielită focalizată contiguă asociată cu insuficiența
vasculară au diabet zaharat. Cel mai adesea sunt afectate oasele și articulațiile picioarelor.
Infecțiile acute la pacienții care nu au primit recent antimicrobiene sunt de obicei
monomicrobiene (cel mai frecvent cu coci Gram-pozitivi aerobi precum S. aureus și streptococi
β-hemolitici), în timp ce infecțiile cronice sunt adesea polimicrobiene cu cca 3-5 izolate, incluzând
aerobii Gram-pozitivi și Gram-negativi (enterococi, bacili Gram-negativi din ordinul
Enterobacterales, Pseudomonas aeruginosa și alți bacili Gram-negativi nefermentativi) și
anaerobi.
Spitalizarea, procedurile chirurgicale și, în special, antibioterapia prelungită sau cu spectru
larg poate predispune la colonizare și/sau infecție cu organisme rezistente la antibiotice (de
exemplu Staphylococcus aureus rezistent la meticilină (MRSA) sau enterococi rezistenți la
vancomicină (VRE). Deficiența de apărare în țesutul moale sau în jurul osului necrotic poate

183
permite colonizarea cu microorganisme cu virulență scăzută, cum ar fi stafilococi coagulazo-
negativi și specii de Corynebacterium („difterimorfi”).
La gazda imunocompromisă sau diabetică, ar trebui luate în considerare și speciile de
Nocardia ca o cauză rară de osteomielită.
Osteomielita acută hematogenă
Osteomielita hematogenă a fost descrisă în mod clasic în copilărie, dar poate apare la orice
grup de vârstă, mai ales atunci când există factori de risc, cum ar fi un dispozitiv intravascular
recent, hemodializă, consum de droguri intravenoase sau infecții recurente cu alte localizări (cum
ar fi infecții ale tractului urinar). La adulți cel mai des afectate sunt vertebrele, dar pot fi de
asemenea afectate și oasele lungi, pelvisul sau clavicula.
Microorganismul cel mai des izolat este S. aureus; mai pot fi izolați streptococi β-
hemolitici și microorganisme din grupul HACEK.
Speciile bacteriene izolate în osteomielita hematogenă variază în funcție de vârsta
pacientului. La nou-născuți cel mai frecvent implicați sunt streptococii beta-hemolitici din grupul
B, S. aureus și Escherichia coli. În intervalul de vârstă între unu și șaisprezece ani predomină S.
aureus și Haemophilus influenzae tip b (deși acesta din urmă este rar după vârsta de cinci ani și
din ce în ce mai rar la copii sub cinci ani din cauza vaccinării). Streptococcus pneumoniae este
implicat ocazional. La adulți S. aureus este cel mai comun microorganism, iar la vârstnici bacilii
aerobi Gram-negativi.
Speciile de Candida pot fi izolate la pacienți cu dispozitive intravenoase.
În osteomielita acută hematogenă este izolat de obicei un singur microorganism patogen,
dar în osteomielita cronică, în special atunci când este asociată cu răni și ulcerații, etiologia poate
fi polimicrobiană.
Speciile de Salmonella cauzează rar osteomielită la pacienții imunocompetenți; de obicei
infecțiile cu specii de Salmonella (frecvent serotipuri non-typhi) sunt asociate cu anemie
falciformă, alte hemoglobinopatii sau la pacienți imunocompromiși. Salmonella afectează obișnuit
diafiza oaselor lungi (de obicei femurul sau humerusul) și vertebrele.
Spondilodiscita
Termenul de spondilodiscită se referă la osteomielită cu evoluție verticală, discită și
spondilită.
Acestea sunt manifestări ale osteomielitei hematogene, care pot rezulta în cadrul aceluiași
proces patologic și pot apărea în același timp. Spondilodiscita este responsabilă pentru 3-5% din
toate cazurile de osteomielită și este principala cauză a osteomielitei la pacienții cu vârsta peste 50
de ani.
Organisme care determină infecții ale vertebrelor sunt: S. aureus, streptococii și bacili
aerobi Gram-negativi (asociați cu infecții ale tractului urinar).
Pacienții dializați
La acești pacienți pot apărea infecții hematogene ca urmare a utilizării dispozitivelor de
acces intravascular. De obicei sunt implicați: S. aureus sau stafilococi coagulazo-negativi.
Infecțiile cu bacterii Gram-negative sunt mai frecvente la pacienții cu hemodializă decât la
populația generală.
Consumatorii de droguri intravenoase
Artrita septică și osteomielita oaselor lungi sau a discurilor vertebrale sunt asociate cu
infecție hematogenă la consumatorii de droguri intravenoase. Microorganismele cel mai frecvent
izolate sunt S. aureus, P. aeruginosa și speciile de Candida.

184
 Osteomielita cronică
Pacienții prezintă de obicei dureri cronice, secreții și pot avea antecedente de osteomielită
în același loc. Tratamentul infecției poate fi dificil deoarece țesutul și osul din jur sunt afectate ;
tratamentul singur cu antibiotice de obicei nu este suficient pentru a rezolva infecția. Factorii de
risc includ fracturi deschise, bacteriemie și ulcere ischemice asociate cu diabetul zaharat, anemia
falciformă și malnutriția.
Microorganismele frecvent implicate în etiologia osteomielitei cronice includ S. aureus,
bacili Gram-negativi și bacterii anaerobe.
Osteomielita asociată cu dispozitive ortopedice
În infecțiile cronice legate de implant ortopedic, organismele pot fi prezente într-un biofilm
asociat cu dispozitivul sau osul bolnav/necrotic.
Organismele pot fi introduse în articulație fie în timpul intervenției chirurgicale de
implantare primară, fie pe cale hematogenă sau de la contaminarea postoperatorie a plăgii.
Acestea pot provoca infecții acute sau cronice.
Staphylococcus aureus (sensibil sau rezistent la meticilină) determină cel mai frecvent
infecții acute, iar în infecțiile cronice pot fi izolați fie S. aureus, fie stafilococi coagulazo-negativi.
Se estimează că până la 30% din infecțiile cu S. aureus pot fi asociate cu artrita septică la cei cu
proteze articulare pre-existente. Multe alte microorganisme pot fi implicate fie prin inoculare
directă, fie pe cale hematogenă, inclusiv flora normală a tegumentelor, streptococi, coliformi,
enterococi și mai rar anaerobi, micobacterii sau fungi.
Odată ce infecția începe să se dezvolte în jurul unei proteze articulare, microorganismele
pot forma biofilm.
În diagnosticul microbiologic al infecției, prezența biofilmului îngreunează izolarea
bacteriilor în cultură. Microorganismele pot rezista în cadrul biofilmului, ele sunt la adăpost de
acțiunea antibioticelor, astfel încât infecția nu poate fi eradicată fără îndepărtarea protezei.
Osteomielita acută hematogenă poate duce la osteomielita cronică caracterizată de apariția
zonelor moarte ale țesutului osos și sinusal în care antibioticele nu pătrund. Din acest motiv infecția
nu răspunde la tratament și persistă perioade lungi de timp. De asemenea pot reapărea infecții după
mulți ani după primul episod.
Abcesul lui Brodie
Abcesul lui Brodie este o afecțiune neobișnuită, este un abces cronic localizat al osului, cel
mai frecvent în partea distală a tibiei. De obicei se datorează S. aureus și apare în general la
pacienții cu vârsta sub 25 de ani. Debridarea chirurgicală și antibioterapia specifică orientată în
funcție de antibiogramă sunt de obicei eficiente în rezolvarea infecției.
Osteomielita fungică
Osteomielita fungică este rară, cu toate acestea, unele ciuperci endemice pentru anumite
zone pot fi asociate cu osteomielita: Cryptococcus, Blastomyces și Sporothrix. La pacienții
imunocompromiși sau la cei cu intervenții chirurgicale multiple în antecedente speciile de Candida
sau de Aspergillus pot provoca, de asemenea, osteomielită.

185
II. Recoltarea și transportul probelor

Tipurile de probe
Este important să fie obținute informații clinice detaliate precum prezența unei proteze sau
a unui dispozitiv (în cazul în care orice organism poate fi patogen, de exemplu un stafilococ
coagulazo-negativ). De asemenea, sunt necesare informații despre suspiciune sau factori de risc
pentru tuberculoză, brucelă, nocardie, micobacterii atipice sau ciuperci.

1. Biopsii osoase percutanate obținute sub ghidaj imagistic – atunci când nu se poate face
puncție – aspirație în lipsa unei colecții lichidiene sau în cazul infecțiilor vertebrale.
2. Biopsii osoase intraoperatorii – sunt recoltate fie ca o procedură de diagnostic, fie ca
prima parte a unei proceduri mai mari de debridare / rezecție. Probele multiple (minim 5) trebuie
luate din locuri diferite folosind instrumente sterile separate (schimbate) pentru fiecare probă
recoltată. În plus față de probele de os, se prelevează în același timp probe de țesut moale.
3. Lichid de puncție articulară - se recoltează aseptic, ideal sub control radiologic sau
intraoperator. Ideală este recoltarea în tub heparinat sau citratat pentru a preveni coagularea probei
și a permite efectuarea unei examinări citologice de calitate.
În infecțiile acute este utilă efectuarea unei colorații Gram din produsul biologic, deși un
rezultat negativ nu ar trebui să excludă diagnosticul de infecție bacteriană. În infecțiile cronice
sensibilitatea examinării frotiului Gram este <10%, dar specificitatea este mare.
În toate situațiile în care la un pacient cu proteză se detectează valori anormale de PCR și
VSH, este utilă citologia lichidului sinovial cu determinarea numărului de leucocite și a
procentului de neutrofile.
4. Implanturi ortopedice – se trimit piesele prelevate intraoperator, la laborator produsul de
însămânțat se obține prin sonicare. Probele destinate sonicării se însoțesc de probe bioptice
periprotetice.
5. Biopsie periprotetică - se recoltează în infecția cronică a protezei, intraoperator. Se
recoltează minim 5 probe, din diferite locuri, în special din zonele cu aspect modificat. Pentru
fiecare probă se schimbă instrumentul de recoltare pentru a preveni contaminarea de la o probă la
alta. Se numerotează probele și se descrie pentru fiecare locul de prelevare.
6. Proteze, dispozitive de fixare – se trimit piesele, la laborator produsul de însămânțat se
obține prin sonicare. Probele destinate sonicării se însoțesc de probe bioptice periprotetice.
7. Hemocultura

Criteriile diagnostice ale unei infecții periprotetice sau perifractură includ izolarea
aceleeași bacterii din cel puțin 2 fragmente bioptice și lichidul obținut prin sonicare (în situația în
care există acest tip de produs).

186
Tabelul 2. Citologia lichidului sinovial
Elemente celulare Articulație nativă Articulație
protezată

Valori normale Artrită septică Infecția protezei

Leucocite /µl < 200 >20 000 > 3000

Polimorfonucleare < 25% >90% > 70%

neutrofile

Recoltarea, transportul și depozitarea probelor

Reguli generale:
- Se foloseste tehnică aseptică.
- Pentru a preveni rezultatele fals-negative se recomandă respectarea intervalului de minim 15
zile fără antibioterapie (cu excepția cazurilor de sepsis), 1 lună în caz de rifampicina sau cicline
- Pentru a preveni rezultatele fals pozitive se recomandă respectarea strictă a regulilor de asepsie
în momentul recoltării
- Tuburile de dren și lichidele de drenaj nu sunt recomandate pentru examinare datorită ratei
mari de contaminare cu flora comensală
- În cazul infecției unui șurub fixator extern se recoltează cu o seringă din colecția de lângă șurub
- Microbiologul trebuie să încurajeze recoltarea a 2 seturi de hemocultură (4 flacoane) în caz de:
- febră sau sepsis
- artrită, osteomielită, spondilodiscită primitive
- imediat postoperator, datorită bacteriemiei care se produce frecvent după intervenții
chirurgicale (atenție la stabilirea semnificației în cazul izolării bacteriilor din flora
tegumentară);

Recoltarea probelor

Timpul optim și metoda de recoltare

Atunci când este posibil probele vor fi recoltate înainte de a începe terapia antimicrobiană.
Dacă este posibil, se opresc toate antibioticele cu cel puțin 2 săptămâni înainte de prelevare și se
ia în considerare să nu se administreze antibiotice pentru profilaxie chirurgicală de rutină până
după prelevare.
Probele recoltate intraoperator vor fi plasate într-un recipient steril etanș cu soluție Ringer
sau soluție salină sterilă.

187
 Probele recoltate pe tampon sunt de cantitate și calitate inferioară. Atunci când se
recoltează cu tamponul, tampoanele pentru cultura bacteriană și fungică trebuie să fie plasate într-
un mediu de transport adecvat (de ex. mediul Amies sau echivalent).

Cantitatea adecvată și numărul adecvat

Prelevarea de probe intra-operatorii în cazurile în care articulația este îndepărtată - trebuie
recoltate probele de lichid, puroi, sinovială, țesut de granulare, membrană (țesutul care se formează
la interfața os-ciment sau os-proteză) și orice zonă cu aspect anormal. Fiecare probă trebuie
recoltată cu un set separat de instrumente și trebuie să fie plasată într-un recipient separat.
Tampoanele nu sunt recomandate deoarece sunt de obicei contaminate cu floră cutanată.
Dimensiunea minimă a specimenului va depinde de numărul de investigații solicitate.
Numărul și frecvența probelor colectate depind de starea clinică a pacientului, în mod
normal minimum 5 probe.
Probele trebuie etichetate corect: nume complet, data și ora, locul anatomic, informații
clinice (istoric infecțios, antibioterapie, corticoterapie, protezare, etc)
Trebuie menționate pe cerere solicitările speciale pentru bacterii specifice – ex.
micobacterii, fungi.

Condiții optime de transport și depozitare

Eșantioanele trebuie transportate și prelucrate cât mai curând posibil. Pentru a permite
obținerea unui rezultat în timp util, probele trebuie prelucrate urgent.
Probele vor fi transportate la temperatura camerei și procesate în maxim 2h. Dacă se
depășește acest interval se va utiliza mediu de transport pentru pretentioși nutritiv și anaerobi.
Dacă prelucrarea este întârziată, refrigerarea este preferabilă depozitării la temperatura
ambiantă.

III. Examenul microbiologic

Pregătirea și prelucrarea probelor

Pre-tratament
Fragmentarea și omogenizarea probei favorizează extragerea bacteriilor aderente în
biofilm și crește sensibilitatea detecției.
a. Se examinează proba pentru prezența oricărui țesut moale. Se îndepărtează țesuturile moi
folosind un bisturiu sau foarfece sterile și se omogenizează utilizând un bisturiu steril sau (de
preferință) foarfeca sterilă și o placă Petri. Adăugarea unui volum mic (aproximativ 0,5 ml) de
apa filtrată sterilă, soluție salină sau soluție Ringer vor ajuta procesul de omogenizare. După
transferul într-un tub steril închis etanș, omogenizarea poate fi efectuată cu ajutorul unui vortex
timp de 15 minute. Recipientul se deschide în hota de biosiguranță de nivel II.
Notă: Probele obținute chirurgical pentru cultura fungică trebuie tăiate (tăiate mărunt) mai
degrabă decât omogenizate.

188
b. Metoda de agitare prin vortexare sau centrifugare cu mărgelele de sticlă este relativ simplă și
prezintă un risc scăzut de contaminare, este superioară omogenizării numai în bulion, în
vederea recuperării sporilor de bacili de pe suprafețele polimerice.
c. Fragmente mici de țesut pot fi strivite în dispozitive speciale (tissue grinder) sau mojarate.
d. În cazul protezelor, dispozitivelor de fixare, implanturilor ortopedice îndepărtate, produsul de
însămânțat se obține prin sonicare, pentru a detașa bacteriile prinse în structura biofilmelor.
Imediat după prelevare (în sala de operație) probeletrebuie plasate în recipiente sterile speciale
destinate acestui scop.
Peste produs se adaugă soluţie Ringer sau soluție de NaCl 0.9% sterilă în containerul de transport
astfel încât implantul să fi acoperit în proporţie de cel puţin 90%;
Dacă prelucrarea nu se poate începe imediat, trebuie păstrat până la momentul procesării, la
temperatura camerei.
Procedura de sonicare
- Containerul trebuie agitat manual sau cu ajutorul aparatului vortex timp de 30 secunde;
- Containerul cu implantul de investigat se pune în baia de ultrasunete şi se expune sonicării de
intensitate 100% timp de 1 minut;
- Containerul trebuie agitat din nou manual sau cu ajutorul aparatului vortex timp de 30 secunde.
Se inoculează fiecare placă de agar și se depune pe o lamă pentru colorarea Gram câte o
picătură de suspensie folosind o pipetă sterilă.
Pentru obținerea coloniilor individuale, se dispersează inoculul utilizând o ansă sterilă.
Restul suspensiei și orice fragment de țesut rămas pot fi utilizate pentru a efectua culturi pe medii
lichide.
În cazul lichidelor de sonicare se va efectua cultivare cantitativă.
Lichidul supus sonicării este inoculat pe următoarele medii de cultură:
- se însămânţează câte 100 μl pe plăci de geloză (geloză sânge, geloză chocolat și opțional
Brucella agar)
- 3-4 ml de lichid se însămânţează pe bulion tioglicolat
Numărul de UFC ⁄placă se multiplică de 10 ori şi se exprimă ca UFC/ml lichid sonicat;
Dacă se va efectua o analiză moleculară, atunci trebuie ca apa și recipientele să fie sterile,
fără DNAze și fără RNAze (molecular biology grade). În cazul analizei moleculare volumul de
probă necesar este de cca 2 ml.
Poate fi păstrat un eșantion de probă la -20oC pentru eventuale investigații suplimentare
(micobacterii, fungi, tehnici de biologie moleculară).

Examenul microscopic
1. Frotiuri colorate Gram se efectuează din toate probele de puroi și pot fi efectuate din
toate tipurile de eșantioane acolo unde este indicat clinic.
Folosind o pipetă sterilă, se pune o picătură de probă pe o lamă curată de microscop.
Se etalează picătura cu o ansă sterilă pentru a face un frotiu subțire pentru colorarea Gram.
2. Pentru numărătoarea diferențială a polimorfonuclearelor se utilizează colorația May-
Grumwald-Giemsa sau altă colorație citologică.

Cultivare
Se inoculează fiecare placă de agar folosind o pipetă sterilă.
Pentru izolarea coloniilor individuale, dispersați inoculul cu o ansă sterilă.

189
 Tabelul 3. Prelucrarea probelor în infecții osteoarticulare - medii de cultură şi condiţii de incubare
Detalii clinice Tipul de probă Medii de Condiţii de incubare Citirea Microorganisme
cultură Temperatura Atmosfera Timp culturilor ţintă
o
C
Osteomielita Os, Agar cu sânge 35-37 5 - 10% 40 - zilnic Staphylococcus spp.
Abcesul lui Biopsie osoasă și CO2 48h Streptococi
Brodie, Țesut moale Agar chocolat Enterobacterales
Piciorul diabetic Aspirat Prelungit Pseudomonade
Osteomielită Implanturi până la 5 grup HACEK
Discită ortopedice: zile* Nocardia spp.
Probe recoltate de Aspirat articular (necesită incubare
la implanturi protetic, biopsie prelungită până la 3-
ortopedice periprotetică, 5 zile)
probe bulion 35-37 5 zile zilnic Staphylococcus
intraoperatorii tioglicolat Streptococi
(chirurgie de (pentru Enterobacterales
debridare și anaerobi) sau Pseudomonade
retenție sau infuzie cord- Anaerobi
revizie), creier
proteze,
dispozitive de
fixare

Lichid articular Flacon de aerob 5 zile Toate speciile

hemocultură În particular pentru
pretențioșii
În special la copii
(Kingella kingae)
Subculturi din Din probele de Agar pentru 35-37 anaerob 40 - ≥40h Anaerobi
mediile lichide de mai sus pretențioși 48h
mai sus, în cazul anaerobi
în care se Agar chocolat 35-37 5 - 10% 40 - zilnic Toate tipurile
modifică CO2 48h

190
turbiditatea sau la
finalul perioadei
de incubare
Infecție fungică Os, Agar Sabouraud 28-30 aerob 14 zile Zilnic Fungi
profundă Biopsie osoasă (pantă) (Incubare până
Țesut moale la 8 săptămâni
Aspirat pentru
Cryptococcus
sau
Histoplasma)
Mycobacterium Toate tipurile Loewenstein- 35-37℃ aerob 60 zile săptămânală Mycobacterium spp.
spp. Jensen

! numai în caz de
suspiciune clinică
sau în caz de
culturi negative
pe mediile uzuale
cu citologie
sugestivă și în
context clinic.
* pentru variantele cu colonii mici, în caz de lipsa creșterii

191
 Variante cu colonii mici
În cazul culturilor pe agar în plăci, acestea trebuie examinate sub mărire pentru variantele
de colonii de stafilococi ”cu colonii mici” care pot fi izolate din probe de țesut. Coloniile mici pot
fi observate doar după prelungirea timpului de incubare. Aceste variante sunt dependente de
timidină, nu cresc de obicei pe agar cu sânge și au aspect atipic asemănător hemofiliilor sau
streptococilor de pe agar chocolat.
Chiar și în cazul culturilor pozitive la 24-28 ore, se continuă supravegherea culturilor până
la 5 zile pentru a verifica prezența variantelor cu colonii mici, mai ales în cazul infecțiilor protetice.
Dimpotrivă, în cazul culturilor pozitive pe medii lichide, se oprește supravegherea
culturilor în momentul pozitivării, pentru a preveni dezvoltarea altor specii microbiene
contaminante.
Trebuie reținut faptul că în cazul rezultatelor negative la cultură și la examinarea
microscopică nu poate fi eliminată posibilitatea unei infecții.

Teste moleculare
Testele moleculare pot furniza rapid informații privind agenți etiologici variați,
complementare celorlalte rezultate.

Testarea sensibilității la antibiotice

Se efectuează conform standardului EUCAST în vigoare. Raportarea sensibilității se va
face selectiv.
Este important să se includă o gamă largă de antibiotice care pot fi administrate pe o durată
prelungită și care sunt active la nivelul biofilmului. Pentru organismele Gram-pozitive acestea pot
include: CMI la teicoplanină, vancomicina plus antibiotice precum rifampicina, tetraciclinele,
clindamicina, chinolonele, trimetoprim/sulfametoxazolul, acidul fusidic, linezolidul sau
daptomicina.

IV. Raportarea rezultatelor

Examenul microscopic
Se raportează categoria microscopică a microorganismelor depistate. Are sensibilitate
scăzută (6%) dar specificitate înaltă (99%) în diagnosticul infecțiilor cronice ale implanturilor
ortopedice.
Pentru lichidul articular se raportează:
- numărul de leucocite/µL.
- se face numărătoare diferențială (se raportează leucocitele polimorfonucleare ca procent din
totalul leucocitelor).
Toate rezultatele trebuie să fie comunicate clinicianului solicitant imediat ce sunt
disponibile.
Rezultatele urgente trebuie să fie transmise telefonic sau electronic în conformitate cu
protocoalele locale.

192
Cultura
Se raportează următoarele rezultate:
- microorganismele semnificative clinic
- altă creștere lipsită de semnificație clinică (floră de contaminare de origine tegumentară, etc.)
- absența creșterii
Din lichidul de sonicare se va raporta cantitativ prezența microorganismului (UFC/ml). Se
consideră creștere semnificativă un număr de germeni de 50 UFC/ml. Rezultatele între 10-40
UFC/ml se interpretează în coroborare cu datele clinice.
Dacă doar culturile de pe bulion tioglicolat sunt pozitive, adică se observă creștere numai
după îmbogăţire, rezultatul nu este de obicei relevant (probabil contaminare în timpul extragerii,
transportului sau procesării), cu excepţia următoarelor situaţii:
- culturi pozitive pentru anaerobi
- pacienţi sub antibioticoterapie
În aceste situaţii sunt necesare investigaţii suplimentare precum: culturi din ţesut
periprotetic, culturi din aspirat articular, examen histopatologic, date intra-operatorii, etc.
Rezultatele intermediare sau preliminare trebuie puse la dispoziția clinicianului imediat ce
este detectată creșterea pentru izolatele semnificative clinic.
Rezultatele urgente trebuie să fie transmise telefonic sau electronic în conformitate cu
protocoalele locale.
Rapoartele finale scrise sau generate de computer trebuie să urmeze cât mai curând posibil
după rapoartele preliminare și verbale.
De asemenea, raportați rezultatele investigațiilor suplimentare.
Orice întârziere în transport trebuie menționată de către laborator în raportul final.

V. Bibliografie
Corvec S, Loiez C, Portillo ME et al: Bone and joint infections In European Manual of
Clinical Microbiology, editors Cornaglia G, Courcol R, Hermann JL, Kahlmeter G, Publisher
SFM, 2012:227-234.
Public Health England. (2016). Investigation of orthopaedic implant associated infections.
UK Standards for Microbiology Investigations. B 44 Issue 2.
Signore A, Sconfienza LM, Borens O et al: Consensus document for the diagnosis of
prosthetic joint infections: a joint paper by the EANM, EBJIS, and ESR (with ESCMID
endorsement). Eur J Nucl Med Mol Imaging, 2019, 46:971–988.
McNally M, Govaert G, Dudareva M et al: Definition and diagnosis of fracture-related
infection. EFORT Open Rev 2020;5:614-619.

193
 Diagnosticul microbiologic al infecțiilor
gastrointestinale (cu excepția celor cauzate de
Clostridioides difficile)

I. Introducere
Diareea se definește ca și eliminarea a cel puțin trei scaune de consistență moale, apoase,
(neformate) pe zi. Consistența moale este un criteriu mai important decât frecvența scaunelor.
Apariția sângelui în materiile fecale, asocierea tenesmelor sunt caracteristice dizenteriei.
Infecțiile gastrointestinale pot fi de origine bacteriană, virală sau parazitară. Dintre aceste
etiologii cea mai frecventă este cea virală. Infecția cu Norovirus poate afecta persoane de orice
vârstă, în schimb rotavirusul, declanșează diareea în special la copiii sub vârsta de 5 ani. Alte
virusuri frecvent implicate în diaree sunt: astrovirusurile, adenovirusurile și coronavirusurile.
Bacteriile cel mai frecvent implicate în infecțiile gastrointestinale sunt Campylobacter
spp., Salmonella spp. Shigella spp, Yersinia spp. În situații clinice particulare și în prezența unor
date anamnestice sugestive pot fi suspicionate și alte etiologii, precum: Aeromonas spp.,
Plesiomonas shigelloides, Vibrio cholerae și alți vibrioni. Diareea asociată asistenței medicale cel
mai adesea este determinată de Clostridioides difficile, însă la pacienții spitalizați cu tratamente
antibiotice trebuie avută în vedere și posibilitatea declanșării diareei datorită efectelor secundare
ale antibioticelor.
În cazul diareei persistente peste 14 zile trebuie efectuat un examen parazitologic și se
recomandă căutarea unor cauze non-infecțioase.
Bolile infecțioase diareice sunt autolimitate și stabilirea etiologiei nu este întotdeauna
importantă. Diagnosticul microbiologic se impune la pacienții cu risc crescut pentru infecții severe
și în cazul investigării unor focare.

II. Indicațiile diagnosticului microbiologic

Examenul microbiologic este indicat în următoarele situații:
- Boală severă însoțită de febră înaltă și persistentă
- Prezența sângelui în materii fecale
- Scaune apoase frecvente
- Pacienți imunosupresați (HIV seropozitivi, neutropenici, etc)
- Pacienți cu vârstă extremă
- În cazul persoanelor care manipulează alimente în scopul consumului public
- Focare de gastroenterită
- Gastroenterite asociate asistenței medicale
În cazul pacienților spitalizați, se indică efectuarea coproculturii pentru evidențierea
patogenilor comunitari doar dacă diareea apare în primele trei zile de la internare. După acest
interval de timp coprocultura pentru germeni din genurile Salmonella, Shigella, Yersinia,
Campylobacter este în marea majoritatea cazurilor nerelevantă, cu excepția focarelor de
toxiinfecții alimentare. Se recomandă consultarea cu microbiologul în asemenea situații.

194
 Cel mai adesea diareea ce debutează după trei zile de la internare este cauzată de
Clostridioides difficile, în asemenea situații se recomandă orientarea diagnosticului către
evidențierea acestei etiologii. (vezi Ghidul de diagnostic al infecțiilor cauzate de C. difficile).

Ce patogeni se urmăresc la pacientul diareic?

La pacientul diareic febril, care prezintă scaune cu sânge sau mucus însoțite de crampe
abdominale intense sau care prezintă semnele unui sepsis se va efectua coprocultura pentru
evidențierea obligatorie a următoarelor bacterii:
- Campylobacter
- Salmonella
- Shigella
La acestea se adaugă următoarele, în context clinic sugestiv:
- Diareea apoasă a copiilor și a contacților acestora: depistarea norovirusului, adenovirusului,
rotavirusului
- Diareea copiilor sub 1 an: Escherichia coli enteropatogen (EPEC)
- Diaree cu sânge, sindrom hemolitic uremic, pseudoapendicită: Escherichia coli
enterohemoragic (EHEC), Yersinia enterocolitica
- Diaree persistentă cu artralgii: Yersinia enterocolitica (însă artralgia apare adesea după remisia
episodului diareic).
- La pacienții cu vârsta de peste 2 ani cu diaree post-antibioterapie sau diaree asociată asistenței
medicale: Clostridioides difficile
- Reîntoarcerea din călătorii: E. coli enterotoxigenic (diareea călătorului), Vibrio cholerae
(sindrom holeriform la o persoană care a călătorit în zonă endemică), febră enterală
- La pacienții cu SIDA se va extinde examenul microbiologic la evidențierea unor
microorganisme ca Cryptosporidium, Cyclospora, Mycobacterium avium complex, ș.a.
- Toxiinfecții alimentare - în funcție de contextul clinic:
- Incubație scurtă (1-4 ore), pacienți afebrili datorită enterotoxinelor produse de
Staphylococcus aureus sau Bacillus cereus: se urmărește prezența bacteriilor și/sau a
toxinelor în alimente;
- Durată lungă de incubație (12-72 de ore): Salmonella, Yersinia enterocolitica,
Campylobacter spp., Clostridium perfringens, EHEC
- Simptomatologie neurologică caracteristică botulismului: se urmărește prezența toxinei
de Clostridium botulinum în probele alimentare.
- Toxiinfecțiile mai rar întâlnite asociate cu consumul de pește, fructe de mare: Vibrio
parahaemolyticus, Plesiomonas shigelloides, Aeromonas spp.
Pe lângă coprocultură se va efectua hemocultura la toți sugarii diareici sub vârsta de 3 luni
și la toți pacienții cu semne de sepsis sau când se suspectează febră enterală, la pacienții cu
manifestări sistemice, imunosupresați.

Screening la persoane asimptomatice

Coproculturi efectuate la persoane asimptomatice pentru detectarea unor patogeni enterali
cu impact asupra sănătății publice:
- În cazul persoanelor care lucrează în industria alimentară, catering, se urmărește detectarea
următorilor patogeni: Salmonella, Campylobacter, Shigella.

195
III. Recoltarea și transportul probelor
Probele se recoltează înaintea începerii tratamentului antibiotic. De obicei o singură probă
este suficientă pentru diagnostic, recoltarea în 3 zile succesive crește sensibilitatea diagnosticului
bacteriologic. Pentru diagnosticul parazitologic bazat pe microscopie se recomandă recoltarea a 3
probe din două în două sau din trei în trei zile.
La recoltarea probei trebuie evitată amestecarea probelor de scaun cu urină.
Un eșantion de materii fecale (cantitate ce se colectează cu lingurița coprorecoltorului) de
1-2 g până la 10 g este suficient pentru prelucrare. Acesta se introduce în recipientul
coprorecoltorului și se închide etanș. Dacă scaunul conține elemente patologice, se vor recolta din
acestea. Pentru probele destinate examenului bacteriologic se folosesc medii de transport (de ex.
Cary-Blair). Materiile fecale se amestecă în acest mediu (nu se pun deasupra mediului).
Probele recoltate pe tampon trebuie evitate, deoarece se obțin cantități reduse de materii
fecale. Sunt acceptabile doar la sugarii și copii mici pentru investigarea sindromului hemolitic
uremic post diareic și pentru diagnosticul infecției C. difficile la pacienții cu ocluzie intestinală.
Pentru diagnosticul oxiuriazei se recomandă efectuarea amprentei anale.
Probele trebuie să ajungă la laborator cât mai repede, însoțite de informațiile clinice
relevante. Trebuie indicate data și ora recoltării probei.

IV. Prelucrarea produselor biologice

Posibilități diagnostice
Diagnostic rapid: identificarea direct din probele biologice a unor
- Antigene virale, bacteriene sau parazitare - prin metode imunoenzimatice.
- Factori de virulență (de ex. verotoxine) - prin metode imunoenzimatice
- Elemente parazitare (ouă, chiști) - prin examen microscopic.
- Gene specifice unui microorganism sau gene care codifică factori de virulență - prin teste
moleculare tip PCR simplu sau multiplex
Metode bazate pe cultivare - coprocultura.

Examinarea macroscopică a probei:

Se înregistrează consistența produsului și prezența elementelor patologice;
Scaunul trebuie să fie diareic, cu excepția probelor de screening a persoanelor care lucrează
în industria alimentară, catering, bucătării din unități de profil. Dacă în cazul unui diagnostic de
diaree se primește scaun format trebuie luată legătura cu medicul curant în vederea clarificării
indicației examenului microbiologic.

Examenul microscopic
Examenul microscopic al materiilor fecale nu se recomandă.
Coprocitograma nu are sensibilitate și specificitate adecvată, astfel efectuarea acesteia nu
se încurajează.

196
 Cultivarea (coprocultura)
Se însămânțează o picătură sau o cantitate de cca 10 µl pe suprafața mediului solid. Aceasta
se întinde pe suprafața unui cadran al mediului după care se diseminează cu ansa. Se însămânțează
o singură probă pe placă. Acest lucru este important pentru obținerea coloniilor izolate. Alternativ
se utilizează un inoculator.
Mediile de îmbogățire se însămânțează prin plasarea unei cantități aprox cât un bob de
mazăre sau câteva picături.

Tabelul 1. Prelucrarea materiilor fecale - mediile de cultură folosite și condițiile de cultivare

Entităţi clinice Medii de Condiţii de incubare Citirea Microorganisme
cultură culturii ţintă
standard h
Temperatură Atmosferă Timp
o
C h

Diaree (în toate Agar 39-42 Microaerofilă ⩾48 ⩾40 Campylobacter

situațiile) selectiv spp.
pentru
Campylob
acter

Agar înalt 35-37 Aerobă 16- 24 ⩾16 Salmonella spp.

selectiv Shigella spp.
pentru
enterobact
erii (SS,
XLD sau
HE)

Bulion cu 35-37 Aerobă 16- 24 ⩾16 Salmonella spp.

selenit,
subculturi
pe SS,
XLD sau
HE)

Agar 35-37 Aerobă 16- 24 ⩾16 Screening pentru

MacConke EHEC O157
y cu
sorbitol

În context clinic sugestiv adaugă următoarele:

197
Toxiinfecții Agar cu 35-37 Aerobă 40- 48 16-24 Staphylococcus
alimentare (pe sare și aureus
baza datelor clinice manitol
și în urma
consultării cu
microbiologul)

Suspiciune de Apă 35-37 Aerobă 5-8 - Vibrio cholerae

holeră peptonată V.
alcalină cu Aerobă 16- 24 ⩾16 parahaemolyticus
subculturi
pe medii
TCBS/BS
A

Apendicită/ Agar CIN 35-37 (sau 28- Aerobă 16- 24 ⩾24 Yersinia
pseudoapendicită 30) enterocolitica
Limfadenită Yersinia spp.
mezenterică
Ileită
Artrită reactivă

Clostridioides
difficile - vezi
ghidul de
diagnostic al
infecțiilor cauzate
de C. difficile

Alte teste de considerat:

În cazul diareei cu sânge: determinarea prezenței verotoxinelor 1,2 prin metode imunoenzimatice,
imunocromatografice
Persoane imunosupresate: specii de Mycobacterium
În caz de diaree persistentă (>14 zile) și suspiciune de infecție parazitară: examen coproparazitologic
Suspiciunea de botulism: determinarea prezenței toxinei botulinice
Teste rapide imunocromatografice pentru etiologii virale, bacteriene, parazitare
Teste moleculare multiplex (teste ”sindromice”) pentru determinarea etiologiei
CIN - mediu cu cefsulodin, irgasan și novobiocină
BSA - mediu cu săruri biliare
HE - Agar Hektoen Enteric
SS - Agar Salmonella-Shigella
TCBS - Mediu cu tiosulfat, citrat, săruri biliare, zaharoză
XLD - Agar xiloză, lizină, dezoxicolat

198
Tabelul 2. Nivelul minim de identificare a patogenilor enterali

Microorganism Nivel de identificare

Campylobacter Gen

EHEC Specie + determinarea producerii de toxină

+/- determinarea serogrupului

Salmonella Specie

Salmonella Typhi/Paratyphi Serovar (se trimit la laborator de referință

pentru confirmare)

Shigella Specie

Staphylococcus aureus Specie

Vibrio Specie (se trimit la laborator de referință

pentru confirmare)

Yersinia Specie

Teste moleculare
Testele moleculare au devenit indispensabile în diagnosticul unor infecții gastrointestinale.
Având în vedere faptul că unii factori de virulență sunt transferabili plasmidic, caracterul de
patogen enteral al unor tulpini de Escherichia coli poate fi demonstrat prin teste moleculare,
determinarea structurii antigenice nu este acceptabilă pentru identificarea acestor patotipuri.
Sunt deosebit de utile testele multiplex care permit stabilirea etiologiei diareei dintr-o gamă
extinsă de patogeni enterali (bacterii, virusuri, paraziți).

Testarea sensibilității față de antibiotice

Se testează sensibilitatea izolatelor bacteriene semnificative conform standardului
EUCAST.
În cazul infecțiilor cauzate de EHEC nu se va comunica rezultatul antibiogramei.
Tratamentul antibiotic în aceste infecții crește riscul declanșării sindromului hemolitic uremic.
În cazul izolatelor intestinale de Salmonella antibiograma se va comunica doar în cazul
pacienților la risc pentru infecții severe (imunosupresie, vârste extreme, infecții diseminate).

V. Raportarea rezultatelor
Se comunică prezența sau absența patogenilor enterali urmăriți în cadrul examenului
microbiologic.

199
 VI. Bibliografie
Public Health England. (2014). Investigations of Faecal Specimens for Enteric Pathogens.
UK Standards for Microbiology Investigations. B 30 Issue 8.1.
Shane AL, Mody RK, Crump JA et al: 20 17 Infectious Diseases Society of America
Clinical Practice Guidelines for the Diagnosis and Management of Infectious Diarrhea. Clin
Infect Dis, 2017, 65:e45-65.

200
 Diagnosticul microbiologic al infecțiilor cu
Helicobacter pylori
Infecția cu H. pylori este cea mai frecventă infecție bacteriană cronică, se asociază cu ulcer
peptic, gastrita cronică și este un factor de risc pentru adenocarcinomulgastric. Semnele și
simptomele care însoțesc infecția sunt: , durere epigastrică, greață, vărsături , pirozis.
Principala indicație de testare este stabilirea etiologiei la pacienți adulți cu simptomatologie
gastrică persistentă. Alte indicații posibile: pacienți cu limfom al țesutului limfoid asociat
mucoasei gastrice, anterior inițierii unui tratament cronic cu AINS la pacienți cu risc crescut de
ulcer, investigarea unei anemii feriprive de cauză neprecizată.
Diagnosticul infecției cu H. pylori se poate realiza prin mai multe metode, alegerea testului
diagnostic depinde de contextul clinic, prevalența infecției, disponibilitatea echipamentelor și a
personalului specializat, precum și de costuri. Metodele de diagnostic sunt invazive (bazate pe
endoscopia gastrică) și non-invazive.
1. Metodele invazive sunt:
- Testul ureazei din proba de biopsie
- Examenul histologic
- Examenul microscopic bacteriologic
- Cultivarea
- PCR
Testul ureazei din fragmentele de biopsie este rapid, sensibil și cost-eficient. Se recomandă
să fie lucrat împreună cu cultura sau examenul histologic. Testul poate fi efectuat în cabinetul de
endoscopie. Creșterea numărului de fragmente (de la unul-două la patru) crește sensibilitatea
testării. Există truse comerciale care au sensibilitate și specificitate mari.
Examenul microscopic din proba de țesut folosind colorația Giemsa sau Gram.
Sensibilitatea este de cca 90% dacă sunt examinate 2 probe. Este o metodă rapidă dar necesită
experiență din partea executantului.
Cultivarea este metoda cea mai specifică și oferă posibilitatea efectuării testării
sensibilității la antibiotice. Necesită respectarea unor condiții de recoltare și transport (de exemplu
fragmentele trebuie plasate în soluție salină izotonă sterilă înainte ca instrumentarul să fie
contaminat cu formol). Rezultatul testării la antibiotice este important pentru a anticipa evoluția,
pentru a evalua eficacitatea tratamentului și pentru a identifica reinfecțiile.
Examinarea histologică permite diagnosticarea infecției cu H. pylori și a leziunilor
asociate, este la fel de sensibilă ca și cultura și are un grad mare de specificitate.
Nici cultura, nici examenul histologic nu dau rezultat rapid.
Testul PCR poate fi utilizat pentru detectarea H. pylori din diverse tipuri de probe dar rolul
său în diagnosticul de rutină rămâne să fie evaluat. Există truse care au sensibilititate și specificitate
bune și care pot detecta și mutații specifice de rezistență la claritromicină.
2. Metodele neinvazive cuprind:
a. Testul respirator cu uree (Urea Breath Test, UBT)

201
b. Detectarea antigenului fecal
c. Examenul serologic
Testul respirator cu uree și detectarea antigenului în fecale detectează infecția activă.
Serologia nu diferențiază între o infecție activă și una în antecedente.
a. Testul respirator cu uree marcată cu izotopi de C14 sau C13 este considerat testul neinvaziv
“gold standard”. Testarea durează 15-20 minute. Utilizarea sa poate fi limitată datorită
necesității unui echipament specific complex și a costurilor crescute. Recoltarea probei
necesită timp și instruire. Testul permite evaluarea rapidă a eradicarii infecției.
b. Detectarea antigenului fecal este un test cu sensibilitate și specificitate bună pentru
diagnosticul infecției cu H. pylori și are capacitatea de a confirma eradicarea infecției.
Sensibilitatea este bună pentru testele imunoenzimatice și moderată pentru cele
imunocromatografice.
c. Detectarea anticorpilor prin ELISA este un test de diagnostic indirect ieftin și accesibil. Există
diverse tipuri de truse, bazate în principal pe detectarea anticorpilor de tip IgG. Există și kit-
uri care detectează anticorpii de tip IgA. Există de asemenea diverse tipuri de teste de tip point-
of-care din sânge integral. Proporția rezultatelor fals pozitive crește cu vârsta pacienților.
Prevalența locală influențează valoarea predictivă a testării. Acest tip de test nu este indicat
pentru a confirma eradicarea infecției datorită prezenței prelungite a anticorpilor în sânge, după
vindecarea microbiologică.

I. Recoltarea probelor
Performanțele testelor de diagnostic direct (invazive și neinvazive) depind de prezența H
pylori în proba analizată, de aceea este important ca testarea să se realizeze la cel puțin patru
săptămâni de la oprirea tratamentului cu antibiotice sau la una-două săptămâni de la întreruperea
administrării de inhibitori de pompă de protoni.
Metode invazive - examene microbiologice
Se recoltează prin endoscopie probe de biopsie gastrică din zona antrumului sau din zona
corpului gastric, în funcție de localizarea inflamației.
Mărimea și numărul probelor sunt la latitudinea specialistului care efectuează endoscopia
și în funcție de extinderea inflamației.

II. Transportul și conservarea probelor

Probele trebuie transportate cât mai rapid la laborator (maxim 6 ore).
Este important ca în timpul transportului să fie menținută o atmosferă umedă. Proba de
biopsie va fi plasată într-un recipient steril, de dimensiuni mici, care conține o cantitate mică (cca
100 ul) de ser fiziologic steril.
Notă: sensibilitatea examenului microscopic poate să scadă dacă biopsia este plasată în ser
fiziologic deoarece mucusul se aglomerează în globuli care îngreunează efectuarea frotiului.

202
 Dacă transportul probelor se întârzie peste 6 ore – proba de biopsie va fi acoperită cu cca
1 ml bulion infuzie cord-creier, într-un container steril. În acest fel poate fi păstrată la 4oC până la
48 ore.
Poate fi utilizat mediul de transport Dent.
Se poate utiliza mediul de transport Amies care asigură viabilitatea bacteriilor dar trebuie
avut grijă deoarece există riscul de detașare a mucoasei de proba de biopsie.
Probele de biopsie pot fi păstrate până la 6 luni la -70oC în bulion cu glycerol 20-25%.
Există însă riscul scăderii viabilității bacteriilor.

III. Prelucrarea probelor

Protocolul de diagnostic cu referire la tipurile de teste utilizate și ordinea în care sunt
efectuate se elaborează de fiecare unitate medicală.

Testul ureazei
Pentru inocularea în bulion urează (dacă nu a fost efectuat în cabinetul de endoscopie) se
zdrobește proba de biopsie de capătul tubului cu bulion. Tamponul ar trebui să fie lăsat în bulion
până la finalul testului. Bulionul urează se incubează la temperatura camerei până la 24 ore. Se
verifică din oră în oră în primele 6 ore dacă se produce virarea culorii care indică o reacție pozitivă.

Teste moleculare
Dacă este disponibil, testul de amplificare a acizilor nucleici (NAAT) se efectuează direct
din proba biologică.

Examenul microscopic
- Se ia proba de biopsie cu un tampon și se aplică cu mișcări ferme pe lama de microscop curată.
Dacă examenul microscopic se efectuează înaintea culturii, se vor utiliza lame de microscop
sterile.
- Lamele vor fi colorate Gram sau Giemsa . Coloratia Gram cu utilizarea fucsinei diluate în timpul
de recolorare crește sensibilitatea examinării.
- Colorarea și examinarea lamei este necesară numai dacă testul ureazei din proba de biopsie a fost
pozitiv iar cultura negativă.

Cultivarea
Nu există un mediu ideal. Mediile suplimentate dar fără sânge nu sunt potrivite pentru
obținerea culturii primare. Mediile de cultură pot fi suplimentate cu antibiotice pentru a inhiba
creșterea contaminanților.
Cele mai bune rezultate se obțin prin utilizarea în paralel a unui mediu selectiv și a unui
mediu neselectiv.

203
 Se poate practica omogenizarea probei dar necesită timp și tuburi Griffiths sau o
alternativă. Biopsiile pot fi tăiate fin cu bisturiu steril.
Cu același tampon (cu care s-a efectuat frotiul) se inoculează câte 1 placă cu agar selectiv
pentru H. pylori și 1 placă cu agar-sânge. Pentru a obține colonii izolate se face dispersie cu ansa.
Se recomandă utilizarea mediilor selective, de ex. “Helicobacter pylori selective medium”,
cu supliment antibiotic DENT (vancomicină, trimetoprim, cefsoludină și amfotericină B). Se pot
utiliza și medii neselective, cum ar fi: BHI agar, Brucella Agar, Wilkins-Chalgren Agar, Trypticase
Soy Agar, Agar Columbia cu 10% sânge defibrinat de cal, pentru obținerea culturii primare.
Incubarea se face în atmosferă umedă, microaerofilă (86% N2, 4% O2, 5% CO2 și 5% H2),
în intervalul de temperatură 35-37oC, timp de 7-10 zile. Există kit-uri comerciale, sisteme
generatoare de gaz sau incubatoare (cu butelii de gaz) în care se generează atmosferă microaerofilă
(controlată, monitorizată).
După 48-72 de ore de incubare (prima citire) se pot vizualiza colonii mici, rotunde, tip “S”,
gri, translucide.
Identificarea microorganismului izolat se bazează pe:
- test oxidază pozitiv
- test catalază pozitiv
- test rapid urează pozitiv
- aspectul de “pescăruș” la examenul microscopic din cultură
- kit-uri comerciale galerii API
- MALDI-TOF.
În cazul în care cultura nu este pozitivă până la ziua 10 de incubare și este raportată ca
rezultat negativ, iar criteriile clinice și testele suplimentare (non-invazive) susțin diagnosticul de
infecție cu Helicobacter pylori, este recomandat testul PCR specific de specie, din fragment de
mucoasă gastrică (fragment deja recoltat și congelat sau o nouă biopsie de mucoasă gastrică).
Stocarea tulpinilor izolate se poate face în bulion Brucella cu 25% glycerol la -70oC și pe
criobile.

IV. Testarea sensibilității la antibiotice

Efectuarea testării sensibilității la antibiotice a tulpinilor de Helicobacter pylori este
importantă datorită creșterii ratei de eșec terapeutic față de prima linie de tratament empiric, la
peste 30% în majoritatea țărilor europene. De asemenea, se recomandă testarea sensibilității la
antibiotice când pacienții sunt refractari la a doua linie de tratament empiric.
Metoda disc-difuziei nu este recomandată pentru acest microorganism deoarece are
creștere lentă și rezultatele pot fi influențate. Metoda recomandată este metoda gradient, conform
instrucțiunilor producătorului.
Din cultura de 2-3 zile se face un inocul cu densitatea de 3 McFarland.
Cu ajutorul tamponului se inoculează plăcile cu agar Mueller-Hinton sau Wilkins-Chalgren
cu 5-10% sânge de cal.

204
 Se incubează la 35℃ în condiții de microaerofilie pentru 3-5 zile.
Conform recomandărilor EUCAST, antibioticele testate sunt: amoxicilina, levofloxacina,
claritromicina, tetraciclina, metronidazolul, rifampicina.
Se citește valoarea CMI la limita de inhibiție completă a creșterii, incluzând haloul sau
coloniile izolate.
Pentru interpretarea rezultatelor se utilizează tabele EUCAST, versiunea actualizată.
Testarea sensibilității la claritromicină se recomandă a se efectua înaintea administrării ei.
Metoda de testare a sensibilității la metronidazol nu este reproductibilă și relevanța clinică
este limitată. Metoda de testare in vitro nu exprimă cu acuratețe activitatea reală in vivo, datorită
activității diferite a metronidazolului, în condiții diferite de atmosferă de incubare (microaerofilie
vs anaerobioză).
Rezistența față de amoxicilină și tetraciclină este redusă în Europa.
Creșterea consumului de fluoroquinolone a fost urmată de creșterea rezistenței izolatelor
de Helicobacter pylori la levofloxacină.
Tehnicile PCR utilizate direct din fragmente de biopsie gastrică pentru detectarea
mutațiilor care determină rezistența la claritromicină și levofloxacină pot fi alternative pentru
înlocuirea cultivării și a testelor de sensibilitate.

V. Controlul calității
Tulpinile de control recomandate sunt:
- H. pylori ATCC 43504 / NCTC 11637
- H. pylori NCTC 12822 – tulpină sensibilă la metronidazol
- H. pylori NCTC 12823 – tulpină rezistentă la metronidazol.

VI. Teste de confirmare a eradicării infecției

Eradicarea poate fi confirmată prin testul respirator cu uree, prin detecția antigenului în
fecale sau prin teste invazive. Testele de confirmare trebuie realizate la cel puțin patru săptămâni
de la terminarea tratamentului antibiotic. Tratamentul cu inhibitori de pompă de protoni trebuie
oprit pentru una-două săptămâni anterior testării, pentru a reduce riscul rezultatelor fals negative.
Serologia nu trebuie folosită pentru confirmarea eradicării deoarece anticorpii pot persista după
eradicare.

205
VII. Raportarea rezultatelor
Testul ureazei din biopsie

- se raportează pozitiv / negativ

Examenul microscopic
- se raportează prezența / absența “microorganismelor de tip H. pylori”

Cultura
- se raportează rezultatul pozitiv – “s-a izolat H. pylori”
- se raportează rezultatul negativ – “nu s-a izolat H. pylori”.

VIII. Bibliografie
1.Francis Me´graud, Norbert Lehn, Tore Lind, Ekkehard Bayerdo¨rffer, Colm
O’morain,Robin Spiller, Peter Unge, Sander Veldhuyzen van Zanten, Michael Wrangstadh, and
Carl Fredrik Burman. Antimicrobial Susceptibility Testing of Helicobacter pylori in a Large
Multicenter Trial: the MACH 2 Study. ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY,
0066-4804/99/$04.0010, Nov. 1999, p. 2747–2752
2."The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables
for interpretation of MICs and zone diameters. Version 13.0, 2023. http://www.eucast.org."
3.Martín Alonso Bayona Rojas, Bact., Esp., M. Sc.1. Microbiological conditions for
culturing Helicobacter Pylori. Rev Col Gastroenterol / 28 (2) 2013
4.Francis Me´graud* and Philippe Lehours. Helicobacter pylori Detection and
Antimicrobial Susceptibility Testing. CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, Apr. 2007, p.
280–322 Vol. 20, No. 2 0893-8512/07/$08.00_0 doi:10.1128/CMR.00033-06
5. JULIA FASHNER, MD, and ALFRED C. GITU, MD, Florida State University College
of Medicine Family Medicine Residency, Lee Memorial Health System, Fort Myers, Florida.
Diagnosis and Treatment of Peptic Ulcer Disease and H. pylori Infection. Am Fam Physician.
2015;91(4):236-242.
6.Sinéad M Smith, Colm O’Morain, Deirdre McNamara. Antimicrobial susceptibility
testing for Helicobacter pylori in times of increasing antibiotic resistance. World J Gastroenterol
2014 August 7; 20(29): 9912-9921
7.Yao-Kuang Wang, Fu-Chen Kuo, Chung-Jung Liu, Meng-Chieh Wu, Hsiang-Yao Shih,
Sophie SW Wang, Jeng-Yih Wu, Chao-Hung Kuo, Yao-Kang Huang, Deng-Chyang Wu.
Diagnosis of Helicobacter pylori infection: Current options and developments. World J
Gastroenterol 2015 October 28; 21(40): 11221-11235. ISSN 1007-9327 (print) ISSN 2219-2840
(online)

206
 8.William D. Chey , MD, FACG1 , Grigorios I. Leontiadis , MD, PhD2 , Colin W. Howden
, MD, FACG3 and Steven F. Moss , MD, FACG4; ACG Clinical Guideline: Treatment of
Helicobacter pylori Infection. Am J Gastroenterol 2017; 112:212–238; doi: 10.1038/ajg.2016.563
; published online 10 January 2017
9. Public Health England. (2015). Identification of Helicobacter species. UK Standards for
Microbiology Investigations. ID 26 | Issue no: 3 | Issue date: 03.07.15.
10 World Gastroenterology Organisation Global Guidelines - Helicobacter pylori. May
2021 https://www.worldgastroenterology.org/UserFiles/file/guidelines/helicobacter-pylori-english-
2021.pdf
11. Christophe Burucoa, Francis Megraud. Helicobacter pylori. European Manual of
Clinical Microbiology 1st edition. pag. 283- 286. EMCM. 2012.
12. Marc Roger Couturier. 2019. Helicobacter. Pag. 1044- 1057. Manual of Clinical
Microbiology, 12th Edition. Vol. 1.

207
 Diagnosticul microbiologic al infecției determinate de
Clostridioides difficile

I. Introducere
Specia Clostridium difficile a fost din 2016 reîncadrată taxonomic în genul Clostridioides.
Diagnosticul infecției cu Clostridioides difficile (ICD) se bazează pe date clinice, epidemiologice
și microbiologice.

II. Orientarea clinică

Orientarea clinică este esențială pentru inițierea rapidă a măsurilor de izolare și a terapiei
adecvate.
Simptomatologie sugestivă pentru ICD și existența riscului de colonizare și a factorilor
favorizanți pentru apariția ICD:
- Diaree asociată asistenței medicale fără alte cauze sau diaree post-antibiotică cu origine
comunitară
- Mai ales la un pacient vârstnic
- Mai ales dacă pacientul a primit antibiotice, imunosupresoare sau antisecretorii gastrice
- Dacă nu aparține unui focar de boală diareică acută din comunitate.
Deoarece ICD poate să apară și la persoane fără factori de risc cunoscuți prezența unei
simptomatologii sugestive pentru ICD trebuie să determine adoptarea măsurilor adecvate cu scop
diagnostic, terapeutic și de control al infecției.

III. Diagnosticul etiologic

Diagnosticul etiologic aduce argumente în favoarea abordării inițiale și permite evaluarea
intensității fenomenului epidemiologic

Indicații de testare
- Diaree care apare la pacienți după 48 de ore de la internare
- Diaree sau alte tablouri clinice sugestive la pacienți nespitalizați sau în primele 48 de ore ale
spitalizării care au avut spitalizări recente sau tratament la domiciliu cu antibiotice,
antisecretorii gastrice, imunosupresoare.
- Diaree de etiologie neprecizată

Nu este indicată testarea pentru evidențierea C. difficile

- La persoane asimptomatice (nu se testează scaune de consistență normală)
- La copiii sub 2 ani cu sindrom diareic (sugarii și copiii mici pot fi colonizați cu C. difficile
toxigen fără a dezvolta ICD)

208
- Ca screening înainte de internare sau transfer.

IV. Recoltare și transport

- Cantități de 1-2 ml de scaun diareic sunt suficiente pentru diagnostic
- Doar la pacienții cu ileus se acceptă și probe recoltate pe tampon rectal.
Materiile fecale normale nu sunt acceptabile pentru prelucrare; acestea trebuie
respinse cu un comentariu adecvat.
- Prelucrarea probei se va efectua în primele 2 ore de la recoltare
- Dacă proba nu se poate prelucra în maxim 2 ore se păstrează la 4°C (toxina se degradează
după 2 ore la temperatura camerei), maxim 2 zile.
- Păstrarea probei pe o durată mai mare de timp este posibilă doar la -20°C.

V. Metode de diagnostic

Tipuri de teste
În practică se utilizează teste rapide, imunoenzimatice sau moleculare. Performanțele
acestor teste se compară cu cele ale testelor de referință.

Teste uzuale

Detectarea glutamat dehidrogenazei (GDH)

Glutamat dehidrogenaza, o enzimă produsă atât de tulpinile toxigene cât și cele netoxigene
de C. difficile, se poate detecta prin teste imunoenzimatice. Metoda are sensibilitate ridicată
(pentru majoritatea truselor), însă specificitate redusă; de aceea poate fi utilizată drept test
screening și necesită un test care să confirme prezența toxinelor.

Detectarea toxinelor A și B
Detectarea concomitentă a toxinelor A/B direct din materii fecale sau din supernatantul
culturilor în bulion se poate realiza prin teste imunoenzimatice. Unele teste permit diferențierea
între cele două toxine. Testele sunt de tip ELISA, ELFA, imunocromatografice și au performanțe
variabile. Se recomandă folosirea testelor care au sensibilitate și specificitate bune. Există și truse
care detectează GDH și toxine, dar performanțele acestora pot fi mai reduse comparativ cu cele
ale truselor cu ținte distincte.

Detectarea genelor care codifică toxine

Detectarea genelor ce codifică toxinele C. difficile se realizează prin metode moleculare,
în general bazate pe real-time PCR. Majoritatea testelor detectează gena tcdB care codifică toxina
B. Există truse care detectează atât tcdB cât și genele pentru toxina binară (cdtA și cdtB) și deleția
în nucleotidul 117 al genei represor tcdC, ținte care permit identificarea prezumtivă a C. difficile
ribotip 027. Există de asemenea truse de tip multiplex care pot detecta simultan direct din probă

209
mai multe microorganisme implicate în sindroame diareice, inclusiv C. difficile. Testele
moleculare au sensibilitate și specificitate mari și oferă un diagnostic rapid.
Limite: necesită infrastructura adecvată.

Teste de referință

Teste de neutralizare a citotoxicității

Testele de neutralizare a citotoxicității evidențiază prezența toxinei B în probă (toxină
produsă in vivo) prin observarea efectului acesteia asupra unei culturi de celule și neutralizarea
efectului cu ser antitoxină. Aceste teste au sensibilitatea cea mai ridicată și sunt utilizate în
laboratoare de referință.
Limite: durata detectării din proba de scaun este de aproximativ 2 zile, necesită laborator
cu dotări adecvate pentru culturi celulare și personal instruit în acest domeniu.

Cultivarea și demostrarea toxigenezei (cultura toxigenă)

Constă în izolarea C. difficile și demonstrarea capacității de a produce toxine in vitro. Este
de asemenea o metodă de referință, cu sensibilitate foarte bună dar cu durată de peste 2 zile.
Pentru a favoriza izolarea C. difficile anterior însămânțării probele se pregătesc prin:
- Tratament cu alcool (se omogenizează proba de scaun în raport de 1:1 cu alcool etilic absolut
și se incubează 30 de minute la temperatura camerei)
SAU
- Încălzire la 80°C timp de 15 minute.
Incubarea se face 48-72 ore în anaerobioză. Medii de cultură adecvate:
- CCFA - Clostridium difficile agar,
- CDSA - Clostridium difficile selective agar,
- geloză-sânge Columbia cu supliment selectiv
- CMA – cefoxitin-mannitol agar-CLO agar, (incubare 48h)
- ChromID C. difficile, (incubare 24h), oferă un rezultat mai rapid, este mai sensibil, dar mai
puțin specific.
Din coloniile suspecte se efectuează frotiuri colorate Gram, iar ulterior se continuă
identificarea prin test de aglutinare sau MALDI-TOF. Tulpinile izolate se pot păstra în bulion
tioglicolat sau prin congelare pentru analize ulterioare.
Notă: izolarea unei tulpini de C. difficile nu este suficientă pentru diagnosticul cert al ICD.
Pentru a certifica diagnosticul, cultivarea trebuie întotdeauna combinată cu o metodă de detectare
a toxinogenezei.

Algoritm de diagnostic etiologic

Ghidurile actuale recomandă un diagnostic în 2 etape:
1. Efectuarea unui test de detecție rapidă cu sensibilitate mare (test imunoenzimatic pentru
GDH sau test molecular):
- Rezultat negativ - diagnosticul de ICD este infirmat
- Rezultat pozitiv se trece la a doua etapă:
2. Efectuarea unui test de detecție rapidă cu specificitate mare (test imunoenzimatic pentru
toxine):
- Rezultat pozitiv - se confirmă diagnosticul de ICD;

210
- Rezultat negativ – se evaluează clinic: posibil ICD sau portaj de C. difficile (toxigen).
În cazul în care primul test efectuat a fost unul imunoenzimatic pentru GDH și tox A/B:
- Rezultat negativ pentru ambele - diagnosticul de ICD este infirmat
- Rezultat pozitiv pentru ambele - diagnosticul de ICD este confirmat
- Rezultat pozitiv pentru GDH, dar negativ pentru toxine A/B - se poate trece la a doua etapă:
test molecular sau cultură toxigenă. Dacă rezultatul este negativ diagnosticul de ICD este
improbabil, dacă rezultatul este pozitiv se evaluează clinic.
- Rezultat negativ pentru GDH, dar pozitiv pentru toxine A/B – rezultat invalid. Este necesară
retestarea.
În caz de probabilitate diagnostică mare în etapa pretestare (date clinice și factori de risc
sugestivi) se acceptă un test PCR pozitiv pentru a confirma diagnosticul.
În cazul diagnosticării ICD se poate efectua cultură din proba de materii fecale, dar nu în
scop diagnostic, ci pentru a avea disponibilă tulpina în scopul unor testări ulterioare (ex. ribotipare,
testarea sensibilității la antibiotice), mai ales în cazul în care apar un nou focar epidemic sau
modificări ale caracteristicilor clinico-evolutive ale cazurilor de ICD dintr-un anumit focar
spitalicesc.

Retestare
- Nu se recomandă repetarea testării cu aceeași metodă dintr-o nouă probă de scaun la mai puțin
de 7 zile de la un prim rezultat negativ, în situație endemică; repetarea testării după un prim
test negativ poate fi utilă în cazul suspiciunii clinice și unui context epidemic.
- Nu se recomandă testarea pentru evaluarea eficienței bacteriologice a terapiei ICD (C. difficile
poate persista în colon câteva luni după remisia simptomatologiei)

VI. Raportarea rezultatelor

Se menționează metoda/metodele utilizate.
Se interpretează și raportează conform algoritmului menționat la capitolul 3.2.

VII. Bibliografie
Crobach M J T, Planche T, Eckert C, Barbut F , Terveer E M, Dekkers O M, Wilcox M H,
Kuijper E J - European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases: update of the
diagnostic guidance document for Clostridium difficile infection. Clin Microbiol Infect. 2016;22
S4:S63-81. doi: 10.1016/j.cmi.2016.03.010.
Lee HS., Plechot K, Gohil S, Le J – C. difficile: Diagnosis and the Consequence of Over
Diagnosis. Infect Dis Ther. 2021; 10(2): 687–697. doi: 10.1007/s40121-021-00417-7
Popescu GA, Szekely E, Codiță I, Tălăpan D, Șerban R, Ruja G - Ghid de diagnostic,
tratament și prevenire a infecțiilor determinate de Clostridium difficile, Ed a 2-a, București 2016.
https://cnscbt.ro/index.php/ghiduri-si-protocoale/ghiduri/520-ghid-diagnostic-tratament-si-
prevenire-clostridium-difficile/file

211
 Diagnosticul microbiologic al infecțiilor genitale

I. Introducere
Acest ghid prezintă aspectele diagnostice ale infecțiilor genitale simptomatice și
asimptomatice, cu și fără transmitere sexuală.

II. Infecții cu transmitere sexuală

Infecțiile cu transmitere sexuală (ITS) pot fi cauzate de o multitudine de microorganisme:
bacterii, virusuri și paraziți. Infecțiile pot avea o perioadă asimptomatică prelungită, depistarea
acestora fiind importantă pentru prevenirea complicațiilor tardive dar și pentru prevenirea
transmiterii.
Astfel analizele pot fi efectuate în scop de screening la persoanele asimptomatice sau în
scop diagnostic la persoanele simptomatice. Unul dintre punctele critice ale diagnosticului ITS
este sensibilitatea metodei diagnostice alese.

a. Se recomandă screeningul tuturor ITS:

- dacă partenerul sexual a fost depistat cu o ITS
- după activitate sexuală cu risc infecțios crescut (parteneri multipli, parteneri necunoscuți)
- la încetarea utilizării prezervativului în cazul cuplurilor stabile
- pentru investigarea infertilității
- investigarea artritei reactive
- consultații ginecologice la gravide sau pentru contracepție
- la persoanele încarcerate
- screening pentru Chlamydia trachomatis la tineri sub 25 de ani
- în urma unor abuzuri sexuale.
b. Diagnosticul infecțiilor simptomatice trebuie să aibă în vedere simptomatologia urogenitală,
severitatea simptomelor și sensibilitatea metodelor de diagnostic. Acestea se manifestă sub
următoarele forme: uretrită, epididimită, epididimo-orchită, proctită, cervicită și infecțiile
tractului genital feminin superior, ulcerații genitale, faringită, conjunctivită. Întrucât
coinfecțiile sunt frecvente, în cazul diagnosticării unei ITS este obligatorie investigarea tuturor
etiologiilor posibile.
Cei mai frecvenți agenți etiologici ai ITS
Investigațiile trebuie să includă teste pentru Chlamydia trachomatis, Neisseria
gonorrhoeae și eventual Mycoplasma genitalium și se recomandă efectuarea testelor pentru
depistarea infecției cu HIV și a sifilisului.
Chlamydia trachomatis este endemică în Europa, fiind agentul etiologic cel mai frecvent
implicat în ITS, cu o medie europeană de 185/100000 (luând în considerare datele țărilor care au
sistem de supraveghere solid). Datele raportate din România arată o incidență foarte scăzută (0,1-
0,3/100000), care probabil reflectă subdiagnosticarea acestei infecții. C. trachomatis cauzează
uretrită, cervicită, proctită. Poate cauza boală inflamatorie pelviană, iar în caz de diseminare

212
peritoneală poate conduce la perihepatită. Se poate asocia cu artrita reactivă. Serotipurile L1-3
cauzează limfogranulomul venerian.
Perioada de incubație este în jur de 2 săptămâni, însă peste 50% a cazurilor rămân
asimptomatice. Se descriu portaj faringian și rectal. Poate cauza infertilitate prin stricturi ale
trompei uterine, sarcină extrauterină și dureri pelviene cronice. În cazul transmiterii verticale apare
conjunctivita neonatală sau pneumonie.
Neisseria gonorrhoeae cauzează uretrită și/sau cervicită după o perioadă de incubație de
2-10 zile. În cazul a 10% dintre bărbați și până la 50% dintre femei infecția este asimptomatică.
Pe termen lung, infecția poate cauza infertilitate, sarcină extrauterină, dureri pelviene cronice,
stricturi uretrale. În cazul transmiterii verticale se dezvoltă conjunctivita neonatală.
Treponema pallidum cauzează o ITS care, netratată, are o evoluție cronică, în mai multe
stadii: sifilisul primar caracterizat prin prezența șancrului dur se dezvoltă la 10-90 de zile după
expunere, sifilisul secundar în 2-8 săptămâni de la apariția șancrului dur, după care urmează o
perioadă de latență iar peste mai mulți ani se poate dezvolta sifilisul terțiar cu leziuni distructive,
afectări cardiace, neurologice și osoase ireversibile.
Haemophilus ducreyi cauzează șancrul moale ce apare la 3-7 zile după expunere. Este o
etiologie întâlnită în regiunile tropicale și mai rară în zona temperată.
Mycoplasma genitalium cauzează uretrite acute, cronice sau recurente la bărbați, cervicite,
infecții pelvine subacute la femei. Infecția este frecvent asimptomatică (>30% la bărbați și >70%
la femei).
Virusurile herpes simplex 1, 2 cauzează infecția primară la 7 zile de la expunere, urmată
de ulcerații genitale recurente. Infecțiile asimptomatice sunt frecvente. În cazul transmiterii
perinatale cauzează infecții herpetice neonatale de severitate variabilă.
HIV (virusul imunodeficienței umane) cauzează sindromul de imunodeficiență
dobândită. Manifestări clinice pot fi prezente în primoinfecție sau după mai mulți ani de evoluție,
fiind în principal expresia infecțiilor oportuniste asociate imunodepresiei. Virusul poate fi transmis
și prin sânge sau secreții sau vertical, preponderent perinatal.
Virusul hepatitei B, deși transmisibil pe cale sexuală, nu duce la manifestări caracteristice
infecțiilor genitale. După o perioadă de incubație de 1-6 luni în aproximativ 10% din cazuri apare
hepatita acută. Infecția acută poate evolua la unii pacienți spre hepatita cronică, ciroză și cancer
hepatic.
Papilomavirusul uman este responsabil pentru infecții cu diverse localizări. Genotipurile
cu risc scăzut sunt responsabile de producerea vegetațiilor genitale. Infecția persistentă cu
genotipuri de risc crescut este o cauză importantă de cancer de col uterin, anal sau faringian. În
România este o infecție probabil subdiagnosticată.
Trichomonas vaginalis cauzează vaginită și/sau uretrită după o incubație de 4-28 de zile.
Infecția rămâne asimptomatică la aproximativ 25% dintre femei și peste 90% în cazul bărbaților.

Screeningul persoanelor asimptomatice pentru ITS:

- Serologie: HIV, VHB (virusul hepatitiei B), sifilis
- Teste moleculare - teste de amplificare a acizilor nucleici (NAAT): Chlamydia trachomatis
(femei sub vârsta de 25 de ani și bărbați sub vârsta de 30 de ani sau fără limite de vârstă în
cazul persoanelor la risc). La femei se recoltează secreție cervicală iar la bărbați primul jet de
urină.
- În funcție de datele anamnestice și clinice:

213
 - depistarea N. gonorrhoeae (prin cultivare sau NAAT) și C. trachomatis (prin NAAT)
din secreții orofaringiene sau probe anorectale.

Diagnosticul infecțiilor cu transmitere sexuală simptomatice în

funcție de patogenul suspectat

Tabelul 1. Metode de diagnostic în infecții cu transmitere sexuală simptomatice, în funcție

de patogenul suspectat
Patogenul Probele recoltate Examen Cultivare Teste Antibiogramă
suspectat microscopic moleculare

Neisseria Secreția uretrală Frotiu colorat Important Preferabil Esențială

gonorrhoeae exteriorizată, Gram sau cu pentru izolarea combinat cu pentru
probe cervicale albastru de germenului și cultivarea documentarea
sau uretrale, urină metilen antibiogramă sensibilității
- primul jet, (sensibilitate față de
exudat faringian, redusă) antibiotice în
tampon anorectal condițiile
răspândirii
tulpinilor
rezistente

Chlamydia Secreții uretrale și - Doar pe culturi Diagnostic Doar în

trachomatis cervicale, tampon celulare (în de bază laboratoare de
vaginal (în funcție laboratoare de referință
de testul folosit!), referință)
exudat faringian
și tampon
anorectal

Mycoplasma Secreție uretrală - Dificil de Diagnostic Doar în

genitalium și cervicală, cultivat de bază laboratoare de
secreție vaginală, (eventual în referință
urină - primul jet laboratoare de
referință)

Trichomonas Secreție uretrală, Preparat nativ Sensibilitate Preferabil la Valoare

vaginalis secreție vaginală, proaspăt sau acceptabilă la bărbați clinică limitată
urină - primul jet frotiu colorat femei, redusă
Giemsa la bărbați
(sensibilitate
acceptabilă la
femei, redusă
la bărbați)

214
Diagnosticul uretritei acute
- Primul jet de urină: C. trachomatis, N. gonorrhoeae, M. genitalium (prin NAAT)
- la femei proba de urină este inferioară secreției cervicale, chiar și în cazul prezenței
disuriei
- Probe uretrale: microscopie, cultivare și antibiogramă pentru N. gonorrhoeae și alți patogeni,
microscopie pentru Trichomonas vaginalis, cultivare cantitativă pentru Ureaplasma
urealyticum (prag de semnificație >104 UFC/ml - sub această valoare semnificația este incertă
datorită portajului frecvent)
- În funcție de context: exudat faringian sau tampon anorectal pentru C. trachomatis, N.
gonorrhoeae (NAAT) și hemoculturi în cazul prezenței febrei.
În cazul în care se suspicionează o ITS se recomandă screening pentru toți patogenii
importanți cu transmitere sexuală (HIV, HBV, Treponema pallidum).

215
 Diagnosticul infecțiilor genitale ulcerative în funcție de patogenul
suspectat
Tabelul 2. Metode de diagnostic direct în infecții genitale ulcerative, în funcție de patogenul
suspectat
Patogenul Probele recoltate Examen Cultivare Teste Antibiogramă
suspectat microscopic moleculare sau similar

Herpes Celule din baza - Culturi Preferabil -

simplex virus ulcerației celulare (permite
stabilirea
tipului)

Treponema Serozitate din Microscopie cu - Preferabil -

pallidum șancrul dur fond întunecat în (sensibilitate
cel mult 15 superioară)
minute de la
recoltare
(specificitate
redusă în cazul
sancrelor cu
localizare anală
sau orală din
cauza prezenței
treponemelor
comensale)

Chlamydia În caz de - Laboratoare Diagnostic -

trachomatis suspiciune LGV: de referință - de bază
serotipurile Produs anal sau culturi
L1-3 biopsie rectală celulare

Haemophilus Puroi din periferia Frotiu colorat cu Dificilă - se Preferabil Relevanță

ducreyi șancrului moale albastru de recomandă (sensibilitate clinică redusă
sau puroi aspirat metilen, MGG însămânțarea crescută)
sau Gram la patul
bolnavului

III. Infecțiile tractului genital feminin (altele decât cele cu

transmitere sexuală)
Microbiomul vaginal al femeii mature este dominat de specii de Lactobacili care asigură
un pH acid de 4,5. Pe lângă acestea microbiomul conține specii variate de streptococi, enterococi,
stafilococi coagulazo-negativi, o multitudine de specii anaerobe și specii de Candida. Bacteriile

216
prezente în cantități mari în cazul vaginozei bacteriene, cum ar fi anaerobii, Gardnerella vaginalis,
Mobiluncus spp., Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis pot fi prezente în număr redus
în condiții normale.
Vaginita candidozică apare în condițiile unor schimbări ale florei vaginale care
favorizează multiplicarea excesivă a speciilor de Candida. Factorii care favorizează multiplicarea
lor pot fi:
- tratamente antibiotice
- diabet zaharat
- imunosupresie
- utilizarea anticoncepționalelor orale
- obezitatea
- sarcina
Examenul microscopic este suficient de cele mai multe ori pentru stabilirea diagnosticului.
În cazul infecțiilor recurente, rebele la tratament se recomandă cultivarea și identificarea speciei
de Candida și antifungigramă în cazul speciilor non-albicans.
Vaginita în prepubertate poate fi cauzată de streptococi 𝛽-hemolitici de grup A (SGA) și
de Staphylococcus aureus. Ocazional, SGA poate cauza vaginită cu leucoree purulentă și la adulți.
Vaginita atrofică se poate dezvolta în menopauză. Nivelul redus de estrogen duce la
scăderea glicogenului și implicit a producerii acidului lactic cu creșterea pH-ului vaginal. Se
caracterizează prin absența lactobacililor, apariția unei flora bacteriene mixte și prezența
leucocitelor polimorfonucleare.
Vaginoza bacteriană (VB) reprezintă o alterare a microbiomului vaginal ce constă din
reducerea numărului sau dispariția lactobacililor, aceștia fiind înlocuiți de o floră anaerobă mixtă.
Reacția inflamatorie nu este caracteristică, iar pH-ul secreției vaginale depășește 4,5. VB este de
multe ori asimptomatică. În cazurile simptomatice apare o leucoree cu miros caracteristic de pește.
La femeile gravide poate cauza amniotită, naștere prematură, greutate scăzută a fătului la naștere,
endometrită postpartum, boală pelvină inflamatorie, infecții de tract urinar.
Suspiciunea VB se ridică în cazul prezenței unei leucoree alb-cenușie, omogenă, aderentă
de peretele vaginal, cu pH>4.5 și cu un miros de pește care se intensifică la adăugarea de KOH
10% (amine sniff test). În preparatul nativ efectuat din secreția vaginală se observă lipsa
lactobacililor, a granulocitelor și prezența celulelor ”clue” (celule țintate).
Bacteriile asociate cu VB, cum ar fi Prevotella spp., Gardnerella vaginalis, Mobiluncus
spp. și micoplasmele urogenitale sunt dificil de cultivat. Diagnosticul se bazează fie pe criteriile
mai sus menționate, fie pe scorul Nugent pe frotiul colorat Gram, descris mai jos.
Vulvovaginita se dezvoltă preponderent în prepubertate, însă se poate întâlni la orice
vârstă. Pe lângă Candida spp. pot fi implicate în etiologie SGA, Staphylococcus aureus,
Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae. Frotiul vaginal relevă prezența granulocitelor.
Semnificația clinică a streptococilor 𝛽-hemolitici de grup B (SGB) - colonizează
vaginul la cca 30% dintre femei. În cursul gravidității, SGB poate cauza amniotită (infecția
lichidului amniotic), ruperea prematură a membranelor și infecția nou-născutului: sepsisul,
meningita sau pneumonia neonatală. Infecțiile neonatale pot fi prevenite prin depistarea colonizării
cu SGB și aplicarea profilaxiei intrapartum.
Infecțiile cu Listeria monocytogenes pot fi grave la gravide, manifestate printr-o boală
febrilă sau chiar sepsis. Transmis transplacentar afectează fătul și poate duce la decesul intrauterin
al acestuia. În cazul nașterilor vii de la mame infectate cu Listeria monocytogenes se dezvoltă
infecții neonatale severe: sepsis, meningite neonatale, amenințătoare ale vieții.

217
 Avortul septic implică infecții cu o floră bacteriană mixtă în care predomină anaerobii.
Bartholinita reprezintă inflamația glandelor Bartholin, ce se poate complica cu abcedare.
Agenții etiologici pot fi variați, incluzând anaerobi, N. gonorrhoeae și alte specii de neisseria,
streptococi, enterobacterii, S. aureus, H. influenzae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma
hominis.
Cervicita mucopurulentă implică inflamația epiteliului columnar. Patogenii cu rol cert în
procesul infecțios sunt cei cu transmitere sexuală: C. trachomatis, N. gonorrhoeae și herpes
simplex. Pe lângă acestea, rolul micoplasmelor urogenitale este controversat. Bacteriile implicate
în cervicită pot cauza infecții ascendente.
În cazul cervicitei se evidențiază o secreție endocervicală mucopurulentă gălbuie.
Examenul microscopic al acesteia relevă prezența polimorfonuclearelor.
Endometrita reprezintă inflamația endometrului. Poate fi cauzată de C. trachomatis, N.
gonorrhoeae, Mycobacterium tuberculosis.
Cel mai adesea, endometrita se dezvoltă postpartum (endometrita puerperală). Etiologia
acesteia este de obicei mixtă și include anaerobii, streptococii 𝛽-hemolitici, S. aureus,
enterobacteriile, G. vaginalis, M. hominis, C. trachomatis și enterococii.
În endometrite hemoculturile se pozitivează în 10-30% din cazuri. Valoarea culturilor
efectuate din secrețiile endocervicale este incertă din cauza riscului crescut de contaminare a
probelor cu flora vaginală. În endometrita non-puerperală se recomandă diagnostic molecular
pentru C. trachomatis și N. gonorrhoeae.
Salpingita este infecția trompelor uterine. Uneori polimicrobiană, etiologia acesteia
include: C. trachomatis, N. gonorrhoeae, M. hominis, anaerobi, specii aerobe, facultativ anaerobe.
Produsele recoltate din cervix sunt relevante doar pentru depistarea infecțiilor cauzate de C.
trachomatis și N. gonorrhoeae, restul spectrului etiologic necesită probe recoltate intraoperator
din salpinge.
Boală inflamatorie pelvină (BIP) include endometrita, salpingita, peritonita pelvină,
caracterizate de dureri cronice, sarcini extrauterine, infertilitate, piosalpinx, abcese tubo-ovariene.
Produsele acceptabile pentru diagnostic sunt cele aspirate din trompa uterină intraoperator.
Cauzele cele mai frecvente sunt: C. trachomatis, N. gonorrhoeae, anaerobii, SGB și alți
streptococi, Escherichia coli, G. vaginalis, Actinomyces israelii, H. influenzae, M. hominis. Aceste
infecții pot fi polimicrobiene.
Infecțiile asociate cu utilizarea dispozitivelor intrauterine sunt cauzate cel mai frecvent
de Actinomyces israelii și de diverse bacterii Gram-pozitive și Gram-negative în floră mixtă.
Examenul bacteriologic se recomandă doar în prezența simptomatologiei sugestive pentru BIP sau
alte boli inflamatorii.

IV. Infecțiile tractului genital masculin

Prostatita acută sau cronică poate fi cauzată de enterobacterii, C. trachomatis, N.
gonorrhoeae și streptococi. Rolul patogenilor cu transmitere sexuală este insuficient demonstrat.
Epididimita și epididimo-orhita ce apare în adolescență și la adultul tânăr (până la 40 de
ani) cel mai frecvent se datorează patogenilor cu transmitere sexuală, în special C. trachomatis și
M. genitalium.
Balanita este inflamația glandului, iar balanopostita a glandului și a prepuțului. Pot fi
cauzate de levuri, virusul herpetic, SGA, SGB, S. aureus, anaerobi.

218
V. Recoltarea probelor biologice de la nivelul tractului
genital
Tipurile de probe prelucrate: secreție vaginală din fundul de sac vaginal recoltat cu
tamponul, secreție vaginală, tampon vulvar, secreție cervicală recoltată pe tampon, secreție
endocervicală recoltată pe tampon, tampon uretral, tampon din șanțul balano-prepuțial, secreții din
ulcere genitale recoltate pe tampon, spermă, aspirate din abcese Bartholin, conținutul trompei
uterine, puroi din abcese ovariene, dispozitiv intrauterin, lichid din sacul Douglas.

Condițiile de recoltare a probelor

În cazul suspiciunii de infecție cu N. gonorrhoeae se recomandă însămânțarea probelor
imediat după recoltare, la patul bolnavului. Orice întârziere în transportul probelor trebuie evitată,
durata transportului trebuie redus la minim deoarece este unul dintre cei mai importanți factori
care influențează succesul cultivării.
În cazul infecției cu Haemophilus ducreyi se recomandă de asemenea însămânțarea la patul
bolnavului.
Secreția cervicală și secreția vaginală din fundul de sac vaginal trebuie recoltate cu ajutorul
valvelor sau a speculumului. Este important de evitat contaminarea cu flora vulvară.
În cazul secrețiilor cervicale este important de evitat și contaminarea cu flora vaginală. În
acest scop, înainte de recoltarea propriu-zisă se curăță suprafața externă a colului cu un tampon
diferit de cel folosit pentru recoltare.
Pentru depistarea infecției cu Trichomonas vaginalis se recoltează din fundul de sac
vaginal, iar în cazul suspiciunii de infecții micotice, din placardele evidente (dacă sunt prezente).
Pentru screeningul portajului de SGB se recomandă recoltarea a 2 tampoane: unul din secreția din
treimea inferioară a vaginului și un tampon anal.
Pentru diagnosticul VB se recomandă efectuarea unor frotiuri din secreția vaginală care
vor fi uscate la aer înainte de trimitere în cutii de transport lame.
Pentru examen virusologic și pentru depistarea C. trachomatis se recoltează produse
separate.
Recoltarea secreției uretrale se face cu ajutorul unor tampoane speciale, mai subțiri decât
tamponul faringian, cel puțin după o oră de la ultima micțiune. În cazul bărbaților, în absența unei
secreții evidente se încearcă presarea ușoară a penisului pentru obținerea secreției prin uretră.
Tamponul se trece ușor prin meat, se rotește pentru obținerea produsului.
Dispozitivele intrauterine îndepărtate se trimit integral, plasate într-un pahar steril cu capac
filetat.
Tampoanele rectale se recoltează în cursul rectoscopiei.
Exudatul faringian se recoltează de pe suprafața amigdalelor și de pe mucoasa peretelui
posterior al faringelui, după un repaus alimentar de cel puțin trei ore.
Probele purulente recoltate intraoperator din trompele uterine sau abcesele ovariene se
transferă în recipiente sterile și se închid ermetic. Cantitatea optimă a acestora este peste 1 mL.
Având în vedere că aceste probe pot conține germeni anaerobi, se recomandă recipiente de
transport speciale pentru anaerobi sau în lipsa acestora probele trebuie transportate fără întârziere.

219
 Probele recoltate pe tampon trebuie introduse în mediu de transport cu cărbune (necesar
pentru permiterea supraviețuirii N. gonorrhoeae) pe durata transportului.

VI. Examenul microbiologic

Examenul microscopic
Examenul nativ (preparatul între lamă și lamelă) al secreției vaginale poate fi utilizat pentru
detectarea Trichomonas vaginalis, a prezenței levurilor și pentru diagnosticul vaginozei bacteriene
(descris mai sus). Se poate efectua imediat după recoltare plasând o picătură de secreție pe lamă și
acoperind-o cu o lamelă. Alternativ, se poate efectua din tamponul cu care s-a efectuat recoltarea
(efectuând o suspensie în ser fiziologic).
Preparate colorate din secreții vaginale
Se întinde un frotiu din secreția vaginală, se usucă la aer și se colorează Gram. În cadrul
examenului microscopic se urmărește:
- flora bacteriană vaginală
- scorul Nugent, prezența celulelor țintate
- prezența leucocitelor și a eventualilor diplococi fagocitați;
- prezența celulelor levurice, a pseudohifelor, a Trichomonas vaginalis
Pe preparatele colorate Giemsa sau MGG se pot urmării leucocitele, celulele țintate,
Trichomonas vaginalis. Nedetectarea T. vaginalis la examenul microscopic nu exclude infecția!
Scorul Nugent de 7-10 confirmă diagnosticul de vaginoză bacteriană.

Tabelul 3. Criteriile Nugent

Scor Morfotip de Lactobacillus Morfotip de Morfotip Mobiluncus
Gardnerella (cocobacili (bacili Gram-variabili
Gram-negativi) încurbați)

Nr. mediu de Nr. mediu de Nr. mediu de

bacterii/câmp (x1000) bacterii/câmp (x1000) bacterii/câmp (x1000)

0 >30 0 0

1 5-30 <1 1-5

2 1-4 1-4 >5

3 <1 5-30 -

4 0 >30 -
Scorul Nugent se calculează adunând scorurile obținute la cele trei categorii de morfotipuri.

În cazul vaginitelor se observă peste 10 granulocite/câmp (cu mărire x1000) și sunt

prezente mai multe granulocite decât celule epiteliale. Lactobacilii pot fi înlocuiți cu un singur

220
morfotip bacterian sau se observă prezența Trichomonas vaginalis sau a levurilor. Se recomandă
testare suplimentară pentru C. trachomatis, N. gonorrhoeae și M. genitalium prin teste moleculare.
Preparate colorate din secreția uretrală recoltată de la bărbați sau secreția
endocervicală în caz de suspiciune de gonoree.
Se prepară un frotiu subțire și se colorează Gram. Se urmăresc granulocitele și prezența
diplococilor Gram-negativi intra- și extracelulari.
Examenul microscopic al aspiratelor și probelor de puroi
Aspiratele se centrifughează la 1500 g timp de 10 minute. Supernatantul se aruncă, lăsând
cca 0,5 ml în care se resuspendă sedimentul. Din această suspensie se prepară un frotiu, întinzând
o picătură pe suprafața lamei. După uscare se colorează Gram. Din probele de puroi se întinde un
frotiu subțire și se colorează Gram.
Dispozitive intrauterine
Suprafața dispozitivului se șterge cu un tampon umectat în ser fiziologic steril. După
însămânțarea mediilor de cultură, cu acest tampon se întinde un frotiu. Se colorează Gram. Dacă
sunt prezente secreții purulente sau exudate, frotiul se prepară din acestea.

Cultivarea
Mediile de cultură și condițiile de cultivare în funcție de situațiile clinice și tipul de produs
sunt descrise în tabelele 4 și 5.

221
 Tabelul 4. Mediile de cultură utilizate și condițiile de cultivare în funcție de situațiile clinice
Situația clinică Produsul recoltat Medii de cultură Condiţii de incubare Citirea Microorganisme
standard culturii ţintă

Temp oC Atmosferă Timp h

Vaginită candidozică Secreție recoltată cu Agar Sabouraud 35-37 Aerobă 40- 48 ≥40 Levuri
recurentă rebelă la tampon din fundul de
tratament sac vaginal

Screening portaj Secreție vaginală din Agar sânge 35-37 5-10% CO2 16- 24 16-24
streptococi 𝛽- treimea inferioară a SGB
hemolitici de grup B vaginului
la gravide (efectuată ȘI
între săptămânile 35- tampon rectal

222
37 de graviditate) Mediu de îmbogățire 35-37 aerobă 16-24 - SGB
selectiv pentru SGB
(bulion LIM)
Treceri pe agar sânge

Cervicită Secreție endocervicală Agar sânge 35-37 5-10% CO2 16- 24 16-24 Staphylococcus
Uretrită sau uretrală recoltată cu aureus
tampon și transportate Streptococi 𝛽-
în mediul Amies cu hemolitici de grup
cărbune A, C sau G

Agar Sabouraud 35-37 aerobă 40- 48 ≥40 Levuri

Agar selectiv GC (cu 35-37 5-10% CO2 40- 48 ≥40 N. gonorrhoeae

substanță
antifungică)

223
ITS Orice produs recoltat Agar selectiv GC (cu 35-37 5-10% CO2 40- 48 ≥40 N. gonorrhoeae
pe tampon substanță
antifungică)

Suspiciune de Secreție vaginală din Mediu special pentru 35-37 aerobă 40- 48 ≥40 T. vaginalis
trichomoniază fundul de sac vaginal T. vaginalis

La gravide: Secreție canal cervical Agar chocolat 35-37 5-10% CO2 40- 48 Zilnic H. influenzae
Iminență de naștere
prematură
Ruptura
membranelor de peste
12 ore
Agar sânge 35-37 5-10% CO2 16- 24 16-24
SGB

CLED sau 35-37 aerobă >16 >16

MacConkey E. coli

224
Decesul intrauterin al Țesut mojarat Agar sânge selectiv 35-37 anaerobă 40- 48 ≥40 Anaerobi
fătului pentru anaerobi (cu
neomicină)
Avort septic
Secreție cervicală

Agar CLED 35-37 aerobă ≥16 ≥16 Enterobacterii

Pseudomonas

Suspiciune de Secreție vaginală din Agar sânge 35-37 Aerobă 40-48 Zilnic Listeria
listerioză fundul de sac vaginal monocytogenes

Fete sub 10 ani Secreție vaginală Agar chocolat 35-37 5-10% CO2 40- 48 Zilnic H. influenzae

Actinomicoză Secreție vaginală Agar sânge 35-37 Anaerobă 10 z ≥40, 7 și Actinomyces spp.
(suspiciune clinică recoltată cu tampon din 10 z
sau pe baza frotiului) fundul de sac vaginal

Sau

Dispozitiv intrauterin

Șancru moale Secreție din șancru Agar chocolat 33-34 5-10% CO2 5 z 5z Haemophilus
ducreyi
Aspirat din bubon

225
 Tabelul 5. Mediile de cultură utilizate și condițiile de cultivare pentru: aspirate/puroaie sau produse recoltate pe tampon din
abcese tubo-ovariene, din trompa uterină, glanda Bartholin, probe intraoperatorii, dispozitive intrauterine

Situația clinică Medii de Condiţii de incubare Citirea culturii Microorganisme ţintă

cultură
standard
Temperatură Atmosferă Timp h
o
C

BIP Agar chocolat 35-37 5-10% CO2 40- 48 Zilnic H. influenzae

Salpingită
Abces tubo-ovarian

Abcesul glandei Agar sânge 35-37 5-10% CO2 40- 48 Zilnic S. aureus
Bartholin Streptococi
Piosalpinge Enterobacterales

Dispozitiv Agar sânge 35-37 Anaerobă 10 z ≥40, 7 și 10 z Actinomyces spp.

intrauterin (în
prezența semnelor
de infecție)
Agar sânge 35-37 Anaerobă 5z ≥40 și 5 z Anaerobi
pentru anaerobi

Agar selectiv GC 35-37 5-10% CO2 40- 48 Zilnic N. gonorrhoeae

Actinomicoză Agar sânge 35-37 Anaerobă 10 z ≥40, 7 și 10 z Actinomyces spp.

(suspiciune clinică
sau pe baza frotiului)

226
Nivelul minim de identificare ai patogenilor izolați
- Actinomyces: actinomycete;
- Streptococii 𝛽-hemolitici: grup Lancefield;
- Enterobacterii: specie;
- Haemophilus: la nivel de specie;
- Listeria: la nivel de specie;
- Neisseria: la nivel de specie;
- Pseudomonade: Pseudomonas aeruginosa și pseudomonade
- S. aureus: la nivel de specie;
- Levuri: specie;

227
Testarea sensibilității față de antibiotice
Se efectuează doar pentru germenii semnificativi, conform standardului EUCAST.

VII. Raportarea rezultatelor

Frotiurile colorate Gram

Se raportează:
- prezența leucocitelor,
- prezența levurilor,
- prezența sau absența diplococilor Gram-negativi,
- prezența T. vaginalis.
- prezența celulelor țintate pe frotiurile vaginale și dacă frotiul indică vaginoză bacteriană.
La solicitarea clinicianului se poate raporta scorul Nugent:
- Scor Nugent 0-3: aspect normal
- Scor Nugent 4-6: sugestiv pentru VB - se solicită repetarea testării
- Scor Nugent ≥7: VB
Rezultatele urgente se comunică telefonic sau electronic.
Rezultatul examenului microscopic se introduce în fișa electronică și se validează imediat
ce este disponibil.

Cultivare
Se raportează izolatele clinic semnificative sau
alte creșteri (de ex. ”Flora comensală”) sau
absența unor microorganisme specifice (se denumesc cele urmărite) sau
absența creșterii microbiene.
Rezultatele urgente se comunică telefonic sau electronic.
Rezultatul în scris se eliberează în 16-72 de ore.

VIII. Bibliografie
de Barbeyrak B, Skov-Jensen J: Sexually transmitted infections. In European Manual of
Clinical Microbiology, editors Cornaglia G, Courcol R, Hermann JL, Kahlmeter G, Publisher
SFM, 2012:21-28.
Public Health England. (2017). Investigation of Genital Tract and Associated Specimens.
UK Standards for Microbiology Investigations. B 28 Issue 4.6.
Public Health England. (2013). Sexually Transmitted Infections. UK Standards for
Microbiology Investigations. S 6 Issue 1.2. http://www.hpa.org.uk/SMI/pdf.

228
 Diagnosticul microbiologic al infecțiilor oculare

I. Introducere
Infecțiile oculare pot duce la pierderea unor structuri sau funcționalități, parțial sau total.
Infecţiile oculare pot fi determinate de o varietate de microorganisme. Tampoanele
recoltate pot fi contaminate cu flora tegumentară, în acelaşi timp orice microorganism izolat poate
fi la un moment dat implicat etiologic.
Microorganismele pot infecta ochiul fie pe cale exogenă (prin intermediul mâinilor,
lentilelor de contact, traumatismelor sau postoperator), fie pe cale hematogenă.

II. Context clinic

Conjunctivita
Cea mai frecventă infecție oculară este conjunctivita, determinată de inflamația
conjunctivei.
Conjunctivita poate surveni în asociere cu infecția pleoapei (blefaroconjunctivită) sau a
corneei (keratoconjunctivită). Inflamația pleoapelor se numește blefarită.
Infecțiile mai puțin frecvente și mai severe includ cheratita (inflamația corneei) și
endoftalmită (infecție în interiorul globului ocular). Alte infecții perioculare includ dacrioadenita
(inflamația glandei lacrimale), dacriocistita (inflamația sacului lacrimal), canaliculită (infecția
punctului lacrimal și a canalului lacrimal) și celulită preseptală și orbitală. Hipopionul este o
afecțiune asociată cu un exsudat leucocitar, prezent în camera anterioară a ochiului, de obicei
însoțit de hiperemia conjunctivei și a episclerei subiacente.
Conjunctivita poate fi acută sau cronică. Bacteriile cel mai frecvent implicate în etiologia
infecțiilor la adulți sunt:
- Staphylococcus aureus
- Streptococcus pneumoniae
- Haemophilus influenzae
Conjunctivita la nou-născuți este cauzată de microorganismele întâlnite frecvent la adulți,
în plus se pot întâlni:
- Neisseria gonorrhoeae
- Haemophilus parainfluenzae
- Streptococi din grupul Lancefield și enterococi
- Enterobacterales, de exemplu Klebsiella pneumoniae și Proteus mirabilis
- Pseudomonas aeruginosa.

Cheratita
Cheratita este o infecție a corneei. Aceasta este o afecțiune gravă care necesită intervenție
promptă și un diagnostic microbiologic meticulos. Ea poate evolua către perforație și orbire în
lipsa unui tratament corect. Infecția inițială cu cheratită poate evolua până la endoftalmită dacă

229
este tratată necorespunzător. Factorii predispozanți sunt: uzura lentilelor de contact urmată de
boală oculară preexistentă, inclusiv cheratită determinată de herpes simplex, traumatism ocular,
chirurgie oculară, chirurgie cu laser și utilizarea steroizilor topici. Cheratita poate fi determinată
de o gamă largă de bacterii, fungi și paraziți:
- Stafilococi
- Streptococi
- Pseudomonade
- Enterobacterales
- Corynebacterium spp.
- Moraxella spp.
- Haemophilus spp.
- Neisseria gonorrhoeae
- Acanthamoeba spp.
- Aspergillus spp.
- Candida spp.
- Fusarium spp.
- Propionibacterium spp., Cutibacterium acnes

Endoftalmita infecțioasă
Endoftalmita infecțioasă este relativ rar întâlnită, dar infecția lichidelor și țesuturilor
intraoculare poate pune în pericol vederea. Se poate dezvolta ca urmare a unei intervenții
chirurgicale, traumatism, sau prin diseminarea hematogenă a microorganismelor. Cele mai
potrivite produse biologice pentru investigarea endoftalmitei sunt lichidele intraoculare (umoarea
apoasă din camera anterioară și umoarea vitroasă din cavitatea / corpul vitros). De asemenea se
pot recolta tampoane. Microorganismele cel mai frecvent implicate sunt:
- Stafilococi coagulazo-negativi
- Staphylococcus aureus
- Streptococi
- Cutibacterium acnes
- fungi
Endoftalmita acută post-operatorie apare în decurs de 1 până la 7 zile de la intervenția
chirurgicală. Sursa infecției este de obicei flora bacteriană prezentă pe suprafața oculară sau a
pleoapei pacientului. Acest lucru face dificilă diagnosticarea prin cultură.
Deși practic orice microorganism poate provoca infecții, cel mai frecvente izolate sunt:
- Stafilococi coagulază negativi
- Staphylococcus aureus
- Streptococi
- Enterobacterales
- Pseudomonas aeruginosa
- Cutibacterium acnes
Endoftalmita asociată chirurgiei glaucomului poate fi localizată la nivelul bulei de filtrare
(„blebită”) sau se poate prezenta ca infecție intraoculară fulminantă. Ea poate să apară la săptămâni
sau ani după operația inițială, inclusiv după vitrectomie prin pars plana, keratoplastie perforantă
sau chirurgia glaucomului cu sisteme de drenaj.
Lista de microorganisme responsabile este similară cu cea enumerată mai sus.

230
 Endoftalmita cronică apare după luni sau chiar ani de la intervenția chirurgicală
intraoculară. Pacienții prezintă de obicei o uveită persistentă ușoară sau se pot prezenta ca
endoftalmita acută. Microorganismele implicate sunt:
- Cutibacterium acnes
- Stafilococi coagulazo-negativi
- Corynebacterium spp.
- fungi
- Pseudomonas aeruginosa
- Staphylococcus aureus
- Mycobacterium spp.
Endoftalmita posttraumatică apare după leziuni de penetrare sau perforare oculară. Această
afecțiune este mult mai gravă dacă leziunea penetrantă conține și material organic. Poate fi
determinată de orice microorganism, exemple mai cunoscute fiind:
- Bacillus cereus
- fungi
- Streptococi
- Clostridium spp.
- Microsporidium spp.
Endoftalmita endogenă este rară și apare la pacienții cu bacteriemie sau fungemie, se
asociază frecvent cu terapia imunosupresivă, abuz de droguri injectabile sau proceduri chirurgicale
invazive. În aceste situații sunt indicate hemoculturile. Microorganismele implicate sunt:
- fungi
- Staphylococcus aureus
- Streptococi
- Enterobacterales
- Bacillus spp.

Uveita
Uveita poate fi parte a unei infecții sistemice de origine bacteriană (Borrelia spp.,
Treponema pallidum, micobacterii), virală sau parazitară (toxoplasmoză, toxocara). Toxoplasma
gondii este principala cauză de corioretinită.

Celulita orbitală
Celulita orbitală este infecția țesutului orbital. Se poate produce prin traumatisme,
intervenții chirurgicale sau diseminarea infecțiilor sinusurilor paranazale. Este o infecție gravă și
poate provoca orbire, tromboză septică a sinusului cavernos sau infecții intracraniene.
Microorganismele cel mai frecvent izolate la adulți sunt S. aureus, streptococii și anaerobii.
La copii Haemophilus influenzae rămâne pe primul loc, dar în urma introducerii programului de
vaccinare tulpina capsulată (tip b) este rar intâlnită. Streptococii, stafilococii, peptostreptococii și
Pseudomonas aeruginosa pot cauza necroză. Fungii sunt o cauză rară, Zigomicetele pot determina
infecții la imunodeprimați, diabetici sau pacienți cu infecție posttraumatică a sinusurilor.
Recoltarea pe tampon are o valoare limitată în diagnosticul microbiologic al celulitei orbitale și
preseptale. Ideal trebuie recoltate aspiratele din zonele afectate.

231
Canaliculita
Canaliculita este o afecțiune rară. Infecțiile sunt de obicei cronice și cauzate de
actinomicete anaerobe precum Actinomyces israelii sau de Propionibacterium propionicum,
Nocardia sau fungi.
Pentru diagnostic se recoltează probe de puroi canalicular cu tamponul.

Blefarita
Blefarita este un proces inflamator acut sau cronic al pleoapelor care se poate asocia cu
conjunctivită și cu alte infecții oculare. De obicei nu se recoltează probe, cu excepția cazului în
care se asociază cu alte infecții oculare. Bacteriile care pot fi implicate în această infecție sunt:
- Staphylococcus aureus
- Staphylococcus epidermidis
- Specii de streptococi
- Moraxella spp.
- Corynebacterium spp.
- Cutibacterium acnes
Pe lângă acestea pot fi implicați și fungi (Pityrosporum ovalae), Demodex folliculorum.
Aceste microorganisme pot fi izolate și de pe pleoapele sănătoase, necesitând o interpretare
atentă a acestor culturi.

Infecții specifice
Chlamydia trachomatis
Conjunctivita de incluziune și trahomul sunt determinate de diferite serotipuri de
Chlamydia trachomatis. Trahomul este asociat cu serotipurile A-C. Aceste serotipuri sunt asociate
cu transmiterea sexuală și pot provoca, de asemenea, infecții la nou-născuți

Protozoare
Speciile de Acanthamoeba pot provoca cheratită severă, de obicei la purtătorii de lentile de
contact sau după un traumatism ocular. Dacă nu este tratată prompt, infecția poate duce la ulcerații
corneene și chiar la orbire. Aceste protozoare pot fi izolate din țesutul corneei, precum și din
lentilele de contact. Cu toate acestea, speciile Acanthamoeba pot să fie izolate din lichidul de
păstrare a lentilelor de contact de la persoane fără semne sau simptome de boala. Diagnosticul se
poate face prin biologie moleculară.

Scopul investigației microbiologice în infecțiile globului ocular și ale

anexelor
Testarea pentru depistarea etiologiei se face în următoarele situații:
- Infecție acută severă a corneei sau conjunctivei sau infecție cronică rezistentă la tratamentul
empiric
- Ulcer, keratită sau abces corneean, atunci când există criterii de severitate sau suspiciune de
infecție fungică sau amoebiană
- Suspiciune de endoftalmită acută sau cronică, uveită sau retinită necrozantă
232
- Tratament chirurgical pentru infecții ale anexelor globului ocular
- Boală ocupațională
- Context epidemiologic

III. Recoltarea și transportul probelor

Tipuri de probe
Se recoltează: secreție conjunctivală, puroi canalicular, umoare apoasă și vitroasă,
fragmente de cornee, cutii pentru lentile de contact și lichid de curățare a lentilelor de contact.

Timpi optimi, metode de recoltare

Probele cele mai utile pentru diagnostic se recoltează de către oftalmolog în sala de operație
și se însămânțează direct pe medii de cultură.
Se colectează probe înainte de terapia antimicrobiană, acolo unde este posibil.
Se recoltează înainte de spălarea feței și fără machiaj.
Raclajul corneei și lichidele intraoculare vor fi colectate de un chirurg oftalmolog.
Secreția conjunctivală se recoltează de la unghiul intern al ochiului cu tamponul.
Raclatul conjunctival se recoltează de pe fața internă a pleoapelor.
Trahom: se întoarce pleoapa și se identifică zonele cu foliculi, inflamație, leziuni – se
raclează zona cu insistență.
Raclajul corneean se obține de la baza și marginile abcesului, după debridare și
îndepărtarea materialului necrotic.
Endoftalmită, necroză retiniană, uveită: se recoltează lichid vitros prin aspirație sau tesut
vitros (în caz de endoftalmită este mai indicat decât umoarea apoasă); probele de conjunctivă,
raclajul din leziune au valoare mică în diagnosticul etiologic al endoftalmitei.
În cazul endoftalmitei endogene trebuie investigată prezența punctului de intrare sau a unui
alt focar metastatic.
Dacriocistită – se recoltează puroiul exprimat din canalul lacrimal.
Gene – se recoltează 8-10 gene într-un recipient steril care se trimite rapid la laborator.
Datorită cantităților mici de material implicat, este mai indicat ca inocularea plăcilor și
pregătirea frotiurilor să se facă lângă pacient. Ar trebui ca laboratoarele să stabilească un protocol
pentru recoltarea probelor, inocularea mediilor și transportul către laborator cu oftalmologii și să
furnizeze materialele necesare în acest scop.
Orice secreție purulentă disponibilă ar trebui prelevată. De asemenea, poate fi util
însămânțarea lentilei de contact în sine, precum și cutia lentilelor de contact, împreună cu soluțiile
de curățare disponibile.
Trebuie recoltate probe separate în medii de transport adecvate pentru detectarea
virusurilor sau Chlamydia trachomatis, acolo, unde aceste investigații sunt disponibile.
Tampoanele nu sunt preferate deoarece cantitatea de produs este foarte mică și poate fi
absorbit în tampon.

Cantitatea adecvată și numărul adecvat de probe

Numărul și frecvența recoltării eșantioanelor depind de starea clinică a pacientului.
233
 În cazul în care cantitatea de probă este insuficientă pentru a efectua atât culturi cât și
frotiuri, se preferă efectuarea culturilor.

Transportul și păstrarea probelor

Eșantioanele trebuie transportate și prelucrate cât mai curând posibil. Dacă procesarea este
întârziată, refrigerarea este preferabilă depozitării la temperatura ambiantă.
Dacă probele pentru investigarea amibelor nu pot fi procesate în decurs de 8 ore, este
preferabil să le depozitați la temperatura ambiantă.
Nu congelați probele, cu excepția celor care se păstrează pentru efectuarea testelor
moleculare.

IV. Examenul microbiologic

Pregătirea probelor
Probele lichide se centrifughează, din sediment se fac frotiuri care se colorează Gram și
se însămânțează pe medii de cultură și dispersate cu o ansă sterilă pentru obținerea coloniilor
izolate. Inoculați fiecare placă de agar cu tampon sau secreție purulentă.
Dacă este disponibil material suficient, trebuie inoculate și medii de îmbogățire.
Raclajul cornean
Plăcile de agar pot fi inoculate direct lângă pacient. Apoi vor fi transportate imediat la
laborator în vederea incubării. În laborator se va face diseminarea cu o ansă sterilă pentru obținerea
coloniilor izolate.
Soluțiile pentru lentile de contact
Se transferă fluidul din cutia de depozitare a lentilelor de contact într-un recipient steril. Se
procesează la fel ca pentru produsele lichide.
Se șterge bine interiorul cutiei de depozitare cu un tampon steril cu vârf de bumbac umezit
cu apă distilată sterilă. Se exprimă lichidul din tampon în fluidul din recipientul steril. Se
centrifughează la 800 x g timp de 5 minute. Folosind o pipetă sterilă, se aruncă supernatantul în
dezinfectant, lăsând aproximativ 0,5 ml depozit centrifugat. Se resuspendă depozitul centrifugat
în lichidul rămas și se pun 2 picături în centrul plăcii cu mediu de cultură.
Un eșantion poate fi păstrat congelat pentru teste moleculare.
Se recoltează probe separat pentru detectarea virusurilor. Raclajul cornean trebuie
investigat pentru prezența speciilor Acanthamoeba în caz de suspiciune clinică (de exemplu,
utilizarea lentilelor de contact sau ulcerații corneene).
Frotiurile și mediile pentru detectarea speciilor de Mycobacterium se procesează conform
procedurilor specifice pentru micobacterii.

Examenul microscopic
Se efectuează frotiuri colorate Gram.

Cultivare

234
 Tabelul 1. Prelucrarea probelor - mediile de cultură și condițiile de cultivare
Detalii Tipul de Medii Condiții de incubare Citirea Microorganisme
clinice probă de T oC Atmo- Timp culturilor țintă
cultură sfera
Conjunctivită Toate Agar 35-37 5-10% 40-48 h Zilnic Haemophilus
Ochi ”lipiți” tipurile sânge CO2 influenzae
(cu secreții) streptococci grup
Agar 35-37 40-48 h Zilnic Lancefield A, B,
Dacă nu chocolat 5-10% C și G
există CO2 Moraxella spp.
detalii clinice Neisseria
disponibile, gonorrhoeae
tratați ca pe Neisseria
un „ochi cu meningitidis
secreții” Pseudomonas
aeruginosa
Blefarită Staphylococcus
(asociat cu aureus
alte infecții) Streptococcus
pneumoniae
alte
microorganisme
Pentru următoarele situații se adaugă:
Ochi ”lipiți” Tampon Agar 35-37 5-10% 40-48 h ≥40 h N. gonorrhoeae
(cu secreții) selectiv CO2
în cadrul gonococ
afecțiunilor
genitourinare

Nou-născuți
Imunodeprim Tampon Agar 28-30 aerob 40-48 h ≥40 h Fungi
ați Saboura
ud
blefarită
cronică
Canaliculită puroi Agar 35-37 anaerob 40-48 h, ≥40 h Anaerobi
Celulita canalicular, anaerobi poate fi
orbitală umoare fastidioș prelungită
Dacriocistita apoasă i până la 5
Dacrioadenit și zile
ă vitroasă,
Keratita raclaj
Endoftalmita corneean 10 zile (în ≥40 h, 7
Hypopyon caz de zile și 10 Actinomicete
suspiciune zile
clinică sau

235
După evidențiere
intervenții a bacililor
chirurgicale Gram-
Posttraumatic pozitivi
ramificați
in frotiul
Gram)
Bacili Gram- Toate Agar 35-37 aerob 16-24 h ≥ 16 h Enterobacterales
negativi tipurile CLED
prezenți în
frotiul Gram

Diagnosticul serologic – poate fi util în cazul uveitelor pentru diagnosticarea bolii Lyme,
sifilis, rickettsioză, borrelioză.
De asemenea se pot face teste PCR pentru: virusul herpes 1 și 2, varicelo-zosterian,
citomegalovirus, adenovirus, Acanthamoeba ș.a. în funcție de disponibilitate.

Testarea sensibilității la antibiotice

Testarea sensibilității la antibiotice se realizează conform capitolului respectiv și a ghidului
EUCAST versiunea actualizată.

V. Raportarea rezultatelor

Microscopie
Se comunică prezența leucocitelor și categoria microscopică a microorganismelor
detectate.
Se comunică prezența paraziților.
Rezultatul examenului microscopic se introduce în fișa electronică și se validează imediat
ce este disponibil.
Rezultatele urgente trebuie să fie transmise telefonic sau electronic, conform protocolului
local.

Cultura
Se comunică:
- Microorganismele izolate semnificative clinic sau
- Alte creșteri, de ex. „fără creștere semnificativă” sau
- Absența creșterii
Se raportează prezența sau absența speciilor Acanthamoeba, dacă este cazul.
Timpul de raportare a culturii:
- Cererile urgente: telefonic, imediat ce este disponibil.
- Raportul scris: 16–72 ore, precizând, în cazul rezultatelor parțiale, că va fi emis un alt raport.
- Pentru speciile Acanthamoeba, raportul scris în ziua a 4-a.

236
VI. Bibliografie
Bourcier T: Ocular infections. In European Manual of Clinical Microbiology, editors
Cornaglia G, Courcol R, Hermann JL, Kahlmeter G, Publisher SFM, 2012:203-214.
Public Health England. (2017). Investigation of Bacterial Eye Infections. UK Standards for
Microbiology Investigations. B 2 Issue 6.1.

237
 Depistarea portajului de germeni multidrog rezistenți
(MDR)

I. Introducere
Termenul de bacterie multidrog rezistentă se referă la prezența rezistenței dobândite la cel
puțin 1 antibiotic din cel puțin 3 clase de antibiotice.
Protocolul de screening este legat de epidemiologia locală și de riscul de transmitere şi se
bazează pe incidența fiecărui tip de bacterie MDR.
Se consideră bacterii MDR:
- Staphylococcus aureus meticilino-rezistent (MRSA)
- Enterobacterii rezistente la cefalosporinele de generația 3 (producătoare de ESBL sau AmpC),
- Enterobacterii rezistente la carbapeneme (CRE) sau producătoare de carbapenemaze (CPE)
- Pseudomonas aeruginosa multirezistent, rezistent la ceftazidim și/sau carbapeneme, în special
tulpinile producătoare de metalo-betalactamaze
- Acinetobacter baumannii multirezistent, mai rar alte specii de Acinetobacter
- Enterococi rezistenți la vancomicină, speciile Enterococcus faecalis și Enterococcus faecium
Bacteriile XDR (extensively drug-resistant) sunt bacteriile care au rămas sensibile numai
la 1-2 clase de antibiotice.
Bacteriile PDR (pandrug-resistant) sunt bacteriile la care se constată lipsa sensibilității la
toate clasele de antibiotice.
Scopul screening-ului este de a cunoaște statusul pacientului pentru:
- A lua măsuri suplimentare față de cele standard
- A identifica rapid orice transmitere în cadrul unității medicale
- A evalua epidemiologia locală
- A efectua decontaminarea nazală, cutanată sau intestinală pre-operatorie.
La ce pacienți este indicată depistarea portajului: vezi ghidul de epidemiologie;

II. Recoltarea probelor

Principiile generale de recoltare includ:

- Înainte de orice spălare sau dezinfecție (în cazul screeningului efectuat din leziuni recoltarea
se face ca în cazul plăgilor, după toaleta locală a plăgii);
- Cu tampoane și recipiente sterile;

Tipuri de probe:
- Tamponul nazal - se recoltează cu un singur tampon din ambele nări. Se plasează tamponul în
vestibulul nazal și se rotește de 5 ori.
- Tamponul inghinal: tamponul va fi rulat de mai multe ori în pliul dintre perineu și coapsă.
- Tampon din orice orice leziune cutanată/site-uri de cateter/site-uri de drenaj.

238
- Exsudat faringian, mai ales în cazul suspiciunii de portaj de lungă durată.
- Tampon rectal – tamponul se inseră 2-3 cm prin anus, pe tampon trebuie să fie urme vizibile
de materii fecale. Proba poate fi recoltată personal de pacient, asistenta verifică doar prezența
materiilor fecale pe tampon. Această probă poate fi înlocuită de probă de materii fecale.
- Materii fecale; la pacienții cu stomă recoltarea se face din orificiul stomei. Dacă însămânțarea
este prelungită până la 24 ore, tampoanele vor fi plasate în mediu de transport.
Pentru depistarea MRSA este indicată recoltarea a 2 tampoane: cu un tampon secreția
nazală iar cu al doilea tampon se șterg cele 2 axile și cele 2 zone inghinale (dreaptă și stângă).
Pentru ESBL probele de screening recomandate sunt tamponul rectal, perirectal sau materii
fecale (Tabelul 1)

Tabelul. 1. Tipurile de probe recoltate în funcție de bacteriile MDR urmărite

Tipul de bacterie Tipul de probă
MDR Tampon rectal Perineal/ Exsudat Tampon Altele
/ materii fecale inghinal faringian nazal
MRSA +a +++ +++ ++++ ++/+++b
VRE ++++ ++++ (+) - ++
Enterobacterii ++++ ++++ + - ++
MR
Acinetobacter +++ ++(++) ++++c (+) +++d
baumannii
MDR
Pseudomonas ++ +++ ++++c - +++d
aeruginosa
MDR
a – utilitate îndoielnică
b – aspirat traheal de la pacienți ventilați, probe din ulcere cronice, urină de la pacienți cu sondă
urinară, tampon axilar
c – spută și exsudat de la traheostomă în loc de exsudat faringian
d – în special probe de secreții din plăgi.

III. Prelucrarea probelor

Metodele utilizate au drept scop obținerea unui rezultat rapid care să poată ghida măsurile
de control a răspândirii tulpinii identificate.

Metode de screening:
a. cultura pe medii solide turnate în plăci Petri. Mediile selective cromogene oferă în același
timp indicații atât asupra speciei bacteriene cât și asupra rezistenței. Există medii comerciale
pentru depistarea MRSA, VRE, ESBL, CRE și de asemenea pentru Acinetobacter baumannii MR.
Pentru depistarea tulpinilor producătoare de ESBL se pot folosi și plăci cu agar CLED sau
MacConkey cu disc de cefalosporină, metodă care va fi validată local.
b. prin tehnici de biologie moleculară - se depistează rapid gene de rezistență

239
 c. prin îmbogățire - se poate face o îmbogățire în bulion nutritiv cu 2.5% NaCl, pentru
MRSA, în paralel cu însămânțarea pe placă. În cazul folosirii unor concentrații de sare mai mari
(de ex. 4%) se obține un nivel de selectivitate mai înalt însă cu riscul pierderii unor tulpini de
MRSA.
d. cultură în bulion selectiv, cu cefoxitin, pentru MRSA.

După obținerea unui prim rezultat pozitiv prin metode rapide de screening, este important
ca în anumite situații să se continue cu testările pentru confirmarea rezultatului:
- identificarea speciei,
- determinarea mecanismului de rezistență și
- testarea sensibilității la alte antibiotice.
Acest lucru este necesar în cazul unor medii care nu permit diferențierea Enterococcus
gallinarum care conține gena vanC de un E. faecalis sau E. faecium; de asemenea, o enterobacterie
hiperproducătoare de AmpC poate fi confundată cu un producător de ESBL. Testarea sensibilității
față de antibiotice este importantă în cazul în care se impune tratament pentru reducerea colonizării
MRSA.
Atenție!
Testele de latex-aglutinare efectuate din culturi pe medii cromogene pot da rezultate
eronate!
Mediile cromogene sunt afectate de expunerea la lumină, iar plăcile trebuie păstrate la
întuneric înainte și după inoculare.

IV. Comunicarea rezultatului

Raportul laboratorului trebuie să precizeze:
- pentru ce bacterie a fost făcută testarea
- prin ce metodă
- locul de unde a fost recoltată proba.
În cazul prezenței unei bacterii MDR se raportează:
- bacteria izolată
- fenotipul de rezistență
Un rezultat negativ nu exclude prezența unei bacterii MDR care să fie sub limita de detecție
a metodei.
Rezultatele pozitive se anunță către secție și/sau CPCIN/SPIAAM, conform protocolului
de comunicare stabilit local.

V. Bibliografie
Cornaglia G, Lawrence C, Martinez-Martinez L: Screening for multidrug-resistant bacteria
in healthcare settings. In European Manual of Clinical Microbiology, editors Cornaglia G, Courcol
R, Hermann JL, Kahlmeter G, Publisher SFM, 2012:421-425
EUCAST guidelines for detection of resistance mechanisms and specific resistances of
clinical and/or epidemiological importance. Version 2.01, July 2017

240
 Public Health England (PHE) in partnership with the NHS, Investigation of specimens for
screening for MRSA, UK Standards for Microbiology Investigations, Issued by the Standards Unit,
National Infection Service, PHE, https://www.gov.uk/uk-standards-for-
microbiologyinvestigations-smi-quality-and-consistency-in-clinical-laboratories. Bacteriology | B
29 | Issue no: 7 | Issue date: 26.05.20
Public Health England (PHE) in partnership with the NHS, Detection of
Enterobacteriaceae producing extended spectrum β-lactamases, UK Standards for Microbiology
Investigations, Issued by the Standards Unit, National Infection Service, PHE,
https://www.gov.uk/uk-standards-for-microbiologyinvestigations-smi-quality-and-consistency-
in-clinical-laboratories. Bacteriology | B 59 | Issue no: 4.1 | Issue date: 17.08.16
Public Health England (PHE) in partnership with the NHS, Detection of bacteria with
carbapenem-hydrolysing β-lactamases (carbapenemases), UK Standards for Microbiology
Investigations, Issued by the Standards Unit, National Infection Service, PHE,
https://www.gov.uk/uk-standards-for-microbiologyinvestigations-smi-quality-and-consistency-
in-clinical-laboratories. Technical | B 60 | Issue no: 3 | Issue date: 18.09.2020

241
 Controlul microbiologic al mediului de spital

I. Introducere
Investigarea microbiologică a probelor de mediu din spital are importanță în anumite
situații. Trebuie evitat controlul de rutină și extensiv al mediului. Acest proces trebuie să includă
un protocol scris, o analiză și o interpretare a rezultatelor precum și o listă a acțiunilor preconizate
pe baza rezultatelor obținute.
Testele bacteriologice bazate pe cultivare sunt recomandate doar în situații de focar
epidemic, pentru a stabili o eventuală sursă a focarului. Nu este recomandată investigarea mediului
din jurul pacienților infectați/colonizați deoarece prezența germenilor în anturajul pacienților este
evidentă. Se impune păstrarea curățeniei și igienizarea corespunzătoare a saloanelor pacienților
colonizați/infectați pentru a evita transmiterea intraspitalicească a germenilor.

II. Recoltarea
Recoltarea probelor se face conform unui plan care stabilește metodele, locurile și
momentul recoltării. Standardizarea acestor parametri este importantă pentru a putea compara
ulterior rezultatele obținute.

Recoltarea probelor pentru verificarea sterilității apei

Sterilitatea apei se verifică doar în situația în care se suspicionează o deficiență în procedura
de mentenanță a sistemelor de filtrare.
Apa sterilă va fi însămânțată direct într-un recipient cu bulion după o prealabilă flambare
a robinetului și lăsarea apei să curgă timp de aproximativ 5 minute.
Se inscripționează recipientul cu numărul probei, locul de recoltă, apoi proba se
înregistrează în fișa de recoltare.

Condiții de transport și timp de transport

Probele bacteriologice sunt transportate în ambalaje sterile etanșe. Cu excepția cazului în care în
standarde specifice se indică altfel și dacă durata transportului este mai mare de 8 ore, probele se
refrigerează (5±3 °C).

Recoltarea probelor de aer

Se va determina compoziția microbiană în aer (numită în unele documente mai vechi
microaerofloră) doar din acele încăperi unde riscurile de colonizare/infectare pentru asistaţi ar
putea fi mai mari: săli de operaţii, săli de pansamente, săli de naşteri, saloane de prematuri etc, în
context epidemiologic justificat sau în cazul în care se suspicionează deficiențe în mentenanța
sistemului de filtrare, precum și după efectuarea lucrărilor de amenajare/reamenajare.
Punctele care sunt verificate cu prioritate trebuie definite anterior printr-o analiză a
riscurilor și raportate în planul locului (plan de eșantionare).

242
 Momentul controlului trebuie să fie compatibil cu activitatea zonei controlate și este definit
în planul de recoltare.
Metoda de recoltare activă constă în utilizarea unor echipamente care colectează,
analizează (cultivă) și cuantifică particulele conținute într-un anumit volum de aer. Particulele sunt
colectate fie într-o soluție lichidă fie pe o suprafață solidă. Pot fi concentrate prin centrifugare sau
prin filtrare.
Este recomandat să se poată măsura volumul de aer recoltat. Volume de aer cuprinse între
100 și 1000 de litri permit efectuarea numărătorii coloniilor pe placa de agar.
Metoda de recoltare pasivă (metoda sedimentării Koch) are sensibilitate redusă,
rezultatele de multe ori sunt neconcordante, nu este adecvată determinării încărcăturii microbiene
și nu se recomandă.

Condiții de transport și timp de păstrare

Condițiile pentru transportul probelor trebuie să asigure supraviețuirea microorganismelor
recoltate:
- nu se pun la frigider,
- timpul de transport este de maximum 24 de ore la temperatura camerei.

Recoltarea probelor de pe suprafețe

În principiu recoltarea se poate face prin mai multe metode fie folosind tampoane umectate
(în special de pe suprafețe care nu sunt plate, de ex. mânerul ușii) fie prin contactul (amprenta) cu
o suprafață de mărime cunoscută a unui mediu de cultură agar. Metoda cu tamponul poate să aibă
rezultate mai bune pentru suprafețe intens contaminate, în timp ce metoda plăcii de agar contact
este mai potrivită pentru suprafețe cu un număr mai mic de germeni contaminanți.
Totuși, metoda cu tamponul este dificil de standardizat și de aceea trebuie evitată, chiar
dacă usurința sa o face frecvent utilizată. Lipsa de reproductibilitate a rezultatelor se explică nu
numai prin diferențe între dispozitivele de recoltare utilizate, tipul de suprafață, microorganismul
țintă, dar și prin dificultatea de standardizare a presiunii exercitate pe suprafața de recoltare,
suprafața ariei recoltate, unghiul cu care este aplicat tamponul pe suprafață, tehnica de recoltare
individuală. Acești factori pot duce la o variație în rata de recuperare a microorganismelor între
22% și 58%. De pe tampoanele de tip ”flocked” rata de recuperare este mai mare și nu necesită
umectare prealabilă.

1. Metoda amprentei pe o suprafață agarizată

Obiectiv: metodă utilizată pentru detectarea microorganismelor viabile și aerobe pe
suprafețe plane, solide, netede și uscate, mai degrabă ca parte a unei activități legate de
managementul de calitate.
Metodă: recuperarea microorganismelor „detașabile” și cultivabile prin aplicarea directă a
unui mediu de agar pe suprafața de prelevat într-un mod standardizat (timpul de contact și
presiunea exercitată pe suprafață).
Metoda contribuie la cunoașterea ecosistemului unei anumite zone (aspect calitativ) și
permite cuantificarea numărului de microorganisme cultivabile și „detașabile” de pe o suprafață
prin metode testate, validate și reproductibile.
Tehnica de recoltare - conform instrucțiunilor producătorului.

243
 Condiții de transport și păstrare a probelor
Condițiile pentru transportul probelor trebuie să asigure supraviețuirea microorganismelor
recoltate:
- maxim 24 de ore la temperatura camerei,
- NU se țin la frigider.
În plus, eșantioanele trebuie plasate într-un ambalaj care să evite orice risc de contaminare
externă (cutiile colectate în aceeași zonă vor fi grupate într-un „container de transport” pe care se
menționează data, ora, locul recoltării probelor).

2. Metoda cu tamponul
Obiectiv: detectarea microorganismelor viabile (aerobe și/sau anaerobe) pe suprafețe
neregulate și/sau zone dificil de accesat și/sau pentru cercetări specifice (condiții de cultura
particulare, focar, etc.).
Evaluează calitativ flora microbiană.
Apreciază aproximativ numărul de microorganisme prezente (aspect semicantitativ).
Condițiile de cultivare și mediul de cultură pot fi adaptate la microorganismele țintă (de
exemplu, Clostridioides difficile etc.).
Metodă: Recuperează microorganismele „detașabile” și cultivabile prin tamponarea
suprafeței care trebuie prelevată.
Notă: în afară de tampoane, există și alte suporturi de prelevare (bureți, șervețele etc.) care
permit prelevarea de suprafețe mari.
Echipamentul folosit :
- tampoane sterile (bumbac sau altele: Dacron, Rayon, poliester), tampoane din spumă sau mai
bine din nylon; bureți sau comprese de tifon
- diluant - neutralizator:
- este utilizat pentru umezirea tamponului și pentru a evita inhibarea creșterii
germenilor de către reziduurile de detergenți sau dezinfectanți care ar putea fi
prezenți pe suprafețe,
- poate servi ca mijloc de transport;
Doar tampoanele special concepute pentru probe de pe suprafețe de mediu
oferă un mediu de transport cu neutralizator!
- șablon (sterilizabil și/sau dezinfectabil), pentru a garanta o probă de pe o suprafață de
dimensiuni identice de la un control la altul sau de la un punct de prelevare la altul, pentru
standardizarea tehnicii și obținerea unui rezultat semicantitativ.
Tehnica de recoltare:
- se umezește tamponul folosind un diluant-neutralizator sau un mediu de clătire steril (apă
distilată sterilă, ser fiziologic, bulion nutritiv plus neutralizator, tioglicolat pentru detectarea
Clostridioides): acest pas îmbunătățește eliberarea bacteriilor de pe tampon;
Tampoanele cu capacitate mare de absorbție (flocked swab) nu necesită umidificare
prealabilă .
- Se trece tamponul în striuri paralele aproape unul de celălalt pe suprafața de prelevat
(delimitată de șablonul sterilizat sau dezinfectat anterior, prin rotirea ușoară a tamponului)
- Se repetă eșantionarea aceleiași zone cu striuri perpendiculare pe prima
- Se așează aseptic tamponul în tubul de transport;
- Se identifică eșantionul;

244
 Atenție! Tamponul, buretele și compresa necesită extracția materialului recoltat pentru a
putea fi procesat ulterior. Soluțiile de extracție pot fi: tampon fosfat salin, tampon Butterfield,
tampon Butterfield și Tween, diluent neutralizator de extracție. Alegerea soluției de extracție are
un impact foarte mare asupra eficienței extracției și influențează direct calitatea rezultatelor.

Condiții de transport și păstrare a probelor

Când timpul dintre recoltare și analiză nu este specificat de producător, tamponul trebuie
trimis la laborator cât mai repede posibil în condiții care nu modifică viabilitatea sau numărul de
microorganisme, protejate de contaminare, de preferință în mai puțin de 4 ore. Cu toate acestea,
spre deosebire de plăcile de contact care nu trebuie refrigerate, tamponul va fi păstrat la 5 ± 3 °C
dacă timpul de transport este mai mare de 4 ore. Timpul de transport nu va depăși niciodată 24 de
ore.

III. Prelucrarea probelor

Prelucrarea probelor de mediu se face în zone dedicate, separate de spațiile în care se
procesează probele de microbiologie clinică!

1. Probele de sterilitate
Apa sterilă va fi însămânțată direct într-un recipient cu bulion nutritiv.

Temperatura, timpul de incubare și atmosfera de incubare:

Tuburile cu bulion nutritiv se incubează 3-5 zile la termostat la 35-37°C;
Incubarea este, în mod convențional, în atmosferă aerobă, dar pentru anumite organisme
țintă poate fi necesară fie o atmosferă anaerobă, fie o atmosferă îmbogățită în CO2.

Citirea culturilor și identificarea microorganismelor indicator:

Se raportează microorganismul/microorganismele identificate sau lipsa creșterii
microbiene.
Se consideră probă conformă proba sterilă, fără prezența germenilor de orice tip.

Rezultate

Rezultatele sunt validate de un responsabil autorizat al laboratorului de microbiologie de

mediu. Acestea sunt apreciate ca fiind „conforme” sau „neconforme” cu privire la valorile țintă
definite în contract și/sau protocoalele unității sanitare.

2. Probele de aer

Obiective
- Cuantificarea microorganismelor florei aerobe prezente în proba de aer;
- Izolarea unui posibil microorganism patogen, identificarea acestuia și cuantificarea acestuia.
245
 Temperatura, timpul de incubare și atmosfera de incubare:
Medii de cultură: Alegerea mediilor de cultură și a condițiilor de incubare (temperatură,
timp, atmosferă) se face în funcție de microorganismele căutate. În mod obișnuit, se folosește un
mediu neselectiv pentru flora bacteriană totală și, dacă este necesar, un mediu specific pentru o
căutare țintită a florei fungice:
- Agar R2A sau PCA (plate count agar) pentru flora aerobă
- Agar malț pentru Aspergillus spp.
Mediile selective pot fi utilizate pentru cercetări bacteriene direcționate, în special în caz
de epidemie.
Incubare: se incubează plăcile de agar pentru cercetarea florei aerobe la 35 ± 2 °C și cele
pentru fungi la 22 ± 2 °C timp de 5 până la 7 zile.

Citirea culturilor:
- Prima lectură: după 48 până la 72 de ore de incubare:
- Se numără flora aerobă totală numărând toate coloniile prezente pe agar,
- Identificarea bacteriilor potențial patogene utilizând tehnici bacteriologice standard,
- Dacă sunt prezente drojdii și/sau ciuperci filamentoase: identificați orice colonie
suspectată de Aspergillus spp. și confirmați identificarea;
- Plăcile sunt reincubate (în total 5 până la 7 zile); atenție la riscul de invazie a agarului
dacă există ciuperci;
- A doua lectură: după 5 până la 7 zile de incubare:
- Se numără flora aerobă totală care ar fi putut evolua de la prima lectură și, dacă au
apărut noi colonii de bacterii potențial patogene, se identifică în mod similar,
- Se verifică din nou prezența drojdiilor și/sau a ciupercilor filamentoase și se continuă
ca la prima lectură.
Pentru fungi:
- Prima lectură: după 48 până la 72 de ore de incubare:
- Se numără coloniile de levuri și/sau ciupercile filamentoase: se identifică orice colonie
suspectată de Aspergillus și se confirmă identificarea,
- Dacă nu există ciuperci, plăcile sunt reincubate (5-7 zile în total).
- A doua lectură: după 5 până la 7 zile de incubare:
- Se verifică din nou prezența drojdiilor și/sau a ciupercilor filamentoase și se continuă
ca la prima lectură.

Rezultate
- Numărul de colonii este exprimat în UFC/m3. Se utilizează tabelul de conversie al dispozitivului
utilizat.
- Aspectul calitativ este evaluat în funcție de prezența sau absența microorganismelor potențial
patogene.
Rezultatele sunt validate de un responsabil autorizat al laboratorului de microbiologie de
mediu. Acestea sunt încadrate ca fiind „conforme” sau „neconforme” cu privire la valorile țintă
definite în protocoalele unității sanitare.

246
 3. Probele de suprafețe
Scopul este izolarea unui posibil microorganism patogen în cadrul unei investigații de
focar.
Calitatea rezultatelor depinde în mod categoric de calitatea recoltării. Are legătură directă
cu tipul de material (plastic, metal, etc.), cu tipul suprafeței (netedă, rugoasă), cu forța de aplicare
pe verticală a dispozitivului de recoltare (tampon sau lamă cu agar).
Însămânțarea tampoanelor se efectuează fie:
- Direct prin epuizarea tamponului pe mediul (mediile) ales (e);
- După îmbogățire: pentru cercetări vizate, este posibil să se îmbogățească cu bulion selectiv
apoi să se inoculeze pe mediu (medii) adecvat (e). (de exemplu se caută VRE după îmbogățire
într-un bulion VRE);

Temperatura, timpul de incubare și atmosfera de incubare:

- Incubare la 35 ± 2 °C pentru flora aerobă, la 22 ± 2 °C pentru fungi, timp de 5 până la 7 zile;
- Medii de cultură: agar tripticază soia sau agar pentru numărarea coloniilor (plate count agar,
PCA);
- Mediile selective pot fi utilizate pentru cercetări specifice, în special în cazul unui focar.
Notă: Rezultatele obținute pot să difere în funcție de mediul de cultură utilizat.
În contextul unei epidemii pot fi necesare condiții și timpi de incubare, precum și medii de
cultură specifice.

Citirea culturilor :
Prima lectură: după 48 până la 72 de ore de incubare:
- Se identifică bacteriile potențial patogene cu tehnicile uzuale de bacteriologie;
- Dacă sunt prezente levuri și/sau a fungi filamentoși: se identifică orice colonie suspectă să fie
Aspergillus și se confirmă identificarea;
- Agarurile sunt reincubate (5-7 zile în total); atenție la riscul invaziei plăcii de agar, dacă există
ciuperci;
A doua lectură: după 5 până la 7 zile de incubare:
- Se verifică dacă au apărut colonii de bacterii potențial patogene
- Se verifică din nou prezența levurilor și/sau a fungilor filamentoși și se continuă la fel ca la
prima lectură;

Rezultate
Se comunică identificarea microorganismelor potențial patogene.
Rezultatele sunt validate de un responsabil autorizat al laboratorului de microbiologie de
mediu.

Căutare specifică pentru fungi filamentoși

Se indică în zonele cu risc crescut de infecție fungică (de exemplu, onco-hematologie,
pacienți cu transplant etc.) și care au un sistem de control al contaminării microbiologice a aerului.
Se utilizează medii specifice, de exemplu: agar malț, agar Sabouraud etc.

247
 Aspergillus fumigatus se dezvoltă la 42°C în 48 de ore; se dezvoltă, de asemenea, foarte
bine la 36°C sau 30°C, temperaturi disponibile în general într-un laborator, dar trebuie avut grijă
să nu se contamineze termostatul (conidii foarte "volatile").
Pentru alte ciuperci filamentoase, incubarea se face la 22 ± 2°C (sau, în lipsa acesteia, la
temperatura camerei) timp de 5 până la 7 zile;
Manipularea plăcilor poate duce la o dispersie a conidiilor, creând o însămânțare secundară a
mediilor, care distorsionează interpretările ulterioare. De aceea este imperativ să se deschidă
plăcile numai dacă sunt pozitive!

IV. Interpretarea rezultatelor

1. Probele de sterilitate
Se consideră probă conformă (probă sterilă), fără prezenţa germenilor de orice tip.

2. Probele de aer
Fiecare unitate medicală trebuie să evalueze riscurile asociate activităților desfășurate și
tipurile de pacienți tratați și să definească nivelul adecvat de risc pentru fiecare zonă.
Prin planul de risc se încadrează spațiile controlate ca fiind de risc scăzut sau neglijabil,
risc moderat, risc mare, risc foarte mare, iar pentru fiecare categorie se stabilește nivelul maxim
de încărcătură microbiană admis. Exemple de valori admise în funcție de nivelul de risc se regăsesc
în tabelul următor:

Nivel de risc al Scăzut/ Moderat Mare Foarte mare

zonei de Neglijabil
recoltare
Număr maxim - 100 10 1
de UFC/m3

În toate cazurile prezența fungilor este considerată neconformă.

Dacă există o abatere de la limitele stabilite, trebuie luate măsuri corective. Numărul
microbian (UFC/m3) este supus lipsei reproductibilității, ceea ce ar trebui să facă interpretările
prudente.

3. Probele de suprafață
Din cauza rezultatelor puternic influențate de calitatea recoltării, aceste probe nu reflectă
exact nivelul de contaminare. Depistarea unui anume patogen (ex. MRSA sau Aspergillus spp.)
poate oferi informații importante pentru activitatea de control al infecțiilor și pentru investigarea
epidemiologică în focar.
Metoda de recoltare este inseparabilă de interpretarea rezultatelor, acestea sunt (pentru
punctele din planul de recoltare): absența/ prezența urmată de identificarea patogenilor urmăriți:
S. aureus, enterobacterii, enterococi etc.

248
V. Raportarea rezultatelor
Raportul trebuie să conțină:
- Datele de identificare a laboratorului
- Data, tipul probei și locul recoltării
- Datele de identificare a persoanei care a efectuat recoltarea
- Tehnica de recoltare, inclusiv prezența unor agenți neutralizanți sau alte substanțe care ar putea
să interfere cu rezultatul analizei
- Motivul recoltării: investigare în focar.
- Tehnica de lucru
- Rezultatul
- Concluzii
- Datele de identificare și semnătura responsabilului de analiză, a șefului de laborator.

VI. Bibliografie
Boulestreau H, Bousseau A, Castel O et al: Surveillance microbiologique de
l’environnement dans les établissements de santé - Guide de bonnes pratiques, 2016
Rawlinson S., Ciric L., Cloutman-Green E.: How to carry out microbiological sampling of
healthcare environment surfaces? A review of current evidence. J Hosp Infect; 2019, 103:363-374.

249