Mecanismos de Funcionamento Da Expressão Gênica em Procariotos de Interesse Na Biotecnologia
Mecanismos de Funcionamento Da Expressão Gênica em Procariotos de Interesse Na Biotecnologia
Mecanismos de Funcionamento Da Expressão Gênica em Procariotos de Interesse Na Biotecnologia
MECANISMOS DE FUNCIONAMENTO
DA EXPRESSÃO GÊNICA EM PROCARIOTOS DE
INTERESSE NA BIOTECNOLOGIA
Brasília - 2003
Centro Universitário de Brasília
Faculdade de Ciências da Saúde
Licenciatura em Ciências Biológicas
MECANISMOS DE FUNCIONAMENTO DA
EXPRESSÃO GÊNICA EM PROCARIOTOS DE
INTERESSE NA BIOTECNOLOGIA
Brasília - 2003
Dedico esse trabalho exclusivamente a Deus,
o verdadeiro autor da vida e da diferenciação celular.
Pelo seu amor, cuidado e proteção para com
a minha pessoa, me ensinou a amar e receber amor.
Não tenho palavras para agradecer Sua bondade.
AGRADECIMENTOS
O meu agradecimento especial a minha mãe pelo apoio e paciência dedicados a mim
ao longo deste curso. O meu empenho em tentar recompensa-la é inevitável.
Agradeço a minha grande família, e principalmente aos meus avós que mesmo
indiretamente me proporcionaram alegria e esforço para concluir um sonho. Em especial as
importantes orações da minha prima Adriana, que foram fundamentais para que obtivesse
uma nova chance para vencer.
A toda minha liderança espiritual, Bispos Robson e Lúcia Rodovalho, Pastores
Geraldo e Denise Alcântara, Lúcia Helena Damasceno e Roberta Campos pelo incentivo
para me tornar uma líder.
Ao bom humor e orientação do Prof. Dr. Paulo Roberto Queiroz pelo atendimento
dado e pela nova visão da Biologia Molecular.
As colegas de curso Andréia e Denise, pelo empréstimo de livros necessários para
realização desse trabalho.
A professora Tânia Andrade pela importante colaboração com o empréstimo de
livro e da tese de doutorado da professora Maria Beatriz Nunes, material fundamental para
obtenção de dados desse trabalho.
Aos professores Marcelo Ximenes, Cláudio Cerri e Adrienne Fernandes por terem
despertado o valioso interesse pelo curso de Biologia.
RESUMO
Introdução............................................................................................................................1
1. Dogma Central da Biologia Molecular............................................................................3
1.1. Transcrição ...................................................................................................................3
1.2. A regulação Ocorre Majoritariamente na Transcrição .................................................5
1.3. Tradução .......................................................................................................................6
2. Regulação Gênica ............................................................................................................7
2.1. Mecanismos Regulatórios ............................................................................................8
Operon da Lactose .........................................................................................................9
Operon Triptofano .........................................................................................................10
Operon Arabinose..........................................................................................................10
Operon Histidina ...........................................................................................................11
2.1.2. Regulação na Tradução .............................................................................................12
2.2. Transdução de Sinais....................................................................................................12
3. Biotecnologia...................................................................................................................13
3.1. Transgenia ....................................................................................................................14
3.2. Vetores..........................................................................................................................15
4. Aplicações e Importância da Utilização de Genes Expressos em Bactérias ...................16
4.1. Insulina Humana...........................................................................................................17
4.2. Antígenos......................................................................................................................18
4.3. Outras pesquisas ...........................................................................................................19
Conclusão ............................................................................................................................20
Referências Bibliográficas...................................................................................................21
INTRODUÇÃO
1.1. Transcrição:
O RNA é a molécula intermediária que será traduzida em uma proteína. O processo
de transcrição resulta na produção de uma molécula de RNA mensageiro (mRNA), a partir
da cópia de uma seqüência de nucleotídeos de uma das fitas do duplex de DNA, chamada
fita molde. A fita molde de DNA gera apenas uma fita de RNA sendo, que neste a tinina é
substituída pela uracila. Os RNAs podem ser classificados em funcionais, de informação e
estruturais, todos são produtos da transcrição.
Existem algumas diferenças na síntese e na estrutura dos mRNA de procariotos e de
eucariotos, mesmo ambos exercendo as mesmas funções. Os processos de transcrição e de
tradução procarióticos ocorrem simultaneamente na mesma região da célula. Os ribossomos
ligam-se ao mRNA antes da transcrição ser completada. Já nos eucariotos, a síntese e
maturação do mRNA ocorrem no núcleo, e as informações são transportadas ao citoplasma,
para ser transcrita em proteína (LEWIN 2001). O mRNA dos procariotos praticamente não
sofre modificações, devido ao fato de não apresentarem íntrons (regiões não codantes). No
entanto, ocorrem interrupções ao longo da leitura no DNA que origina o mRNA, pois
diferentes segmentos em tamanho são produzidos. Existem cerca de 4.000 tipos de mRNA
diferentes que vão dar origem a proteínas (AZEVEDO 1998).
A transcrição inicia-se quando a enzima RNA polimerase encontra o promotor, para
iniciar a síntese do mRNA. Promotores são seqüências específicas no DNA que fazem parte
da região reguladora presente numa região adjacente ao gene. Essa informação é
extremamente importante para se compreender os mecanismos de expressão gênica em
procariotos (GRIFFTHIS et al 2001). Além do promotor, muitos dos genes bacterianos
contêm seqüências regulatórias de DNA que são necessárias para ligar e desligar o gene. O
contato da enzima com o promotor resulta na abertura ou separação da dupla hélice
deixando as bases de uma das fitas para que para haja síntese do RNA. A leitura da fita de
DNA ocorre sempre no sentido 3’-5’. Estudos mostram que as bactérias possuem
seqüências comuns de bases de região promotora para uma série de genes, as seqüências de
consenso. As duas seqüências antes do primeiro nucleotídeo a ser lido, região conhecida
como TATA Box, cujas bases são TATAAT e está localizada à 10 pb do início da
transcrição, e a região 35 pb com seqüência TTGACA (CAMPBELL 2001).
Em procariotos, a RNA polimerase move-se ao longo da fita molde numa
velocidade de aproximadamente 40 pb/s a 37 ºC sobre um gene promovendo a sua leitura
até que encontre uma seqüência do terminador. A iniciação da leitura do DNA requer a
abertura de uma bolha no segmento a ser transcrito, a fita é formada pelo pareamento
complementar de bases sintetizadas em outro lugar na célula que vão se alinhando
respectivamente: Adenina com Uracila, Timina com Adenina, Citosina com Guanina e
Guanina com Citosina (STRYER 1996, ALBERTS et al 1997). Esse caminho que se
estende do promotor até o terminador formado de um produto direto transcrito, define uma
unidade transcricional primária, que em procariotos é rapidamente degradada ou clivada
para formar os outros RNAs. Uma unidade transcricional pode conter um ou mais genes
(LEWIN 2001).
Enfim, quando a enzima encontra a seqüência terminadora, ela para de adicionar os
ribonucletídeos complementares à cadeia de mRNA sintetizado, liberando o produto
completo e desprendendo-se do molde de DNA. Contudo, para que haja interrupção na
transcrição, o processo de terminação, tem que haver o reconhecimento de sinais no
transcrito pela RNA polimerase ou por fatores auxiliares (LEWIN 2001). As pontes de
hidrogênio que mantinham a fita molde de DNA ligada à fita transcrita de RNA são
quebradas e a fita mensageira é liberada.
2. Regulação Gênica
Os organismos têm a capacidade de selecionar seus genes, para expressar suas
características fenotípicas. Num genoma completo apenas uma pequena parte de suas
proteínas são expressas e os níveis quantitativos são diferentes. Até mesmo os procariotos
com suas reduzidas fontes de informação tem a capacidade de ativar e desativar a expressão
dos seus genes para produzir sua proteína necessária dependendo de suas fontes de
alimento (ALBERTS et al 1999).
Embora os maiores índices regulatórios sejam no nível transcricional, o controle
também poderá ser feito no DNA, no momento da ativação ou inativação do gene a ser
expresso e na tradução do RNA mensageiro. A expressão gênica pode ser controlada num
processo de três estágios: transcrição, alongamento e tradução. Como já dito, o controle da
transcrição dá-se mais freqüentemente na fase inicial podendo também ser controlada na
fase terminal quando se encontra um gene terminador. Em bactérias não ocorre regulação
na fase de processamento de mRNA. Em alguns casos, na tradução a expressão gênica
também pode ser controlada similarmente na transcrição (MADIGAN et al 2000, LEWIN
2001).
As bactérias possuem várias enzimas biossintéticas responsáveis por suas
transformações químicas metabólicas. Essas reações metabólicas podem ser controladas em
resposta ao meio em que vivem, por exemplo, o bloqueio da via metabólica levando a
obtenção do produto final diretamente do meio extracelular. A possibilidade de escolha
entre vários substratos que fornecerão nutrientes como carbono, fósforo, nitrogênio e
enxofre de forma que seja mais proveitosa pela célula de um ponto de vista de rendimento e
de custo energético. Outros mecanismos utilizados pelas bactérias estão relacionados a
reações químicas e físicas. A resistência dessas células a fatores como falta de oxigênio,
lesões genéticas, choque térmico ou osmótico e dessecação, estão relacionadas sistemas de
controle (COSTA 1986).
Operon Triptofano
O triptofano (Trp) é um aminoácido essencial para o homem e deve ser adquirido na
alimentação. O Trp é sintetizado por uma série de reações, e cada etapa requer uma enzima
específica. Quando não houver mais Trp, a síntese dessas enzimas será ativada e
conseqüentemente, a quantidade suficiente de Trp reprime a produção dessas enzimas. O
conjunto de genes que codificam as enzimas necessárias para a síntese do Trp constitui o
operon do Trp (AZEVEDO 1998).
O operon do Trp também é controlado por uma enzima repressora e por um
ponto de terminação interno, o atenuador, e estão localizados entre o promotor e pelo
primeiro gene estrutural do operon. O gene regulador sintetiza a enzima repressora (apo-
repressora), que não vai ligar-se ao operador, isso permite a ligação da RNA polimerase
iniciando a transcrição do aminoácido. Quando o aminoácido está disponível no meio de
cultura sua síntese é reprimida. Nesse caso atua como um co-repressor combinando com o
repressor inativo ligando-se ao operador impedindo a transcrição. O metabólito final
impediu sua própria síntese, até que todo o Trp seja consumido pala célula (ÉTIENNE
2003). Para Stryer (1996), os operons da fenilalanina e da treonina também possuem
atenuadores.
Operon Arabinose
Os genes codificadores das enzimas desse operon são araA, araB e araD. Possui
ainda uma região iniciadora formada por um sítio com dois operadores araO1 e araO2, um
ponto de ligação para CAP e outro regulador araI, um promotor, e uma outra região de
controle araC para síntese de uma proteína C reguladora.
Nesse operon são necessários dois sinais para uma transcrição eficiente, o complexo
AMPc-CAP e a arabinose ligada a proteína C. A proteína C funciona como um regulador
negativo que na ausência da arabinose (monossacarídeo), muda de conformação reprimindo
o operon ara. Outra característica desse operon é que o seu mRNA só é formando quando
os níveis de cAMP-CAP é baixo. Quando a proteína C é abundante e o AMPc-CAP não, a
transcrição do gene que sintetiza a proteína C cessa pois a proteína liga-se ao centro
controlador do operon. A ligação de uma segunda molécula C ao centro controlador
bloqueia a síntese dos genes estruturais que sintetizam as proteínas cinase, isomerase e
epimerase. Isso faz com que se forme uma alça de DNA bloqueadora da RNA polimerase
que vai se ligar a uma região adjacente do promotor (STRYER 1996, GRIFFITHS et al
2001).
A presença de dois fatores reguladores positivos, AMPc-CAP abundante e a
arabinose está ligada a proteína C, torna a RNA polimerase capaz de se ligar ao promotor
para os genes e transcrevê-los. Logo, o mRNA para a proteína c não é formado.
Assim, no operon da arabinose ocorre um controle duplo onde a proteína regula sua
própria síntese reprimindo a transcrição Numa outra situação a ligação de uma molécula
alostérica a uma proteína pode mudar sua conformação de inibidora para ativadora da
transcrição. As alterações induzidas por moléculas alostéricas são reversíveis, também
diferem em suas habilidades em se ligar a um sítio-alvo, o operador. O sistema da arabinose
é extremamente sensível às variações nos níveis metabólicos (STRYER 1996).
Operon Histidina
A presença ou ausência de histidina no meio não impede a atividade do operon, mas
interfere o processo. Se houver histidina no meio, a transcrição do mRNA é parada na etapa
que contém os códons para a síntese de poli-histidina, alguns nucleotídeos nessa região
formam alças. Quando houver uma série de tRNA carregados com histidina o ribossomo
que traduz o peptídeo líder fica perto da RNA polimerase impedindo a formação de uma
das alças e permitindo a formação de outras duas. Uma dessas duas alças é um atenuador e
quando ela não é formada a síntese ocorre formando as enzimas necessárias para síntese de
histidina. Esse sistema não precisa de um gene regulador e o tRNA funciona como co-
repressor (AZEVEDO 1998). O operon da isoleucina-valina é muito semelhante ao da
histidina.
3. Biotecnologia
O termo biotecnologia diz respeito à tecnologia do DNA recombinante, ou seja, a
capacidade de isolar, manipular e reintroduzir genes nos seres vivos. A técnica consiste na
interferência controlada e intencional onde o cientista pode inserir ou retirar genes de
interesse em qualquer organismo. Os avanços da ciência permitiram a modernização da
biotecnologia de forma que a obtenção dos resultados tornou-se mais rápida precisa e
eficiente.
A nova tecnologia abriu espaço para realização de infinitas possibilidades de
compartilhamento de genes entre organismos. Mesmo considerando o código genético uma
ferramenta universal, para se obter sucesso nas pesquisas é necessário que haja
compatibilidade entre células hospedeiras e a mensagem exógena. Diversas técnicas foram
desenvolvidas com intuito de facilitar a obtenção de proteínas de interesse de forma
orientada. A mais importante e mais utilizada é a técnica de PCR (“reação em cadeia da
polimerase”).
O PCR é utilizado para adquirir grande quantidade de seqüências específicas da
molécula de DNA do organismo desejado. Essa amplificação é possível sem a necessidade
de separa-lo do restante do DNA da amostra desejada. A reação necessita de um par de
primes com cerca de 20-30 nucleotídeos, que são seqüências flanqueadoras, ou seja que
indicam a localização da região do DNA desejada. Necessita também das bases
desoxirrobonucléicas que vão parear complementarmente ao DNA desejado e de uma DNA
polimerase termoestável. O procedimento consiste em três etapas de aquecimento e
resfriamento da molécula que permitirá a separação seguida da hibridação dos primers ao
filamento da molécula e da síntese do DNA onde o alongamento por uma DNA polimerase
termoestável derivada de uma bactéria termófila. Todos os novos filamentos de DNA são
servem como moldes nos ciclos sucessivos. A amplificação é de cerca de um milhão de
vezes após 20 ciclos e um bilhão de vezes após 30 ciclos que podem ser feitos em menos de
uma hora (STRYER 1996, CAMPBELL 2001).
Muitos trabalhos já foram realizados utilizando as técnicas de engenharia genética
nas áreas de medicina, agricultura, farmaco-química e em vários países como, Argentina,
Estados Unidos, França, Brasil entre outros. Contudo, existe um grande interesse por parte
destes na produção em larga escala de proteínas de mamíferos em células bacterianas.
Sabe-se porém, que as bactérias não conseguem expressar genes interrompidos, ou seja,
genes constituídos de íntrons e éxons, pois elas não possuem a maquinaria necessária para
remover esses íntrons. Por isso, para que ela expresse a proteína desejada é necessário
introduzir um DNA recombinante complementar ao mRNA (STRYER 1996). Segundo
Souza (1995), há alguns fatores como maior grau de estabilidade do mRNA derivados das
etapas de transcrição e tradução e seleção do vetor adequado também são indispensáveis na
produção de proteínas de interesse, pois essas características são determinantes para
expressão de genes de importância biotecnológica.
3.1. Transgenia
Refere-se aos organismos geneticamente modificados, onde há utilização de um
gene exógeno e uma célula receptora. Um gene selecionando é adquirido através das
técnicas de engenharia genética onde será clonado e multiplicado. Esses fragmentos
constituem uma biblioteca de DNA. A disponibilidade de uma grande coleção de clones
desafia o pesquisador a achar o gene desejado. Uma das mais importantes contribuições da
engenharia de DNA é a possibilidade de adquirir grandes quantidades de qualquer proteína
de uma célula (ALBERTS et al 1997).
A produção de bactérias transgênicas, isto é contendo gene exógeno de interesse, é
possível utilizando as técnicas da engenharia genética. A industria tem utilizado células
bacterianas para fabricar proteínas úteis para o homem. Para Souza (1995), este processo
apresenta as vantagens de independência da matéria prima que na maioria das vezes é de
difícil disponibilidade, obtenção do produto de interesse em grande quantidade, relativa
facilidade de purificação além de reduzir os custos de produção. Nesse sentido muitos
trabalhos já foram realizados como a produção de insulina, do hormônio de crescimento, o
interferon, antígenos, etc.
Um gene de interesse pode ser adquirido através da elaboração de uma biblioteca de
cDNA. Um cDNA é produzido através do mRNA isolado do total de mRNAs da célula e
que dará origem à proteína de interesse. Esse processo é possível graças a ação da enzima
transcriptase reversa que produz um duplex de DNA através de um mRNA. Esses cDNA
são transportados para as células hospedeiras, as bactérias, pelos vetores onde serão
expressos de forma controlada (ÉTIENNE 2003).
3.2. Vetores
Os plasmídios são moléculas constantemente utilizadas como vetores de expressão,
que são programados para produzir grandes quantidades de mRNAs estáveis. Plasmídios
são moléculas de DNA circular que se replicam independentes e à parte do cromossomo
bacteriano. Eles são muito eficientes, desde que haja um promotor e um sítio de ligação
compatível a RNA polimerase, para efetuar a tradução de uma proteína desejada. A
eficiência de vetores compatíveis e estáveis é um ponto fundamental que requer atenção,
pois do contrário acarretaria na perda de material clonado e falta de êxito na obtenção de
resultados. Em alguns casos o alto nível de expressão pode vir a ser tóxico para a célula
hospedeira, causando a recombinação do plasmídio ou sua perda total, além de retardar o
crescimento celular (SOUZA 1995).
As bactérias absorvem DNA do meio e o incorporam naturalmente, transformação
de Griffith, ou artificialmente no seu citoplasma (AZEVEDO 1998). As técnicas de
transformação artificial são utilizadas para produção de DNA recombinante, mas são menos
eficientes e precisa de tratamentos especiais como aumento de permeabilidade de
membrana e ação de íons Ca2+ (COSTA 1986). Como já foi visto, as bactérias sofrem
constantes influências do meio em que vivem, por isso a utilização de eficientes e
compatíveis vetores é extremamente importante para expressão de genes. Diante disso, os
pesquisadores têm construído vetores que possibilitem a expressão de genes de interesse de
forma regulável. Podem ser citados os vetores montados com promotores lac, trp, citados
anteriormente, o operon tac e o promotor do bacteriófago lambda (λ). Os promotores lac e
trp já forma descritos. O promotor tac é um híbrido de seqüências de promotores lac e trp
(SOUZA 1995).
Um outro tipo de vetor utilizado para introduzir genes exógenos em bactérias é
bacteriófago λ. É necessário que haja compatibilidade no tamanho da molécula introduzida
com a molécula receptora. Essa é a forma mais conveniente de introduzir um gene estranho
em bactéria, pois os plasmídios apenas ocasionalmente conseguem adrentar na célula
procariótica intacta. O DNA recombinado do fago é incorporado ao cromossomo bacteriano
onde serão replicados e expressos em proteínas (LEHNINGER 1984).
4.2. Antígenos
Há algum tempo tem sido testadas bactérias patogênicas pelas técnicas de
engenharia genética como veículo para administração de vacinas. Contudo, considerando os
riscos apresentados a crianças e indivíduos imunodeficientes começaram a pesquisar a
possibilidade de utilização de bactérias não patogênicas na produção de vacina. Algumas
características favorecem esse sistema, pois ocorre facilidade de administração (oral),
possibilidade de serem administradas em forma de coquetéis, além de também
apresentarem baixo custo. Vários antígenos bacterianos e virais já foram produzidos em
bactérias lácticas, amplamente utilizadas na indústria agro alimentícia, entre eles a
expressão do gene produtor do fragmento C da toxina tetânica e da peritactina um
fragmento da coqueluche. Ambos os genes forma sintetizados a partir do promotor tac, uma
modificação do promotor lac, pois apresentaram maior afinidade com maior taxa de
expressão nessas condições (RIBEIRO et al 2001).
A produção do antígeno da bactéria causadora da Brucelose, Brucella abortus,
patogênica para humanos e bovinos foi possível com a utilização do promotor indutível
PnisA, pois apresentou altos níveis para a produção da proteína L7/L12. Essa proteína foi
expressa em três áreas celulares na parede celular, no citoplasma e meio extracelular, todas
construídas através das técnicas de engenharia genética. Apesar da competência de
expressar a proteína nas três localidades, buscou-se investigar a via de exposição mais
adequada para vacinação oral. Os resultados demonstraram que os vetores construídos
possuem a capacidade de controlar a expressão nas três áreas testadas otimizando a
produção da proteína (RIBEIRO et al 2001).
4.3. Outras pesquisas
Enfim, com o advento da construção de vetores muito já foi feito para minimizar os
problemas e aumentar o nível de expressão de genes heterólogos e de forma regulável. O
gene da somatostatina foi expresso através de um vetor contendo o promotor lac. A
prolactina humana, hormônio do crescimento e a interleucina 6 foram adquiridas pelo vetor
contendo o promotor trp. Outros genes também foram expressos tais como o que sintetiza o
interferon e o da urogastrona (SOUZA 1995).
CONCLUSÃO
ALBERTS, B.; BRAY, D.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K & WATSON, J. D.
Biologia Molecular da Célula. 3ª ed. Porto Alegre: Artes Médicas, 1997. 1291p.
ALBERTS, B.; BRAY, D.; JOHNSON, A.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K. &
WALTER, P. Fundamentos de Biologia Celular. Porto Alegre: Artmed, 1999. 757 p.
DARNELL, J. E.; LODISCH, H.; BALTIMORE, D.; BERK, A.; MATSUADAI, P. &
ZIPURSKY, S. Molecular Cell Biology. 3ª ed. New Jesey: Scientific American Books,
1995. 1344p.
LEWIN, B. Genes VII. 1ª ed, editora Artmed, Porto Alegre, RS. 2001. 955p.
LIMA, B. D. A produção de insulina humana por engenharia genética. Bactéria
transgênica produz insulina humana, Brasília, Biotecnologia, Ciência & Desenvolvimento,
nº 23, p. 28-31, 2001.
RIBEIRO, L.; PONTES, D.; DORELLA, F.; LANGELLA, P.; LE LOIR, Y.; OLIVEIRA,
S. C; AZEVEDO, V. Bactérias lácteas produtoras de antígenos. Desenvolvimento de uma
vacina oral contra brucellose, Belo Horizonte, Biotecnologia, Ciência & Desenvolvimento,
nº 22, p. 36-40, 2001.