DETERMINAREA AMILAZEI

Cptan Marta Tamara An III, Ingineria i Informatica Proceselor Chimice si Biochimice

Amilaza este enzima care hidrolizeaz macromolecula polizaharidelor pn la maltoz, trecnd prin stadiul de dextrine. Este produs de celulele secretoare din pancreasul exocrin. Punerea n eviden a amilazei se face, principial n dou moduri: 1. Se determin cantitatea de zahr reductor care se formeaz din substrat sub aciunea enzimei, n unitatea de timp. Acesta este principiul metodelor zaharimetrice. 2. Se determin schimbarea culorii produse prin reacia amidonului cu iodul. Aceast metod este utilizat n mod curent n laboratorul clinic.

Amilaza serica. Se preleveaza 5-10 ml sange venos intr-o eprubeta sterila cu capac rosu. Administrarea anumitor medicamente, precum morfina, demerol, codeina, trebuie intrerupta inainte de test. De asemenea, pacientul trebuie sa evite consumul de alcool timp de 24 de ore inainte de prelevarea sangelui. Amila urinara. Se colecteaza urina intr-un recipient steril pe o perioada de timp recomandata de medic (2, 6, 8, sau 24 ore). Pacientul trebuie sa evite consumul de alcool timp de 24 ore inainte de test. Recipientul ce contine urina este pastrat la rece. Amilaza este foarte instabila in urina acida

Valori normale

Valorile normale ale amilazuriei (amilaza in urina) sunt: 5000-8000 de unitati internationale sau 8-64 de unitati Wohlgemuth Valorile normale ale amilazemiei (amilaza in sange) sunt: 20 - 140 UI; provin din pancreas, glandele salivare, ficat.

CRETERI

PATOLOGICE

Cresteri patologice pentru amilazuriei (amilaza in sange): cresterea nivelului urinar al amilazei este secundara cresterii la nivelul sangelui, daca functia renala este intacta de asemenea, cresteri ale amilazei se intalnesc in boli extrapancreatice: calculi salivari, ulcer perforat, parotidite, ocluzie intestinala, insuficienta renala, colecistita acuta cresteri ale amilazei survin in afectiuni ale pancreasului cum ar fi pancreatita acuta, fazele de acutizare ale pancreatitei cronice, neoplasme ale capului pancreasului.

Boli ale aparatului cardiovascular:hipertensiunea arteriala, insuficienta cardiaca congestiva Boli ale aparatului respirator: neoplasm bronhopulmonar Boli ale aparatului uro-genital:insuficienta renala, chistul ovarian, afectiuni ale prostatei Boli ale aparatului digestiv:ulcerul perforat, ocluzia intestinala, suferinte ale ampulei lui Vater, peritonite, stari post-operatorii ale abdomenului superior Boli ale glandelor anexe ale tubului digestiv:insuficienta hepatica, hepatita cronica activa,colecistita acuta cronica,hepatita cirogena.. etc

CRESTERI PATOLOGICE PENTRU AMILAZEMIEI (AMILAZA IN URINA):

Afectiuni: pancreatita acuta, ulcer peptic perforat (posterior), colecistita acuta, obstructie canal cistic, cancer pancreatic, pseudochist pancreatic, ascita pancreatica, ocluzie intestinala, perforatie intestinala, infarct intestinal, peritonita, apendicita acuta, sarcina, sarcina extrauterina, ruptura de chist ovarian, coledocolitiaza, parotidita, oreion, traumatism de gl. salivare sau pancreas, infarct pulmonar, arsuri, cetoacidoza diabetica, insuficienta renala, alcoolism acut, colangiopancreatografie retrograda endoscopica, macroamilazemia, Medicamente (Morfina, Aspirina, diuretice tiazidice, corticosteroizi, Azartioprina, contraceptive orale), ciroza.

SCDERI PATOLOGICE

Scaderi patologice pentru amilazuriei (amilaza in sange) apar in afectiuni de tipul: hepatite cronice,cirozele hepatice, carcinomul hepatic, alcoolismul cronic.
Scaderi patologice pentru amilazemiei (amilaza in urina) apar in afectiuni de tipul: pancreatita cronica in stadiu terminal, insuficienta hepatica, hepatita severa.

DETERMINAREA ACTIVITII AMILAZEI SERICE

Amilaza 1,4-glucanhidrolaza (E.C.3.2.1.1.) catalizeaz hidroliza polizaharidelor solubile formate din uniti de glucoz legate prin legturi 1-4 glucozidice. Amilaza acioneaz asupra amidonului prin scindarea legturilor 1-4 glucozidice, producnd fragmentarea substratului n molecule mai mici: dextrine, maltodextroze, maltoz, glucoz. n funcie de greutatea molecular a dextrinelorrezultate, acestea dau cu iodul coloraii diferite, dup cum urmeaz: albastru amilodextrine rou eritrodextrine galben flavodextrine Dextrinele cu mase moleculare mici (acrodextrine) nu dau reacii de culoare cu iodul.

Principiul metodei: Amidonul rmas nehidrolizat n urma aciunii enzimei din proba biologic este dozat colorimetric cu iod.

Reactivi: Substrat tamponat: 13,3 g Na2HPO4 i 4,3 g acid benzoic. Se dizolv n 250 ml. ap distilat la fierbere. Se adaug 5 ml suspensie rece coninnd 200 mg amidon. Se las s se rceasc. Se aduce la 500 ml cu ap distilat. Se pstreaz la 40C (soluia trebuie s fie limpede). Soluie stoc iod: 3,56 g KIO3 i 45 g KI. Se dizolv n 800 ml ap distilat. Se adaug prin picurare 9 ml soluie HCl 12 M agitnd continuu. Se aduce la 1 l cu ap distilat. Se pstreaz la +40C timp de maxim un an.

Soluia de iod pentru determinri: se face o diluie din soluia stoc 1:10 cu ap distilat. Se pstreaz la +40C maxim 2 luni. Soluia acid clorhidric 1N. Soluie amilaz din comprimat: soluie enzimatic obinut prin triturarea unui comprimat de Mezym forte n mojar i extracia produsului finpulverizat obinut cu 10 ml tamponat fosfat timp de 30 min. la temperatura camerei, urmat de filtrarea soluiei. Soluia filtrat se aduce n balon cotat de 100 ml cu ser fiziologic tamponat.

MODUL DE LUCRU

Se folosesc baloane cotate de 25 ml.

Reactivi (ml) Substrat 370C) Prob Martor 2,5 (amidon 2,5

Preincubare 15 minute la 370C

Soluie amilaza din comprimat

0,05

Incubare 7,5 minute la 370C. Rcire pe ghea

Acid clorhiddric 1 N Ap distilat Soluie iod determinri Soluie amilaza din comprimat 1 15 2,5 1 15 2,5 0,05

Se aduc ambele baloane la cot cu ap distilat Se citete absorbana la 660 nm fa de apa distilat Calcul: (AM-AP)/AM x 4200 = uniti amilazice/dl prob

METODA WOHLGEMUTH

Principiu:

Amilaza hidrolizeaz amidonul transformndu-l n glucide mai simple (dextrine, maltoz) care nu mai dau reacia de culoare ca amidonul. Se determin diluia maxim la care amilaza din produsul de cecetat hidrolizeaz complet o anumit cantitate de amidon.

REACTIVI Soluie NaCl 8,5 %o 2. Soluie amidon 0,1% n NaCl 8,5%o 3. Soluie iod N/10 sau soluie Lugol diluat 1/2 Lugol diluat 1/2 Soluia Lugol: Iod ...1g Iodur de K 2g 1 Ap distilat.. 50ml (Iodul metalic este foarte puin solubil n ap. n amestec cu KI formeaz un complex -triiodur de K, devenind astfel solubil)

MODUL DE LUCRU

ntr-o serie de 10 eprubete mici se face o scar de diluii de ser de la 1/1 la 1/312, astfel:
2 3 4 5 6 7 8 9 10

Eprubeta nr. 1

Diluia format
NaCl 8,5%o

1/1

1/2

1/4

1/8

1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/312

1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml

1ml

1ml

Ser

1ml 1ml

n prima i a doua eprubet se pune cte 1ml de ser sanguin n a doua eprubet i n toate cele care urmeaz se pune cte 1ml de ser fiziologic Amestecul din a doua eprubet se omogenizeaz prin agitare i, din amestec, se transfer 1ml in eprubeta a treia. Amestecul din eprubeta a treia se omogenizeaz prin agitare i, din amestec, se transfer 1ml n eprubeta a patra. Operaia se trepet i cu eprubetele urmtoare. Din ultima eprubet se ndeprteaz 1ml de amestec.

n fiecare eprubet se adaug:

Eprubeta nr. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Soluie amidon

2ml 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml

2ml

2ml

Se incubeaz la 37o C, timp de 30 minute n fiecare eprubet se adaug:

Eprubeta nr. 1 Soluie Lugol1-2 (picaturi) 2 1-2 3 4 5 6 7 8 1-2 1-2 1-2 1-2 1-2 1-2 9 1-2 10 1-2

Se omogenizeaz coninutul fiecrei eprubete.

Calculul: Primul tub n care se dezvolt culoarea albastr este tubul limit. Se noteaz diluia tubului anterior (culoare violet). Valoare diluiei din eprubeta care preced eprubeta limit se nmulete cu 2 Culoarea violet este dat de prezena dextrinelor

Valori normale Amilazemie: 16 - 32 uniti Wolgemuth Amilazurie: 32 - 64 uniti Wolgemuth

INTERPRETAREA VALORILOR
Organele n care Afeciuni n care Creteri fals pozitive amilaza este crescut Pancreatit acut Administrare de morfin Litiaz coledoc Administrare de transportori Ulcer septic perforat macromoleculari Ocluzie intestinal Parotidit acut Sarcin tubar rupt Malabsorbie intestinal

este localizat Pancreas Glande salivare Muchi Ficat Duoden