UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

POTENCIAL ANTIFÚNGICO DE Olea europaea FRENTE A FUNGOS

LEVEDURIFORMES E FILAMENTOSOS

Márcia Kutscher Ripoll

Porto Alegre
2019
 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

POTENCIAL ANTIFÚNGICO DE Olea europaea FRENTE A FUNGOS

LEVEDURIFORMES E FILAMENTOSOS

Autor: Márcia Kutscher Ripoll

Dissertação apresentada como

requisito parcial para obtenção do
grau de Mestre em Ciências
Veterinárias na área de
Toxicologia, Farmacologia e
Terapêutica Animal.

Orientador: João Roberto Braga de

Mello
Coorientadora: Renata Osório de
Faria

PORTO ALEGRE
2019
 O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001 .
This study was financed in part by the Coordenação de Aperfeiçoamentode Pessoal de
Nivel Superior – Brasil (CAPES) – Finance Code 001.
 Márcia Kutscher Ripoll

POTENCIAL ANTIFUNGICO DE Olea europaea FRENTE A FUNGOS

LEVEDURIFORMES E FILAMENTOSOS

Aprovada em 15 FEV 2019

APROVADO POR:

Prof. Dr. João Roberto Braga de Mello

Orientador e Presidente da Comissão

Prof. Dr. Mário Carlos Araujo Meireles

Membro da Comissão

Profª. Drª. Fernanda Bastos de Mello

Membro da Comissão

Prof. Dr. Régis Adriel Zanette

Membro da Comissão
 IV

RESUMO
A Oliveira (Olea europaea L.) é a única espécie da família das Oleaceae que
produz fruto comestível, é considerado um dos plantios mais antigos, com sua origem
relatada primordialmente na Palestina. Estudos recentes revelam que o azeite e seus
compostos têm comprovada eficácia na medicina para tratamentos de doenças crônicas,
sendo eficaz também em enfermidades cardiovasculares, diabetes, possuindo ação
anticancerígena, anti-inflamatória, anticarcinogênica, antinociceptiva, antioxidante e
citoprotetora, e tanto no azeite quanto em extratos de folhas e ramos da planta, sua ação
frente a micro-organismos já foi comprovada através de estudos in vitro. Estudos têm
revelado cepas resistentes a antifúngicos tradicionalmente utilizados na clínica, nessa
perspectiva e com propósito de avaliar a atuação dos extratos provenientes da oliveira
frente a fungos patogênicos e/ou oportunistas, delineou-se esta proposta com a intenção
de obter-se um extrato fungicida e/ou fungistático, testando a citotoxicidade dos extratos
em bovine kidney cells (MDBK) e também a presença de compostos fenólicos através
da CLAE. Na possibilidade de novas alternativas e na tentativa da obtenção de produtos
efetivos, foram obtidos extratos aquosos do bagaço para utilização em teste de
sensibilidade in vitro a partir da microdiluição em caldo conforme proposto pelo CLSI
de acordo com os documentos M27-A3 e M38-A2, frente a fungos do gênero Candida
spp., Complexo Sporothrix schenckii e dermatófitos. Segundo a metodologia
desenvolvida obteve-se os seguintes resultados, a INF 10’ não foi efetiva para nenhum
dos isolados e cepas padrões testados, assim como as variedades arbequina, arbosana,
frontoio e manzanilla não revelaram presença de oleuropeína e obtiveram baixas
concentrações de hidroxitirosol na sua composição. Os extratos de DEC 10’ foram
efetivos para duas cepas padrões de Candida albicans, inibindo a partir de
concentrações de 3,12 mg/mL, porém não apresentou inibição em isolados clínicos de
Candida spp., dermatófitos e Sporothrix spp. Os extratos apresentaram taxas de 15 a
50% de viabilidade celular a partir do teste de toxicidade dos extratos de concentração
de 25 mg/mL, que torna o extratos viável por não apresentar intensa toxicidade. Nas
condições trabalhadas, permite-se concluir que os extratos não apresentaram os
resultados esperados como antimicrobiano, não apresentaram citotoxicidade e algumas
variedades revelaram presença de oleuropeína.
Palavras-chave: Extratos aquosos, oliveira, dermatófitos, Sporothrix spp., Candida spp.
 V

ABSTRACT
Oliveira (Olea europaea L.) is the only species of the Oleaceae family that
produces edible fruit, is considered one of the oldest tree, with origin reported primarily
in Palestine. Recent studies have shown that olive oil and its compounds have effect in
the treatment of chronic diseases. It’s also effective in cardiovascular diseases, diabetes,
anticancer, anti-inflammatory, anticarcinogenic, antinociceptive, antioxidant and
cytoprotective actions, and in extracts of leaves and part of the plant, their action against
microorganisms has already been proven through in vitro studies. Studies revealed
antifungal resistant against clinical strains, with the purpose of evaluating the
performance of extracts from the olive tree against pathogenic and/or opportunistic
fungi, this proposal was outlined with the intention of obtaining a fungicide extract
and/or fungistatic, testing the cytotoxicity of extracts in bovine kidney cells (MDBK)
and also the presence of phenolic compounds through HPLC. With the possibility of
new alternatives and in the attempt to obtain effective products, aqueous extracts of the
bagasse were obtained for use in an in vitro sensitivity test from the microdilution in
broth as proposed by CLSI according to documents M27-A3 and M38-A2 , against
fungi of the genus Candida spp., Sporothrix schenckii Complex and dermatophytes.
According to the methodology developed, the following results were obtained: INF 10'
was not effective for any of the isolates and strains tested, as the arbequina, arbosana,
frontoio and manzanilla varieties didn’t show presence of oleuropein and obtained low
concentrations of hydroxytyrosol their composition. The DEC 10' extracts were
effective for two standard strains of Candida albicans, inhibiting from concentrations of
3.12 mg/mL, but did not present inhibition in clinical isolates of Candida spp.,
Dermatophytes and Sporothrix spp. The extracts presented rates of 15 to 50% of cell
viability from the toxicity test in extracts of concentration with 25 mg/mL, which makes
the extracts viable because it doesn’t present intense toxicity. Under the conditions
studied, it’s possible to conclude that the extracts did not present the expected results as
antimicrobial, didn’t present cytotoxicity and some varieties showed the presence of
oleuropein.
Keywords: Aqueous extracts, olive tree, dermatophytes, Sporothrix spp., Candida spp.
 IV

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Concentração Inibitória Mínima (CIM) apresentada no teste In vitro 28

do extrato de decocção 10’ frente a fungos do gênero Candida spp.

Tabela 2 – Concentração Fungicida Mínima (CFM) apresentada no In vitro do 29

extrato de decocção 10’ frente a fungos do gênero Candida spp.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Viabilidade celular frente a extratos de Arbosana, Arbequina, 30

Coratina e Frontoio em decocção 10’

Figura 2 – Viabilidade celular frente extratos de Koroneiki, Picual e Manzanilla 30

em decocção 10’

Figura 3 – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) de extratos de 31

bagaço decocção 10’
 SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................8
2 OBJETIVOS ..........................................................................................................10
2.1 Objetivo Geral ......................................................................................................10
2.2 Objetivo Específico ...............................................................................................10
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .............................................................................11
3.1 Oliveira (Olea europaea L.) .................................................................................11
3.2 Antifúngicos na Medicina Veterinária ...............................................................13
3.3 Dermatofitose ........................................................................................................15
3.4 Esporotricose ........................................................................................................16
3.5 Candidose ..............................................................................................................18
4 ARTIGOS CIENTÍFICOS ...................................................................................20
4.1 Artigo I – Delineamento de suscetibilidade in vitro de extratos aquosos de
Olea europaea frente a fungos filamentosos e leveduriformes ............................20
5 CONCLUSÃO .......................................................................................................42
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS ...............................................................................42
REFERÊNCIAS ....................................................................................................44
ANEXOS ................................................................................................................49
ANEXO I - Resumo expandido publicado na Terceira Semana Integrada
(SIIEPE) da Universidade Federal de Pelotas 2017, categoria XIX Encontro de
Pós-Graduação ........................................................................................................50
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1 INTRODUÇÃO

A Oliveira (Olea europaea L.) é a única espécie da família das Oleaceae que
produz fruto comestível. O seu cultivo data de três a quatro mil anos a.C., sendo
considerado um dos plantios mais antigos, com sua origem relatada primordialmente na
Palestina. A partir da azeitona que são extraídos os óleos de oliva, também
denominados de azeite. O seu plantio é realizado em regiões de clima temperado ou
subtropical, caracterizados por verões calorosos e secos, contando com baixas
temperaturas para sua floração. (COUTINHO et al., 2015).
Na indústria oleícola, durante cultivo e processamento do azeite têm-se grande
produção de resíduos. Esses resíduos podem ser provenientes da poda, onde ocorre o
descarte das folhas e também do processamento do azeite, podendo ser classificados em
resíduos líquidos e sólidos (bagaço). Estudos realizados em regiões de grandes
produções localizadas na Europa indicam que das azeitonas colhidas para produção de
azeite, o rendimento é de apenas 20% do total, e 80% são destinados ao descarte
(bagaço e resíduo aquoso) (ALCAIDE et al., 2010). Esses subprodutos têm sido
utilizados de diversas formas, sendo eles, adubos e pesticidas (CABRERA, et., 2010),
ração animal, obtenção de energia (MORE, 2008) e também através dos seus extratos,
revelaram atividade antimicrobiana (PEREIRA et al., 2007; MARKIN et al., 2003;
ZORIC et al., 2013; GOEL et al., 2016).
De modo geral, há dois tipos de metabólitos produzidos por vegetais, o primário
e o secundário. O primeiro corresponde à sobrevivência da planta, e o segundo
correspondente à sua defesa, podendo ser separados em três grandes grupos: compostos
fenólicos, terpenos e compostos que contém nitrogênio (TAYZ & ZEIGER, 2004).
Sabe-se que a oliveira é rica em compostos fenólicos tais como: oleuropeina, tirosol,
hidroxitirosol (JUVEN et al., 1970). Historicamente, os extratos de oliveira eram
utilizados na medicina no combate a doenças (BENAVENTE-GARCIA et al., 2000).
Estudos recentes revelam que o azeite e seus compostos têm comprovada eficácia na
medicina para tratamentos de doenças crônicas devido a sua atividade moduladora de
radicais livres, sendo eficaz também em enfermidades cardiovasculares, diabetes,
possuindo ação anticancerígena (MELLO et al., 2012), anti-inflamatória (EIDI et al.,
2012; KIM et al., 2018), anticarcinogênica (IMRAN, 2018), antinociceptiva (EIDI et al.,
2012), antioxidante (AREE et al., 2018) e citoprotetora (ALY et al., 2018), e tanto no
 9

azeite quanto em extratos de folhas e ramos da planta, e sua ação frente a micro-
organismos já foi comprovada através de estudos in vitro (PEREIRA et al., 2007;
MARKIN et al., 2003; ZORIC et al., 2013; GOEL et al., 2016).
Existem cerca de 800.000 espécies de fungos conhecidos e relatados pela
ciência, 400 deles são patogênicos para animais e seres humanos. Esses micro-
organismos pertencem ao Reino Fungi e são classificados eucariontes podendo ser pluri
ou unicelulares e heterótrofos. Há, principalmente, três tipos morfológicos de fungos, os
filamentosos, os leveduriformes, havendo também os fungos termodimórficos, que
apresentam as duas morfologias de acordo com a temperatura em que se encontram.
Fungos capazes de metabolizar queratina e transformar em nutriente são denominados
dermatófitos, pertencentes a categoria de fungos filamentosos patogênicos que podem
parasitar homens e animais. Em contato com a pele, desenvolve-se de maneira
centrífuga, invadindo o extrato córneo, realizando uma reação inflamatória devido a
produção de metabólitos tóxicos. Esse grupo compreende três gêneros que podem ser
diferenciados a partir da forma de seus conídios, são eles Microsporum, Trichophyton e
Epidermophyton. (CRUZ, 1985; LARONE, 2011; QUINN et al., 2011; MEIRELES &
NASCENTE, 2009). Já os fungos leveduriformes, são micro-organismos unicelulares,
eucariotos e de forma redonda a ovalada. Suas colônias possuem textura úmida e
cremosa, podendo ser encontradas no ambiente, comensais em mucosas e pele dos
animais e em sua maioria podem ser consideradas oportunistas. Candida sp.,
Malassezia sp. e Cryptococcus sp. são espécies de leveduras causadoras de doenças de
importância na medicina e veterinária. E por fim, o Sporothrix sp. fungos
termodimórficos, agentes da esporotricose, que causam lesões subcutâneas e sistêmicas.
A infecção ocorre através de inoculação traumática de conídios, devido a esse fator a
doença é classificada como uma micose de implantação e pode acometer homem e
animais (LARSSON, 2011; TRABULSI et al., 2008; QUINN et al., 2005).
As terapias antifúngicas consistem no emprego de fármacos como cetoconazol,
anfotericina B, itraconazol, iodeto de potássio, terbinafina e equinocandinas. Contudo,
estudos revelaram a existência de cepas resistentes a esses fármacos, principalmente
devido ao seu uso indiscriminado (NOBRE et al., 2002; ODDS et al., 2003). Nessa
perspectiva, tem-se procurado métodos alternativos para auxiliar no tratamento das
afecções fúngicas, tendo nas plantas e seus extratos uma fonte próspera para tratamento,
 10

como demonstram estudos realizados, não somente com fungos, mas também com
bactérias, mostrando ser eficiente no combate a ambos micro-organismos (SUDJANA
et al., 2009; KORUKLUOGLU, et al., 2006; WALLER et al., 2016). Sempre
salientando a importância desses fitoterápicos seguirem a mesma segurança, controle de
qualidade e eficácia que os medicamentos aloterápicos disponíveis no mercado (KLEIN
et al., 2009).
A fim de recorrer a novas alternativas para tratamentos de doenças causadas por
fungos, plantas com ação medicinal estão sendo testada devido a sua atual utilização a
nível popular, seja em infusões, óleos essenciais e extratos alcoólicos. Sabe-se que os
principais compostos que atuam combatendo micro-organismos são os compostos
fenólicos, contudo o extrato, em seu conjunto, tem se mostrado mais benéfico que estes
compostos isoladamente (PEREIRA et al., 2007). A possibilidade dessas novas
alternativas e na tentativa de observar efetividade dos extratos, os quais há escassez de
estudos in vitro, realizou-se esse projeto com a prerrogativa de obter-se um extrato
eficiente frente à fungos patogênicos mais recorrentes na medicina veterinária e após
testes in vitro e in vivo, utilizar os compostos isolados ou em associação a antifúngicos
comerciais para combate desses micro-organismos.

2 OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral

Avaliar a atividade antifúngica de diferentes extratos de Olea europaea, frente a
fungos patogênicos.

2.2. Objetivo Específico

Avaliar as atividades fungistática e fungicida de extratos obtidos de diferentes partes
de Olea europaea, incluído azeite bruto, azeite comercial e extratos aquosos de bagaço.

Estabelecer a citotoxicidade in vitro de Olea europaea na forma de extrato aquoso

do bagaço em cultura de células.

Analisar através de Cromatografia Liquida de Alta Eficiência (CLAE) os principais

constituintes químicos presentes nos extratos obtidos e utilizados no teste in vitro.
 11

3 REVISÃO DE LITERATURA

3.1.Oliveira (Olea europaea L.)

Olea europaea L., tradicionalmente conhecida como oliveira, é a única a
produzir fruto comestível entre as espécies da família Oleaceae. Do gênero Olea, há em
torno de 35 espécies conhecidas. Relatado inicialmente na Palestina, datado de 3 a 4 mil
a.C. é considerado um dos mais antigos cultivos. Concentra-se principalmente em
latitudes de 30º e 45º em ambos os hemisférios (Norte e Sul), sua plantação é
preconizada nas áreas de clima mediterrâneo onde há baixas temperaturas em períodos
de floração e verões com altas temperaturas e baixa umidade, apesar de seu cultivo
também ser empregado em regiões tropicais (COUTINHO et al., 2015).
No Brasil, o cultivo foi instaurado há muitos séculos e espalhou-se por diversas
Federações. Atualmente o interesse pela cultura da oliveira vem expandindo e pode-se
destacar São Paulo, Santa Catarina, Minas Gerais e Rio Grande do Sul como os estados
com maior frequência (COUTINHO et al., 2009; COUTINHO et al., 2015). Sexto maior
consumidor de azeite no mundo e terceiro maior importador, segundo dados da
Internacional Olive Oil Council (2018), o Brasil importou mais de 60 mil toneladas de
azeite, aumentando em seis vezes sua importação desde os anos de 1990 (COI, 2009).
Nos anos de 1948, a oliveira foi introduzida no Rio Grande do Sul, sua produção e
venda foi estimulada através de criação de órgãos especializados apoiados pelo governo
com o intuito de estimular fomento à pesquisa. Os plantios comerciais ativos estão
presentes, atualmente, na região de Caçapava do Sul, Dom Pedrito, Encruzilhada, Rio
Grande, Santana do Livramento, Cachoeira do Sul, Vacaria e Bagé. São
aproximadamente 1,6 mil hectares de oliveiras no estado, onze marcas registradas e seis
indústrias de azeite, com isso, destacando sua produção no território brasileiro
(COUTINHO et al., 2009; GOMES, 1979).
Cultivada geralmente em solo do Mediterrâneo, local que possui invernos frios e
verões com elevadas temperaturas e baixos índices pluviométricos. O cultivar possui
limiar de temperatura entre 12,5 a 40ºC, porém sua temperatura de conforto em que há
frutificação limita-se de 25 a 35ºC, por ser mais vulnerável ao frio que outras plantas
frutíferas. Necessita baixos índices pluviométricos devido à presença de estômatos no
interior das folhas, impedindo a perda de água pela transpiração e permitindo retomada
 12

imediata após situações de estresse. A exigência pluviometria é em torno de 650 a 800

mm/ano, preferencialmente com chuvas regulares, pois o excesso de umidade é nocivo
para a planta facilitando doenças fúngicas e dificultando a polinização (VILLA, 2004;
COUTINHO et al., 2009; BARRANCO et al., 2004).
Das condições de maior importância na plantação de um cultivar de oliveira estão:
disponibilidade de nutrientes, drenagem do solo, profundidade e estrutura, textura e
reação (neutra, ácida ou alcalina). Para correta avaliação, deve-se fazer uma correta
amostragem do solo e posterior análise, assim como amostragem das folhas. Os solos do
Rio Grande do Sul são conhecidos por sua deficiência nutricional, portanto, após a
avaliação de solo pode-se adubar através de nitrogênio, boro, fósforo potássio. No
momento do plantio é preconizado no fim do inverno, para evitar que o cultivar passe
por períodos de geadas, que podem comprometer o crescimento normal da planta
(PARRA et al., 2003; COUTINHO et al., 2009; COUTINHO et al., 2015; BARRANCO
et al., 2004).
A poda tem como principal propósito propiciar formato adequado e obter máxima
produção em menos tempo. No olival, a poda deve balancear frutificação e crescimento,
não provocar envelhecimento precoce e nem desvitalizar a planta, devendo ser de baixo
custo. Tem-se principalmente dois tipos de poda, a de frutificação e a de formação.
Pode ser realizada anualmente ou uma vez a cada dois anos, preferencialmente no fim
do inverno e início da primavera, evitando que ocorra anteriormente a possíveis
momentos de geada pois a árvore encontraria-se desprotegida (BARRANCO et al.,
2004; PASTOR et al., 1995; COUTINHO et al., 2009).
Recentes pesquisas sugerem o plantio de certos cultivares específicos para o sul do
Brasil, de acordo com seu resultado em avaliações agronômicas de solo e clima. Sendo
eles a Arbequina, que conta com elevada produtividade e rendimento graxo, produzindo
um azeite de suprema qualidade, porém com baixa estabilidade. A Picual é a variedade
de maior importância no mundo, considerada uma planta rústica, porém sensível à seca
e solos demasiadamente alcalinos. Koroneiki, conta com a produtividade mais
constante, sensível ao frio, porém resiste melhor a períodos de seca. Frantoio, de
produtividade constante e elevada e alta capacidade de adaptação. Arbosana, muito
semelhante a Arbequina, porém sua colheita é realizada após alguns dias da colheita de
sua similar. Coratina, possui facilitada adaptação à diversas zonas de cultivo, entra
 13

precocemente em estado de produção e se comporta bem em regiões de frio intenso,

porém fortemente sensível a certos parasitas. Manzanilla é a variedade mais
disseminada internacionalmente por demonstrar características de alta qualidade e
produtividade do fruto, além de também entrar precocemente em fase de produção. A
região sul conta com distintos cultivares, dispondo de diferentes pontos favoráveis e
desfavoráveis (COUTINHO, 2007; COUTINHO, 2009; AOC, 2018; BARRANCO et
al., 2004).

3.2.Antifúngicos na Medicina Veterinária

Antifúngico é conceituado como qualquer substância capaz de realizar
alterações na estrutura da célula fúngica, fazendo com que altere sua viabilidade
inibindo seu desenvolvimento e capacidade de manter o organismo vivo (VARGAS,
et al., 2005). Até a década de oitenta, diversos antissépticos eram utilizados no
tratamento de doenças micóticas, como quinonas, antifúngicos poliênicos, ácido
salicílico e benzoico, cristal violeta e tintura de iodo (TORTORA et al, 2000).
Atualmente o iodo ainda é utilizado, pois é uma alternativa economicamente viável
devido ao baixo custo e pode ser administrado através de soluções saturadas via oral
(VO) na forma de iodetos em concentração de 20%. Apesar de uma opção
economicamente acessível possui diversos efeitos colaterais e frequentemente ocorre
reações alérgicas, principalmente em felinos que possuem sensibilidade à compostos
com iodo (LACAZ et al., 2002).
Através do isolamento da Streptomyces noursei foi sintetizado o primeiro
antibiótico poliênico que até hoje é amplamente utilizado em casos clínicos de
candidíase vaginal e oral. A nistatina, derivada do isolamento dessa bactéria, é um
dos inúmeros antibióticos poligênicos descritos e utilizados para micoses. A
anfotericina B também é um antibiótico do mesmo grupo da nistatina, após sua
descoberta foi utilizada em casos de doenças fúngicas, porém devido a sua alta
toxicidade tornou-se pouco utilizada na clinica. Em casos de otite externa causada
por Malassezia spp. a nistatina também é usada em associação com antibióticos
tópicos (FARIAS & GIUFFRIDA, 2002; JAHAM, 2000).
Devido ao aumento de doenças fúngicas, em meados dos anos oitenta houve o
aparecimento de uma nova classe de antifúngicos com estrutura química totalmente
 14

diferente do que já havia no mercado. Conhecido como derivados azólicos, os

fármacos presentes nessa classe possuem uma estrutura que apresenta um ou mais
anel azólico conectados a ligações do tipo C-N. Sua forma de atuação é em nível de
ergosterol, e agem inibindo a síntese desse componente interferindo no citocromo P-
450. Após a troca de ergosterol por precursores metilados ocorre a formação de
membrana plasmática defeituosa aumentando a permeabilidade e prejudicando a
troca e captação de nutrientes para dentro da célula fúngica resultando em morte
celular. Além de prejudicar a produção de ergosterol, interfere no sistema enzimático
a partir do mecanismo peroxidativo e do oxidativo. Esses fármacos são divididos em
dois grupos, os triazois que engloba os fármacos fluconazol e itraconazol, e os
imidazóis que são o miconazol e cetoconazol (FARIAS & GIUFFRIDA, 2002;
NOBRE et al., 2002, JAHAM et al., 2002; TORTORA et al., 2000).
O primeiro imidazól utilizado na clinica foi o cetoconazol por VO para
terapêutica de micoses sistêmicas, possuindo também boa efetividade frente à
dermatófitos. Possui principal metabolização hepática e biliar, não possuindo
efetividade no tratamento de micoses como esporotricose e aspergilose devido a sua
limitada distribuição, não sendo recomendada para animais lactantes e prenhez. O
fluconazol encaixa-se nos fármacos de eleição para tratamento de micoses no sistema
nervoso central (SNC), apresentando alta segurança no seu uso e é amplamente
empregada em afecções por fungos filamentosos como Aspergillus spp e também
para leveduras do gênero Candida em pacientes que apresentam neutropenia. O
itraconazol é amplamente utilizado na clinica de pequenos animais para tratamento
de blastomicose, criptococose, aspergilose e dermatofitose, sendo o fármaco de
eleição para a esporotricose, devido à baixa toxicidade e alta distribuição tecidual
(JAHAM et al., 2002; FARIAS & GIUFFRIDA, 2002; NOBRE et al., 2002).
Em suma, o numero de fármacos antifúngicos é escasso para tratamento de
micoses em animais, além de relatos de resistência de isolados fúngicos, os efeitos
colaterais também restringem o uso desses fármacos (NOBRE et al., 2002;
LUGMAN et al., 2007). A partir dessa situação, a importância de alternativas
terapêuticas que possam atuar sinergicamente ou individualmente vem ganhando
espaço nas pesquisas. Visando principalmente sanar os problemas de resistência aos
fármacos, alto custo dos medicamentos e diminuição de efeitos colaterais, o
 15

conhecimento de plantas medicinais como fontes terapêuticas para tratamentos de

micoses. Estudadas e testadas em in vitro já comprovando a eficácia da utilização de
partes de plantas para inibição ou morte de agentes fúngicos (ODDS, 2003;
JOHANN et al., 2007; WALLER et al., 2016)

3.3.Dermatofitose
Os dermatófitos são capazes de metabolizar queratina transformando-a em
nutrientes para sobrevivência, fazem parte das espécies fúngicas
patogênicas/oportunistas que parasitam tanto humanos quanto animais. Classificada
como uma escleroproteína, a queratina possui diversas cadeias de polipeptideos unidas
através de ligação covalente e de ligações de hidrogênio a moléculas de enxofre. Ao se
instalar causando lesão, os dermatófitos realizam a quebra dessas ligações e expandem
seu crescimento em busca de novas fontes de queratina. A dermatofitose é classificada
como uma micose superficial e a partir da produção de metabólitos pelo agente, ocorre a
reação inflamatória devido a toxicidade dos mesmos. E por não sobreviverem muito
tempo em tecidos inflamados ou com infecção bacteriana secundária, alguns
dermatófitos extinguiram a produção desses elementos irritantes. São divididos em três
gêneros, os Microsporum, Trichophyton e Epidermophyton, suas diferenciações se dão a
partir da macro e microscopia. Na clinica de pequenos animais, destacam-se as espécies
M. canis, M. gypseum e T. mentagrophytes, devido a sua alta ocorrência. É uma micose
que atinge principalmente animais jovens, devido ao sistema imune estar menos
preparado (CRUZ, 1985; LARONE, 2011; REIS-GOMES, 2012).
O período de incubação dá-se em torno de 7-28 dias, sua transmissão pode
ocorrer através de fômites, solos com contaminação e contato direto com animais
infectados. As lesões são caracterizadas por alopecia descamativa e quando presente
reação inflamatória mais acerbada pode apresentar hiperpigmentação com as bordas da
lesão levemente aumentadas (CRUZ, 1985; LARSSON, 1988).
O diagnóstico é realizado através do conjunto: anamnese, tipo de lesão
encontrada e crescimento e identificação em cultura fúngica. Sendo a coleta realizada
com a assepsia recomendada e é facilmente isolada em laboratório. Em um estudo
realizado no Paraná, entre os casos de dermatopatias a dermatofitose foi a terceira que
mais acometeu cães e gatos na clinica de pequenos animais, ficando atrás das dermatites
 16

bacterianas e parasitárias (CARDOSO et al., 2011).

O tratamento para dermatofitose pode ser através de tosa, descontaminação do
local e assim como banho utilizando antissépticos tópicos acrescidos de antifungicos.
Nas terapias tópicas podem ser utilizados antifúngicos como miconazol e enilconazol
em associação ou separadamente. Em casos recorrentes pode utilizar-se a terapia
sistêmica, onde é indicado o uso clotrimazol 1%, que atua principalmente na alteração
da permeabilidade de membrana e na síntese do esrgosterol e outros ésteres de
membrana ou griseofulvina que atua como fungistático (CLAUDINO et al., 2012;
NOBRE et al., 2002; MORIELLO, 2004; REIS-GOMES; 2012),

3.4.Esporotricose
A esporotricose é uma doença causada por fungos do Complexo Sporothrix, é
uma micose de implantação que acomete humanos e diversas espécies animais. Esse
Complexo compreende seis espécies, sendo elas S. albicans, S. brasiliensis, S.
mexicana, S. lurei, S. schenckii e S. globosa (MANIMON et al., 2007; RODRIGUES et
al., 2014). É um fungo saprofítico que prefere solos com intensa quantidade de matéria
orgânica ficando em locais com matéria em decomposição e cascas de árvores, sendo
transmitido através da inoculação traumática de seus conídios (CRUZ, 2011; LACAZ et
al., 2002).
É uma micose reconhecida mundialmente, no Brasil as regiões onde há mais
relato da doença, na qual ela tornou-se endêmica e importante problema de saúde
pública, são Rio de Janeiro e Rio Grande do Sul (MADRID et al., 2010; BARROS et
al., 2001). Anteriormente, a doença era reconhecida como doença dos floristas,
justamente pelo contato com os espinhos da rosa que realizavam inoculação traumática,
quando em contato solo contaminado (BRAUNWALD et al., 2013), porém atualmente
sabe-se que nas regiões endêmicas do Brasil o principal tipo de transmissão está
intimamente relacionado com a mordedura e arranhadura de felinos, espécie de maior
importância na cadeia de transmissão tanto zoonótica quanto inter-espécies (CRUZ,
2011; MADRID et al., 2011). Devido ao hábito de afiar as unhas e cavar na terra para
tapar as fezes, os felinos são mais propensos a albergar os conídios nas garras, sendo
capazes de transmitir a doença para outros animais e humanos através de brigas e/ou
brincadeiras envolvendo arranhaduras. Apesar dos felinos e humanos serem as espécies
 17

em foco, já foram relatados casos de esporotricose em golfinhos, bovinos, roedores,

raposas, lagomorfos, tatus e equinos (CRUZ, 2011; LARSSON, 2011).
Os fungos do Complexo Sporothrix apresentam morfologia dimórfica,
visualizando-se leveduriforme quando em parasitismo e filamentosa quando no meio
ambiente. Quando ocorre a infecção pela forma filamentosa, 24 a 48 horas após a
inoculação não há mais hifas ocorrendo a transição completa para forma leveduriforme
em torno de 13 dias. Ocorrendo assim um período de incubação maior quando adquirido
do ambiente que adquirido pela transmissão direta de animais, onde o fungo encontra-se
na fase leveduriforme (MEIRELES & NASCENTE, 2009; CRUZ, 1985; CRUZ, 2011).
A apresentação da doença está ligada a imunidade do hospedeiro, podendo essa
auxiliar na permanência ou crescimento da lesão e até a cura espontânea. Porém a
eficiência imunológica fica comprometida devido aos fatores de patogenicidade
adquiridas pelo fungo, tais como constituintes da parede celular, termotolerância,
enzimas extracelulares e produção de melanina (LARSSON, 2011; MADRID et al.,
2007). As apresentações clinicas ocorrem através das formas cutânea-linfática, cutânea
e fortuitamente na forma sistêmica, apresentando tempo de evolução dependente dos
fatores de imunidade e patogenicidade do agente, podendo levar de 2 a 24 meses
(LACAZ et al., 2002; MADRID et al., 2010).
Para realização do diagnóstico preciso é necessária a associação da anamnese,
sinais clínicos, histórico e isolamento do agente a partir da semeadura em meio de
cultura, essa deve ter crescimento em ambas temperaturas (ambiente a
aproximadamente 25ºC e corporal a aproximadamente 37ºC) para confirmação do
dimorfismo (MEIRELES & NASCENTE, 2009). Primordialmente, os primeiros
fármacos a serem utilizados para o tratamento da esporotricose foram iodeto de sódio e
iodeto de potássio. Devido a sensibilidade dos felinos a iodetos em geral, esse fármaco
foi alterado por derivados azóis que agem substancialmente no ergosterol, componente
da membrana celular (SHUBACH et al., 2004; NOBRE et al., 2002). Após diversas
experiências com drogas antifúngicas como cetoconazol, flucitosina e anfotericina B,
umas apresentaram diversos casos de efeitos colaterais e outras não eram mais utilizadas
devido ao alto custo e período prolongado de tratamento (NOBRE et al., 2002;
SCHUBACH et al., 2004; HEIT & RIVIERE, 1995). Atualmente, o fármaco de eleição
para o tratamento da esporotricose é um derivado de triazólico, o itraconazol,
 18

recomendado na dose de 10-40mg/kg ao dia, por via oral e com duração mínima de três
meses de tratamento (MADRID et al., 2007; SCHUBACH et al., 2004).

3.5.Candidose
A candidose é uma doença micótica causada por fungos do gênero Candida,
micro-organismos comensais presentes em mucosa e pele. São leveduras oportunistas
que cometem principalmente indivíduos imunodeprimidos e também aqueles que
possuem alguma doença crônica, causando lesões cutânea úmidas, eritematosas com
erosões e em formato placóide de coloração esbranquiçada acometendo mucosas,
junções mucocutâneas e locais com umidade persistente, podendo também apresentar
caráter sistêmico (CRUZ, 1985; WILLEMSE, 1994; MEIRELES & NASCENTE;
2009).
Dentro do gênero encontram-se as C. albicans, C. krusei, C. tropicalis, C.
curvata, C. lambica, C. rugosa, C. humicola, C. guilliermondii, C. parapsilosis, C.
dublinensis, C. famata, C. lusitanie, C. stellatoidea, que são as principais espécies. O
diagnóstico se da através do cultivo celular em ágar Sabouraund dextrose acrescido de
cloranfenicol e possui célere crescimento, sendo ele entre 24-48h formando colônias de
coloração branco a creme com textura cremosa. Microscopicamente são identificados os
blastoconídeos com formatos de esféricos à ovais de 3 a 5µm de diâmetro, paredes
delgadas e não apresenta cápsula, a identificação de espécie pode ser realizada através
de testes bioquímicos como assimilação de açucares, fermentação de carboidratos e
presença ou não de pseudo-hifas ou hifas verdadeiras, destacando-se a C. albicans,
espécies mais envolvida em casos de candidose em mamíferos (LACAZ, 2002; SIDRIM
& MOREIRA, 1999; RIPPON, 1988).
Apesar da colonização do fungo não denotar doença, a alta concentração de
leveduras e principalmente doenças agregadas ao paciente como: transplantados,
pacientes oncológicos que fazem uso de antineoplasicos, uso prolongado de
antimicrobianos e anti-inflamatórios não esteroidais, alterações na barreira primária da
pele, doenças metabólicas e uso prolongado de dispositivos intravenosos fazem com que
a doença se instaure e até mesmo evolua causando lesões mais graves ou tornando-se
sistêmica. (SIDRIM & MOREIRA, 1999; CLEFF et al., 2007; FERREIRO et al., 2002;
RODRIGUEZ et al., 2003)
 19

A fixação e penetração da Candida spp. em tecidos está intimamente ligado aos

fatores de virulência, sendo capazes de ligar-se às membranas celulares do hospedeiro
em locais como mucosa oral e vaginal, córnea, plaquetas, endotélio vascular e sistema
gastrointestinal. Essa aderência se dá através dos componentes glicoproteicos presentes
na parede celular das leveduras que proporciona a inflamação ativando a via alternativa
do complemento (LACAZ, 2002; ZIARRUSTA, 2002).
Os relatos de candidose vêm tornando-se recorrente na clínica de pequenos
animais, com sinais clínicos de dermatite mucocutânea disseminada ou localizada,
piodermatite de comissuras labiais e em pele sendo descrito lesões úmidas, presença de
prurido, pápulas, pústulas e podendo evoluir para ulcerações do tecido acometido
(MUELLER et al., 2002; MORETTI et al., 2006). Na espécie canina, a Candida spp.
possui favoritismo pelas mucosas, interdígitos e junções mucocutâneas, podendo-se
observar lesões ulceradas, placóides de exsudato esbranquiçado. Áreas de intensa
umidade também são de eleição para a Candida spp. como orelhas e meato acústico
externo (GUILLOT et al., 1996; RAPOSO, et al., 1996; WILLEMSE, 1995).
Com base na epidemiologia, sinais clínicos, apresentação de lesões e exame
direto do material coletado é possível chegar-se ao diagnóstico presuntivo.
Microscopicamente aparecerão células arredondadas ou ovaladas com presença de hifas
e brotamentos (SIDRIM & MOREIRA, 1999; KNOW-CHUNG & BENNETT, 1992).
Para o diagnóstico definitivo o método de eleição é cultivo em agar Sabouraud dextrose
acrescido de cloranfenicol, de 24-48 horas acondicionados em temperatura de 35-37ºC.
Após o crescimento, as leveduras podem ser identificadas microscopicamente e sua
espécie pode ser revelada através de provas bioquímicas, repiques em meios de cultura
específicos, testes de termotolerância e prova do tubo germinativo (LACAZ, 2002;
SIDRIM & MOREIRA, 1999).
 20

4. ARTIGO CIENTÍFICO

4.1. Artigo I

Delineamento de suscetibilidade in vitro de extratos aquosos de Olea europaea

frente a fungos filamentosos e leveduriformes.

Márcia Kutscher Ripoll1, Stefanie Bressan Waller2, Otávia de Almeida Martins2, Luiza
da Gama Osório3, Renata Osório de Faria4, Mario Carlos Araujo Meireles4, Rogério de
Oliveira Jorge5, Fabio Clasen Chaves6, João Roberto Braga de Mello7.

Artigo formatado nas normas da revista Microbial Pathogenesis.

O texto será traduzido para a língua inglesa para submissão.
 21

Delineamento de suscetibilidade in vitro de extratos aquosos de Olea

europaea frente a fungos filamentosos e leveduriformes.

Márcia Kutscher Ripoll1, Stefanie Bressan Waller2, Otávia de Almeida Martins2,

Luiza da Gama Osório3, Renata Osório de Faria4, Mario Carlos Araujo Meireles4,
Rogério de Oliveira Jorge5, Fabio Clasen Chaves6, João Roberto Braga de Mello7.

1
Mestranda em Ciências Veterinárias pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul
(UFRGS). Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil.
2
Doutoranda em Veterinária pela Universidade Federal de Pelotas (UFPel). Pelotas, Rio
Grande do Sul, Brasil.
3
PNPD pela Universidade Federal de Pelotas (UFPel). Pelotas, Rio Grande do Sul,
Brasil.
4
Faculdade de Veterinária, Departamento de Veterinária Preventiva, Setor de Micologia
na Universidade Federal de Pelotas (UFPel), Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil.
5
Responsável Técnico na EMBAPA - Cascata.
6
Faculdade de Agronomia, Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial na
Universidade Federal de Pelotas (UFPel), Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil.
7
Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Departamento de Farmacologia da
Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Porto Alegre, Rio Grande do
Sul, Brasil.

*Correspondência: M.V. Márcia Kutscher Ripoll

Setor de Micologia, Departamento de Veterinária Preventiva, Faculdade de Veterinária,

Universidade Federal de Pelotas,

Email [email protected]
 22

Resumo

A oliveira é conhecida e amplamente utilizada na medicina popular brasileira no

tratamento de infecções e diminuição de sinais clínicos, os extratos de oliveira são
reconhecidos por apresentarem atividade antifúngica frente a diversos agentes
patogênicos e por auxiliar na restauração de tecidos lesados. Ainda que, a
disponibilidade de antimicrobianos seja ampla, o número de antifúngicos é irrisório
quando comparado com a quantidade de antibacterianos disponíveis no mercado. O
presente estudo avaliou o perfil de suscetibilidade in vitro de isolados clínicos e cepas
padrões de Candida spp. e Sporothrix spp., e isolados de M. canis e M. gypseum, bem
como o fator de toxicidade celular dos extratos e a presença dos principais compostos
fenólicos. A metodologia para os testes de sensibilidade in vitro foi utilizado o
documento M27-A3 preconizado pelo CLSI para as leveduras e protocolo M38-A2,
para fungos filamentosos, ambos adaptados para uso de fitoterápicos. O teste de
viabilidade celular em MDBK e CLAE para identificação dos compostos. De acordo
com o teste de suscetibilidade in vitro de duas cepas padrões de C. albicans (ATCC
14053 e IOC 3691) foram sensíveis a partir da concentração de 50 mg/mL dos extratos
de bagaço em DEC 10’, com baixa toxicidade em MDBK, obtendo-se 15 a 50% de
viabilidade a partir de 25 mg/mL e a CLAE revelou presença de oleuropeína e
hidroxitirosol principalmente nos extratos coratina, kororneiki e picual, principais
variedades que inibiram as cepas de Candida spp. Para os testes com Sporothrix e
dermatófitos, não demostrou eficiência frente aos patógenos testados. Nas condições
experimentais, permitiu concluir que os extratos não apresentaram atividade
antimicrobiana esperada, entretanto duas cepas de Candida spp. foram sensíveis. Os
extratos aquosos das sete variedades de azeitona, não foram citotóxicos e algumas
variedades revelaram presença de oleuropeína, porém a quantidade não foi capaz de
realizar a inibição de mais isolados.

Palavras-chaves: Fungos, Teste de suscetibilidade, Antifúngico, Olea euroapaea.

 21

Introdução

Pertencente à família das Oleaceae, a Olea europaea é a única dentre a família a

produzir fruto comestível, a azeitona, a qual utiliza-se para realização da extração do

azeite. No momento atual, o plantio das oliveiras dá-se em regiões que possuem verões

quentes e seco, forte insolação e com presença de precipitações moderadas e invernos

amenos. Podendo ser plantada e cultivada em regiões de clima temperado ou

subtropical, caracterizados por verões de perfil citados anteriormente e também com

baixas temperaturas no inverno, facilitando sua floração. É considerado um dos cultivos

mais antigos e no Brasil sua produção tem destaque nas regiões Sul e Sudeste [1]. O

fator climático no sul do Brasil agrega positivamente para o cultivo das oliveiras, onde a

variação de temperatura anual fica na média de 17ºC e 24ºC, tornando atrativo e viável

seu plantio, posto que a temperatura ideal para o crescimento e frutificação da oliveira

está entre 10ºC e 30ºC [2] [3].

Com aproximadamente 98% da composição do azeite estão os ácidos graxos [4],

dentre eles os ácido oleico, importante auxiliar na redução de doenças da artéria

coronária [5] [6]. Além de ácidos graxos, carotenoides e tocoferóis também estão

presentes na composição [7] [8], assim como os fenóis que podem ser divididos em

fenóis simples, secoiridoides e lignanas, responsáveis por inúmeros benefícios à saúde

[9]. Os compostos fenólicos, principalmente a oleuropeína e hidroxitirosol, entre outros

elementos químicos são conhecidos pela sua ação antimicrobiana [10] [11] [12], anti-

inflamatória [13] [14], antinociceptiva [13], anticarcinogênica [15], antioxidante [16] e

crioprotetora [17]. Seus extratos são reconhecidos por apresentarem atividade

antifúngica frente a agentes patogênicos e por dar suporte às recuperações realizando

cicatrizaçãode tecidos lesionados [11] [18].

 22

As enfermidades fúngicas apresentam-se cada vez mais frequente na clinica de

pequenos animais, principalmente pela resistência aos antimicrobianos usuais e devido à

enfermidade que causam imunossupressão nos pacientes [19] [20]. Entre estas,

destacam-se as dermatofitoses, a esporotricose e a candidose, a primeira micose

caracteriza-se por uma doença oportunista causada por um grupo de fungos pertencentes

aos gêneros Epidermophyton, Microsporum e Trichophyton [21]. Na clinica de

pequenos animais, os principais causadores desta infecção são M. canis e M. gypseum

[22]. O tratamento das dermatofitoses normalmente é demorado, sendo muitas vezes

necessário combinações de fármacos com diversos mecanismos de ação até obter-se a

cura total [23], considerando relatos de casos de resistência aos fármacos de eleição para

o tratamento [24]. Além de casos que apresentam resistência a antifungicos e são

recorrentes, deve-se considerar também sua toxicidade exacerbada, que resulta em

efeitos colaterais não desejados [25].

A esporotricose é considerada uma zoonose endêmica no Brasil e de alta

prevalência em felinos e humanos, caracterizando assim, um problema de saúde pública

no país [26]. A resistência aos fármacos de eleição para o tratamento é resultante de

falhas terapêuticas no processo de recuperação dos animais e posterior reaparecimento

de lesões ulcerativas que tendem a evoluir e espalhar-se através de vasos linfáticos. O

habito dos felinos de enterrar fezes, arranhar cascas de árvores, disputar por território

associado aos fatores farmacológicos citados anteriormente faz com que ocorra elevado

número de casos desta micose [20] [27] [28]. Já os fungos do gênero Candida

contemplam centenas de espécies, sendo a Candida albicans a de maior importância

devido a frequênte ocorrência tanto em humanos quanto animais. É um agente de

caráter oportunista e está presente como comensal nas mucosas de cerca de 50% da
 23

população de indivíduos sadios. Normalmente a causa da doença está associada a um

desequilíbrio entre os micro-organismos presentes nas mucosas comumente causado por

uso de antibióticos por períodos prolongados, deficiência imunológica do hospedeiro,

uso exacerbado de corticoides ou imunodeficiências decorrentes de doenças crônicas.

Diversos fármacos antifúngicos são indicados no tratamento da candidose, sendo os

principais os derivados azólicos como o fluconazol e itraconazol, de baixo efeito tóxico

e amplo espectro de ação. Também são utilizados os polienos, fluoropirimidinas e para

cepas com resistência ao farmacos anteriores são utilizadas as equinocandinas. Apesar

de deter mais de uma possibilidade de fármacos, ainda sim, o número de antifúngicos é

irrisório quando comparado com a quantidade de antibacterianos disponíveis no

mercado. Além da pouca disponibilidade dos fármacos temos os mecanismos de defesa

fúngica que manifestam-se de diferentes formas, como desvios metabólicos,

superexpressão ou alteração de alvos farmacológicos ou diminuição da concentração do

fármaco [29] [30] [31] [32]. Tendo em vista sanar os problemas de resistência aos

fármacos, altos custos dos medicamentos e redução de efeitos colaterais, o

conhecimento de plantas medicinais como fontes terapêuticas para tratamentos de

micoses apresenta-se uma alternativa farmacológica, onde estudos que usam parte de

plantas já foram realizados, comprovando a eficácia da utilização de fitoterápicos como

fungicidas e/ou fungistáticos [33] [34] [35] [36].

A partir dessa perspectiva, o objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil

sensibilidade in vitro de isolados de Sporothrix spp., de Microsporum spp. e de isolados

e cepas padrões de Candida spp. frente extratos aquosos de bagaço de Olea europeae L.

Assim como testar a toxicidade celular dos extratos utilizados e determinar presença e

quantidade dos principais compostos fenólicos.

 24

Material e Métodos

Isolados Fúngicos

No estudo foram utilizados isolados e cepas padrões de diferentes de Candida,

dentre elas encontram-se as espécies albicans, glabrata e tropicalis totalizando 15

isolados cedidos da micoteca pelo Centro de Diagnóstico e Pesquisa em Micologia

Veterinária (MicVet) da Universidade Federal de Pelotas, provenientes de isolamentos

obtidos de casos clínicos de cães e gatos. Os isolados foram identificados macro e

micromorfologicamente e com auxílio de Vitek MS (bioMérieux) e analisados no Vitek

MS IVD system® (bioMérieux; Marcy l’Etoile, France). O estoque foi recuperado e

mantido sob refrigeração entre 4 a 8ºC durante seu uso em experimento. Anteriormente

a todos os testes as culturas foram repicadas para ágar sabouraud dextrose acrescido de

cloranfenicol e incubadas a 37ºC por 48h, para comprovar pureza e viabilidade das

colônias. Assim como, utilizados 18 dermatófitos, das espécies M. canis e M. gypseum e

30 isolados de Sporothix spp, dentre os isolados a espécie S. brasiliensis, todos

provenientes de casos clínicos de cães e gatos, também recuperados da micoteca do

MicVet. Recuperados e mantidos a temperatura ambiente (25ºC).

Extratos Aquosos
O estudo foi realizado a partir de 14 extratos aquosos derivados de bagaço, os

quais foram divididos em decocção realizada por dez minutos (DEC 10’) e infusão por

dez minutos (INF 10’), a partir de sete diferentes variedades de oliveiras, sendo elas:

arbosana, arbequina, coratina, koroneiki, frontoio, manzanilla e picual. Todos extratos

armazenados em frasco âmbar e refrigerados em geladeira.

 25

Teste de Microdiluição em Caldo

O teste suscetibilidade in vitro foi realizado conforme as recomendações

propostas pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) através do protocolo

M27-A3 para fungos leveduriforme e seguindo protocolo M38-A2, para fungos

filamentosos, adaptados para uso de fitoterápicos [37] [38] [39]. Antecedendo o teste,

como preconiza o CLSI, foram realizados os inóculos a partir dos fungos a serem

testados. Os testes foram realizados em triplicata, em microplacas de 96 poços de fundo

chato, onde se estipulou controle positivo a coluna A e controle negativo coluna H. Nos

outros poços (de B a G), foram acrescidos 100μL do produto a ser testado e realizada

cinco diluições seriadas permitindo a avaliação das concentrações de 50mg/mL a 1,56

mg/mL, posteriormente foi acrescentado 100 μL do inóculo diluído em sabouraud

líquido e solução salina para isolados de dermatófitos, para os do Complexo Sporothrix

e isolados/cepas de Candida spp. foram diluídos em meio RPMI-1640 acrescido de

tampão 3-N-ácido morfolinopropanosulfónico (MOPS) e solução salina. Posteriormente

incubadas por 48 horas em estufa shaker, com agitação constante e à temperatura de

35ºC até a realização da leitura da Concentração Inibitória Mínima (CIM), que é

marcado pela menor concentração capaz de inibir o crescimento fúngico, visualmente.

Em seguida foi realizada a leitura da Concentração Fungicida Mínima (CFM), através

da semeadura de 10 µl de cada poço em placas de Petri adicionadas de ágar sabouraud

dextrose acrescido de cloranfenicol. As placas foram incubadas a temperatura de 35ºC,

para realização da Concentração Inibitória Mínima (CIM).

Teste de Citotoxicidade

A partir de células MDBK (bovine kidney cells), cultivadas em RPMI-1640

acrescida de L-glutamina, sem bicarbonato de sódio (pH 7,2) suplementado de

 26

penicilina-estreptomicina e fungizona (PSF) em atmosfera controlada com 5% de CO2,

úmida e a 37ºC, o efeito citotóxico foi estabelecido a partir do ensaio MTT (3-(4,5-

dimetiltiazol-2-il)-2-5difeniltetrazólico). Adição de tripsina nas células monocamada,

suspensas em RPMI-1640, resultando em suspensão com cerca de 2x105 células ml-1.

Alíquotas da suspensão celular foram transferidas para poços de microplacas de 96

poços e essas células incubadas juntamente com meio RPMI-1640 acrescido de soro

fetal bovino e a 5% de CO2 por 24 horas na temperatura de 37ºC. Posteriormente, 100

µl de cada extrato com suas sucessivas diluições foi acondicionado às microplacas nas

concentrações de 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,12, 1,56, 0,78 mg/mL sendo essas testadas

em triplicata durante 48 hora com atmosfera controlada de 5% de CO2, úmida e a 37ºC.

Sequencialmente, adicionou-se 50 µl da solução MTT a 2,5 mg mL-1 nos poços,

incubados a 37ºC por duas horas em atmosfera controlada. Em seguida, a solução MTT

foi retirada e 50 µl de DMSO (dimetilsufóxido) acrescentado, para desfazer os cristais

de formazan, e agitados suavemente por 5 minutos. O monitoramento das células foi

realizado a partir de um microscópio invertido, e os resultados expressos em

porcentagem de inibição de acordo com as células controle, esta sendo considerada

100%.

Cromatografia Liquida de Alta Eficiência

Os materiais usados para realização da análise foram o ácido fórmico Sigma-

Aldrich (St. Louis, MO, EUA) e acetonitrila de JT Baker (Phillipsburg, NJ, USA). A

água ultrapura foi obtida utilizando o sistema de purificação MegaPurity. As análises

por LC-QTOF MS foram realizadas em um cromatógrafo líquido (UFLC, Shimadzu,

Japão) acoplado a espectrômetro de massas de alta resolução do tipo quadrupolo-tempo

de voo (Maxis Impact, Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha). A separação

 27

cromatográfica foi realizada utilizando uma coluna Bidentate C18 (100 x 2.1 mm,

MicroSolv Technology Corporation, Eatontown, NJ, EUA) empregando como fase A

água com 0,1% de ácido fórmico (v/v) e como fase B acetonitrila com 0,1% de ácido

fórmico (v/v) e o seguinte programa de gradiente: 5% B (0,0 min), 0-90% B em 0.01-15

min, 90% em 15-18 min e 90-5% B em 18,01-20 min. Depois de cada injeção a coluna

foi re-equilibrada por 6 minutos utilizando a composição do solvente inicial. Para todas

as análises foi injetado 10 µL de extrato previamente filtrado em membrana de nylon de

0,2µm, empregado um fluxo constante de 0,2 mL min-1 e a temperatura da coluna foi

mantida a 40ºC. O espectrômetro de massas foi operado no modo ESI negativo

utilizando os seguintes parâmetros: voltagem do capilar, +4000V; pressão do gás de

nebulização (N2), 2 bar; fluxo do gás de secagem, 8 L min-1, temperatura da fonte,

180°C; colisão de RF,150 Vpp; transfer, 70 mS e armazenamento pré-pulso de 5 mS. Os

espectros de massas foram adquiridos em um rango de 50 a 1200 m/z a 4 espectros/s

para ambos modos de ionização. As análises MS/MS foram obtidas por fragmentação

automática empregando os seguintes valores de energia de colisão: m/z 100, 15 eV; m/z

500, 35 eV; m/z 1000, 50 eV e usando N2 como gás de colisão. A calibração externa foi

realizada utilizando Formiato de sódio 10Mm como calibrante, cobrindo toda a faixa de

aquisição de 50-1200 m/z. A concentraçao de hidroxitirosol e oleuropeina foi

determinada de forma semi-quantitativa com base no sinal analitico do padrão interno

(reserpina) adicionado a cada amostra (concentração final 4 μg mL−1). Os íons

monitorizados foram: hidroxitirosol ([M- H] - m /z 153,0546) e oleuropeína ([M - H] -

m/z 539,1759).

Resultados

Compostos presentes nos frutos de azeitona possuem ação antimicrobiana tanto

 28

de forma sinérgica ou isolada [40] [41], contudo, no presente estudo não foi observado

atividade antifúngica desses extratos aquosos diante dos isolados de dermatófitos e de

Sporothrix spp. E dos 15 isolados testados para susceptibilidade in vitro, dois isolados

de Candida foram sensíveis ao extrato de decocção do bagaço de Olea europaea. As

Candidas que apresentaram sensibilidade pertenciam à espécie albicans, sendo uma

American Type Culture Collection 14053 (ATCC) e a outra do Instituto Oswaldo Cruz

3691 (IOC), apresentaram susceptibilidade a partir da concentração de 50mg/mL de

DEC 10’ do extrato de bagaço de oliveira. Já para o extrato em INF 10’ não obteve

resultado inibitório de nenhum isolado testado. A inibição da ATCC 14053 diante da

DEC 10’ ocorreu nas sete variedades testadas, já na IOC 3691 não foi eficiente nas

variedades arbosana e frontoio, conforme Tabela 1.

Extrato DEC10’ Olea C. albicans (ATCC C. albicans (IOC

europaea 14053) 3691)

Arbequina 25 mg/mL 25 mg/mL

Arbosana 25 mg/mL SI
Coratina 25 mg/mL 3,12 mg/mL
Frontoio 50 mg/mL SI
Koroneiki 25 mg/mL 3,12 mg/mL
Manzanilla 50 mg/mL 25 mg/mL
Picual 25 mg/mL 3,12 mg/mL
SI – Sem inibição

Tabela 1: Concentração Inibitória Mínima (CIM) apresentada no teste In vitro do extrato de

decocção 10’ frente a fungos do gênero Candida spp.

O extrato DEC 10’ também apresentou ação antifúngica in vitro frente ao

isolados testados, exceto para as variedades arbosana e frontoio tentadas frente a C.

 29

albicans IOC 3691, conforme ilustrado na tabela 2.

Extrato DEC10’ Olea C. albicans (ATCC C. albicans (IOC

europaea 14053) 3691)

Arbequina 50 mg/mL 50 mg/mL

Arbosana 25 mg/mL SI
Coratina 50 mg/mL 25 mg/mL
Frontoio 50 mg/mL SI
Koroneiki 25 mg/mL 12,5 mg/mL
Manzanilla 50 mg/mL 50 mg/mL
Picual 25 mg/mL 12,5 mg/mL
SI – Sem inibição

Tabela 2: Concentração Fungicida Mínima (CFM) apresentada no teste In vitro do extrato de

decocção 10’ frente a fungos do gênero Candida spp.

A viabilidade celular dos extratos variou de 15 a 50% apresentando resultados

satisfatórios, pois preservaram, nas concentrações testadas, a viabilidade das células

MDBK nos extratos a partir da concentração de 50mg/mL (Figura 1 e 2).

 30

Citotoxicidade Celular
80,0%

70,0%

60,0%
Viabilidade Celular (%)

50,0%
Arbosana
40,0%
Arbequina
30,0% Coratina

20,0% Frontoio

10,0%

0,0%
100 50 25 12,5 6,25 3,125 1,562 0,781
Concentração (mg/mL)

Figura 1: Viabilidade celular frente a extratos de Arbosana, Arbequina, Coratina e Frontoio em

DEC 10’.

Citotoxicidade Celular
80,0%

70,0%

60,0%
Viabilidade Celular (%)

50,0%

40,0% Koroneiki
Picual
30,0%
Manzanilla
20,0%

10,0%

0,0%
100 50 25 12,5 6,25 3,125 1,562 0,781
Concentração (mg/mL)

Figura 2: Viabilidade celular frente extratos de Koroneiki, Picual e Manzanilla em DEC 10’.
 31

Os compostos químicos explorados através da CLAE foram oleuropeína e

hidroxitirosol, que de acordo com a literatura são os compostos fenólicos que possuem

ação antimicrobiana. Hidroxitirosol foi encontrado em diferentes concentrações no

extrato, variando de 0,008 a 0,034 mg/mL nos extratos de INF 10’ e de 0,011 a 0,081

mg/mL em extratos de DEC 10’. porém no extrato de INF 10’ a oleuropeína foi

detectada em baixa concentração variando de 0,001 a 0,008 mg/mL, porém ausente nas

variedades arbosana, arbequina, frontoio e manzanilla, enquanto que o extrato DEC 10’

apresentou oleuropeína nas sete variedade, as concentrações variaram de 0,007 a 0,087

mg/mL, sendo as mais altas observadas nas variedades coratina, koroneiki e picual

(Figura 3).

CLAE
0,100
0,090
Concentração (mg/mL)

0,080
0,070
0,060 Hidroxitirosol no extrato
0,050 (mg/mL)
0,040 Oleuropeina no extrato
0,030 (mg/mL)
0,020
0,010
0,000

DEC 10'

Figura 3: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) de extratos de bagaço decocção 10’.

Discussão

Diversos extratos de oliveira já foram testados frente a bactérias e fungos,

 32

obtendo resultados promissores como extratos aquosos de folha de oliveira frente

isolados clínicos de bactérias e fungos filamentosos [42], sinergismo de compostos

fenólicos da folha frente a bactérias [43][44], aldeídos alifáticos frente a isolados e

padrões de bactérias [45] [18], nanoparticulas de prata biossintetizadas a partir de

extrato aquoso de oliveira frente bactérias [46], extratos comerciais de folhas de oliveira

frente a bactérias e fungos leveduriforme [47]. Outros autores testaram isoladamente a

atividade de compostos específicos presentes em diversas partes da oliveira, testando a

oleiropeina notaram atividade inibitórias frente a Mycoplasma pneumoniae, M. pirum,

M. hominis e M. fermentans encontrando valores de CIM respectivamente de 0,36, 0,32,

0,02 e 0,02 μg/mL [48]. Estudos utilizando extrato bruto de polifenóis e com

hidroxitirosol isolado apresentaram atividade, porém em baixa escala diante de Listeria

monocytogenes [49].

Estudos avaliando eficiência de extratos de folha de oliveira diante de Candida

albicans, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia,

Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa e

Proteus mirabilis, observaram atividade antimicrobiana em todos os isolados, de

maneira que os extratos evitaram o crescimento na menor concentração utilizada no

teste [50].

Segundo Zoric et al. (2013) [11], em seu estudo corroboraram com um estudo

realizado por Battinelli et al. (2006) [18], testando aldeídos alifáticos, extraídos da

azeitona, sobre isolados de Trichophyton mentagrophytes, Candida spp., Microsporum

canis, verificando eficiente ação antifúngica nos dermatófitos testados, porém, não

apresentando boa atividade frente isolados de Candida spp., assim como foi verificado

nos extratos aquosos de INF 10’ para isolados de Sporothrix spp., dermatófitos e
 33

Candida spp. do presente estudo. Divergindo do que foi obtido nesse estudo para

extratos, autores têm apresentado dados de que a oliveira e seus extratos têm ação

antimicrobiana frente a fungos patogênico e que pode evoluir para avaliação in vivo e

posteriormente ser utilizado na terapêutica de doenças fúngicas seja isolado ou em

associação a fármacos presentes no mercado, entretanto, apenas após a elucidação do

mecanismo de ação dos seus compostos bioativos [51].

Ao contrário do extrato de INF 10’, o extrato de DEC10’ de bagaço de oliveira,

partir desse estudo, observou atividade antimicrobiana demonstrando-se eficiente frente

a dois isolados padrões de Candida albicans, esse resultado em comparação aos

resultados obtidos por Sudjana et al. (2009) [47], que apesar de ter utilizado isolados de

Candidas de outras espécies além da albicans, essas foram as mais susceptíveis. Porém,

possivelmente nossos resultados não foram tão próximos e não inibiram mais isolados,

porque no estudo em questão foram utilizados outros tipos de extratos, do óleo de folhas

de oliveira, enquanto que o nosso foi realizado a partir de extratos aquosos do bagaço.

Estudos que confirmam a prerrogativa de que os compostos fenólicos

presumivelmente são os que possuem boa atividade frente a fungos do gênero Candida

Batinelli et al. (2006) [19], não obteve ação inibitória, nem antifúngica em sete isolados

de Candida, sendo o composto testado os aldeídos alifáticos do fruto de Olea europaea,

esses compostos de diferenciam pela composição química, onde os alifáticos não

apresentam anel de benzeno e os fenólicos que apresentam a estrutura hidroxila ligada a

um anel aromático.

No estudo os extratos apresentaram baixa atividade frente ao gênero Candida,

onde treze dos quinze isolados não foram inibidos pelo extrato aquoso DEC 10’,

enquanto no extrato aquoso INF 10’ nenhum dos isolados foi inibido, isso deu-se
 34

provavelmente, segundo Korukluoglu et al. (2006) [33], pela forma de obtenção dos

referidos extratos que devido a altas temperaturas para sua obtenção a fração não polar

desses compostos evaporam e por fim não apresentam atividade esperada. Entretanto,

esse mesmo autor afirma a partir de diversas extrações com outros solventes como

álcool, cetona e acetato de etila demonstraram atividade inibitória e antifúngica. O

presente estudo mostrou que apesar de os extratos serem expostos ao calor, ainda sim

alguns seguiram apresentado compostos fenólicos, em baixas quantidades. Os isolados

que apresentaram sensibilidade podem diferenciar-se dos outros em diversos aspectos

como grau de patogenicidade, que explica porque ser efetivo em certos isolados e não

efetivo em outros. A quantidade dos compostos fenólicos encontrados parece interferir

na atividade antimicrobiana, onde os extratos de DEC 10’ que possuíam maior

quantidade de oleuropeína, variando de 0,087 a 0,007 mg/mL, foram os extratos que

melhor inibiram os isolados e que também apresentam ação antifúngica. Já os

compostos que obtiveram concentração de oleuropeína menor que 0,002 mg/mL não

apresentaram atividade.

Considerar o tipo de extrato é importante, pois os mesmos podem variar na

constituição e quantidade de composto presente, dependente do tipo de extração

utilizada entre outros fatores de acordo com características da planta, solo, umidade,

colheita, e época do ano. É importante salientar que, de acordo com o tipo de extrato, as

concentrações dos seus constituintes podem variar e essas diferenças de quantidade e

tipo de composto explica o por quê de alguns autores verificarem atividade

antimicrobiana do produto enquanto outros não [5]. Segundo Korukluoglu et al. (2006)

[33] a obtenção dos extratos aquosos do bagaço que são submetido a altas temperaturas

para sua obtenção interferiria na fração apolar desses compostos, evaporando e por fim
 35

não apresentando a atividade esperada. Esse mesmo autor afirma que a obtenção a partir

de diversas extrações com outros solventes como álcool, cetona e acetato de etila

demonstraram atividade inibitória e antifúngica. Mesmo após essas considerações, o

presente estudo mostrou que apesar de os extratos serem expostos ao calor, ainda sim

alguns apresentaram compostos fenólicos em baixas quantidades, que pode estar

relacionado com a não inibição nos testes in vitro apresentados.

Um estudo que abordou a capacidade de extratos de oliveira atuarem na proteção

celular em estresse oxidativo, após identificar grande variação na eficácia dos produtos

relacionado a composição e concentração de derivados presente nos extratos. Indicando

que a variação da eficacia pode dar-se de acodo com o tipo de extrato utilizado e o tipo

de extração realizada, asim como seus compostos majoritários [52]. Assim, pressupõe-

se que, entre outros fatores, os extratos de bagaço de O. europaea testados não

apresentaram atividade antifúngica por já terem passado por diversos processos de

extração, obtendo assim menor teor de compostos bioativos [53] [54] devido a esses

processamentos realizados no produto inicial e também a baixa concentração utilizada

nos testes.

Segundo a literatura consultada não foram encontradas referências sobre a

utilização de extratos aquosos a partir do bagaço (matéria resultante do processamento

da indústria do azeite), portanto é um estudo pioneiro, pois é o primeiro a utilizar esse

tipo de substrato da olivicultura para realização dos testes de sensibilidade in vitro e

também em testes de citotoxicidade celular.

 36

Conclusão

O estudo demonstra que o extrato de DEC 10’ foi efetivo frente a dois isolados

padrões de C. albicans, a partir de concentrações de 50mg/mL, apesar de não possuir

valor estatístico, pode-se aprimorar as quantidades utilizadas, visto que na comparação

de extratos os efetivos foram o que obtiveram maiores concentrações de oleuropeína,

conforme demonstra a CLAE. O trabalho também verificou que os extratos aquosos de

bagaço a 10 minutos de O. europaea não foram eficientes para eliminar e/ou inibir o

crescimento fúngico, quando se trata de isolados de dermatófitos e isolados de

Sporothrix spp. A viabilidade celular variou de 15 a 50% em extratos de DEC 10’ com

concentrações a partir de 25mg/mL, que foi efetivo frente a duas cepas. Os extratos de

INF 10’ não inibiram frente as cepas em nenhuma das concentrações testadas (de 50 a

0,078 mg/mL) apesar de apesentaram oleuropeina e hidroxitirosol, exceto nas

variedades arbequina, arbosana, frontoio e manzanilla em que não revelou presença de

oleuropeina. Nos extratos de DEC 10’ obteve-se concentrações de 0,007 a 0,087

mg/mL, O hidroxitirosol variou em 0,008 a 0,034 mg/mL nos extratos de INF 10’ e de

0,011 a 0,081 mg/mL em extratos de DEC 10’, concentrações que não obtiveram

resultados satisfatório frente a ação antimicrobiana nos isolados testados, A partir de

mais estudos e através da calibração das concentrações os extratos aquosos de bagaço

podem ser promissores e auxiliar em terapias antifúngicas, não só pela sua atividade

antimicrobiana, mas também outras atividades benéficas dos extratos como a baixa

citotoxicidade celular.
 37

Agradecimentos
Os autores agradecem a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível

Superior (CAPES), ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico (CNPq), e a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do

Sul (FAPERGS) pelo auxílio financeiro. Assim como à Universidade Federal do Rio

Grande do Sul pelo apoio através do Departamento de Farmacologia.

Conflito de interesse: Não há conflito de interesses.

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5. CONCLUSÃO GERAL
Os resultados obtidos permitem as seguintes conclusões:
 O extrato aquoso obtido por decocção durante dez minutos (DEC 10’)
foi efetivo frente a duas cepas padrões de Candida albicans e não
mostrou efetividade frente a isolados clínicos de fungos do gênero
Candida spp., dermatófitos e Sporothrix spp.
 Os extratos aquosos obtidos por infusão e decocção por dez minutos
(INF 10’ e DEC 10’) do bagaço de azeitona foram de baixa
citotoxicidade a partir da concentração de 50 mg/mL onde
apresentaram de 15 a 50% de viabilidade celular.
 Os extratos aquosos de DEC 10’ revelaram moderadas concentrações
de oleuropeina e hidroxitirosol nas variedades testadas.
 Os extratos aquosos de INF 10’ não revelaram presença de oleuropeína
nas variedades arbequina, arbosana, frontoio e manzanilla, e baixas
concentrações de hidroxitirosol em todas as variedades testadas.

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
A cadeia produtiva da olivicultura no Rio Grande do Sul está organizada e conta
com a Câmara Setorial e o fundo de desenvolvimento e hoje no estado contamos com
160 produtores que cultivam aproximadamente 4.800 hectares, extraem 50 mil litros de
azeite, processado em doze indústrias que comercializam 26 diferentes marcas
(Ibraoliva, 2019).
De acordo com os dados da IOC (International Olive Oil Council) o Brasil é o sexto
maior consumidor e terceiro maior importador de azeite e está tornando-se um produtor
em franca ascensão e com a perspectiva de chegar a um milhão de hectares de oliva nos
próximos anos, com destaque de produção na região sul do Rio Grande do Sul.
Considerando a quantidade de resíduo produzido (bagaço e folha) pela indústria
 43

processadora, surge a perspectiva de buscar nesses subprodutos um legado de insumos a

agroindústria através da busca de compostos que possam agregar valor através da
obtenção de extratos e óleos essenciais com atividades antimicrobianas. Na primeira
fase da proposta foi trabalhado apenas o azeite e extrato aquoso com resultados
discretos, uma vez que não trabalhou-se a parte foliar da oliveira, proposta para segunda
fase, onde espera-se obter compostos com resultados promissores.
 44

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ANEXOS
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ANEXOS I – Resumo expandido publicado na terceira semana integrada da

Universidade Federal de Pelotas 2017, categoria XIX Encontro de Pós-Graduação.
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