CULTURI DE CELULE ANIMALE 1.

Biologia celulelor cultivate Celulele cultivate prezint anumite particulariti fa de celulele aflate n organism, diferena care reprezint chiar limitele modelelor experimentale pe culturi de celule n tehnica experimental. Cele mai importante diferene se refera la mediul de cultur diferit de mediul interstitial att n ceeea ce privete mediatorii celulari, ct i lipsa matricei extracelulare care asigur constituirea celulelor n esut. Prin urmare este oportun de remarcat c matricea extracelular nu reprezint doar un suport inert care asigur structura tridimensional a esutului, ci prin intermediul ei celulele comunic ntre ele i rezultatul acestei comunicri este apoi transmis nuleului. In felul acesta celulele particip la reglarea unor funcii proprii legate de metabolism, diviziune i apoptoz, spre exemplu. Sugestiv n acest sens este faptul c hepatocitele cultivate pe suport de material plastic i pierd capacitatea de a sintetiza albumine, proprietate rectigat prin cultivarea n matrice de colagen. Pe de alt parte esuturile reprezint o populaie celular complex, unde prin intermediul diferitelor citochine se transmit semnale de la celul la celul, cu rol n diferenierea celular, controlul diviziunii, sinteza diferiilor produi biologic activi, iniierea apoptozei etc. Mediile de cultur utilizate, dei ncearc s reproduc ct mai fidel caracteristicile mediului interstiial, nu reusesc s mimeze n totalitate mediul fiecarui esut, deoarece folosesc cel mai adesea ca surs de citochine i hormoni serul fetal bovin, care are limitele lui din acest punct de vedere. Cu toate c mediile de cultur nu imit complet mediul interstiial, noiunile generale de biologie celular sunt valabile i pentru celulele cultivate in vitro. In cele ce urmeaz nu vom insista asupra noiunilor de biologie celular, ci doar asupra acelor aspecte care se refar la particularitile creterii celulelor n cultur. 1.1. Metabolismul celular In cazul celulelor din organism principala modalitate de procurare a energiei este calea aerob, cnd substratul energetic este oxidat pe calea ciclului acizilor tricarboxilici (ciclul Krebs). Celulele aflate n culturi i procur energia pe cale anaerob, cnd principalul substrat energetic glucoza este convertit n energie (ATP) pe calea glicolitic. Problema care apare este aceea c produsul final al glicolizei este acidul lactic, care se acumuleaz n mediul de cultur i este toxic pentru celule; ndepartarea lui se face prin schimbarea periodic a mediului de cultur. Chiar dac oxigenul este prezent n atmosfera incubatorului, el ajunge n cantitate insuficient n mediul de cultur ca s poat susine procesele metalolice oxidative de producere a energiei n celulele cultivate. Situaia nu poate fi remediat prin simpla cretere a nivelului oxigenului n atmosfera incubatorului, deoarece un nivel prea ridicat al oxigenului liber n mediul de cultur ar induce un stres oxidativ intensificat si moartea celulelor cultivate. In mediul intern al organismului oxigenul este legat de hemoglobin (oxihemoglobin) i n felul acesta este prentampinat formarea la acest nivel a radicalilor liberi i prin aceasta apariia stresului oxidativ. De asemenea organismul posed un mecanism antioxidant(catalazic, superoxid-

dismutazic, glutation-peroxidazic i altele) bine pus la punct care anihileaz radicalii liberi generai n procesele metabolice oxidative. Cu toate acestea, respiraia aerob pe calea acizilor tricarboxilici nu este absent n celulele cultivate, doar c ele nu folosesc ca surs de carbon glucoza, ci glutamina. Aceasta este convertit n glutamat n reacia catalizat de glutaminaz. Apoi, glutamatul este dezaminat i se transform n oxiglutarat care intr n ciclul acizilor tricarboxilici. Amoniacul generat n aceast reactie este toxic pentru cultura de celule i este ndeprtat ca i acidul lactic, produs pe calea glicolitic, prin schimbarea periodic a mediului de cultur. 1.2. Adeziunea Formarea esuturilor i a organismului n ansamblu depinde de capacitatea celulelor de a se conecta unele de altele i de asemenea la structurile matricei extracelulare. Matricea extracelular conine proteine i substane glicoconjugate. Proteinele sunt reprezentate prin: - elastin i - colagen de tip I- IV. Glicoconjugatele sunt reprezentate prin: - glicoproteine i - proteoglicani Glicoproteinele sunt reprezentate prin: - fibronectin; - laminin; - tetramectin; - undulin; - entactin; - tenascin; - nitronectin; - osteonectin. Proteoglicanii sunt reprezentai prin: - proteine miez i - glucozaminoglicani. Proteinele miez sunt reprezentate prin: - fibromodulin; - biglican; - decorin; - luminan; - agregan; - sidecan; - versican; - betaglican. Glucozaminoglicanii sunt reprezentai prin: - hialuronat; - condroitin sulfat; - dermatan sulfat;

heparan sulfat.

Celulele provenite din esuturi i pstreaz proprietatea de a se ataa i in vitro, mai mult dect att ataarea la substrat rmne o condiie esenial a procesului de proliferare. Cu toate acestea, exist i unele linii celulare care capt capacitatea de a se multiplica i far ataarea de substrat. Substratul care permite ataarea este reprezentat prin sticl sau material plastic( polistiren). Pentru o mai bun ataare celular materialul din care sunt alctuite flacoanele de cultur pot fi tratate cu diveri constitueni ai matricei celulare (fibronectina, colagen) sau gelatina. Ataarea celulei(la substrat, la componentele matricei) sau legarea lor de alte celule nvecinate este condiionat de existena la nivelul membranei celulelor a unor proteine speciale numite molecule de adeziune celular. Moleculele de adeziune celular se mpart n dou mari categorii, molecule care asigur contactul intercelular i molecule care asigur ataarea celulelor la componentele matricei extracelulare. Moleculele care asigur adeziunea intercelular, la rndul lor, se mpart n molecule de adeziune celular independente de ionii de calciu, CAMs ( cell adhesion molecules engl) i molecule de adeziune dependente de ionii de calciu, numite caderine (cadherins engl.). Contactul celulelor cu componentele matricei extracelulare (fibronectina, entactina, laminina, colagenul etc) este realizat ndeosebi de ctre integrine (integrins engl.). Acestea se leag ntotdeauna prin intermediul unei structuri alctuite din arginin, glicin, i acid aspartic, cunoscut sub numele de structur RGD ( RGD motif engl.). Fiecare integrin conine cte dou subuniti ( i ), fiecare din ele se prezint sub diferite forme, ceea ce induce o mare varietate a integrinelor. O alta categorie de molecule de legatur cu componentele matricei extracelulare, dar care nu se leag prin intermediul RGD, o reprezint proteoglicanii transmembranari. Dezagregarea enzimatic a esuturilor, cea mai utilizat metod de iniiere a unei culturi celulare primare, produce o digestie a proteinelor constituente ale matricei extracelulare i a poriunii extracelulare a moleculelor de adeziune, ceea ce duce la disocierea celular. Fiecare tip celular depinde n mai mare msur de anumite tipuri de molecule de adeziune celular. De exemplu, celulele maligne depind ndeosebi de caderine( receptori dependeni de calciu), ceea ce face ca detaarea acestora s se poat face numai cu soluii care conin molecule care fixeaz calciul (EDTA). Alteori, dei EDTA este prezent n toate soluiile folosite pentru disocierea celular, nu este suficient, fiind necesare enzime proteolitice. Enzimele utilizate depind, de asemenea, de tipul de esut utilizat. Astfel, pentru esuturile mezenchimale, bogate n matrice extracelular, se poate folosi colagenaza, hialuronidaza n timp ce pentru esuturile epiteliale este necesar tripsina( pentru a ataca poriunea extracelular a CAMs). 1.3. Diviziunea celular Ciclul celular este alctuit din patru faze, faza M- mitoza, G1, S i G2. Mitoza se caracterizeaz prin formarea cromozomilor i se termin o dat cu formrea a dou celule fiice. Mitoza este urmat de faza G1. Din faza G1 celur poate trece n mod reversibil sau ireversibil n stadiul neproliferativ G0. Celulele difereniate din organism se afl n

stadiul G0. Faza S este caracterizat prin replicarea ADN-ului i este urmat de faza G2, n care celula pregtete o alt mitoz. Iniierea ciclului celular este declanat de semnalele venite din mediul extracelular, cum ar fi prezena unor factori de cretere, ca de exemplu, factorul de cretere al fibroblatilor (FGF), factorul de cretere al epiteliilor(EGF), factorul de cretere al trombocitelor(PDGF), etc. Dintre factorii externi responsabili de inhibiia diviziunii celulare este (pentru celulele normale) venirea n contact cu alte celule- inhibiie de contact. La nivel nuclear aceti factori i exercit funcia prin intermediul ciclinkinazelor, proteine nucleare care asigur trecerea celulei dintr-o etap n alta a ciclului celular. Ciclul celular este controlat de mai multe proteine specializate n aa numitele puncte de control, astfel nct s fie asigurat o diviziune far erori a ADN-ului. Astfel de puncte de control a integritii ADN-ului sunt prezente la sfritul fazei G1 i nceputul fazei S de ctre proteinele Rb i p53, astfel nct s nu se realizeze replicarea unui ADN alterat. In cazul n care se constat erori n structura ADN-ului se oprete evoluia ciclului celular prin activarea proteinei p21, care inhib ciclinkinazele CDK2 i CDK4, realiznd oprirea diviziunii celulare. Se iniiaz apoi repararea ADN-ului lezat sau apoptoza. 1.4. Diferenierea celular Celulele cultivate prezint unele diferene morfofiziologice fa de celulele din care au provenit. Diferenele se datoreaz condiiilor diferite oferite de mediul de cultur fa de cele din organism. In principiu, prin manipularea condiiilor de cultur celulele pot fi meninute n stadii nedifereniate, sau din contra pot fi orientate pe calea diferenierii. Studiile de difereniere celular reprezint un domeniu de mare actualitate n cercetarea medical, datorit aplicaiilor practice nelimitate pe care celulele stem le au n medicina regenerativ. Pentru a nelege acest lucru, vom rememora cteva noiuni de baz n ceea ce privete diferenierea celular. Deferenierea reprezint fenomenul prin care celula stem i capat proprietile caracteristice, specifice celulei adulte. Momentul n care celula i dobndete fenotipul matur, terminandu-i procesul de difereniere, se numeste difereniere terminal. Momentul diferenierii poate fi evideniat prin markerii de difereniere, proteine caracteristice celulelor mature (miozina pentru fibra musculara, hemoglobina pentru eritrocite, albumina pentru hepatocite etc). Pentru majoritatea celulelor (neuroni, miocite, hepatocite) n aceast faz, procesul de difereniere devine ireversibil. Cu toate acestea, unele celule difereniate, cum ar fi fibroblatii, pot reveni la un fenotip mai nedifereniat, stadiu n care-i pot continua proliferarea. Angajarea reprezint o transformare a celulei stem multipotente ctre o celul stem capabil s dea natere unei categorii mai restranse de celule specializate. In principiu, se consider c procesul de angajare este ireversibil, o dat angajat celula poate da natere numai unei categorii restrnse de celule n direcia n care s-a fcut angajarea. Totui, n cazul unor celule provenite de la vertebrate inferioare a fost constatat i transformarea unei celule angajate ntr-o celul angajat n alt direcie, fenomen cunoscut sub denumirea de transangajare. La mamifere transangajarea a fost observat numai n cazul celulelor tumorale, unde o linie de celuile tumorale se poate transforma ntr-o linie de celule tumorale de alt origine.

Procesul de difereniere poate fi stimulat de o serie de factori cum ar fi hormoni, citochine, unele vitamine, ioni, precum i diverse substane chimice (dimetil sulfoxid, hexa metil diacetat, acetatul de phorbol, etc). De o importan deosebit n iniierea diferenierii celulare sunt interaciunile intercelulare( dintre celulele de acelai tip, ct i ntre tipuri celulare diferite). Este cunoscut c proteinele transmembranare responsabile de adeziunea intercelular pot influena activitatea nuclear, blocnd diviziunea celular (inhibiia de contact) i sinteza proteinelor responsabile de diferenierea celular. Efect similar au i proteinele constituente ale matricei extracelulare. In oeganismul animal diferenierea celular se poate realiza n dou modaliti principale: - n esuturile cu vitez de nnoire crescut, cum ar fi epiderma, esutul hematopoetic sau mucoasa intestinal, regenerarea celular se face continuu, pornind de la celule stem multipotente capabile att de renoire ct i de generarea unor celule n stadiul de difereniere terminal( care i pierd capacitatea de diviziune); - in esuturile n care n mod normal celulele nu se multiplic intens ( practic majoritatea esuturilor din organism), nu exist celule stem. Multiplicarea celular apare mai ales n cazul unor distrucii celulare masive. In acest caz regenerarea se face prin diferenierea celulelor specializate care-i recapat capacitatea proliferativ. Cel mai semnificativ exemplu l reprezint fibrocitele care devin fibroblati i ncep s se divid ca urmare a reducerii densitii celulare, sau prezenei unor factori de cretere. Cnd leziunea este reparat i esutul i recapat densitatea celular optim , diviziunea nceteaz, fibroblatii redevin fibrocite i rencep sinteza colagenului. Aceast proprietate nu etse specific fibrocitelor, ci i celulelor endoteliale, hepatice, gliale. In cazul fibrelor musculare, celule nalt specializate, regenerarea se face pornind de la celule nedifereniate, diseminate n masa esutului muscular. Procesul de difereniere se poate realiza in vitro i n cazul celulelor tumorale ( n ciuda faptului c n general cancerul este considerat o alterare a proceselor de difereniere celular). Departe de a fi o excepie, multe linii tumorale, n timp, exprim n condiiile cultivrii, caracteristici ale celulelor de origine, o dat cu diminuarea caracteristicilor de malignitate. Aceast reversibilitate a fenomenului de transformare neoplazic sugereaz noi oportuniti n terapia cancerului. Difrenierea reprezint revenirea unor celule difereniate la un fenotip mai nedifereniat. Fenomenul are loc n cazul transformrilor maligne sau n cazul cultivrii in vitro. Nu trebuie confundat acest fenomen cu transformarea malign unde alturi de difereniere mai apar i alte modificri cum ar fi piederea inhibiiei de contact, dispariia apoptozei, independeta de factorii de cretere etc. In cazul culturilor celulare apariia formelor celulare nedifereniate, s-ar putea s nu se datoreze unui proces de difereniere real, ci a unei selecii a formelor nedifereniate cu o capacitte de diviziune superioar. In cultur, cel mai adesea celulele se prezint sub form dedifereniat sau nedifereniat, practic ntr-un stadiu proliferativ, care nu permite exprimarea tuturor funciilor unei celule aflate n faza de difereniere terminal. Acest fapt reprezint una din limitele culturilor celulare in vitro. Acest dezavantaj poate fi nlturat parial prin

asigurarea unor sisteme de cultura care s asigure o structura tridimensional i s imite structura matricei extracelulare. 1.5. Senescena i apoptoza Senescena celular reprezint limitarea numrului de diviziuni care le pot realiza celulele provenite din esuturi normale. Primele observaii privind senescena celular au aprut o dat cu primele culturi de fibroblati. Acetia creteau, se divideau, dar dup un numr de pasaje mureau fr un motiv evident. Investigaii ulterioare au artat c secretul limitrii de diviziuni st n nite structui cromatinice aflate la capetelor braelor cromozomiale numite telomere. Telomerele au rolul de a stabiliza braul cromozomial n timpul mitozei, astfel nct diviziunea celular s se fac cu meninerea integritii ADNului. Cu fiecare diviziune telomerele se scurteaz pn cnd acestea devin prea reduse pentru a mai putea asigura stabilitatea moleculei de ADN n timpul mitozei, n consecin diviziunea se realizeaz cu alterarea materialului genetic. Dupa cum am artat mai sus ( vezi Reglarea ciclului celular) pe parcursul diviziunii celulare exist mai multe puncte de control realizate de ctre proteinele Rb i p53, care realizeaz blocarea diviziunii celulare i apoi prin activarea bcl-2 iniiaz procesul apoptotic. Apoptoza reprezint moartea celular programat, ntlnit n organismele animale superioare. Ea este iniiat de leziuni ale materialului genetic celular, sau de diveri stimuli venii din mediul extracelular. Procesul apoptotic se realizeaz pe calea proteinei bcl-2. Aceasta elibereaz la nivelul citosolului citocromul c (prezent n mod normal n mitocondrii), care activeaz caspazele 9 i 3, care la rndul lor, pin efectul lor proteolitic degradeaz nucleul, citoscheletul i organitele celulare. Apoptoza este un proces stadial, iniial se constat o blocare a celulei datorat degradrii citoscheletului, urmat de densificarea citoplasmei i aglutinarea organitelor; cromatina se condenseaz, nucleul capatnd aspectul caracteristic de picnoz. In continuare asistm la fragmentarea nucleului cariorexa, cu formarea unor corpi cromatinici rezultai in urma degradrii moleculei de ADN. In final, se produce ruperea membranei celulare, celula se fragmenteaz n corpi apoptotici. Limitarea de diviziuni celulare prin mecanismul amintit mai sus nu este o constant a lumii animale, ci organismele unicelulare(protozoarele), precum i pluricelularele inferioare (celenteratele), au celule cu un numr teoretic nelimitat de diviziuni. Aceast proprietate se datorete existenei unei enzime numit telomeraz, care asigur refacerea telomerelor dup fiecare diviziune celular. Gena care codific sinteza telomerazei este prezent i n celulele organismelor superioare, dar este activ n mod normal numai n celulele stem, fiind inactiv n celulele somatice. Telomeraza se poate activa i n celulele maligne, iar n condiiile cultivrii in vitro i n unele linii celulare (provenite att din celule tumorale ct i celule normale). 1.6. Transformarea Transformarea reprezint modificarea materialului genetic al celulelor cultivate, caracterizat prin trei mari categorii de transformri fenotipice: imortalizarea

( capacitatea realizrii unui numar nelimitat de diviziuni i lipsa apoptozei), creterea aberabt(multiplicarea intens i independena fa de factorii de cretere, independenta de ancorare la substrat i dispariia inhibiiei de contact) i malignitatea (achiziionarea unor proprieti caracteristice celulelor tumorale, anume invazibilitatea, angiogeneza etc). Imortalizarea unei linii celulare nseamn dobndirea capacitii de a se divide n numr nelimitat de diviziuni. La liniile celulare normale (cu un numr limitat de diviziuni), senescena celular este controlat de un grup de gene; unele din ele cu rol n reducerea progresiv a sintezei telomerazei(vezi Senescena i apoptoza). Prin mutaii ale genelor senescenei, sau deleii ale poriunilor cromozomiale care cuprind aceste gene, telomeraza redevine activ i celulele capat proprietatea de a-i reface telomerele la sfritul fiecrei mitoze i, n consecin, de a se divide nelimitat. Imortalizarea unei linii celulare nu nseamn obligatoriu achizitionarea altor atribute caracteristice malignitii. Totui, imortalizarea favorizeaz instabilitatea genetic a liniei celulare afectate, prin urmare n timp, liniile celulare imortalizate pot achiziiona i atribute caracteristice malignitii. Dei imortalizarea unei linii celulare poate avea loc i spontan, totui in mod uzual imortalizarea se realizeaz n mod deliberat. Cea mai utilzat metod este imortalizarea cu gene virale, cele ma folosite fiind virusurile SV40, Epstein Barr, virusul papilomatozei umane etc. Rezultate similare se pot obine prin transferul genei care codific telomeraza. Exist i o linie de oareci transgenici care pot da natere spontan, cu incident crescut, la linii celulare nemuritoare. Creterea aberant grupeaz o serie de caracteristici, cum ar fi multiplicarea intens i independena fa de factorii de cretere, independena de ancorarea la substrat i dispariia inhibiiei de contact. Ca i n cazul imortalizrii, aceste caracteristici sunt frecvent ntlnite la celulele tumorale, dar nu pot fi considerate atribute exclusive ale malignitii. Multiplicarea intens se realizeaz prin mecanisme numeroase, similare cu cele implicate n creterea tumoral in vivo, cum ar fi: supraexprimarea unor gene responsabile de iniierea ciclului celular, sau inhibarea unor gene legate de blocarea acestuia, stimularea autocrin( celula i sintetizeaz proprii compui stimulatori ai mitozei), activarea continu a proteinelor traductoare de semnal, etc. Aceste proprieti fac celula mai puin dependent de factorii de cretere; n consecin celulele pot crete mai bine pe medii libere de ser, au un potenial mai bun de proliferare clonal( deoarece cresc mai bine la concentraii celulare mici, datorit necesarului mai sczut de factori de cretere). In acelai timp, viteza mare de diviziune celular crete incidena modificrilor materialului genetic. Independena de ancorare se datoreaz modificrilor receptorilor membranari responsabili de aderena celulelor la matricea extracelular (integrine i proteoglicani transmembranari). In acest fel celulele nu mai ader de substrat i se pot divide n suspensie, situaie ntlnit n mod normal numai n cazul celulelor sanguine (limfocite). Alterrile prezente la nivelul proteinelor membranare responsabile de comunicarea intercelular (CAMs i caderine) (vezi Adeziunea) sunt responsabile de pierderea inhibiiei de contact. In mod normal celulele n mediul de cultur se divid pn cnd vin

n contact unele cu altele, dup care diviziunea nceteaz. In cazul celulelor transformate, celulele nu se opresc n stadiul de monostrat, ci ncep s se suprapun i n final se desprind n mediul de cultur. Malignizarea presupune un proces complex multistadial, n urma cruia o celul normal devine celul canceroas. Procesul poate avea loc att in vivo ct i in vitro, chiar dac etapele transformrii maligne sunt diferite n cele dou cazuri. Celulele tumorale cultivate, dei maligne nc din momentul izolrii lor n cultur, au capacitatea de a continua procesul de transformare malign i dup formarea unei linii celulare. Malignizarea include i celelalte proprieti asociate transformrii celulare tratate anterior, chiar dac nici una dintre ele nu sunt atribute exclusive ale celulelor maligne. Dintre atributele caracteristice celulelor maligne cultivate cele mai importante sunt tumorigenega, invazivitatea i angiogeneza. Tumorigeneza reprezint capacitatea celulelor tumorale cultivate de a genera tumori dac sunt inoculate unor organisme receptive din punct de vedere imunologic. In cazul inoculrii unor celule tumorale, ca i n cazul pasajelor tumorale apar probleme comune oricrui transplant, anume rejecia esutului strin datorit incompatibilitii imunologice. Pentru ca o tumoare s poat fi transplantat de la un animal obinuit la altul, ea trebuie s fie lipsit de antigenele de histocompatibilitate. Astfel de tumori transplantabile au fost obinute att la obolani (carcinomul Walker 256, ascita Walker, sarcomul RS1) ct i la oareci (ascita Ehrlich). Aceste linii tumorale pot fi meninute fie prin pasaje de la un animal la altul, sau pot fi cultivate in vitro. Cu toate acestea, majoritatea liniilor celulare tumorale prezint antigene de histocompatibilitate ale individului de la care au provenit, ceea ce face s nu poat fi inoculate la animale normale. Din aceast cauz se utilizeaz indivizi cu deficite imunologice care s nu resping esutul strin. Se pot utiliza n acest sens oareci iradiai, timectomizai i splenectomizai. Cei mai folosii pentru studiul tumorigenezei sunt oarecii nuzi, animale care datorit unei mutaii prezint o aplazie timic congenital, mutaie asociat cu lipsa prului (de unde le vine i numele). Aceast metod are avantajul c permite i evaluarea histologic a tumorii. Invazivitatea reprezint capacitatea celulei tumorale de a infiltra esutul nvecinat, proprietate condionat de numeroase caracteristici cum ar fi aderena slab la proteinele matricei extracelulare i la alte celule, precum i capacitatea de sintez a unor enzime proteolitice capabile s destructureze matricea extracelular. Pe modele in vitro invazivitatea se poate evalua prin cultivarea celulelor tumorale pe membrana alantoidian de pui sau pe fragmente de miocard de pui. In ambele cazuri celulele tumorale sunt capabile s colonizeze esutul. Alte metode evalueaz capacitatea de infiltrare tumoral prin utilizarea unor filtre celulare nglobate n constitueni ai matricei extracelulare i msoar capacitatea de penetrare a filtrelor. Tot o msur a gradului de invazivitate al unor linii tumorale este i dozarea nivelului enzimelor proteolitice cum ar fi activatorii plasminogenului. Angiogeneza reprezint capacitatea tumorilor de a-i dezvolta propria reea vascular. Aceast proprietate se realizeaz prin sinteza unor factori angiogenetici. Pe modele in vitro aceast proprietate poate s fie evideniat prin adausul unor extracte de celule tumorale pe membrana alantoidian de pui, efectul fiind o intensificare a vascularizaiei acesteia.

2. Laboratorul de culturi celulare

2.1. Incaperile laboraturului: - birou pentru personalul laboratorului; - sala pentru instrumentar; - sala pentru spalarea sticlriei; - sala cu congelator(-80 C) i container cu azot lichid; - laborator cu frigider, microscoape i centrifug; - laboratorul de culturi celulare cu mas de lucru, microscop, hot steril. In laboratorul de culturi celulare se desfoar urmtoarele principale activiti: manipularea steril a culturilor celulare, incubarea acestora, prepararea reactivilor, spalarea, sterilizarea i stocarea. Deosebirea fundamental ntre laboratorul de culturi de celule i alte laboratoare const n meninerea sterilitii pe parcursul tuturor activitilor legate de cultivarea celulelor. Datorit faptului c este greu s se realizeze o meninere steril a tuturor ncaperilor laboratorului de culturi celulare, limitarea acestei operatiuni la hota de lucru efectiv, unde are loc manipularea vaselor de cultur, este oportun. Restul zonelor din laborator fiind nesterile, trebuie s ne asigurm c n laborator nu exist cureni de aer( germenii care se ataeaz particulelor de praf). Pentru a asigura acest deziderat, este necesar asigurarea climatizrii conform standardelor industriale care asigur filtrarea particulelor de praf i o presiune pozitiv n ncapere, care previne contaminarea cu aer exterior, dar i un optim de temperatur i umiditate. Ventilaia prin deschiderea ferestrelor nu ste corespunztoare, pentru c permite intrarea prafului din exterior, dar i pentru c duce la formarea unor cureni de aer care interfereaz cu fluxul de aer laminar al hotei sterile. Este recomandabil ca sala n care se afl hota n care se realizeaz activitile sterile cu flux de aer laminar, s nu fie prevzut cu geam, iar dac geamul exist, s nu fie deschis. Pentru a preveni orice curent de aer care ar putea produce turbulene n fluxul de aer laminar n timpul cultivrii, camera n care se realizeaz cultivarea este bine s fie prevazut cu o anticamer separat de o u de sticl ( pentru ca persoanele aflate n anticamer s poat vedea dac se lucreaz n laloratorul de culturi de celule i s atepte pn cnd operaiunile sterile care se efectueaz sub nia s-au terminat). In acest fel intrarea n laboratorul de cultivare se poate face reducnd la minimum curenii de aer. Este bine s evitm intrarea sau ieirea din ncapere n timp ce exist flacoane deschise sub hota steril, deoarece simpla deschidere a uilor poate genera cureni care aduc aer nesteril n flacoanele de culturi. Fiecare ncapere a laboratorului trebuie prevzut cu lampa UV i sterilizarea laboratorului trebuie fcut zilnic. Suprafeele de lucru trebuie s fie confecionate din matriale impermeabile, uor de igienizat i rezistente la diferite substane chimice, ele trebuie s fie fixate la o nime corespunzatoare pentru a facilita poziionarea

confortabil n timpul manoperelor. Camerele trebuie s fie finisate n aa fel nct s poat fi curatate uor, pardoseala i pereii trebuie s fie plane, netede, din materiale rezistente la dezinfecii. Mobilierul din laboratorul de culturi celulare i laboratoarele aferente trebuie s fie lipsite de pardoseal ( s nu poat intra nimic ntre mobilier i pardose) sau pe picioare( ca s se poat curaa pe dedebubt). In laboratorul de culturi celulare accesul persoanelor trebuie restricionat i permis doar personalului autorizat s lucreze n acest laborator. 2.2. Aparatura: - termostatul (incubatorul); - hota cu flux de aer laminar; - sterilizator; - microscop cu inversie; - congelatoare i frigidere; - recipiente de criostocare; - echipamente de purificare a apei; - centrifug; - balane; - pH metru; - echipamente de numrat celule; - pomp de aspiraie. Termostatul (incubatorul) asigur un mediu de cultivare constant. Culturile celulare necesit condiii de mediu foarte bine controlate. Foarte importante sunt: temperatura, umiditatea i concentraia CO2. In general temperatura se situeaz n jurul valorii de 28 C (pentru liniile celulare provenite de la insecte, peti i amfibieni) i 37 C ( pentru liniile celulare de la mamifere). Incubatorul trebuie s prezinte de asemenea reglaje pentru umiditate i concentraia CO2; unele incubatoare au reglaje i pentru concentraia O2. Interiorul incubatorului nu este steril, mai mult dect att, acesta reprezint o important surs de contaminare a culturilor celulare(umezeala i temperatura asigur un mediu propice dezvoltrii bacteriilor i fungilor). Datorit acestui neajuns, incubatoarele trebuie s fie supese unor operaii de dezinfecie periodic cu antiseptice i fungicide. Se pot folosi i incubatoare acoperite cu cupru ori aliaje de cupru avnd proprietatea de a inhiba activitatea microbiologic. Cele mai eficiente sunt incubatoarele cu flux intern de aer laminar steril, care menin sterilitatea n interiorul incubatorului, dar datorit preului ridicat nu sunt frecvent ntlnite n laboratoarele de culturi celulare. Hota cu flux de aer laminar este un echipament de baz n laboratorul de culturi celulare, reprezentnd cel mai simplu mod de a asigura sterilitatea culturilor celulare. Cea mai eficient este hota cu flux de aer orizontal( unde aerul vine din faa operatorului), dar acesta este recomandat numai pentru prepararea unor medii i reactivi n condiii de sterilitate, eventual culturi de celule cu grad redus de risc( celule animale nonprimate) (vezi nivelul de risc biologic). Pentru celule cu risc mediu i ridicat de contaminare, astfel de hote nu sunt recomandate deoarece fluxul de aer vine direct pe operator, n acest caz

acesta este supus contaminrii. Pentru manipularea acestor tipuri de celule se utilizeaz hote cu flux de aer vertical, de fapt cel mai utilizat tip de hot. In ambele tipuri de hote aerul steril este asigurat de un filtru antibacterian i antiviral care sterilizeaz aerul atmosferic. Este foarte important ca n apropierea hotei s nu fie surse de turbulene, care ar putea genera alterri n curgerea laminar a aerului i, n consecin, infectarea culturilor. Hota trebuie s fie prevazut cu bec de gaz pentru flambare) i lamp cu raze ultraviolete(pentru sterilizare). Meninerea sterilitii depinde de presiunea cu care aerul traverseaz filtrul; dac filtul se ncarca cu particule, viteza fluxului de aer scade, iar sub 0,4 m/s dispozitivul nu mai poate asigura securitatea cultivrii. Este necesar msurarea periodic a presiunii cu un manometru, dar mai util este msurarea vitezei curentului de aer cu un anemometru. O dat la 6 luni este necesar verificarea instalaiei de personal specializat. Hota steril trebuie verificat sptamnal de personalul laboratorului, splat i dezinfectat (dezinfectanii chimici sunt mai eficieni dect radiaiile ultraviolete). Este important de verificat dac exist impuriti czute prin orificiile suprafeei de cultivare, care ar putea afecta fluxul de aer. Unii autori recomand ca aparatul s funcioneze continuu ceea ce reduce semnificativ ncrctura cu particule a ncaperii i mai ales o sterilitate superioar a hotei. Este important ca hota s fie lsat s funcioneze o perioad naintea folosirii, iar dup utilizare s fie sterilizat i apoi nchis.

Sterilizatorul difer n funcie de necesiti i resursele financiare de care dispune laboratorul. Sunt preferate sterilizatoarele cu cldur umed. Este de asemenea important ca aburul se fie eliminat dup sterilizare, iar ustensilele supuse sterilizrii s se usuce n interiorul aparatului, n acest fel scade riscul contaminrii dup sterilizare. In aparatul de sterilizat se utilizeaz numai ap distilat sau deionizat. In jurul aparatului de sterilizare trebuie meninut suficient spaiu pentru a asigura ventilaia. Pentru sterilizarea sticlariei de laborator este recomandat sterilizarea uscat, n acest caz autoclava trebuie s asigure temperaturi mai mari ( 160-180 C).

Microscopul cu inversie este folosit pentru examenul morfologic al culturilor. O modificare morfologic este de multe ori primul semn al deteriorrii culturii; infecia culturilor induce de asemenea modificri morfologice specifice. Examenul culturilor ne d date importante cu privire la succesul iniierii unei culturi celulare, stadiul ei de evoluie i momentul pasajului celular. In afara examenului microscopic nu este posibil nici numrarea celulelor. Pentru examenul morfologic al celulelor cultivate este utilizabil orice microscop cu inversie, precum i pentru fotografierea celulelor. Congelatoarele i frigiderele sunt aparate de uz casnic, nefiind necesare aparate frigorifice speciale. Este de preferat ca frigiderele i congelatoarele s fie achziionate ca aparate independente. Camera frigorific este eficient numai pentru laboratoarele mari ( mai mari de 4 operatori). Majoritatea reactivilor utilizai n culturi celulare se pstreaz corespunztor la -20 C. Toate spaiile frigorifice trebuiesc curaate regulat ( aruncai reactivii vechi rmai nefolosii) i dezinfectate penrtu a preveni contaminarea micotic ce se poate produce n frigidere. Congelatoarele care asigur -80 C nu sunt eseniale

penrtu laboratoarele de culturi celulare, majoritatea reactivilor fiind bine pstrai la -20 C. Cu toate acestea congelatorul de -80 C este util pentru pregtirea celulelor n vederea imersrii n azot lichid, precum i pentru pstrarea unor probe( supernatant, celule) n vederea examenelor biochimice ulterioare. In plus, n absena azotului lichid liniile celulare pot fi pstrate la -80 C timp de luni de zile. Recipientele de crioconservare sunt echipamente speciale. Celulele preparate pentru crioconservare (n recipiente speciale) se menin imersate n containere cu azot lichid, aceast form de conservare asigurnd un timp nelimitat de pstrare a culturilor celulare. Containerele cu azot lichid trebuie verificate periodic pentru a urmri nivelul azotului lichid. Catitaile pierdute prin evaporare trebuie completate periodic (acest sistem de crioconservare necesit o surs accesibil de azot lichid). Echipamentele de purificare a apei . Apa purificat este necesar pentru splarea sticlriei de laborator, dizolvarea mediilor achiziionate sub form de pulbere i dilurii diferitelor soluii concentrate. Splarea sticlriei de lebortor se poate face n condiii bune cu ap deionizat sau supus osmozei inverse. Pentru dizolvarea concentratelor de medii de cultur este necesar apa ultrapur, care necesit o procedur de preparare n tei sau patru stadii. Principiul obinerii apei ultrapure este ca fiecare etap s aib un principiu de purificare diferit. De exemplu, osmoza invers poate fi urmat de deionizare i filtrare prin micropori sau s fie urmat de distilare etc. Deionizatorul trebuie s aib un conductomertu pentru a verifica calitatea apei produse i a stabili momentul schimbrii cartuului filtrant. Dac purificarea apei se face prin distilare, costul este mai ridicat datorit unui mare consum de energie electric. Dac purificarea apei se face prin deionizare, costul este mai mic. Cu toate acestea ns, aparatele de deionizare au dezavantajul c necest nlocuirea periodic a cartuului. Nu este recomandat stocarea apei purificate, ci este necesar circularea ei continu n interiorul aparatului pentru a minimaliza riscul infectrii cu alge. Toate recipientele cu care se transport apa purificat trebie s fie periodic dezinfectate. Centrifuga este o component indispensabil( folosit de obicei pentru realizarea subculturilor i pentru pregtirea celulelor n vederea crioconservrii). Centrifuga trebuie postat intr-o zon a laboratorului unde se poate ajunge cu usurin ( pentru ca aparatul s poate fi uor de manipulat i intreinut). Utilizarea centrifugii necesit trei reguli elementare: nu se deschide centrifuga n timpul funcionrii, nu se dechide inainte de a fi scoas din priz i nu se scoate din priza inainte de oprirea complet a rotorului. In mod practic dup ce probele au fost aezate n centrifug, se pune centrifuga n priz, se aduce treptat la turaia dorit, se marcheaz durata de funcionare din momentul n care a fost atins viteza dorit, apoi, dup ce timpul de centrifugare a expirat se aduce poteniometrul treptat la zero. Dup oprirea complet a rotorului se scoate din priz, apoi se deschide capacul i se iau cu grij probele centrifugate. De menionat este faptul c godeurile cu probele de centrifugat trebuie s fie echilibrate foarte bine pentru a evita accidentele, cum ar fi ruperea rotorului si distrugerea probelor aflate n centrifug.

Balanele sunt necesare mai ales dac mediul destinat culturilor celulare este preparat in laborator. Aceast form de preparare a mediului este mult mai economic; n acest fel se pot prepara i medii speciale indisponibile comercial. Se recomand mai multe balane cu scri de precizie diferite. pH metru este necesar pentru prepararea mediilor. Cel mai adesea indicatorii de pH dizolvai n mediu nu sunt suficieni de exaci pentru a asigura condiii optime de cretere celular i acurateea experimentelor. Echipamentele de numrat celule sunt eseniale n tehnica culturilor celulare, cel mai ieftin dispozitiv de numrat fiind hemocitometrul (vezi numrarea celulelor). Pentru laboratoarele mai dotate este util un numrator automat de celule, care are avantajul vitezei i exactitii evalurii. Pompa de aspiraie nu este unul din echipamentele eseniale pentru realizarea culturilor de celule. In lipsa ei evacuarea mediului epuizat din vasele de cultur, se poate face cu ajutorul unei pipete ataat la o pomp de aspiraie. Totui pompa de vid asigur o evacuare rapid, reducnd n acelai timp riscul infeciei. In plus lichidul aspirat este colectat ntr-un recipient nchis, unde n prealabil a fost introdus formol sau alt dezinfectant. In acest fel riscul de contaminare este mai sczut. 2.3. Insrtrumentar Majoritatea materialelor folosite pentru tehnicile de cultivare a celulelor sunt de unica folosin, putnd fi folosite i materiale de alt natur (sticl, inox), dar dup o sterilizare prealabil. Instrumentarul necesar: -flacoane de cultur; - seringi i ace; - filtre de sterilizare; - pipete; - criotuburi. Flacoanele de cultur sunt alese n funcie de numrul celulelor cultivate, de modul de cretere al celulelor (monostrat su suspensie) i de modul de recoltare a probelor luate in studiu( sunt necesare cantiti mari de celule deodat, sau pot fi recoltate ealonat). Se pot folosi recipiente de sticl (refolosibile dup spalare i sterilizare), sau recipiente de plastic de unic folosin (sterile, livrate de productor). Chiar dac sunt mai costisitoare, recipientele de plastic sunt preferate. Recipientele de cultur se prezint sub form de plci Petri, plci cu godeuri, sau recipiente de cultur cu dop nfiletat. Cele mai eficiente sunt flacoanele cu dop nfiletat, care pot furniza cantiti mari de mas celular, asigur o manipulare uoar i asigur un risc minim de contaminare a culturilor celulare. Unele din aceste recipiente sunt prevzute cu un dop cu filtru, care permite intrarea aerului din incubator fr a permite contaminarea bacterian. Flacoanele

de cultura au inscripionate cantitile de mediu care se recomand sa fie adugate i au marcat, printr-o linie, nivelul pn la care trebuie adugat mediu, n felul acesta se evit un strat prea gros de mediu pentru celule, care ar afecta schimburile respiratorii dintre celule i mediul din incubator. Seringi i ace de unic folosin sunt frecvent folosite n numeroase laboratoare, att pentru disocierea celulelor n momentrul pasajului celular, ct i pentru sterilizarea mediilor prin ataarea unui filtru bacterian i extragerea unor reactivi din flacoanele de depozitare etc. Pentru pasajul celular se recomand utilizarea unor ace lungi cu o grosime apreciabil. Filtrele de sterilizare se folosesc pentru obinerea unor cantiti mici de soluii sterile cum ar fi soluiile tampon pentru splare, mediu de tripsinizare, chiar medii de cultur celular, dac este preparat n laborator din mediu pudr. Totui, n cazul n care mediul se prepar uzual n laborator sunt necesare echipamente speciale de filtrare steril a mediului; filtrarea n acest mod fiind deosebit de anevoioas. Pipetele sunt ustensile de baz n laboratorul de cercetare i analiz. Cele mai simple pipete utilizate n laboratoarele de culturi de celule sunt pipetele Pasteur, utile mai ales pentru ndepartarea mediilor consumate din vasele de cultur. In acest caz, pipetele Pasteur trebuie ataate la o pomp de vid cu vacuum. Pentru alte manopere se folosesc pipete simple gradate de diverse volume ( 5ml, 10 ml, 20 ml, 50 ml) de unic folosin ( atunci cnd sunt din material plastic) sau folosibile dup splare i sterilizare (dac sunt din sticl). Pentru manipularea unor cantiti mai mici de lichide se folosesc pipete automate cu vrf de plastic detaabil; n acest caz numai vrfurile detaabile trebuie s fie sterile. Criotuburile reprezint recipientele confecionate din material plastic special, realizat pentru a rezista la temperatura azotului lichid, eseniale pentru crioconservarea culturilor celulare. In unele situaii pot fi folosite i recipiente din aluminiu pentru crioconservarea probelor de culturi de celule.

2.4. Medii i reactivi medii de cultur; FCS (ser fetal de vitel) (Fetal Calf Serum); antibiotice; glutamin; albastru de tripan; DMSO (dimetil sulfoxid); EDTA sodic (dietil diamino tetraacetat de sodiu); PBS (tampon fosfat); HEPES (acid-2-hidroxietil-1-piperazin etan sulfonic);

alcool 70%.

Mediile de cultura reprezint combinaii de minerale i diveri ageni nutritivi cu scopul de a simula ct mai bine mediul intern (caracteristicile mediilor de cultur vor fi prezentate n detaliu la subcapitolul Mediul de cultur). Se pot achiziiona att medii de cultur lichide sterile (gata preparate), sau medii pulbere care se dizolv n laborator. Indiferent de forma de prezentare, mediile de cultur se pstreaz n frigider la 4 C. La aceste medii se adaug FCS, glutamin, antibiotice, etc., n funcie de necesitate. FCS (ser fetal de vitel), este o component de baz pentru majoritatea mediilor, fiind o surs important de aminoacizi, hormoni, citokine i ali stimulatori de cretere. Se pstreaz la congelator la -20 C i se decongeleaz numai n momentul folosirii. Antibioticele se pstreaz congelate la -20 C, n capsule Ependorf, dozate n prealabil astfel nct s poat fi utilizate imediat n momentul preparrii mediului de cultur. Cele mai utilizate antibiotice sunt asocierea penicilin-streptozotocin i gentamicin. Glutamina este un aminoacid necesar metabolismului energetic celular ( vezi Compoziia chimic a mediilor de cultur), se pstreaz la congelator la -20 C. Albastru de Tripan se pstreaz la congelator la -20 C. Este o suspensie macromolecular care n mod normal nu penetreaz membrana celular. In cazul celulelor moarte sau neviabile, datorit creterii permeabilitii celulare, trece n citoplasma celulara. In acest fel prin colorarea cu albastru de Tripan, celulele viabile ramn albe, transparente, n timp ce cele moarte se coloreaz n albastru. Aceast coloraie este o metod de control a viabilitii celulare (vezi Cuantificarea celulelor). DMSO (dimetil sulfoxid) este o substan indispensabil crioconsevrii celulelor. Simpla congelare a celulelor duce la distrugerea acestora datorit formrii unor cristale de ghea care duc la spargerea membranei celulare. Prin adausul de DMSO se previne formarea cristalelor de ghea, astfel membranele celulare rmn intacte, ceea ce face posibil imersarea acestora n azotul lichid (vezi Crioconservarea). DMSO este un solvent puternic, o substan iritanta, care n contact cu pielea determin arsuri; trebuie manipulat cu dou perechi de mnui (vezi Protecia muncii). EDTA sodic este folosit pentru capacitatea sa de a fixa calciul din soluii. Captarea calciului din mediul de cultur duce la scderea eficienei caderinelor (proteine implicate in ataamentul celular) ceea ce faciliteaz desprinderea celulelor de substrat. Este un component nelipsit al mediilor de pasaj celular, singur sau mpreun cu enzime proteolitice (tripsina)( vezi Pasjul celular). PBS (tampon fosfat)(Phosphate Buffer Solution) reprezint unul din sistemele tampon de baz att in votro ct i in vivo ( fiind unul din cele mai importante sisteme tampon din plasma sanguin). Este un amestec de fosfat disodic i fosfat monosodic, amestecul de soluii fiind ajustat cu ajutorul unui pH- metru la un pH de 7,4 (ph-ul

normal al lichidului interstiial). Soluia de PBS este folositaca baz pentru soluia de tripsinizare, sau alte soluii, sau pentru splarea culturilor atunci cnd dorim ndeprtarea resturilor de mediu de cultur. Soluia de PBS se pstreaz la frigider. HEPES reprezint cel mai eficient tampon utilizat n cultura celulelor. Far a fi indispensabil culturilor, asigur o bun stabilitate a pH-ului pe parcursul creterii celulare. Administrat n cantiti prea mari poate inhiba creterea celular prim modificarea osmolaritii. Substanta se prezint sub form de pulbere i se pstreaz la temperatura camerei, n recipiente bine inchise i ferite de lumin.

3. Asigurarea sterilitii 3.1. Dezinfecia Dezinfecia deseurilor rezultate, a suprafeelor de lucru i a echipamentelor reprezint o operaiune important pentru a minimaliza la maximum posibil riscul de contaminare. Principalele clase de substante dezinfectante utilizate: Hipocloriii sunt dezinfectani generali, foarte activi contra virusulor; datorit faptului c sunt corozivi nu se folosesc pentru dezinfecia suprafeelor metalice. Cantitatea folosita: 1000 ppm pentru dezinfecia general, 2500 ppm pentru dezinfecia instrumentarului i splarea pipetelor i 10.000 ppm pentru ndepartarea deeurilor tisulare. Important! Cnd se realizeaz fumigaii cu ajutorul formaldehidei, trebuie ndeprtate toate sursele de hipoclorii, deoarece cele dou substane reacioneaz i produc compui chimici cu efect cancerigen. Fenolii nu inactiveaz virusii, care rmn activi n prezena materiei organice. Alcoolii trebuie s ating o concentraie eficient de 70% pentru etanol i 60-70% izopropanol. Sunt foarte utilizai n tehnica culturilor celulare, att pentru dezinfecia minilor, a hotei cu flux de aer laminar nainte i dup terminarea lucrului, a diferitelor instrumente etc. Alcoolul nu sterilizeaz, adic nu distruge n totalitate germenii patogeni, ci doar reduce numrul acestora, deci nu poate fi singur cale de a asigura sterilizarea culturilor i a suprafeelor de lucru din laborator. Totui sunt eficieni asupra virusurilor i bacteriilor (nu au efect asupra virusurilor neincapsulate); izopropanolul nu este eficient asupra virusurilor. Aldehidele sunt iritante, iar utilizarea lor trebuie s fie limitat. Glutaraldehida poate fi folosit n situaiile n care hipocloriii nu pot fi utilizai (dezinfecia materialelor din metal).

3.2. Asepsia cultivrii celulare 3.2.1. Reguli generale de asepsie Contaminarea culturilor cu microorganisme (bacterii, microplasme, micei) rmne cel mai important risc n tehnica culturilor celulare. Sursele de contaminare sunt numeroase: operatorul, atmosfera din laborator, suprafeele de lucru, mediile, soluiile, incubatorul, vasele de cultur, instrumentarul de laborator etc. Meninerea sterilitii culturilor necesit mult rigoare, cunosiinte teoretice, dar mai ales o manualitate special. La prima observaie, manoperele par banale, uor de reprodus, n realitate, succesul cultivrii depinde de multe mici amnunte greu de sesizat la prima vedere. La nceput, operatorul trebuie s fie asistat de cineva cu mult experien care s observe eventualele greeli de manipulare nainte ca ele s devin automatism. Este foarte important ca manipularea corect a echipamentelor s depeasc stadiul controlului contient i s devin reflex, pentru aceasta fiind necesare luni de practic susinut. O simpl cultivare cu succes este departe de a nsemna stpnirea tehnicilor, majoritatea specialitilor n domeniu fiind de acord c un operator stpnete tehnica de cultivare dac timp de trei luni nu are infecie n culturi n condiiile cultivrii far adaos de antibiotice. In urma infeciei, mediul de cultur devine acid i se coloreaz n galben, celulele sufer modificri morfologice (vacuolizri,cariorez i picnoz) i se desprind de pe substrat (n cazul celulelor ataate), mediile de cultur i pierd lipezimea devenind tulburi i cu aspect floconos. Extinderea infeciei poate avea graviti diferite, de la cteva flacoane pn la tot stocul de celule al laboratorului. Pentru minimalizarea riscului de infecie trebuie avute n vedere cteva msuri simple, respectate cu strictee de toate laboratoarele de culturi celulare: controlul flacoanelor de culturi cu ocazia fiecrei manipulari att vizual ct i la microscopul cu contrast de faz, meninerea culturilor cteva zile far adaos de antibiotice naintea nceperii experimentului (pentru evidenierea eventualelor infecii ascunse), verificarea sterilitii mediilor de cultur, verificarea sterilitii soluiilor utilizate, recipientele de cultura nu se mpart cu alte persoane i nu se folosesc pentru mai multe linii aflate n cultur (practic toate soluiile trebuie s aib inscripionat coninutul, data preparrii i nulele celui care le-a preparat) i verificarea infeciilor cu micoplasm periodic, ori mcar la fiecare linie celular strn introdus n laborator (identificarea infeciilor cu micoplase necesit tehnici de amplificare genetic, PCR). 3.2.2. Pregtirea spaiului de lucru Ceea ce trebuie nteles de la bun nceput este c laboratorul, spaiul de lucru al hotei cu flux de aer laminar, incubatorul i suprafaa recipientelor de cultur nu sunt sterile. Singurele elemente sterile sunt aerul laminar care coboar din partea superioar a hotei, instrumentarul sterilizat, interiorul flacoanelor de cultur, soluiile de splare sau tripsinizare i mediile de cultur. Cu toate acestea este recomandat s reducem pe ct este posibil i contaminarea bacterian a spaiilor nesterile din laborator, n acest fel reducem riscul de infecie n cazul unor greeli de manipulare. Se recomand dezinfecia periodic

a incubatorului, meninerea curaeniei i dezinfecia laboratorului n mod periodic. La fel de important este reducerea traficului din laboratorul de cultivare, n acest fel nivelul contaminrii bacteriene scade semnificativ. De multe ori este dificil de restricionat traficul persoanelor, laboratoarele de culturi celulare fiind spaii solicitate, atunci este esenial s se interzic traficul persoanelor pe timpul lucrului sub hota steril. Micarea persoanelor prin camer genereaz curent de aer care perturb curgerea lamin a aerului din hota, creaz turbulente i n consecin ntroduce aer nesteril n flacoanele de cultur. Inainte de nceperea lucrului, hota steril se porneste cu 30 de minute nainte pentru a ndeprta aerul contaminat din spaiul interior al hotei, suprafaa de lucru se elibereaz complet, se cur cu alcool sanitar, poriunea exterioar a flacoanelor de cultur se cur i ea cu alcool. Se aduc sub hota steril numai acele recipiente i insterumentar care vor fi utilizate. Se va avea grij ca toate manoperele efectuate s fie n cmpul vizual, s se curee aria de lucru ori de cte ori este murdrit cu ceva i la ncheierea lucrului. 3.2.3. Igiena personal Este recomandat splarea minilor nainte de nceperea lucrului deoarece prin aceast operaiune se ndeparteaaz de pe suprafaa tegumentului celulele superficiale care altfel ar putea infecta mediul pentru culturile celulare. Unii practicieni recomand splarea cu alcool att naintea nceperii lucrului ct i periodic n timpul lucrului. Indiferent de metoda utilizat pentru dezinfecie, operatorul trebuie s fie pe deplin contient c minile (chiar dac sunt splate i dezinfectate), nu sunt sterile, deci nu au voie s vin n contact sau s treac pe deasupra unui recipient sau instrument steril. Este important de reinut c tehnicile de asepsie utilizate n culturile celulare presupun reguli total diferite de cele valabile n tehnica chirurgical. Majoritatea persoanelor cu experien n domeniu recomand efectuarea manoperelor fr mnui chirurgicale, ceea ce asigur o mai bun sensibilitate i o priz mai bun a matarialelor manipulate, fr riscul ca acestea s fie scpate n timpul lucrului. Utilizarea manuilor este totui necesar atunci cnd materialul manipulat prezint risc de contaminare pentru operator (risc biologic mediu i crescut). In timpul utilizrii hotei sterile, utilizarea bonetei, halatului i a mnuilor sunt obligatorii numai n vederea respectrii normelor de igien n industria farmaceutic, nu i n laboratoarele de cercetare obinuite. Prul lung trebuie legat la spate. Pe parcursul manoperelor este bine ca mnecele halatului s fie suflecate, astfel nct antebreul s fie liber, mnecile lugi pot perturba fluxul de aer laminar i implicit pot cauza infectarea culturilor. Dac lucrul necesit utilizarea mnusilor, acestea trebuie s fie trase peste mnecile suflecate ale halatului. Dac operatorul sufer de o viroz, nu este recomandat s lucreze sub hota steril, sau dac activitatea este absolut necesar, s poarte o masc. 3.2.4. Manipularea recipientelor Manipularea recipientelor i a instrumentarului se face respectnd o regul simpl, fluxul de aer steril vine de sus (sau din fa n cazul hotelor cu flux de aer orizontal), deci nici o data un obiect nesteril nu poate fi trecut pe deasupra ori prin faa unui obiect steril. De exemaplu mna nu trebuie trecut pe deasupra unui flacon de cultura fr capac, un recipient de cultur nu trebuie trecut pe deasupra unui alt recipient de cultur cu capacul deschis. Pentru a preveni suprapunerea unui obiect nesteril peste ceva steril, recipientele

vor fi deplasate fr s fie ridicate de pe suprafaa de lucru, asfel ele nu vor trece peste alte vase ci le vor ocoli. Este strict interzis vorbitul n timpul lucrului la hota cu flux de aer orizontal, iar n cazul hotei cu flux vertical, dei este permis vorbitul, acesta trebuie redus la minim. In hota steril nu se recomand flambarea, deoarece flacra deschis genereaz cureni de aer care afecteaz fluxul de aer laminar. Un moment cu mare risc de contaminare l reprezint deschiderea capacului filetat att pentru flacoane ct i pentru recipientele cu medii. Pentru deschidere, recipientul trebuie uor nclinat (pentru hota cu flux vertical) dopul se defileteaz i se ndeparteaz nclinnd uor sticla astfel nct nici un moment poriunea inferioar a dopului s nu se suprapun peste orificiul deschis al vasului de cultur (numai poriunea interioar a dopului este steril, restul nu). In continuare dopul poate fi pus pe suprafaa de lucru cu poriunea steril n jos, sau poate fi inut ntre degetul mic i podul palmei cu partea steril spre exterior, pe durata aspirrii sau introducerii lichidului n recipient. Este recomandat ca recipientele s nu fie lsate fr capac, ci dopul s fie ataat imediat dup extragerea sau introducerea lichidului. Este foarte important ca gtul flacoanelor s fie uscat, deoarece umezeala de pe gtul flaconului favorizeaz ptrunderea bacteriilor ciliate din incubator n vasul de cultur. Pe perioada incubrii, au dopurile aezate n poziia ventilat(adic ntredeschise) pentru a permite schimbul de gaze dintre interiorul incubatorului i flaconul de cultur. 3.2.5. Transferul lichidelor Pentru trensferul lichidelor dintr-un recipient n altul se folosesc pipete i seringi. Acele uzuale sunt mult prea scurte pentru a fi utilizate n cultura celular, de aceea se folosesc ace lungi de 15-20 cm lungine cu vrful bont. Din motive de protecia muncii i asepsie este interzis aspirarea pipetelor cu gura, dispozitivele de aspiraie automat sunt cele mai indicate pentru lucrul sub hota steril. Pipeta ataat pompei de aspiraie trebuie dezvelit puin de hrtie la captul care vine ataat pompei ( pentru a preintampina infectarea) dup care se ndeprteaz i restul hrtiei de pe pipet. Pipeta va fi manipulat cu grij astfel nct s nu ating nimic nesteril. Introducerea n mediul de cultur a pipetei se face n aa fel nct aceasta s nu ating gtul sticlei cu mediu. Introducerea mediului de cultur n flaconul de cultur se va face fr a introduce pipeta n flacon, iar jetul de lichid s nu ating pereii interiori ai flaconului. Dac ajung mici cantiti de mediu pe pereii flaconului de cultur, acestea vor fi ndepartate imediat cu dispozitivul de aspiraie. Dac pipeta a atins pereii interiori ai vasului de cultur, aceasta nu mai poate fi folosit pentru a extrage lichid din vasul cu mediu i trebuie nlocuit. Este bine ca transferul de lichide dintr-un vas n altul s se fac doar prin pipetare sau cu ajutorul unei seringi, turnarea dintr-un recipient n altul este o manoper cu un mare risc de contaminare a lichidelor.

4. Mediul de cultur
Primele ncercri de culturi celulare s-au realizat n medii naturale reprezentnd extracte celulare sau fluide ale organismului, precum extractele embrionare, ser, limf. O

dat cu dezvoltarea acestui domeniu, cererea pentru cntiti mari de medii nbuntite calitativ a dus la introducerea unui mediu definitivat chimic, bazat pe analiza fluidelor organismului i biochimia nutritional. Mediul de Baz Eagle i Mediul Minim Esenial Eagle au fost unanim acceptate, suplimentate variat cu ser de vac, cal sau ser uman i extracte embrionare. Cu timpul mai multe linii celulare continue au devenit accesibile, deoarerce aparent aceste medii erau adecvate pentru majoritatea acestor linii; descoperirile urmtoare s-au bazat pe nlocuirea serului, optimiznd astfel mediul n funcie de tipul celular sau modificandu-l pentru ndeplinirea anumitor condiii (ex: Leibovitz L15 pentru a elimina nevoia adugrii CO2 si NaHCO3). Momentan exist o divergen cu privire la necesitile mediului, deoarece unii cercettori doresc s izoleze i s dezvolte celulele unei linii specifice, n timp ce alii folosesc celulele ca substraturi pentru formarea unor produi, gazde pentru dezvoltri virale sau studii moleculare noncelularospecifice. Tehnicile de producie au mai mult nevoie de medii selective, de obicei tip serum-free, n timp ce studiile virale i moleculare se bazeaz pe Mediul MEN Eagle, Mediul modificat de Dubecco DMEM sau RPMI 1640. In momentul de fa este prezent o gam foarte larg de medii de cultur cu cele mai diverse utilzri. Se poate face i un compromis prin mixarea unui mediu complex, precum mediul F12, cu unul cu o concentraie mai mare n aminoacizi i vitamine, precum mediul DMEM; aceast alternativ duce la formarea unui mediu folositor pentru toate scopurile, att pentru culturile celulare primare, ct i pentru dezvoltarea liniilor celulare. Din punct de vedere comercial mediile de cultur sunt disponibile sub form de pulbere sau gata pentru utilizare sub form de soluii sterile n flacoane speciale. Mediile sub form de pulbere sunt utilizate pentru prepararea mediilor de culturi celulare n laborator, un procedeu care necesit echipament special de ajustare a pH-ului, echipament de sterilizare. Manopera presupune un risc de infecie a mediului, dar este preferat de multe laboratoare deoarece este mai economic dect achizitionarea mediului gata preparat, acesta din urm fiind mai sigur i mai comod. In ceea ce priuvete caracteristicile mediului de cultur (DMEM, DF) acestea pot varia puin n funcie nu numai de firma productoare ci i de numrul de catalog al produsului. Variaiile se refer la concentraia glucozei, prezena sau absena glutaminei, a piruvatului de sodiu, HEPES, rou fenol, a ionilor de calciu i magneziu, unele vitamine etc. Toate aceste variabile duc la o mare diversitatate de oferte adaptate celor mai diverse nevoi experimentale. 4.1. Proprieti fizico-chimice pH-ul este pentru majoritatea liniilor celulare 7,4. Dealtfel, pH-ul optim pentru creterea celulelor variaz relativ puin ntre diferitele linii celulare: unele linii normale fibroblastice se dezvolt mai bine la un pH= 7,4-7,7, iar cele transformate la un pH= 7,07,4. S-a artat c celulele epidermice se pstreaz la un pH= 5,5, dar aceast valoare nu a fost unanim acceptat. In general este acceptat c celulele i nceteaz diviziunea la un pH cuprins intre 6,5 i 6.

In cazuri speciale este indicat realizarea unui experiment de creterea sau analiza unor funcii speciale pentru determinarea pH-ului optim. Cel mai folosit indicator de pH este rou fenol (rou n mediu alcalin i galben n mediul acid, n jurul unui pH neuteru are o culoare portocalie). Bioxidul de carbon, n faza gazoas apare n mediu ca bioxid de carbon dizolvat n echilibru cu H2CO3 i scade pH-ul. Deoarece cele trei sunt independente, este dificil de determinat efectul direct al CO2. Tensiunea CO2 atmosferic determin concentraia CO2 dizolvat direct, producnd n schimb H2CO3 care disociaz conform reaciei: H2O+ CO2 = H2CO3 +H+ +HCO3O dat cu inroducerea sistemelor tampon ale lui Good, precum HEPES, Tricine, au aprut speculaii conform crora CO2 nu mai este necesar pentru stabilirea pH-ului, deci poate fi omis; lucru dovedit mai trziu neadevrat, cel puin pentru o concentraie mare de celule. Dealtfel, 20 mM HEPES poate menine pH-ul n limite fiziologice, dar absena CO2 mut reacia spre stnga. Pentru a asigura condiii optime de cretere a celulelor trebuie s se pstreze proporiile concentraiilor ntr-un echilibru ( de exemplu, pentru un Mediu Eagle: NaHCO3 = 26nM, CO2 = 5%, HEPES = 50 mM). Temperatura folosit pentru incubare este n funcie de temperatura corpului animalului de la care au fost obinute celulele i de variaiile temperaturii dependente de regiunea anatomic (ex temperatura tegumentului este mai mic dect temperatura orgnelor interne); ncorporarea unui factor de siguran n cazul unor erori ale incubatorului. Temperatura recomandat pentru liniile celulare animale este de 37 C. Se recomand mentinerea unei temperaturi constante n incubator (fluctuaie +/- 0,5 C) pentru realizarea unor rezultate reproductibile. Creterea temperaturii este o problem serioas deoarece celulele nu pot tolera temperaturi cu 2 C peste temperatura normal mai mult de cteva ore i mor rapid la o temperatur de 40 C, sau la valori peste aceasta. In schimb tolereaz scderi considerabile ale temperaturii, putnd supravieui cteva zile la 4 C i pot fi rcite i congelate la -196 C. Presiunea osmotic, cuprins ntre 260-320 mOsm/Kg este acceptabil pentru majoritatea celulelor, dar este indicat ca o dat selectat s nu prezinte variaii mai mari de +/- 10 mOsm/Kg. Adiia de HEPES poate afecta osmolaritatea mediului.

4.2. Compoziie Aminoacizi. Celulele cultivate au nevoie de aminoacizi eseniali n adiie cu cisteina i tirozina, de asemenea cererile de aminoacizi sunt individuale, variind de la o celul la alta. Deseori sunt adaugai i aminoacizi neeseniali, fie pentru a completa incapacitatea unui anumit tip celular de a-i sintetiza, fie datorit faptului c, dei sunt sintetizai, sunt pierduti n urma reaciilor din mediu.

Concentraia aminoacizilor limiteaz de obicei concentraia celular maxim ce poate fi atins i acest balans poate influena supravieuirea celular i viteza de cretere. Glutamina este important pentru majoritatea celulelor. Unele linii celulare utilizeaz glutamatul drept surs de energie i carbon prin oxidarea la glutamat cu ajutorul glutaminazei i intr n ciclul acizilor tricarboxilici prin transaminare la 2-oxiglutarat. Dezaminarea glutaminei tinde s produc amoniac care este toxic i poate limita creterea celular. Vitaminele n general sunt incluse n ser, dar pot fi adugate i separat la nbogairea mediului. Vitaminele sunt precursori pentru numeroi co-factori. Multe dintre ele, n special cele din grupa B, sunt necesare pentru creterea i proliferarea celular. Cele mai des folosite sunt vitaminele A,E, riboflavina, tiamina i biotina. Sarurile sunt de sodiu, potasiu, magneziu,calciu,clor, SO42-, PO43- si HCO3- si reprezinta componentele majore implicate n osmolaritatea mediului. Natriul, potasiul i clorul au rol n meninerea potentialului membranar, n timp ce ionii sulfat, fosfat i carbonat reprezint anioni necesari matricei i precursorilor nutriionali ai macromoleculelor, dar i regulatori ai ncrcturii celulare. NaHCO3 are un important rol nutritiv alturi de capacitatea sa de tamponare, concentracia sa n mediu fiind determinat de concentraia CO2 n faza gazoas. Glucoza, este inclus n majoritatea mediilor ca surs de energie, fiind metabolizat n principal prin glicoliz. Astfel, se formeaz piruvatul care poate fi apoi convertit n lactat, care apoi intr n ciclul acizilor tricarboxilici, unde pe lng energie, rezult CO 2. Acumularea acidului lactic n mediu indic faptul c iclul Krebs nu funcioneaz n totalitate precum in vivo. Dat fiind faptul c majoritatea carbonului necesar culturii rezult din glutamin i mai puin din glucoz, glutamina trebuie s fie adaugat n concentraie mai mare dect glucoza n mediu. Serul sanguin, conine factorii de cretere care promoveaz proliferarea celular, factori de adeziune i cu activitate antitripsinic care promoveaz ataarea celulelor, fiind de asemenea i surs de aminoacizi, hormoni, minerale i lipide. Cele mai folosite tipuri de ser sunt: bovin, bovin-fetal, de cal i cel uman. Proteinele serice, dei sunt componentele majore ale serului, funciile multora sunt nc neclare. Se cunosc proteinele carrier, cum este albumina, prin legare acestea realizeaz transportul altor elemente; proteine care favorizeaz ataarea celular, precum fibronectina; alfa2-macroglobulina inhib tripsina; dar i alte proteine necaracterizate pot fi eseniale n ataarea i dezvoltarea celulelor cultivate. Hormonii, n ser, se gsesc ntr-o concentraie de 1-100 ng/ mL. Hormonii mai importani sunt: - hormonul de cretere (somatotropina) are efect mitogenetic; - insulina- asigur meninerea glucozei i a aminoacizilor, ceea ce poate inbuntii efectul mitogen, sau activa receptorii pentru IGF-1 i IGF-2: - hidrocortizonul favorizeaz ataarea celulelor i proliferarea lor, iar n anumite condiii, precum densitatea prea mare, poate avea efect citostatic;

Factorii de cretere prezeni n ser sunt: EGF (epidermal growth factor), PDGF (plateled derived growth factor), IGF-1,2 (insulin-like growth factor), FGF (fibroblast growth factor), IL-1 si IL-6 (interleukine). PDGF este principalul factor de cretere din ser i reprezint o familie de polipeptide cu efect mitotic care stimuleaz n special proliferarea celulelor fibroblastice i gliale. Ceilali factori de cretere prezint diferite grade de specificitate fiind prezeni n ser n cantiti mici. Lipidele, sunt prezente n ser n cantiti mici, fiind reprezentate de acidul linoleic, acidul oleic, etanolamina i fosfoetanolamina i apar de obicei legate de peroteine. Mineralele prezente n ser sunt: calciu, clor, fier, fosfor, seleniu, natriu, potasiu, zinc. Ele apar fie n stare liber, fie legate de unele proteine serice. Dezavantajele utilizrii serului. Dei component de baz n cultivarea celulelor in vitro, utilizarea serului sanguin presupune i numeroase dezavantaje i riscuri. Un prim dezavantaj ar fi faptul c serul este un produs biologic natural, de o mare complexitate, deci cu o semnificativ variaie de la o serie celular la alta. Multe din componentele din ser nu sunt complet determinate, efectele acestora fiind greu de prevzut. Mai mult dect att, fiecare sarj de ser trebuie caracterizat din punct de vedere al ratei de proliferare celular, pe fiecare tip celular n studiu. Un alt impediment major este riscul crescut de contaminare. Sterilizarea serului se face prin ultrafiltrare (metode care pot preveni contaminarea cu bacterii i cu micoplasma), desigur sterilizarea prin cldur ar inactiva componentele active ale serului.. De menionat este fptul c prin ultrafiltrare nu pot fi deparai virusii i prionii, ceea ce creaz probleme att n ce privete pstrarea indentitii celulelor cultivate, reproductibilitatea experimentului, ct i n ceea ce privete dezideratele de biosecuritate. Din aceste motive mediile cu ser nu se pot folosi n procese biotehnologice industriale, unde intereseaz compuii sintetizai de celulele n cultur. Antibioticele au fost introduse iniial n mediile de cultur pentru a reduce frecvena contaminrii. Dezavantajele utilizrii antibioticelor sunt: - favorizeaz dezvoltarea organismelor antibiorezistente; - ascund prezena unor contaminani care devin complet operaionali atunci cnd antibioticele sunt ndepartate din mediu, sau se schimb condiiile de mediu; - ascund infeciile cu microplasma; - au efecte antimetabolice care pot da o reacie ncrucisat cu celulele cultivate. Cu toate acestea, numeroase protocoale de preparare a mediilor includ i antibiotice n cantiti mici. Este esenial de menionat c folosirea antibioticelor nu nlocuiete msurile de antisepsie. Cantitile de antibiotice recomandate nu previn n totalitate riscul infectrii culturilor n cazul unor manipulri incorecte. 4.3. Mediile libere de ser

Mediile libere de ser au aprut ca o necesitate de a standardiza mai bine metodele utilizate, de a controla mai bine condiiile culturii celulare i de a face fa cerintelor din ce n ce mai mari de medii de cultur. In esen, formula mediilor libere de ser se bazeaz pe ideea nlturrii serului, cu adaosul unor componente care s-l suplineasc (aminoacizi, hormoni, factori de cretere etc.) Avantaje. Mediile libere de ser asigur o mai bun standardizare a condiiilor de cultur, o mai bun reproductibilitate a experimentelor printr-o compoziie constant i perfect controlat. Elimin riscul contaminrii, prezent n cazul majoritii oricror produi biologici, inclusiv serul. Mai mult dect att, reprezint excelente medii selective deoarece se pot aduga numai acei factori de cretare necesari unor tipuri celulare, lipsa lor inhibnd dezvoltarea tipurilor celulare nedorite. Prin utilizarea mediilor libere de ser se pot studia efectele factorilor de cretere, citochielor i interleuchinelor, ai cror efecte nu pot fi evideniate altfel, pentru c sunt constitueni obligatorii ai serului sanguin. Dezavantaje i limitri. Primul ar fi pre preul de cost mai mare dect al mediului cu ser, dei n mediile cu ser, serul este componenta cea mai costisitoare. Dac mediile cu ser asigur cultivarea unor categorii largi de linii celulare, n cazul mediilor fr ser, exist medii diferite pentru fiecare tip celular. Serul sanguin are o compoziie complex i asigur o bun parte din substanele necesare creterii celulare. Pentru a minimaliza aceste inconveniente mediile fr ser sunt suplimentate n funcie de utilitatea lor cu o serie de componente menite s mimeze compoziia serului snguin. Albuminele, sunt constitueni eseniali ai serului sanguin i ai lichidului interstiial, avnd rolul de sisteme tampon, meninerea osmolaritii plasmei, transport etc. Lipsa albuminelor din mediile lipsite de ser poate fi substituit prin adaosul de albumin seric bovin (ASB) care are rolul de a inbunatii durata de supravieuire a celulelor, dar are dezavantajul c adaug constitueni incomplet caracterizai n mediul de cultur. Factorii de adeziune celular, cum sunt fibronectina sau laminina adaugai direct n mediul de cultur amelioreaz semnificativ capacitatea de adeziune celular. Tripsinizarea. In cazul mediilor libere de ser, se realizeaz n mod diferit, comparativ cu mediile normale, deoarece proteinele din ser (antitripsina) interacioneaz cu tripsina realiznd o diminuare a eficienei acesteia, prin aceasta se exercit un efect protector asupra celulelor. Tripsinizarea celulelor cultivate n medii libere de ser se face numai dup o prealabil racire a acestora. Pentru tripsinizare se utilizeaz numai tripsina purificat, mai puin activ dect tripsina pur. Dup desprinderea celulelor de substrat i dispersarea, n mediile uzuale (cu ser), proteinele din ser au i rolul de a consuma tripsina ramas, prevenind digestia celulelor. In mediile fr ser pentru inactivarea tripsinei se adaug inhibitori de proteaze, cum ar fi inhibitorul de proteaz din soia sau aprotinina. Hormonii sunt o alt component important, care trebuie suplimentat n cazul mediilor lipsite de ser.

Cei mai utilizai, capabili s imbunteasc capacitatea de supravieuire celular, sunt hormonul somatotrop i insulina. Hidrocortizonul este util n cazul cultivrii celulelor gliale, a cheratinocitelor i a fibroblastilor. Alte linii celulare necesit triiodotironin (T3), n timp ce celulele epiteliului mamar necesit estrogeni i progesteron. Nevoia suplimentrii hormonilor n mediile libere de ser are i avantaje, anume prin omiterea unor hormoni se pot realiza medii de cultur selective pentru anumite culturi celulare. Factorii de cretere, cum ar fi factorul de cretere al epiteliilor (EGF), factorul de cretere al plachetelor sanguine (PDGF), interleukinele, pot de asemenea imbuntii semnificativ durata de supravietuire i viteza creterii celulare. Microelementele cele mai des ntlnite ca suplimente n mediile libere de ser sunt fierul, cuprul, seleniul. Adesea mediile sunt suplimentate i n vitamine (colina) i acizi grai (acid linoleic).

5. Intreinerea celulelor n cultur Din punct de vedere morfologic, culturile celulare iau una din cele dou forme: - n monostrat (monolayer sau ancorage-dependent); reprezint culturi celulare ce necesit un suport pentru cretere i dezvoltare; - n suspensie (ancorage-independent); reprezint culturi celulare ce nu necesit un suport pentru cretere i dezvoltare; Sunt i cazuri n care creterea celulelor se face i semiaderent, fiind o combinaie dintre creterea n mediu lichid (suspensie) i creterea pe suport solid. Forma de cretere a culturii celulare reflect, de obicei, esutul din care deriv. Astfel, celulele cultivate din snge tind s creasc n suspensie, pe cnd celulele derivate din esuturi solide (plmni, rinichi etc.) tind s creasc sub form de monostrat. Culturile celulare ataate pot fi clasificate n funcie de morfologia celulelor n: - fibroblastice; - endoteliale; - epiteliale (cum ar fi liniile celulare HeLa); - neuronale (SH-SY5Y) etc. Fiecare linie celular este clasificat i denumit, morfologia lor reflectnd aria esutului de origine. 5.1. Schimbarea mediilor Flacoanele din termostat se examineaz zilnic, urmrind numrul celulelor, diviziunea acestora i confluena lor. Mediul conine un indicator de culoare, rou fenol, care la nceput are culoarea rou purpuriu, iar o dat cu trecerea timpului (cteva zile) i schimb culoarea, n funcie de consumarea mediului devine portocaliu, iar n condiiile unei acidifieri marcante, galben. Culoarea galben denot o epuizare complet a mediului i acumularea acidului lactic,

mult peste capacitatea de tamponare a sistemelor tampon, sau o infecie a culturii. Se recomand schimbarea mediului nainte de apariia culorii galbene, anume la culoarea portocalie. Mediul uzat se aspir cu o pipet Pasteur ataat la o pomp de vacuum, apoi se adaug mediul proaspt. Se introduce din nou n termostat, cu dopul n poziia ventilat. 5.2. Pasarea culturilor celulare ataate Liniile celulare aderente vor crete pn n momentul n care vor acoperi toat suprafaa disponibil sau pn cnd mediul ramne fr nutrienii necesari creterii. Din acel moment trebuie realizate subculturi pentru a preveni moartea celulelor. Pentru aceasta trebuie mai ntai s realizm suspensionarea celulelor (desprinderea acestora de pe suprafaa recipientului). In majoritatea cazurilor este necesar utilizarea proteazelor (tripsina) pentru desprinderea celulelor de pe suprafaa de cretere. In unele situaii proteazele pot fi duntoare i atunci se folosesc alte metode de desprindere, cum ar fi cele mecanice; n cazul celulelor tumorale pentru desprindere se foloseste EDTA pentru ndepartarea calciului. In acest caz proteinele de adeziune dependente de calciu (caderinele i integrinele) i pierd proprietaile i celulele se desprind de substrat. Inainte de nceperea manoperei propriu zise, mediile se scot din frigider i se las la temperatura laboratorului. De asemenea se scoate tripsina de la frigider i FCS de la congelator. Tuburile cu culturi celulare se examineaz zilnic. Dup 2-3 ore de la pasaj se observ aderarea celulelor la pereii tubului; dup cateva ore devin fusiforme, se alungesc i ncep diviziunea. Din tuburi se arunc mediul, se spal de cteva ori cu PBS, se adaug tripsin (1200 microlitri) i EDTA pn se acoper. Se las 2-3 minute la incubator pentru desprindere (se urmrete la microscop procesul). Nu trebuie s apar n cmp celule aglomerate. Dup desprinderea celulelor se adaug 6 ml de mediu (FCS din mediu inactiveaz tripsina) i se amestec de 10 ori cu o sering sau cu pipeta pn la organizarea celulelor. Manopera se executa sub hata sterila. Pentru numrare, se centrifugheaz n prealabil, 5 minute la 1000 rot/min; limfocitele se centrifugheaz 10 min la 1200 rotaii/min. Dup centrifugare se arunc supernatantul, se resuspensioneaz cu mediu (1 mL), se iau 10 microlitri i se numar pe camera de numrat. Concentraia de nsmnare a celulelor difer de la o linie la alta, dar n general pentru majoritatea liniilor celulare coninue i ale liniilor finite fibroblati este ntre 10.000-50.000 celule/ml, iar celulele cu vitez mic de cretere cum sunt celulele epiteliale necesit o concentraie de 100.000 de celule/ml. In principiu, n cazul pasajelor iniiale, concentraia de celule trebuie s fie mai mare, ea scznd treptat n pasjele care urmeaz. 5.3. Pasarea culturilor celulare n suspensie

Unele linii celulare cresc suspendate n mediile de cultur, fie pentru c nu au capacitatea de adeziune la substrat (limfocitele, celulele leucemice, celulele ascitice Ehlich etc), fie c sunt meninute suspendate prin diferite procedee. Cultivarea n suspensie are avantajul unei ntreineri mult mai simpl, pasajul se face fr a mai fi nevoie de metode care s mobilizeze celulele. Alt avantaj major const n faptul c pe acest tip de cultivare se pot dezvolta diverse procedee biotehnologice, prin realizarea unor instalaii de tip industrial. Celulele n suspensie se menin n flacoane normale de cultur; este i aici important c stratul de mediu de cultur s nu aib o grosime mai mare de 5 mm pentru a permite schimbul de gaze. Pasajul se poate realiza far schimbarea vasului de cultur, dar n acest caz riscul de contaminare bacterian crete cu fiecare pasaj datorit picturilor fine de mediu care se depun pe gtul flaconului. Iniial se recolteaz o prob pentru evaluarea concentraiei celulare din vasul de cultur. Concentraia celular trebuie s fie sub 1.000.000 celule/ ml. Se amestec suspensia celular, prin aspirare i refulare cu ajutorul pipetei, pentru a dispersa celulele aglutinate. Se introduce o parte din mediu cu celule n suspensie ntr-un flacon nou, astfel nct concentraia final la nsmnare s fie de 100.000 celule/ ml pentru liniile cu vitez de cretere mic i 20.000 celule/ml pentru cele cu vitez de cretere mare. 5.4. Cuantificarea celular Pentru majoritatea tehnicilor utilizate n culturile celulare ( crioconservare, realizarea subculturilor, tehnici de fuziune celular etc) este necesar numrarea celulelor i, n acelai timp, exprimarea viabilitii acestora. Utiliznd un numr consitent i cunoscut de celule se va obine o cretere corespunztoare n mediu i de asemenea se vor putea standardiza anumite metode experimentale care utilizeaz culturile celulare. Se mobilizeaz culturile celulare aderente cu ajutorul tripsinei, iar apoi se vor resuspensiona ntr-o cantitate mic de nediu de cultur obinuit. Din aceast suspensie se ia o cantitate de 100-200 microlitri i se adaug un volum egal de Albastru Tripan (se obine o soluie 1:1, factorul de dilutie = 2). Se fixeaz hemocitometru la microscop i se vizualizeaz campul cu obiectivul 10x sau 20x. Celulele viabile vor apare necolorate, iar cele moarte vor apare n cmpul microscopului, de culoare nchis, albastru-violet. Viabilitatea celulelor se poate evalua procentual numrnd 100 de celule, indiferent de starea lor. Diluia uzuata pentru numrarea celulelor este de 1:2, folosindu-se ca diluant mediul de cultur proaspt. Numrarea celulelor se face n ptratul de ordinul unu din mijlocul camerei. Se numar ca i n cazul hematiilor 5 ptrate de ordinl doi, utilizndu-se ptratele de ordinul trei cuprinse n fiecare. Rezultatul se exprim n numr de celule/ml. c numr de celule n numrul celulelor numrate v volumul (ml)

c= n/v (camera de numrat la microscop) 5.5. Congelarea (crioconservarea) Scopul congelrii este acela de a avea posibilitatea pstrrii, pe timp ndelungat, n cadrul laboratorului a diferite linii celulare, disponibile n orice moment n funcie de necesitate. Alte avantaje sunt, reducerea riscului contaminrii microbiene, sau cu alte linii celulare, precum i reducerea riscului apariiei modificrilor genetice, sau morfologice. Principiul de baz care trebuie respectat n timpul crioconservrii este acela de a nghea lent i a dezghea rapid. Astfel se elimin pe ct posibil pieredrile celulare din timpul acestui tip de manipulare. In prezena unor substane crioprotectoare, liniile celulare pot fi conservate pe perioade lungi de timp. Pentru realizarea crioconservrii se face un amestec din suspensia celular avnd n componen FCS 40-50% i DMSO (dimetilsulfoxid) 10%. Se calculeaz 1-2 milioane de celule/criotub. Se rcesc 2 ore la -20 C, 6-12 ore la -80 C, apoi se introduc n azot lichid unde pot fi conservate timp nelimitat. La -80 C pot fi pastrate cteva luni. Se prefer urmrirea acestor trepte pentru crioconservare, nefiind indicat trecerea direct n azot lichid, deoarece celulele sufer degradri. Pentru o mai bun conservare a viabilitii celulare se folosesc dispozitive speciale de tip Mr. Frosty care asigur o racire lent (1 C/ min). 5.6. Decongelarea liniilor celulare Liniile celulare se pstreaz sub form congelat; este foarte important ca ecestea s fie decongelate corect pentru ca celulele s poat fi meninute viabile. Substanele crioprotectoare obinuite sunt toxice la temperaturi obinuite, de aceea este indicat o dezgheare rapid i o diluie imediat n mediul de cultur, pentru a minimiza pe ct posibil efectele toxice. Pentru decongelarea liniilor celulare se pregtete mediul de cultur (special pentru fiecare linie celular de exemplu: pentru HeLa- carcinom epitelial, mediul n care crete este DMEM care include 1% aminoacizi eseniali, 10% FCS i gentamicin). Se scoate mediul de cultur de la frigider i se las la temperatura camerei. Intr-un tub gradat se pregtesc 5 ml de mediu. Criotubul se scoate din azotul lichid, utiliznd mnuile de protecie; se ine n mn pn cnd se ndeprteaz mediul de pereii criotubului, se pune coninutul n mediu, se amestec i dup aceea se centrifugheaz 5 minute la 1000 rot/min. Se arunc supernatantul, se resuspend n mediu i se pun n flacoane inscripionate n prealabil. Un ml din mediu se omogenizeaz foarte bine apoi se va face aprecierea numeric. In paralel se evalueaz viabilitatea cu soluie de Albastru de Tripan: pe o lam se pune o pictur de suspensie celular + o pictur de Albastru de Tripan i se examineaz la microscop. Se numr 100 de celule indiferent de starea lor, iar numrul celor viabile se exprim procentual. Celulele vii sunt transparente cu citoplasma si membrana luminoase. Celulele moarte sunt mate, colorate n albastru datorit distrugerii structurii membranei celulare i a permeabilizrii acesteia.

Numrul de celule/flacon se fixeaz la 500.000-1.000.000, n funcie de volumul flaconului, tip de celule, scop etc. Se completeaz suprafaa celular pn la 7-8 ml cu mediu i se introduce n flacon, avnd grij s nu atingem gtul flaconului. Flacoanele cu culturi celulare se introduc n incubator cu dopul aezat n pozitia ventilat, urmarindu-se la 2-3 ore aderarea celulelor. Dup decongelare este de preferat ca mediul de cultur s aiba 20%FCS.

6. Tipuri de culturi celulare

Majoritatea celulelor cultivate sun rezultate prin dispersia mecanic sau enzimatic a unor esuturi. Indiferent de metoda folosit, va rezulta o cultur primar (primul stadiu al cultivrii oricrui tip celular). Procesul de selecie celular ncepe n mod spontan nc din primele ore ale cultivrii. O dat acomodate cu noile condiii de mediu, dup ce se ataeaz la substrat, celulele vor ncepe s se divid, dar intensitatea diviziunii celulare nu va fi aceeai din cauza faptului c viteza de diviziune nu este aceeai pentru toate celulele i pentru c unele tipui celulare vor fi mai avantajate dect altele de condiiile mediului de cultur. In practic nu toate celulele dintr-un esut se pot adapta la noile condiii din mediul de cultur, unele celule dispar, n timp ce altele prolifereaz intens (fibroblatii). Diviziunea celular se va opri atunci cnd celulele vor ocupa tot spaiul disponibil (inhibiie de contact). Pentru a asigura diviziunea n continuare a celulelor, ele trebuie desprinse de substratul la care ader i apoi o cantitate determinat din aceste celule s fie mutat intr-un alt flacon de cultur. Aceast manoper poart denumirea de pasaj celular. In urma primului pasaj (sau prima subcultur) va rezulta o linie celular finit, care poate fi pasat de cteva ori consecutiv. Numrul pasajelor reprezint de cte ori o cultur celular finita a fost pasat (transferat ntr-un alt recipient de cultur). Numrul de pasaje nu trebuie confundat cu numrul de generaii celulare (care reprezint numrul de diviziuni celulare suferite de celulele cultivate), fiind n jur de 50 (ntre 20 i 80) pentru majoritatea tipurilor celulare. Atunci cnd celulele din recipientul de cultur sunt mparite n dou cantiti egale i recultivate n dou recipiente de dimensiuni identice cu recipientul din care au provenit (raport de separare 1:2), numrul de pasaje devine aproximativ egal cu numrul de generaii. In practic se utilizeaz raportul de separare de 1:8, 1:16, dar daca se respect principiul de a folosi ntotdeauna un multiplu de 2, atunci se va putea calcula uor n funcie de numrul pasajelor, numrul de generaii. Linia celular devine omogen i stabil dup trei pasaje succesive. Dei majoritatea celulelor i psteaz nelimitat numrul de cromozomi i integritatea genetic pe parcursul cultivrii (fibroblatii normali umani ramn euploizi pe parcursul a 50 de diviziuni i apoi intr n apoptoz), totui sunt i linii celulare (cum ar fi fibroblatii murini i diverse linii tumorale umane i animale) care pot genera linii celulare continue. Aceste linii celulare sufer un proces de imortalizare, adic pot supravieui ntr-o cultur o durat nedeterminat de timp, suportnd teoretic un numr infinit de pasaje. Liniile imortalizate prezint adesea modificri cromozomiale (aneuploidii). Imortalizarea poate aparea, sau poate fi indus cu ajutorul unor mutageni chimici sau virali. Adesea, dar nu ntotdeauna, liniile imortalizate sufer i un proces de transformare, asociat cu pieredrea inhibiiei de contact ( capacitatea celulelor ataate de a-i opri diviziunea cnd acopera n totalitate suprafaa de cretere i vin n contact unele cu altele), scderea aderenei la substrat (sau pierderea ei totale), pierderea dependenei

de ataare (se multiplic i cnd se gsesc n suspensie, neataate), pierderea inhibiiei de supraaglomerare, scderea dependenei de factorii de cretere, expresia diferitelor antigene embrionare etc. In mod firesc trnsformarea implic modificri genetice similare cu cele pe care le presupune transformarea malign in vivo.

6.1. Culturi primare Cultura primar este stadiul imediat izolrii celulelor dintr-un esut, nainte de prima subcultur. In realizarea unei culturi primare se disting mai multe etape: izolarea esutului, disecia i /sau dezagregarea i cultivarea n vasul de cultur. Dezagregarea poate fi mecanic sau enzimatic. Pentru dezagregarea enzimatic se pot folosi o gam foarte larg de enzime cum ar fi tripsina, colagenaza, elastaza, hialuronidaza, pronaza etc., singure sau n diverse combinaii. Fiecare enzim utilizat are avantajele i dezavantajele ei. Cele mai bune rezultate sunt date de tripsin si pronaz, dar acestea au dezavantajul c lizeaz adesea i celulele cultivate. Colagenaza este mult mai puin agresiv pentru celule, dar i mai puin eficient n ce pivete dezagregarea celular. Acest neajuns poate fi ameliorat prin asocierea cu hialuronidaza. Dup separare majoritatea celulelor normale izolate (excepie fac celulele hematopoetice) pentru a supravieui i prolifera necesit un substrat solid de care s se ataeze. 6.1.1. Tesuturi folosite pentru obinerea culturilor primare Regulile generale pentru realizarea culturilor primare ar fi: - cu ocazia diseciei se ndeparteaz esutul necrozat i esutul adipos; - se vor folosi numai instrumente bine ascuite pentru a minimaliza distrugerile tisulare; - enzimele utilizate pentru dezagregare trebuie ndepartate imediat prin centrifugare. Concentraia celulelor din cultura primara trebuie s fie mult mai mare dect a celor pasate din subculturi. Trebuie avut n verdere c multe din celulele izolate nu vor supravieui din diverse motive. Cel mai adesea se folosesc medii complexe cu ser fetal bovin. Pentru izolarea unor celule specializate se folosesc adesea medii selective. Cele mai bune rezultate sunt obinute atunci cnd sunt utilizate esuturi embrionare, a caror dezagregare ste mai simpl, conin mai multe celule viabile, prolifereaz mai rapid, asigur linii cu un numr mai mare de pasaje pn la intrarea n declin, ofer condiii mai bune de sterilitate etc. Izolarea din embrion murin. Pentru a cunoate exact stadiul gestaiei este important ca monta s se realizeze controlat, prin introducerea unei femele adulte n spaiul masculului. In principiu mperecherea va avea loc n decurs de trei zile i poate fi confirmat de prezena unui dop mucos la nivelul vaginului. Vrsta optim la care embrionii se utilizeaz pentru obinerea de celule este de 13 zile, cnd embrionii sunt destul de mari, dar au i un numr mare de celule mezenchimale nedifereniate, obiectul culturii primare embrionare. Dac urmarim cultivarea unor esuturi specifice unor organe,

atunci este recomandabil s sacrificm animalele n ziua a 18 cnd majoritatea organelor sunt deja formate. Sacrificarea animalelor se face prin luxaie axoatloidian. Dup sacrificarea animalelor, se deschide cavitatea abdominal pe direcia fasciei albe mediane, dup o prealabil ndepartare prin traciune lateral a tegumentului pros. Se evideniaz n felul acesta viscerele abdominale, iar n partea inferioar se distinge cornul uterin care este excizat i plasat intro plac Petri care conine soluie salin tamponat, steril, cu adaos de antibiotice. Se aduce uterul n hota steril, ude se schimb placa Petri. Se extrag pe rnd embrionii din uter, dup care se nltur nvelitorile fetale Se transfer embrionii ntr-un nou vas Petri. Este preferabil plasarea cutiei Petri pe un vas cu ghea pentru racirea embrionilor. Izolarea din esuturi adulte. In unele cazuri, indeosebi n cazul celulelor tumorale, este necesar ca esutul din care se face cultivarea s provin de la oameni sau animale adulte internate pentru diferite afeciuni. In cazul manipulrii esutului uman trebuie avute n vedere precauii suplimentare, comparativ cu animalele. Tesuturile umane reprezint un risc crescut pentru operator, fiind considerate celule cu risc mare de contaminare i, n consecin, trebuiesc lulate msuri suplimentare de precauie ( se lucreaz numai cu mnui, se dezinfecteaz instrumentarul i dup terminarea lucrului, dezinfecia riguroas a hotei cu flux de aer laminar). Este recomandabil ca toate operaiunile menionate s se realizeze ntr-o sal separat. In plus, manipularea esutului uman presupune numeroase reglementri privind etica i legislaia medical, care trebuie cunoscute temeinic naintea manipulrii acestor probe biologice. 6.1.2. Tehnici utilizate n realizarea culturilor primare Exisa mai multe tehnici utilizate n realizarea culturilor primare, acestea pot fi mecanice (disectia) i enzimatice. Metoda explantelor primare a fost prima metod utilizat n culturile celulare. Astzi este o metod rar utilizat, totui poate fi util cnd sunt disponibile cantiti foarte mici de esut. Este de asemenea util pentru cultivarea celulelor foarte sensibile care nu rezist la procedee de dezintegrare mecanic sau enzimatic. Dezavantajul const n slaba adezivitate a unor esuturi i n faptul c nu se pot izola n acest fel celule cu vitez de cretere mai mic. Metoda const n izolarea unor poriuni mici de esut, care apoi sunt introduse ntr-un vas de cultura i acoperite cu mediu. Poriunile de esut ader spontan la substrat i din ele ncep s creasc celule care se rspndesc pe suprafaa de cultur. Ulterior poriunile de esut se ndeprteaz, cu ajutorul unei pipete, i pot fi folosite pentru realizarea altor culturi. Ceea ce rmne se numete cultar primar, care apoi poate fi utilizat pentru realizarea de subculturi. Digestia enzimatic. Adeziunea celular este dependent de existena unor glicoproteine (CAM Cell Adhesion Molecules) din care unele sunt calciu dependente (caderinele i integrinele). Altele nu depind de calciu pentru realizarea funciilor de ataare (fibronectina i laminina). Caderinele i integrinele sunt sensibile la aciunea chelatanilor de calciu cum este EDTA.

Fibronectina i laninina nu sunt sensibile la scderea ionilor de calciu din mediu extracelular, dar sunt sensibile la aciunea proteazelor (pepsina, tripsina, pronaza etc). Alte molecule de adeziune celular cum sunt proteoglicanii sunt mult mai puin sensibili la enzimele proteolitice, dar pot fi degradai de hialuronidaz i heparin. Soluiile de dezagregare sun diverse i cu o compoziie de o complexitate variabil n funcie de de tipul de esut utilizat, soluia de baz coninnd tripsina i EDTA. Tripsina este cea mai utilizat enzim datorit eficienei ei crescute i pentru faptul c reziduurile de tripsin pot fi nlaturate cu uurin datorit proteinei antitripsina prezent n serul din mediul de cultur. Expunerea la tripsin nu trebuie s depeasc 30 de minute, la 37 C deoarece afecteaz celulele. La 4 C expunerea crete pn la 6-18 ore. In funcie de temperatura utilizat (4 C- 37 C) distingem metoda cu tripsin la cald i la rece. Metoda cu tripsina la cald. Aceast metod este util n cazul unor cantiti mari de esut, care se pot dezagrega ntr-un timp relativ scurt, reprezentat ndeosebi de esutul embrionar murin i de esutul embrionului de pasre. Metoda este mai puin eficient n cazul esutului adult unde cantitatea de esut fibros este mare i dezagregarea se realizeaz mai greu. Dup ce piesa de esut este curaat de esutul gras, se secioneaz n cuburi mici care apoi sunt puse ntr-un pahar Erlenmeyer, peste care se adaug soluia de dezintegrare. Se acoper paharul i se pune la agitator magnetic, cu temperatur reglabil, l00 r/min i 37 C. Dup 30 min se extrage mediul, se centrifugheaz pentru sedimentarea celulelor desprinse, se ndeprteaz supernatantul, iar celulele se resuspend n mediul de cultur. Se cuatific celulele, apoi se introduce o cantitate determinat din acestea n recipientul de cultur, se completeaz cu mediu i se introduc n incubator. In paharul Erlenmeyer (n care au mai rmas poriuni de esut) se adaug o nou cantitate de soluie de dezagregare i procesul se reia de 5-7 ori ( la interval de 30 de minute), pn cnd esutul este digerat complet, sau pn se constat c nu se mai realizeaz o digestie vizibil a esutului. Metoda cu tripsin la rece. Una din dezavantajele tripsinizrii la cald este expunerea prelungit la tripsin. Un alt dezavantaj este procedeul destul de ndelungat de 4-5 ore. Aceste dezavantaje pot fi nlaturate prin meninerea esutului n soluie de dezintegrare timp de 6-18 ore la 4 C (practic peste noapte). In aceste condiii tripsina penetreaz tesutul pn n profunzime, dar nu are nici un efect proteolitic datorit temperaturii neadecvate (37 C). In continuare dezagregarea se face ca n primul caz, doar c este suficient o etap de 30 de minute pentru dezagregarea complet a esutului. Aceast metod asigur un numr mai mare de celule viabile i asigur izolarea unor celule care nu supravieuiesc altor metode. Metoda cu colagen. Tripsina poate distruge unele celule cum este cazul celulelor epiteliale, sau poate fi ineficient n cazul esuturilor fibroase, de aceea este necesar s fie utilizate enzime cum ar fi colagenaza, hialuronidaza, neuraminidaza, dispaza, pronaza etc. Dintre aceste enzime cea mai utilizat este colagenaza; utilizat de obicei pentru esuturile adulte, care n mod normal conin cantiti mari de colagen. Piesele de esut recoltate se plaseaz n recipiente de cultur (20-30 piese de esut), se ndeparteaz soluia salin n care au fost recoltate i se adaug mediu de cultur obinuit. Se adaug colagenaz 200U/ml, se introduce la incubator 12-48 de ore. Datorit colagenazei esutul nu va adera la substrat, iar celulele desprinse vor pluti libere n

soluie.Dup un timp, acest lucru depinznd de tipul de esut, n urma unor agitri uoare esutul se va dezintegra n celule individuale sau mici conglomerate celulare. Dac se constat conglomerate celulare, se repet operaiunea de dezagregare cu colagenaz. Dac deagregarea este complet, atunci se recolteaz mediu cu celule dispersate, se separ celulele prin centrifugare, se cuanific celulele i se adaug mediu de cultur pentru splare(indeprteaz restul de colagenaz) i se introduc ntr-un flacon cu mediu de cultur; la 24 de ore, dup ce celulele s-au ataat, se nlocuiete mediul de cultur. Unele celule, cum ar fi macrofagele, ader la substrat n prezena colegenazei, de aceea prin selectarea celulelor suspendate se elimin macrofagele. Dezagregarea mecanic. Exist mai multe procedee de disociere mecanic, cum ar fi colectarea celulelor care se desprind n urma disocierii mecanice, trecerea pieselor de esut prin site cu ochiuri din ce n ce mai mici, aspirarea i evacuarea brusc dintr-o sering, sau prin pipetare repetat. Avantajul ar fi durata mai scurt dect n cazul metodelor enzimatice, dar dezavantajul major l constituie lezare celulelor. In principiu metodele mecanice se utilizeaz n cazul esuturilor moi, ca de exemplu, creierul, splina, ficatul embrionar i unele tumori ale esuturilor moi. Chiar i n cazul acestor esuturi unde dezagregarea se face uor, viabilitatea celular este mai sczut dect n cazul metodelor enzimatice. 6.2. Linii celulare O linie celular reprezint acea cultur celular alctuit dintr-un singur tip celular, care poate fi propagat serial pentru un numr limitat de diviziuni sau un numr nelimitat de diviziuni. Liniile celulare cu via limitat imbtrnesc i mor dup 30-80 de diviziuni, de aceea este necesar pstrarea lor n banci de linii celulare, pentru a fi accesibile perioade cnt mai lungi. Liniile celulare trebuie denumite, numele unei linii celulare poate fi dat n funcie de esutul de origine ( NHB- normal human brain), numrul pasajului NHB1 i dup caz numrul coloanei celulare (NHB1-1). Numrul este dat de numrul biopsiei din care au provenit, pentru aceasta fiind necesar o eviden impecabil, preferabil computerizat, a probelor recoltate din clinic. La liniile celulare finite, este recomandabil s se in evidena i la numrul de generaii la care se afla linia (NHB ). Intreinerea culturilor celulare Toate culturile celulare odat iniiate au nevoie de ntreinere periodic. Intreinerea se refer n primul rnd la schimbarea mediului de cultur. Exist cel puin dou motive principale pentru care mediul de cultur trebuie schimbat periodic, epuizarea substanelor nutritive din mediu i acumularea unor produi toxici, n deosebit a acidului lactic care altereaz metabolismul celular. In general mediul de cultur trebuie schimbat cnd culoarea acestuia vireaz de la rou purpuriu (culoarea normal) la portocaliu. Schimbarea culorii mediului este dovada acidifierii datorit acumulrii acidului lactic. Frecvena cu care se realizeaz schimbarea mediului depinde de intensitatea metabolismului celular; se face o dat sau de dou ori pe saptmn. O alt manoper esential pentru supravieuirea celulelor este pasarea (adic formarea unei noi

subculturi) n momentul n care celulele ocup intrega suprafa disponibil. Frecvena pasajelor celulare difer foarte mult de la o linie celular la alta, n principiu liniile cu un numr definit de diviziuni au o vitez mai mic de cretere, deci pasajul se face mai rar (o data la 2, 3 sau 4 sptmni, depinde mult i de tipul celular cultivat), n timp ce liniile imortalizate tumorale pot necesita i un pasaj pe sptmn. Timpul n care trebuie realizat pasajul depinde i de cantitatea de celule care sunt introduse n flaconul de cultur, cu ct sunt mai puine celule, cu att timpul de ocupare a spaiului disponibil este mai mare. In cazul n care o linie cu un numr limitat de diviziuni are un ritm de cretere prea rapid, n acest fel epuizandu-i prea repede durata de via, se poate recurge la mediile de oprire. Ele pot fi utile i pentru creterea intervalului dintre pasajele celulare, n plus prin blocarea celulelor n stadiul neproliferativ se poate induce un anumit grad de difereniere fenotipic util n diverse protocoale experimentale. Un mediu de oprire se obine prin reducerea procentului de ser (0,5- 2%), sau chiar omiterea lui. In cazul mediului liber de ser oprirea se realizeaz prin reducerea sau omiterea unor factori de cretere. Metoda nu poate fi aplicat i n cazul celulelor tumorale, care nu i blocheaz ciclul celular n condiiile lipsei factorilor de cretere. Flacoanele cultivate trebuie examinate periodic pentru a urmri starea de sntate a celulelor i a sesiza din timp apariia unor infecii. Dac mediul de cultur nu are suficieni nutrieni, cultura ncetinete n ceretere. Prezena unor compui toxici, defeciuni ale incubatorului, pot s afecteze calitatea i viteza de cretere a celulelor. 6.3. Sisteme tridimensionale de culturi celulare Una din principalele limitri ale culturilor celulare este c, celula cultivat nu se comport n mediul de cultur ca n organismul de origine. Dintre cele mai importante motive se numr i acela c funcia celular se realizeaz ca urmare a interaciunilor complexe care se stabilesc ntre diverse tipuri celulare care intr n structura unui esut, sau dintre celule i componentele matricei extracelulare. Pentru a indeprta cel puin parial acest neajuns, s-a ncercat cultivarea celulelor n structuri tridimensionale, care s mimeze ct mai bine condiiile din organism. In principiu acest deziderat se poate realiza pe dou ci, fie prin pstrarea structurii iniiale a esutului de origine prin realizare culturilor de organe (n care poriuni de organe sunt cultivate fr a mai fi supuse dezagreagrii), fie reconstituirea sa, dup dezagregarea celular, prin culturi n matrice tridimensionale i culturi organotipice. Cultura de organe este cea mai simpl metod i presupune recoltarea unei poriuni de organ cu cultivarea ei n mediul de cultur, meninndu-se astfel complexitatea celular i structura histologic a organului iniial. Metoda are numeroase dezavantaje, principalul este deficitul de nutriie si oxigenare. In organism nutriia, oxigenarea i eliminarea produilor de metabolism se realizeaz datorit perfuziei sanguine continue, nutriia prin difuziune este prezent att in vivo ct i in vitro, dar este eficient numai n mic masur. Din aceast cauz tesuturile care se cultiva n acest fel au o dimensiune mic (1 mm). Chiar i aa n zona central a acestor esuturi se ntlnesc zone necrozare, practic celulele sunt n status proliferativ numai la periferia fragmentului. Un alt dezavantaj l reprezint slaba reproductibilitate, deoarece fragmentele obinute n acest fel sunt deosebit de eterogene.

Culturile celulare n structuri tridimensionale se pot realiza ndeosebi prin cultivarea celulelor n diferite matrice care mimeaz ntr-o oarecare msur nu numai structura ci i compoziia matricei extracelulare. Cea mai utilizat este matricea de colegen care este disponibil comercial, dar care poate fi preparat i n laborator. Cultura n colagen stimuleaz o serie de funcii celulare care nu se exprim prin cultivarea n condiii obisnuite (monostrat); hepatocitele nu sintetizeaz albumine dect dac sunt cultivate n colagen. Celulele mai pot fi cultuvate n agaroz, dezavantajul este c acesta nu conine proteinele normale ale matricei extracelulare, dar are o rezisten mai mare, ceea ce-l face utilizabil pentru experimenele de compresiune mecanic (aplicabile n cercetarea ortopedic).

7. Selecia celular
Cultivarea celulelor presupune utilizare unor celule omogene, standardizate, care s asigure reproductibilitatea experimentului. In acest sens se impune izolare unor populaii pure de celule prin selectarea unor celule i crearea unei linii celulare cu originea ntr-o singur celul; celulele obinute vor fi foarte asemntoare sau chiar identice. Acest deziderat este uor de atins pentru liniile celulare continue, ns greu de realizat pentru culturile primare. Cu toata acestea, selecia clonal pentru culturi primare nu este imposibil de realizat, dei datorit numrului limitat de diviziuni a celulelor din culturile primare, o dat cu obinerea liniei celulare pure, celulele ajung deja la numrul maxim de diviziuni. In practic eficacitatea seleciei clonale reprezint unul din criteriile avute n vedere n evaluarea gradului de transformare. Selecia clonal poate fi utilizat i pentru optimizarea condiiilor de cretere pentru celulele n culturi, pentru determinarea sensibilitii celulelor tumorale la chimio- i radioterapie etc. Se poate realiza att pe culturi ataate (forma cea mai convenabil, deoarece pe celule ataate coloniile celulare pot fi identificate uor) ct i pe culturi n suspensie. 7.1. Selecia pe culturi ataate Pe culturi celulare ataate selecia se poate face pe plci Petri, plci de cultur cu godeuri; selecia clonal a celulelor se face prin micromanipulare, izolnd practic celulele dorite de pe suprafaa mediului de cultur. 7.1.1. Factori limitativi ai seleciei celulare Tripsinizarea. Reprezint un moment esenial n realizarea culturilor celulare; este esenial ca n urma tripsinizarii s rezulte celule individuale. O tripsinizare insuficien duce la obinerea unor conglomerate de celule (ceea ce face imposibil izolarea unor colonii rezultate dintr-o singur celul), o tripsinizare excesiv duce la pierderea viabilitaii celulare. Din aceast cauz eficiena tripsinizrii trebuie evideniat de fiecare

dat i protocolul trebuie adaptat fiecarei linii celulare n parte. Tripsina trebuie s fie purificat i s nu exceada 0.05 mg/L. Este preferat tripsinizarea la rece. In acest caz se asigur un procent bun de supravieuire celular. Densitatea celular. Pentru cultivarea celular n scopul seleciei clonale este foarte important ca densitatea celular sa fie mult mai mic dect n cazul unui pasaj obinuit (10-200 celule/ml mediu). Chiar dac densitatea celular este mic, schimbarea nediului de cultur o dat pe sptmn este necesar deoarece muli compui prezeni n mediul de cultur nu sunt satbili n timp. 7.1.2. Metode de mbunatire a eficienei nsmnrii Sunt numeroase modaliti care cresc semnificativ eficiena nsmnrii. Cultivarea cu celule doic presupune cultivarea celulelor ce urmeaz a fi selecionate clonal pe un strat de celule (cel mai adesea fibroblati) carora li s-a inibat capacitatea mitotic. Celulele doic au rolul de a oferi nutrieni, factori de ceretere i constitueni ai matricei celulare; iar prin inhibarea activitii mitotice ele nu se pot multiplica odat cu celulele supuse multiplicrii clonale, ci mor dup trei sptmni de la iniierea culturii. Cele mai indicate sunt culturile primare de fibroblati embrionari murini, dar fiecare tip celular folosit pentru selecia clonal poate prefera un tip de celul doic diferit. Mediul de cultur. Pentru selecia celular se utilizeaz un mediu bogat n nutrieni i factori de cretere cum ar fi Ham F12, sau mai bine, un mediu optimizat pentru fiecare tip celular utilizat. Alteori pot fi folosite medii de cultur condiionate. Mediul de cultur condiionat este mediul de cultur pe care s-au cultivat n prealabil celule, de obicei de acelai tip cu celulele supuse proliferrii clonale sau fibroblati embrionari. In felul acesta mediul este mbogit n metabolii celulari, factori de cretere i proteine ale matrixului extracelular, care pot mbogai substanial durata de supravieuire a celulelor supuse seleciei. Pentru a fi adecvat mediul de cultur condiionat nu trebuie s conin metaboliti toxici (de aceea celulele folosite pentru condiionare nu sunt meninute n mediu mai mult de 24 de ore) i s nu conin celule din linia utilizat pentru condiionare ( de aceea acesta trebuie supus obligatoriu centrifugrii, filtrrii i congelrii). Se utilizeaz n raport de diluie 1:2 cu mediul proaspt din lotul folosit iniial pentru cultura celulelor de condiionare. Serul. Se recomanda folosirea serului fetal bovin FCS (fetal calf serum) care d rezultate mult mai bune dect serul animalelor adulte. Hormonii pot fi de asemenea utilizai pentru creterea duratei de via a celulelor, cum ar fi insulina n doze de 10-7UI/L sau dexametazona, 10 mg/L. Fiecare tip celular necesit hormoni diferii, la o concentraie diferit. Produii intermediari de metabolism cum ar fi acidul piruvic i cetoglularic sau nucleozidele au de asemenea capacitatea de a crete durata de via a celulelor supuse seleciei clonale. De altfel mediile folosite pentru selecie clonal conin aceste componente. Nivelul bioxidului de carbon din aerul din incubator poate fi de asemenea utilizat pentru a mbunti supravieuirea celular, poate fi folosit o cantitate redus de CO2 (2%), n general asociat cu HEPES (20 mM). Pentru unele tipuri celulere poate fi recomandat i o cretere a CO2 pn la 10%.

Tratamentul substratului de ataare cu D-polizina mbuntete semnificativ indicele de ataare pentru fibroblati. Evidenierea coloniilor. Pentru evidenierea capacitii de formare de colonii a unei linii celulare se poate recurge la clonarea celulelor obinute prin selecie clonal n culturi ataate, sau se poate recurge la cultura celulelor pe lama de microscop, ori cultura celulelor pe lame Lab-Tek, modificnd densitatea de cultivare a celulelor. Microtitrarea este una din cele mai eficiente metode de selecie celular, care const n cultivarea celulelor n plci cu godeuri mici i numeroase, cu o suspensie celular foarte diluat. In acest fel n godeu trebuie s ajung o singur celul, din care apoi s se dezvolte o colonie monocelular. 7.2. Selecia pe culturi n suspensie Pentru celulele aflate n suspensie este necesar cultivarea n gel de agar (sau agaroz), sau n soluii cu vscozitatea crescut cum ar fi soluia Metocel. Vscozitatea soluiei de Metocel permite celulelor nou formate s rmn grupate, permitnd formarea unor colonii. Cultivarea n agar (sau agaroz) se bazeaz pe proprietatea agarului de a fi lichid la temperaturi crescute, dar se prezint sub form de gel la temperatura de cultivare a celulelor. Pentru a cultiva celule nglobate n interiorul agarului acestea trebuie introduse n agar cnd acesta este lichid, dup solidificare acestea (celulele) rmn prinse n interiorul agarului gel. Agarul normal nu poate fi folosit pentru cultivarea celulelor, deoarece gelificarea se face la temperaturi cerescute i celulele nu supravieuiesc nglobarii. Datorit acestui fapt se folosete agaroza cu punct de topire sczut. Aceasta se topete la 65 C, dar rmne fluid pn la 37 C, n felul acesta celulele pot fi nglobate n agarul lichid. Pentru izolarea coloniilor formate n agar se folosesc inele de clonare, realizate din diferite materiale, porelan, sticl oel sau teflon. Cu ajutorul inelelor se realizeaz niste cilindri din agaroz care cuprind n mijlocul lor colonia care urmeaz a fi izolat. In continuare celulele sunt eliberate din agaroz prin metode enzimatice i apoi cultivate. 7.3. Selecia prin inhibitori selectivi Alt metod de selecie celular este utilizarea inhibitorilor selectivi. Metoda este limitat de faptul c celulele, n general, au cam aceleai necesiti nutriionale i mediul de cultur contine n general factori de cretere necesari unor variate categorii celulare. Din acest motiv selecia celular se face cel mai bine folosindu-se medii libere de ser. Cele mai numeroase investigaii au fost orintete n sensul obinerii unor formule care s blocheze dezvoltarea fibroblatilor. In mod normal fibroblatii sunt primele celule care se dezvolt n cultura primar dintr-un esut. In cazul n care nu se urmarete cultura fibroblatilor, acetia devin un impediment major n dezvoltarea altor tipuri celulare, deoarece le nltur competitiv. Printre substanele care pot inhiba creterea fibroblatilor se numr cishidroxi-prolina, fenobarbitona, etilmercurisalicilatul de sodiu etc. Toate acestea

au marele dezavantaj c sunt toxice i pentru alte celule ; principiul utilizrii lor const n identificarea unor compui mai puin toxici pentru celulele cultivate dect pentru fibroblati. O metod mai recent i mai eficient de mpiedicare a creterii fibroblatilor, folosit ndeosebi pentru cultura celulelor tumorale, o reprezint anticorpii monoclonali impotriva celulelor din stroma tumoral. Acetia pot fi folosii fie n asociere cu complementul, sau mai eficient, legai de substane citotoxice. Alte metode de izolare ar fi cultivarea celulelor pe straturi de celule doic care favorizeaz proliferarea celulelor epidermale i o inhib pe cea a celulelor stromale. Cultura pe medii semisolide, este o msur eficint pentru selectarea celulelor transformate (care i pierd dependena de ancorare) n defavoarea celor care cresc exclusiv n monostrat. 8. Aplicaii ale culturilor celulare Culturile celulare i gsesc multiple aplicaii, att n cercetarea tiinific (fundamental i aplicativ), ct i n testrile farmacologice i diverse biotehnologii. 8.1. Testarea de compui farmaceutici Medicamentele noi, compuii cosmetici i aditivii alimentari nainte de a fi administrai n consumul uman sau veterinar sunt supui testrii. Aceste testri necesit un numr mare de animale de experien, ceea ce atrage o opoziie crescnd din partea organizaiilor de protecie a animalelor. Legislatia fiind din ce n ce mai restrictiv, se impune gsirea unor modaliti de testare in vitro. Testrile farmacologice in vitro sunt ndeosebi centrate pe toxicitatea la nivel celular i se realizeaz prin evaluare viabilitii celulare, eficiena proliferrii clonale, teste de proliferare celular, teste de genotoxicitate etc. Pe celule cultivate se pot testa nu numai principii farmacologici ineri, dar i microorganisme folosite n diferite biotehnologii din industria alimentar i farmaceutic. Inlocuirea total a experimenelor de toxicitate pe animale, cu metode realizate pe culturi celulare nu este posibil pentru c celulele izolate nu pot simula farmacocinetica, metabolizarea sau rspunsul sistemic i local al oranismului afectat de intoxicaie, cu toate acestea ns sistemele tridimensionale de cultivare pot compensa parial aceste neajunsuri. 8.1.1. Evaluarea viabilitii celulare Evaluarea viabilitaii celulare se poate face n mai multe variante, cea mai uzual i mai simpl n acelai timp, este metoda cu albastru de tripan. Albastru de tripan este o suspensie macromolecular, ale carei particule nu traverseaz membrana celulelor intacte. In cazul n cre celula este moart sau sufer alterri metabolice severe, prezint i o permeabilitate membranar crescut (anormal) i devine permeabil pentru macromolecule. In acest fel prin coloraia cu albastru de

tripan celulele viabile rmn necolorate, n timp ce cele moarte se coloreaz n albastru. Pentru determinri mai elaborate se pot folosi i ali colorani standardizai cum ar fi LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (L-3224). Principiul acestei metode se bazeaz pe existena activitii esterazice n toate celulele vii; aceast activitate enzimatic face posibil transformarea calceinei nefluorescente (permeabil la nivelul membralei celulare), n calcein fluorescent. Aceast form fluorescent nu mai trece prin membrana celular i este reinut n citoplasma celular unde d o culoare verde la microscopul cu fluorescen. Se adaug apoi etidium homodimer (EthD) o substan capabil s penetreze selectiv membranele celulelor neviabile; apoi reacioneaz cu calceina inducnd o culoare roie intens. In acest fel celulele viabile apar colorate n verde (culoare dat de calcein), iar celulele moarte n rou (culoare dat de reacia calceinei cu EthD). 8.1.2. Evaluarea proliferrii celulare Metodele de evaluare a proliferrii celulare reprezint metote utilizate cu succes i n testele de toxicitate. Evaluarea proliferrii celulare se poate face direct (prin urmrirea creterii numrului de celule, sau cuantificarea numrului de mitoze) i indirect pe seama evidenierii sintezei de acizi nucleici (prin nglobarea timidinei), sau prin evidenierea activitii mitocondriale (cu MTT). In cele ce urmeaz vom prezenta cteva din metodele directe i indirecte de evaluare a prolificitii celulare. Metode directe Presupun fie cuantificarea celulelor aflate la un moment dat n cultur, sau n diferite momente ale dezvoltrii culturii clulare, fie evidenierea mitozelor din celulele aflate n cultur (prin numrarea direct, sau prin marcarea enzimatic a celulelor aflate n diviziune celular). In evoluia unei culturi celulare se evideniaz trei faze, anume o faza de iniiere, o faza proliferativ i o faz de platou. Atunci cnd ne referim la o cultur celular este important s identificm stadiul n care se gsete cultura. In faza de iniiere celulele nu se divid, fiind n stadiul de aderare la substrat i adaptare la condiiile de cultur. In aceast faz i refec elementele constituente ale matrixului extracelular, distruse n timpul tripsinizrii. Cu toate c n aceast faz are loc o sinteza proteic intens, produii specifici tipului celular respectiv nu se mai sintetizeaz pn la sfritul fazei proliferative. In faza proliferativ celulele sunt mai omogene, mai reproductibile. Viteza de cretere se msoar n timpul de dublare a populaiei celulare, mrime care nu trebuie confundat cu timpul necesar ciclului celular (timpul unei generaii celulare). Prima se refer la totalitatea celulelor din recipientul de cultur (inclusiv celulele aflate n stadiul neproliferativ), n timp ce al doilea reprezint un interval de timp care cracterizeaz individual o celul. Timpul de dublare a numrului celulelor poate varia de la 24 de ore (cazul celulelor tumorale), la 72 de ore cum este cazul unor linii celulare finite.

In faza de platou celulele sufer o reducere marcant a vitezei de diviziune i o modificare morfologic, cu tendina de specializare, datorit inhibiiei de contact. In aceast faz au tendina de a sintetiza matrice extracelular n cantiti crescute i de aceea sunt mai greu de detaat de substrat i de dezagregat. In cazul celulelor normale, diviziunea celular nceteaz, sau se reduce foarte mult. In cazul liniilor tumorale imortalizate, prin pierderea inhibiiei de contact i independenei de ancorare, faza de platou capt o alt semnificaie, aici numrul de celule devine relativ constant deoarece viteza de diviziune celular devine egal cu viteza de mortalitate. Evidenierea celulelor n mitoza este o alt metod de evalauare a vitezei multiplicrii unei culturi celulare. Rezultatul obinut se exprim prin indicele mitotic (numrul de mitoze raportat la numrul total de celule). Metode indirecte. Evideniaz funcii celulare, constant asociate cu diviziunea celular, cum ar fi sinteza acizilor nucleici i activitatea mitocondrial. Evidenierea sintezei acizilor nucleici se face prin evaluarea H-timidinei. Htimidina este o substan radioactiv care este ncorporat n acizii nucleici n cursul sintezei ADN-ului, celulele aflate n stadiul de multiplicare ncorporeaz timidina, celelalte nu. Procentul de celule care au ncorporat timidina (cunoscut i sub numele de indice de marcare) se determin prin autoradiografie. In cazul culturilor de celule aflate n faza de cretere exponenial procentul de narcare este de 10-20%, n timp ce n cazul celulelor aflate n faza de platou este de 1%. Metoda are marele dezavantaj c utilizeaz substane radioactive periculoase pentru operator i pentru mediu. Testul de proliferare celular cu MTT (sare de tetrazoliu) imbin avantajul metodelor descrise mai sus, fiind rapid, relativ ieftin, exact i sigur pentru operator i mediu. Metoda se bazeaz pe reducerea srurilor de tetrazolium (din culoare galben) de ctre mitocondriile celulelor viabile, la cristale insolubile de formazan (de culoare mov). Celulele sunt lizate i cristalele solubilizate prin utilizarea unui detergent. Intensitatea culorii poate fi evaluat spectrofotometric. Eficiena seleciei celulare prin proliferare clonal este o alt metod de testare a citotoxicitii, dup ce n prealabil celulele au fost tratate cu agentul potenial citotoxic. 8.1.3. Teste farmacocinetice Farmacocinetica evalueaz circuitul n organism al unui compus activ, cum ar fi absorbia, traversarea peretelui vascular, concentrarea n anumite esuturi i organe, eliminarea din organism etc. In ce privete testarea substanelor pe culturi celulare, studiile farmacologtice reprezint una din limitrile principale ale metodelor in vitro, deoarece o celula izolat nu poate simula funciile complexe ale ntregului organism. Cu toate acestea modelele organotipice au reuit parial s nlature aceste neajunsuri, astfel nct unele teste farmacocinetice se pot realiza cu succes pe culturi celulare.

Nivelul de penetrarea tisular poate fi reprodus prin utilizarea sferoizilor celulari, sau alte modele de culturi tridimensionale. Metabolizarea unei substane active (cel mai adesea la nivel hepatic), poate reprezenta n unele cazuri un eveniment cheie, astfel, unele substane toxice pot fi atenuate sau uneori chiar inactivate complet de diverse enzime hepatice, alteori substane relativ inofensive devin extrem de toxice prin metabolizarea hepatic. Aceste neajunsuri pot fi parial nlturate prin testarea substanelor toxice pe culturi de hepatocite. Rspunsul tisular i sistemic este de asemenea un component important n evaluarea efectelor unui toxic, foarte multe substane toxice acionnd prin generarea unui rspuns vascular, inflamator, degenerativ,fibrotic, sau, n plan sistemic prin febr, tulburri cardiovasculare, respiratorii, de motilitate digestiv, nervoase etc. Rspunsul tisular poate fi parial mimat prin culturi celulare tridimensionale. In acest sens se pot realiza sisteme de cultur care imit pielea i corneea, ceea ce face posibil testarea efectului proinflamator al unor produse cosmetice. 8.1.4. Teste de patogenitate microbiologic Microorganismele (bacterii i levuri), nainte de a fi utilizate n diferite procese biotehnologice, att n industria alimentar ct i n industria farmaceutic, trebuie mai nti testate din punct de vedere al patogenitii. Aici, testarea pe animale nu este o metod relevant, deoarece unele microorganisme pot fi nepatogene pentru roztoare, dar patogene pentru om. Patogenitatea acestor microorganisme se testeaz prin cultivarea mpreuna cu celulele umane, urmrindu-se dac contactul cu celulele umane ar determina inducerea unui stres celular. Stresul clular poate fi cuantificat prin evidenierea unor proteine numite proteine de oc caloric (heat shock proteins). Acestea au fost descoperite iniial la celulele supuse supranclzirii, de unde le vine i numele, dar apar n toate situaiile de stres celular, inclusiv infecii. Lipsa acestor proteine nseamn c microorganismele nu sunt patogene pentru celulele umane. Un exemplu concret n acest sens l constituie testarea tulpinilor noi de lactobacili utilizai n prepararea iaurturilor. Acestea se cultiv mpreun cu celulele din linia Caco. Linia este o linie tumoral imortalizat, provenit dintr-un carcinom de colon, dar care are proprietatea de a-i dobndi, parial, dup ataarea la substrat, proprietile endoteliului intestinal. 8.2. Culturi virale Culturile virale reprezint o important aplicaie a culturilor celulare, ntrucat virusurile nu pot crete pe medii inerte. Ele i gsesc aplicaii vaste att n studiile de virusologie, ct i n fabricarea vacinurilor. Culturile virale pot fi utilizate i n cazul cultivrii altor microorganisme dependente de metabolismul altor celule pentru a supravieui, cum ar fi micoplasmele. Pentru cultivarea celular se utilizeaz n general linii celulare imortalizate (pentru c sunt mai uor de cultivat), n general aparinand speciei pe care virusul

o infecteaz n mod normal. Capacitatea de infectare viral depinde de receptorii de suprafa specifici fiecarei specii sau comuni mai multor specii. Cultivarea celulelor suport pentru culturile virale se face dup regulile uzuale privind restul culturilor celulare; o data obinut cultura celular se introduce virusul care urmeaz a fi cultivat. Dup scopul n care se face cultivarea, se deosebesc culturi virale pentru multiplicarea virusului i pentru evidenierea agresivitii virale. Multiplicarea viral se realizeaz prin adaosul suspensiei virale decongelate peste culturile celulare aflate n monostrat. Mediul de cultur folosit pentru realizarea infeciei virale difer puin de mediul de cultur utilizat pentru cultivarea celulelor. Pe lng componentele normale coninute n mediul de cultur, acesta mai conine albumin bovin (BSA)(necesar stabilizrii virale) i tripsin (pentru unele rotavirusuri). Tripsina are rolul de a accentua agresivitatea viral prin efectul proteolitic asupra unor proteine virale. Dup liza celulelor virusul se regsete n supernatantul din mediul de cultur, i se poate congela timp nelimitat n azot lichid. Pentru evidenierea infectivitii se foloeste un mediu de cultur similar (cu BSA i tripsina), doar c virusul este adugat n diluii seriate, n general cu scale 10 (10 -1, 10-2,10-3... 10-8). Aceste diluii seriate sunt necesare deoarece la concentraii mari virusul lizeaz rapid toate celulele din cultur, acest rezultat fiind greu de cuantificat. Concentraiile virale mai mici nu distrug n ntregime celulele de cultur ci creaz nite plaje; nivelul de agresivitate viral fiin direct proportonal cu numrul de plaje. Pentru a preveni muliplicrea celular (care ar putea acoperi unle plaje dup infectarea cu virus) celulele sunt acoperite cu un strat de agaroz. Dup un timp care difer n funcie de tipul de virus utilizat, se fixeaz celulele (n mod normal cu formol) apoi se coloreaz i se numr plajele formate. Calculul titrului viral dup titrarea pe plac. Infectivitatea virusului este exprimat prin numrul de plaje formate la nivelul culturii celulare (PFU plague-forming units) lundu-se n calcul i diluiile efectuate la titrare. Se cuantific numrul total de plaje formate la fiecare diluie (pentru fiecare plac/prob). Se vor lua n calcul doar diluiile la care plajele formate sunt cuantificabile ( la primele diluii plajele au tendina de a se uni, fcnd imposibil numrarea acestora). In tabelele de mai jos este prezentat un exemplu de calcul la o prob pentru care s-au efectuat dou cultivri pentru fiecare diluie. Se observ c prima diluie la care s-au putut cuantifica plajele formate, este 10-3 .

Tabelul 1. Calculul titrului viral Dilutia 10 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7
-1

Cultura 1 >100 >100 49 30 15 3 0

Cultura 2 >100 >100 72 36 9 5 0

Total >200 >200 121 66 24 8 0

In continuare se raporteaz numrul de plaje formate (PFU) la volumul viral introdus n cultura celular. Pentru aceasta se adaug numrul total al plajelor (din toate diluiile folosite) i volumul total de suspensie viral introdus n cultur. Dat fiind faptul c volumul utilizat pentru fiecare cultur a fost de 0,2 ml, fiind dou culturi, pentru calculul final volumul trebuie dublat, iar toate cantitile luate n calcul trebuie aduse la acelai ordin de mrime ca s poata fi adunate (10 -3), calculul fcndu-se astfel: 0,4 ml 0,04 ml 0,004 ml 0,0004 ml 0,4444 ml n diluie de 10-3 n diluie de 10-3 n diluie de 10-3 n diluie de 10-3 n diluie de 10-3 121 PFU 66 PTU 24 PFU 8 PFU 219 PFU

Astfel, 0,4444 ml de suspensie viral nediluat conine 219 x 103 PFU = 2,19 x 105 PFU. Rezult c 1 ml de suspensie nediluat conine: ( 1/0,4444) x 2,19 x 10 5 PFU= 4,93 x 105 PFU/ml.

8.3. Cultivarea limfocitelor Cultivarea limfocitelor este o tehnic relativ simpl cu numeroase aplicaii n tehnica biomedical. Pentru cultivare limfocitele trebuie separate de plasma sanguin. Dei sunt disponibile mai multe tehnici, cea mai eficient i mai des utilizat este metoda cu ficol i metrizoat de sodiu. Ficolul este un polizaharid hidrofil cu masa molecular mare, foarte ramificat i cu caracter neutru. Este uor solubil n ap i n amestec cu sngele (tratat cu anticoagulant) face ca leucocitele i granulocitele granulare (neutrofile, bazofile i eozinofile) s se aglutineze i s formeze un sediment. In supernatant rmne plasma, iar leucocitele granulare (monocite i limfocite) se izoleaz n limita de

separare a celor dou lichide. Monocitele pot fi uor ndeprtate ulterior pe seama abilitii lor de a adera la substrat, n timp ce limfocitele rmn n soluie. Limfocitele astfel preparate pot fi folosite pentru testele de transformare blastic. Atentie: In cazul n care se utilizeaz material uman trebuie inut cont c exist riscul ca individul examinat s fie purtator al unor boli cu transmitere sanguin (hepatita B, SIDA), de aceea este recomandat evitarea utilizrii seringilor cu ac ascuit sau a pipetelor Pasteur, pentru a exclude complet pericolul unor rniri. Se pot utiliza seringi cu ac bont sau pipete de plastic. Transformarea blastic Este o tehnic care se bazeaz pe proprietatea normal a limfocitelor, care n contanct cu antigenul, devin fibroblati i a prolifera. In medii de cultur limfocitele pot fi stimulate de diverse substane mitogene ca fitohemaglutinina sau ali antigeni. Metoda poate fi utilizat pentru evaluarea rspunsului imun al unui anumit individ, pentru studiul unor substane imunomodulatoare sau imunosupresoare precum i pentru realizarea cariotipului. 8.4. Producerea anticorpilor monoclonali Anticorpii monoclonali au devenit elemente indispensabile n cercetare, diagnostic i terapie. Au fost descoperii n anul 1975 de ctre George Kohler i Cesar Milstein, acetia fiind distini cu premiul Nobel pentru Medicin i Fiziologie n anul 1984. Ideea lor a constat n fuzionarea unor limfocite care secretau anticorpi, dar nu supravietuiau mult n timp, cu celule de mielom (proliferri neoplazice limfocitare), care nu secretau anticorpi dar aveau un numr nelimitat de diviziuni i rspundeau bine seleciei colonale. Exist numeroase avantaje ale utilizrii anticorpilor monoclonali fa de cei policlonali n tehnicile imunoenzimatice de diagnostic i cercetare, absena anticorpilor nespecifici, uurina caracterizrii i lipsa diferenelor de la un lot la altul. Exist nsa i unele dezavantaje, cum ar fi sensibilitatea mai mic (datorit faptului c recunosc un singur epitop al antigenului, se vor fixa mai puini anticopi pe acesta) i posibilitatea reaciilor ncruciate (poate fi recunoscut un epitop identic dar prezent pe un alt antigen). Anticorpii aparin unui grup numeros de proteine numit imunoglobuline mparite n cinci mari clase: IgG, IgA, IgM, IgD, i IgE. Anticorpii policlonali sunt sintetizai ca urmare a ptrunderii unei structuri strine n organism (antigen); acetia sunt sintetizai de mai multe tipuri de celule i interacioneaz cu diferii epitopi ai antigenului mpotriva cruia au fost sintetizai. Epitopii sunt poriuni din antigen recunoscute de ctre anticorpi. Anticorpii policlonali se obin prin inocularea animalelor de laborator cu diveri antigeni, cei mai folosii n acest sens fiind iepurii din rasa Alb de Noua Zeeland. Anticorpii astefel formai se obin prin vinisecie urmat de purificarea serului obinut.

Anticorpii monoclonali sunt sintetizai de plasmocite izolate i multiplicte, cultivate in vitro, sau in vivo. Anticorpii monoclonali sunt identici i reacioneaz cu un singur epitop al antigenului mpotriva cruia au fost realizai, ei se obin aproape exclusiv pe oareci. Pentru aceasta animalele se inoculeaz cu antigenul urmrit, dup apariia rspunsului imun se sacrific i se recolteaz limfocitele B din splin i limfonoduli. Se realizeaz cultivarea limfocitelor, apoi limfocitele izolate sunt fuzionate cu celule de mielom. Fuziunea este posibil datorit unui agent care are proprietatea de a labiliza membrana celular etilen glicol. Celulele astfel obinute poart denumirea de celuile hibridoma, celule care motenesc calitile celor dou celule parentale, anume capacitatea de a sintetiza anticorpi i capacitatea de a se divide nelimitat i supravieui la densiti celulare mici. Celulele limfacitare nefuzionate se elimin de la sine, ele avnd un numr limitat de diviziuni. Pentru eliminarea celulelor de mielom se folosete un mediu de cultura selectiv HAT(Hipoxantina Aminopterina Timidina); aceste trei componnte se adaug n mediul uzual de cultur (ex Men 10% FCS). Metoda se bazeaz pe deficitul enzimatic al celulelor de mielom n hipoxantin guanin fosforibosil transferaza (HGPRT), sau timidin kinaza (TK); n lipsa acestor enzime componentele mediului de cultur selectiv HAT devin toxice pentru celule. Celulele care supraviuies acestei selecii sunt supuse seleciei colnale i sunt identificai anticorpii sintetizai de acestea. In funcie de calitatea anticorpilor produi sunt alese clonele celulare cele mai corespunztoare. Celulele hibridoma astfel obinute pot fi cultivate timp nelimitat in vitro, n sisteme de culturi celulare descrise n capitolele anterioare, sau n diverse instalaii biotehnologice care asigur cantiti mult mai mari de anticorpi. Anticorpii se obin prin recoltarea i purificarea supernatantului celular. Anticorpii monoclonali se pot obine i prin inocularea intraperitoneal la oareci a celulelor de tip hibridoma. In acest fel se obine o ascit bogat n celule tumorale care se poate pasa de la un animal la altul. In acest caz anticorpii se obin prin recoltarea i purificarea lichidului ascitic.

Aplicaii importante ale celulelor stem

1. Retina creat din celule stem, primul pas spre un ochi creat n laborator Cel mai important element al ochiului care influeneaz vederea uman, retina, a fost reprodus n laborator cu ajutorul celulelor stem de origine animal. Acest proces duce la creterea speranei persoanelor nevztoare i a celor care sufer de problemele vederii, c n viitor exist posibilitatea ca un ochi ntreg s fie creat n laborator. Retina reprezint un grup de celule ce invelete interiorul ochiului uman. Razele de lumin care ptrund n ochi sunt centrate pe retin i care produc o imagine ce este transmis prin intermediul nervului optic la centrul vederii din lobul occipital al creierului. Ochiul i creierul produc mpreun imaginile pe care le vedem. Bolile retinei pot duce la pierderea vederii, sau chiar la orbire, dac sunt lsate netratate. Oamenii de tiin japonezi au utilizat celule stem provenite de la oareci. Aceste celule imature au posibilitatea de a se transforma n mai multe tipuri de esut organic. Celulele stem prelevate de la oareci i-au schimbat forma, transformndu-se n timp ntro retin artificial. Acest proces a putut avea loc prin combinaii potrivite ale substanelor nutritive din mediul de cultur. Cercetatorii sper s poat crea un numr nelimitat de celule pentru retin, sau retine artificiale n ntregime, care pot fi folosite pentru transplant. De asemenea, ei apreciaz c intr-o zi ar putea crea un ochi complet ntr-o eprubet. O companie de biotehnologii din SUA a primit deja o licen n vederea nceperii studiilor pentru un transplant cu celule stem dedicat nevztorilor. Retina pigmantar i degenerescana macular legat de vrst sunt cele mai frecvente cauze de orbire la btrnee i implic, n mod normal, distrugerea treptat i ireversibil a celulelor retiniene. Intr-un studiu japonez, culturile de celule stem s-au organizat spontan ntr-o structur complex ce seamn cu ochiul uman n curs de dezvoltare embrionar. Structura tridimensional stratificat amintete de structura ochiului uman. Oamenii de tiin au fost surprini de organizarea celulelor, dar mai ales pentru faptul c acetia nu au intervenit n mod special. Profesorul James Bainbridge de la Morfields Eye Hospital NHS Fundation Trust, declar c generaia retinei sintetice, format din celule stem embrionare, reprezint o descoperire imens ce va fi luat drept reper pentru nelegerea bolilor oculare. Barbara McLaughlan de la centrul de sprijinire a nevztorilor, declar c ntmpin trecerea de la studiile de laborator ale celulelor stem de la animale, la efectuarea cercetrilor in rndul oamenilor, toate acestea fiind eseniale n dezvoltarea tratamentelor sigure i eficiente.

2. Boli tratate prin transplant cu celule stem In Roamania se apreciaz c sunt 1.500 de copii bolnavi de leucemie, leucemiile acute reprezentnd 105 din cancerele la aceast categorie de vrst i este principala cauz de deces sub 35 de ani (leucemia acut limfoblastic este cea mai frecvent afeciune hematologic malign aprut n copilrie la cca 80-90% din cazuri aprnd sub vrsta de 10 ani). La aceasta se adoug 3.500 de pacieni cu boala Hodkin, o parte din acetia avnd indicaia de transplant de celule stem hematopoetice pentru a putea supravieui i 370 de copii cu Talasemie major, o boal de snge transmis ereditar i n care singurul tratament curativ este reprezentat de transplantul de celule stem hematopoetice de la un donator sntos. Primul transplant de celule stem hematopoetice efectuat cu succes s-a realizat n urm cu 45 de ani (1968) de ctre doctorul Robert A. Good de la Universitatea din Minesota. S-a deschis astfel o era nou, era terapentic pentru afeciunile hematologice severe care pn n acel moment erau considerate incurabile. Realizarea cu succes n 1988, la Paris de ctre Prof.dr. Eliane Gluckman (medic hematolog specialist n transplant de mduv osoas la Spitalul Sant Louise din Paris) a primului transplant alogen fraternar de snge placentar, ca surs de celule stem hematopoetice ntr-un caz sever de anemie Falconi, a deschis un nou capitol n domeniul transplantului de celule stem. In prezent pacientul Mathew Farraw, trieste i este considerat vindecat. Profesorul Broxmeyer de la Universitatea Indiana din SUA, a fost primul cercettor care n urma studiilor efectuate in anii 80 a costatat c sngele placentar conine un numr suficient de celule stem i progenitori hematopoetici, care s permit obinerea grefrii medulare n urma efecturii unui transplant. Ulterior, n colaborare cu geneticianul A.D. Auerbach de la Institutul din Rokeffeler i Eliane Gluckman au format primul colectiv de medici care au realizat n premier un transplant de celule stem hematopoetice din sngele placentar. Pe msur ce s-a consolidat expriena n domeniu, paleta de indicaii clinice de efectuare a unui transplant cu celule stem hematopoetice placentare s-a extins, n prezent cuprinznd peste 70 de afeciuni hematologice ereditare i oncologice. 3. Celule de nou-nscut create din celulele corpului unui btrn Oamenii de tiin din Israel au reuit n premier mondial s transforme celule ale pielii extrase de la pacieni cu insuficien cardiac n celule cardiace noi, identice cu cele existente n corpul unui bebelu. Reuita fr precedent sugereaz c este posibil repararea inimii unui pacient cu propriul esut al acestuia. Celulele extrase de la doi brbai ce sufereau de insuficien cardiac au fost reprogramate genetic pentru a deveni celule cardiace. Experimentul a fost efectuat de oamnii de tiin de la Institutul de tehnologie Technion Israel i de la Centrul medical Rambom din Haifa. Celule cardiace astfel obinute au fost observate ca fiind viabile n muchiul cardiac al obolanilor sntoi crora le-a fost transplantate, estimndu-se c testarea acestora n muchiul cardiac uman va putea fi realizat abia peste un deceniu, dup ce tehnica va putea fi mbuntit prin testarea repetat pe animale. Reuita oamenilor de tiin indic o nou potenial surs de celule stem, elemente de baz ale vieii ce se pot dezvolta n orice tip de esut din organism. Cercettorii afirm

c prin folosirea de celule ale pielii extrase de la pacient nu va mai fi necesar obinerea de celule stem de la embrioni i se va reduce totodat riscul ca sistemul imunitar al pacientului s resping transplantul. Am artat c este posibil s folosim celule ale pielii extrase de la un pacient n vrst ce suferea de probleme grave ale inimii i s obinem n laborator celule cardiace tinere i sntoase echivalente celulelor existente n inima sa imediat dup ce s-a nscut, a explicat Lior Gepstein, profesor de medicin i fiziologie i totodat coodonatorul acestui studiu. Insuficiena cardiac este o slabire a muchiului inimii ce poate provoca oboseal, i ulterior, decesul. In SUA aporoximativ 5,8 milioane de persoane sufer de aceast afeciune. Tot mai multe persoane supravieuiesc atacului cardiac, astfel nct numrul oamenilor care traiesc cu o inim deteriorat crete.. Din nefericire organismul are o capacitate limitat de a repara inima n urm unui atac cardiac, astfel c este o nevoie urgent de a concepe transplante eficiente i sigure pentru regenerarea inimii, a afirmat Nicholas Mills, cardiolog la Universitatea din Edinburgh. In acest moment pacienii suferinzi de insuficient cardiac trebuie s apeleze la dispozitive mecanice sau s spere ca vor putea beneficia de un transplant. Acum, cercetatorii doresc s efectueze mai multe studii pentru a stabili dac aceste celule ale inimii pot fi produse n cantiti suficiente pentru a reprezenta un tratament eficient. De asemenea specialitii doresc s conceap strategii de transplant care s reduc riscul respingerii selulelor de ctre organismul primitor. Pe lng aceste aspecte, o alt problem este faptul c studiile se anun a fi foarte costisitoare. Presupun c va mai dura 5-10 ani pn cnd vom putea efectua studii clinice, dac vom putea depi aceste provocri , a conchis Gepstein. 4. Oamenii de tiin au putut s fabrice neuroni plecnd de la celule ale pielii Mergnd pe calea descris de primele experimente reuite de clonare, soldate cu creerea oii Dolly, oamenii de tiin scoieni au crescut n laborator celule nervoase, obinute din celule ale pielii prelevate de la persoane ce suferea de afeciuni neurologice i psihice. Studiind neuronii asfel obinui, specialitii sper s afle mai multe despre caracteristicile genetice i biochimice asociate cu aceste maladii. Experienele au avut loc la Centrul de Medicin Regenarativ al Universitii din Edinburgh, Marea Britanie. Oamenii de tiin au pornit de la ideea de a studia celulele din creierul persoanelor cu tulburari neurologice (maladia Parkinson, scleroza mulipl) i psihice (schizofrenie, tulburarea bipolara), dar fr a recurge la prelevarea de celule direct din creier, deoarece aceasta este o manevr foarte periculoas pentru pacieni. De aceea, cercettorii au mers pe o cale ocolit, pentru a obine celule identice cu cele din creierul pacienilor, au prelevat celule din piele i le-au transformat n celule stem, iar apoi au dirijat aceste celule stem s se transforme n celule nervoase ( reamintim c celulele stem sunt celule primordiale ale organismului, aa-numite pluripotente, adic avnd posibilitatea de a se transforma n diverse tipuri de celule n laborator, n funcie de condiiile de mediu n care sunt crescute, din celule stem se pot obine o mare varietate de celule diferite).

In felul acesta, cercettorii dispun de un stoc de celule nervoase identice cu cele din ceierul pacientilor cu diferite tulburri. Aceste celule pot fi utilizate pentru a studia caracteristicile lor asociate cu boala i pentru a testa efectele unor medicamente. Aceeai metod poate fi folosit, spun cercettorii, pentru a obine celule identice cu cele din ficat i inim, organe n cazul crora este dificil practicarea biopsiilor. 5. Sngele artificial creat din celule stem ar putea deveni realitate n civa ani In doar civa ani pacienii din Marea Britanie ar putea beneficia de snge artificial creat din celule stem, anun cercettorii de la dou universiti prestigioase britanice. Cecetatorii susin c aceast inovaie va salva mi de viei pe cmpurile de lupt i la locul accidentelor rutiere, eliminnd totodat problema stocurilor de snge din spitale. Cercettorii de la universitile din Bristol i Edinburgh au reuit pentru prima dat s creeze mii de milioane de hematii din celule stem ce proveneau din mduva osoas. Aceast cantitate nu este ns suficient, o transfuzie obinuit necesit n medie 2,5 milioane de miliarde de hematii. Cercettorii sper s obin snge artificial din celule stem provenite de la embrioni umani, acest tip de celule permind obinerea mai multor hematii. Cercettorii spun c o dat descoperit cea mai bun metod de obinere a sngelui artificial din celule stem embrionare, un singur embrion ar fi sursa tuturor celulelor sanguine necesare pentru transfuziile efectuate n Marea Britanie. Dr Turner afirm c n urmatorii civa ani sngele artificial din celule stem va putea fi testat pe voluntari sntoi, ceea ce va constitui primul test de acest tip din istoria Marii Britanii. Doctorul Turner prezice c n 20 de ani producia de snge artificial din Marea Britanie ar ajunge la 950.000 l , acoperind tot necesarul rii. Celulele stem ar proveni de embrioni n vrst de 4-5 zile ce au rmas nefolosii n urma tratamentelor de nsmnare artificial. Cu toate acestea, statele europene au interzis brevetarea tratamentelor bazate pe celule stem embrionare, lucru care va duce la reducerea numrului de studii efectute n acest sens n Europa. 6. Celulele stem ar putea reda vederea persoanelor nevztoare. Sun mai bine de 15 ani de cnd celulele embrionare au fost izolate pentru a pute fi crescute n laborator. In tot acest timp majoritatea cercetrilor au fost efectuate pe animale de laborator. Noul studiu a testat pentru prima dat efectele unui transplant cu celule embrionare asupra organismului uman. Cercettorii de la Universitatea din California au implantat celule stem embrionare n unul din ochii a doi pacieni participani la studiu. Unul din volultari suferea de o form uscat de degenerare macular, cauzat de vrst (cea mai des ntlnit cauz a orbirii), iar celelalt suferea de o afeciune congenital, cunoscut sub denumirea de Boala lui Stargardt i care duce la pierderea total a vederii. Pentru nici una din aceste afeciuni nu exist tratamete. Dup 4 luni de la implant, pacientul care suferea de Boalalui Stargardt i care la nceputul tratamentului nu vedea nici o liter de pe panoul oftalmologic, a ajuns s vad primele 5 litere cele mai mari. In cazul pacientului cu degenerescen macular mbunatirea vederii constatat tot la acelai interval de la implant, s-ar putea datora

unor factori psihologici, deorece chiar i ochiul netratat a nregistrat performane mai bune. In ciuda mbuntiirii vederii, cei doi pacieni sunt nc nevazatori conform definiiei legale. Scopul acestui studiu, spun specialitii, a fost acela de a demonstra c tratamentul cu celule stem este unul sigur pentru oameni; din acest motiv specialitii s-au declarat multumii de experiment, mai ales c nu au existat semne care s indice respingerea celulelor stem.