Hibridização

de ácidos
nucleicos
HIBRIDIZAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Explora a capacidade de ácidos nucleicos de fita simples,

parcial ou totalmente complementares em sequência, de
formar moléculas de dupla-fita pelo pareamento de bases
entre elas.

É baseada no princípio de complementaridade das bases

nitrogenada

Tipos de hibridização de ácidos nucleicos

• Em solução
• Em membrana
• In situ
 Amostra teste – é a
Sonda – é a sequência
amostra que se pretende
de nucleotídeo
buscar uma sequência
conhecida, sintética
específica de
(oligonucleotídeo) e
nucleotídeos. Por
marcada*, que se
exemplo, o DNA
encontrar
genômico de um
complementaridade na
paciente com suspeita de
amostra teste se
AME –atrofia medular
hibridiza (anela).
espinhal.
Etapas da técnica de hibridização
• desnaturação amostra teste.
# aquecimento ou solução alcalina –
formamida/ureia (romper as pontes de hidrogênio)
• incubação com a sonda.
# permitir que a sonda anele se houver
complementaridade.
• retirada das sondas que não hibridizaram.
# solução de lavagem
• relevação da hibridização.
# o método depende do tipo de marcação da
sonda
# ex.: sondas marcadas radioativamente a
revelação é feita por exposição à raios X.
 Condições que afetam a
desnaturação e o anelamento

• Moléculas grandes= muitas pontes H

→grande quantidade de energia para quebrá-
las.
• Grandes porcentagens CG →maior
dificuldade para desnaturação.
• # Cátions monovalentes(Na+) →estabilizam as
pontes de H.
• # Moléculas fortemente polares(formamida e
ureia) →promovem o rompimento das pontes
de H.
• # Aumento da temperatura → promovem a
• A hibridização pode ser:
• Alta estringência – quando só
ocorre se houver 100% de
complementaridade entre as bases
nitrogenadas.

• Baixa estringência – quando ocorre

mesmo que não haja 100% de
complementaridade entre as bases
nitrogenadas.
 Quando e como usar
baixa/alta estringência?

• Baixa estringência: Temp. de

anelamento; concentraçãode
sal.
• Ex.: identificação de
sequências alvos semelhantes.
• Alta estringência:  Temp. de
anelamento; concentraçãode
sal.
• Ex.: identificação de uma
mutação específica.
 Temperatura de desnaturação(dissociação) –melting
temperature -Tm

• É a temperatura que corresponde ao ponto

médio em que se observa a transição entre
os estados de dupla fita para fita simples.
• Temperatura de hibridização e Tm:
• - 25º abaixo da Tm permite mau
pareamento(ou seja, hibridização sem 100%
de similaridade entre as sequências.
Hibridização em Hibridização em
Hibridização in situ:
solução: membrana:
• é o tipo mais • é um tipo de • é um tipo de
simples de hibridização em hibridização em
hibridização. As solução, no qual que as moléculas
moléculas de DNA as moléculas de de DNA de fita
de fita simples DNA de fita simples são
são misturadas simples são marcadas com
em uma solução imobilizadas em um fluorocromo
e incubadas a uma membrana. A ou um
uma temperatura amostra de DNA radioisótopo e
adequada para de interesse é incubadas com
que a hibridização incubada com a uma amostra de
ocorra. A detecção membrana e, após tecido ou células.
da hibridização a hibridização, a A detecção da
pode ser realizada detecção é hibridização é
por meio de realizada por meio realizada por meio
técnicas como de técnicas como de técnicas de
radioatividade, radioatividade, microscopia.
fluorescência ou fluorescência ou
quimioluminescên quimioluminescên
 1- Dot blot – ASO
(oligonucleotídeo alelo específico)

• Baseia-se na hibridização de oligonucleotídeos

sintéticos com sequências de DNA específicas,
permitindo a detecção de mutações, polimorfismos e
outras alterações genéticas para alelos que diferem em
apenas 1 nucleotídeo).

• Usa sondas de nucleotídeo alelo-específico (ASO)

marcadas radioativamente em solução.
• Sondas de 15-20 nucleotídeos, só hibridizam em
100% de complementaridade.

• Usa amostras-teste fixadas (membrana de nylon ou

nitrocelulose).
• Aplicação: distinção de
 Investigação de anemia falciforme
através de dot-blot

Sequênci
as
gênicas

ASO

Dot-blots

Genótipo
s
Fonte: STRANCHAN e READ, 2013
2- Southern blotting

- Princípio se baseia em 4 etapas:

1. Fragmentação do DNA: O DNA genômico é

cortado em pedaços menores por enzimas de
restrição, gerando fragmentos de diferentes
tamanhos.

2. Separação por tamanho: Os fragmentos de

DNA fragmentados são separados por tamanho
em um gel de agarose através da eletroforese.
2- Southern blotting

- Princípio se baseia em 4 etapas:

3. Transferência para membrana: O DNA do

gel é transferido para uma membrana de
nitrocelulose ou nylon por capilaridade ou vácuo.

4. Hibridização com sonda: Uma sonda de

DNA marcada radioativamente ou com fluoróforos
se liga complementarmente às sequências
homólogas do DNA na membrana, formando
híbridos.
 Digestão do DNA com enzimas de restrição

Eletroforese em gel para separação

dos fragmentos de
restrição
-Após a eletroforese o gel é tratado
com substância
alcalina para a desnaturação.

Transferência para membrana (capilaridade)

Sonda Hibridização
-Após a hibridizaçào a
membrana é lavada
para remover
Revelação o
em autoradiografia
excesso de sonda.
-Secagem da
2- Southern blotting

• Aplicação:

• identificação de sequências-alvos
semelhantes, mas não idênticas ao gene. Ex.:
famílias de genes.

• Identificação de polimorfismos no tamanho

dos fragmentos de restrição (RFLP -
Restriction Fragment Length Polymorphism)
 Reação de Southern blotting
realizada em paciente do INCA,
visando à identificação de rearranjos
do MLL . Seis microgramas de DNA
foram digeridos completamente com
BamHI, seguiu-se hibridização, com
sonda de 0,74-kb e a eletroforese em
gel de agarose a 0,8%

Rearranjos MML – associados a

leucemias em lactentes

Fonte: COSER, 2009.

 Eletrofores
e
dos
fragmento
s de
restrição.

A – sequência de DNA com mutação que gerou um novo sitio de restrição.

B - sequência de DNA sem mutação.
Probe = sonda

CANIATO, 2006.
http://www.cnpsa.embrapa.br/met/palestra06.pdf
 3- Northern blotting

Princípio baseia-se em cinco etapas:

1. Extração do RNA:
• O RNA é extraído da amostra de interesse,
que pode ser células, tecidos ou
organismos.
2. Separação por tamanho:
•O RNA extraído é separado por tamanho
em um gel de agarose utilizando
eletroforese.
3. Transferência para membrana:
•O RNA do gel é transferido para uma
membrana de nitrocelulose ou nylon por
 3- Northern blotting

4. Hibridização com sonda:

•Uma sonda de RNA ou DNA marcada
radioativamente ou com fluoróforos é
utilizada para detectar a sequência de RNA
de interesse.
5. Detecção e análise:
•Os híbridos formados entre a sonda e o
RNA são detectados por métodos como
autoradiografia ou fluorescência.
•A análise do padrão de bandas permite
determinar a presença, o tamanho e a
quantidade da sequência de RNA específica
3- Northern blotting
Aplicação: obter informação sobre o padrão
de expressão de um gene específico.
se é expresso ou não
 abundância relativa da expressão –
intensidade da banda de hibridização.
Hibridização por Northern blot: com sonda marcada
orrespondente ao gene FMR1 ( síndrome do X frágil)

Comparação da
mRNA do expressão do gene
FMR1 FMR1 nos diferentes
tecidos.

mRNA do
FMR1 menor
– splicing
alternativo

Fonte: STRANCHAN e READ, 2013

4- Microarranjos

•Princípio baseia-se em 4
etapas:

1.Preparo da superfície: Uma superfície

sólida, como uma lâmina de vidro ou um chip
de silício, é coberta com milhares de sondas de
DNA ou RNA.
– Sondas são fixadas no suporte sólido
(lâmina de vidro ou quartzo);
• Milhares de fragmentos de DNA que
representam genes específicos.
• Sondas com posição definida e conhecida
4- Microarranjos

2. Preparo da amostra: O DNA ou RNA da

amostra é marcado com um fluoróforo ou outro
marcador.

3.Hibridização: A amostra marcada é aplicada à

superfície do microarranjo. As moléculas-alvo na
amostra se ligam às sondas complementares na
superfície.

4. Detecção e análise: O sinal de fluorescência

ou outro marcador é detectado e quantificado. A
quantidade de moléculas-alvo presentes na
amostra é estimada com base na intensidade do
sinal.
4- Microarranjos

3. Chipe de DNA, biochipe, chipe

biológico, microarrays
• Dot blot invertido

– Aplicação: Monitoramento de
expressão gênica característicos de
diferentes situações.
• Leveduras crescendo na presença
de glicose x leveduras crescendo na
presença de álcool.
• Células de diferentes tipos de
câncer x células normais
• Modelo desenvolvido em Stanford
(1992)
– Sondas consistem em clones de cDNA ou
produtos de PCR (100-300pb);
– 10.000 diferentes sondas depositadas
(processo automatizado) numa área total de
3,6cm2.
– DNA é secado, fixado e desnaturado na lâmina
de vidro;
• Minúsculos círculos (0,1mm de diâmetro) de DNA
são fixados na lâmina, formando os spots
• Cada spot contém milhares de cópias do
fragmento de DNA-sondas que representa um
determinado gene
 RNA total de células
em 2 diferentes
condições é isolado e
marcado com 2
fluorocromos.
Os 2 cDNAs marcados são misturados
e incubados sobre a lâmina contendo
o microarranjo.

Leitura (software)
Spots verdes - genes expressos na condição 1
Spots vermelhos - genes expressos na condição 2
Spots amarelos - Os genes expressos em
quantidades
equivalentes nas 2 condições .
 5- Técnica de FISH

• O princípio da técnica tem várias etapa:

1- cultura de linfócitos
- após ±70 h, acrescenta-se colchicina →
bloqueia a mitose, e os cromossomos
metafásicos.

2- extração dos cromossomos e fixação em

lâminas.
 5- Técnica de FISH
3- desnaturação e hibridização com sondas
marcadas com fluoróforos.

4- revelação em microscopia de fluorescência.

Aplicação:
- mapeamento genético.
- Identificação de aneuploidias.
- Identificação de microdeleções e
microduplicações.
- Diagnóstico de alguns cânceres.
- ERBB2, também conhecido como HER2/ NEU, está
amplificado em aproximadamente 20% a 30% dos
carcinomas invasivos de mama.
http://www2.uah.es/genetica_juangonzalez/GeneticaHumana/Temario/Tema3/Imagenes-3/esquematecnicaFISH.gif
Fonte: Sanders e Bownman, 2014.
Fonte: Sanders e Bownman, 2014.
Referências Bibliográficas

 COSER, V.T. Disponível em:

http://dspace.c3sl.ufpr.br/dspace/handle/1884/32101
Acesso em: 23 set.2013.

 FARAH, S B. DNA – Segredos e mistérios. 2. ed. São Paulo: Sarvier. 2000.

 GRIFFTH, J.F. et al. Introdução à genética. 7. ed. Rio de Janeiro:

Guanabara-Koogan, 2002.

 NAUSSBAUM, R L; McINNES, R R; WILLARD, H F. Thompson & Thompson -

Genética médica. 6. ed. Rio de Janeiro: Guanabara-Koogan, 2002.

 SNUSTAD, P; SIMMONS, M J. Fundamentos de Genética. 2. ed. Rio de

Janeiro: Guanabara-Koogan, 2001.

 STRANCHAN,T.; READ, A. Genética molecular. 4. ed. Porto Alegre: Artmed,

2013.