Ensaio Antioxidante DPPH Revisitado Port

25/05/2016 ensaio antioxidante DPPH revisitado
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artigo esboço
Abstrato
Food Chemistry
Palavras-chave Volume 113, Issue 4 , 15 de abril de 2009, páginas 12021205
1. Introdução
2. Materiais e métodos
3 Resultados e discussão
Reconhecimento Métodos analíticos
Referências
ensaio antioxidante DPPH revisitado
,
Om P. Sharma , Tej K. Bhat
As figuras e tabelas
Mostre mais
tabela 1
doi: 10.1016 / j.foodchem.2008.08.008 Obter direitos e conteúdo
Abstrato
Limpeza de DPPH radical livre é a base de um ensaio antioxidante comum. Um certo
número de protocolos têm sido seguido para este ensaio, resultando em variação entre
os resultados de diferentes laboratórios. Nós apresentamos uma perspectiva dos
protocolos seguidos por diferentes trabalhadores com incongruência em seus
resultados e recomendar um procedimento padrão dentro da faixa de sensibilidade de
espectrofotometria. Três antioxidantes padrão comuns viz. ácido ascórbico, BHT e
galato de propilo foram utilizados neste estudo. O IC 50 Os valores para o ácido
ascórbico e o galato de propilo foram de 11,8 uM e 4,4 uM em metanol e 11,5 uM e 4,7
uM em metanol tamponado como meio de reacção, respectivamente. A eliminação de
radicais livres por BHT foi marcadamente influenciados por o meio de reacção. O IC 50
Os valores foram de 60,0 uM e 9,7 uM, quando a reacção foi feita em metanol e
tamponado metanol, respectivamente.
Palavraschave
PROPAGANDA
DPPH ;1,1difenil2picrilhidrazilo ;Ensaio antioxidante ;captador de radicais livres
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814608009710 1/14
1. Introdução
Os antioxidantes são considerados nutracêuticos importantes por causa de muitos
benefícios para a saúde ( Droge, 2002 , Lee et al., 2004 e Valko et ai., 2007 ). A
exigência de um ensaio padrão é muito importante, a fim de comparar os resultados de
diferentes laboratórios e validação das conclusões. 1,1difenil2picrilhidrazilo (DPPH)
é um radical livre estável que tem um electrão não emparelhado de valência em ponte,
um átomo de azoto ( Eklund et al., 2005 ). Eliminadora de radical DPPH é a base do
ensaio de DPPH populares antioxidante ( Alma et al., 2003 , Karioti et al., 2004 e Kordali
et al., 2005 ). Uma leitura das publicações no passado recente ( Tabela 1 ) mostra que
diversos grupos de pesquisa têm utilizado amplamente diferentes protocolos que
diferiam na concentração de DPPH (22,5250 uM), tempo de incubação (5 min1 h), a
reacção e solvente pH da mistura de reacção. Altas concentrações de DPPH na mistura
de reacção dar absorção para além da precisão das medições espectrofotométricas (
Ayres, 1949 e Sloane e William, 1977 ). Como resultado destas diferenças nas
condições de reacção, o IC 50 Os valores para os antioxidantes mesmo padrão como o
ácido ascórbico e hidroxitolueno butilado (BHT) pode variar muito ( Tabela 1 ). Assim,
não é possível comparar os resultados de diferentes laboratórios ( Kano et ai., 2005 e
Ricci et ai., 2005 ). Luz, do oxigénio e do pH da mistura de reacção também afectar a
absorvência de DPPH ( Ozcelik, Lee, & Min, 2003 ). A presente investigação sobre o
ensaio antioxidante DPPH foi realizado para o desenvolvimento de um protocolo padrão
dentro do intervalo de sensibilidade dos ensaios espectrofotométricos ( Ayres, 1949 e
Sloane e William, 1977 ). Além disso, a cinética de eliminação de radicais livres para três
viz antioxidantes padrão. ácido ascórbico, BHT e galato de propilo, foi investigada.
Tabela 1.
Resumo de algumas publicações representativas DPPH utilizando o ensaio antioxidante
Referências
DPPH (uM)
22,5 MimicaDukic et ai. (2004)
50,0 Karioti et ai. (2004)
80,0 Eklund et ai. (2005)
100,0 Govindarajan et al., 2003 , Saito et ai., 2004 , Kano et al., 2005 , Chen et al.,
2005 , Tepe et al., 2005 e Chien et ai., 2007
250,0 Alma et al., 2003 e Kim et al., 2004
meio reaccional
Etanol Karioti et al., 2004 , Kano et al., 2005 e Mimura et al., 2005
Metanol Alma et ai. (2003), Eklund et ai. (2005), Govindarajan et ai. (2003), e Mimica
Dukic et ai. (2004)
Metanol Chen et al. (2005)
tamponado (pH
5,5)
Etanol Takebayashi, Tai, Gohda e Yamamoto (2006)
tamponada (pH
3,0)
O tempo de incubação (min)

5 Govindarajan et ai. (2003)
20 Karioti et al., 2004 e Mimura et al., 2005
30 Alma et al., 2003 e Kim et al., 2004
60 Karioti et al., 2004 e MimicaDukic et al., 2004
IC 50 de ácido ascórbico
9,84 (56 uM) Kano et ai. (2005)
110,77 (629 uM) Ricci et ai. (2005)
IC 50 de BHT
5,4 (25 uM) MimicaDukic et ai. (2004)
19,8 (90 uM) Sökmen et ai. (2004)
86,6 (393 uM) Ricci et ai. (2005)
opções de tabela
2. Materiais e métodos
1,1difenil2picrilhidrazilo (DPPH) foi adquirido a partir de SigmaAldrich (EUA). O
ácido ascórbico e hidroxitolueno butilado (BHT) foram adquiridos a partir de E. Merck

(India). Propil galato foi comprado de Sisco Research Laboratories, Mumbai, na Índia.
As soluções de reserva foram preparados de DPPH em metanol e metanol tamponada
com o tampão de ácido acético (0,1 M, pH 5,5), respectivamente. metanol tamponada foi
preparada misturando 40 ml de tampão acetato 0,1 M (pH 5,5) com 60 ml de metanol. Os
solventes e outros produtos químicos eram de grau analítico. Os tubos de reacção, em
triplicado, foram envolvidos em folha de alumínio e mantida a 30 ° C durante 30 min no
escuro. Todas as medidas foram feitas sob luz fraca. Usando espectrofotometria foram
realizados a 517 nm usando Spectronic Genesys 5 espectrofotômetro. Os dados são a
média ± DP.
3 Resultados e discussão
Os perfis de absorvância de DPPH em metanol, etanol e metanol tamponada são
mostrados na Fig. 1 . A fim de absorvância foi mais elevada em solução metanólica
tamponada, seguido de soluções metanólicas e etanólico. Absorção superior em
soluções metanólicos implica melhor sensibilidade visàvis solução etanólica de DPPH.
A gama de precisão para medições espectrofotométricas cai dentro de uma absorção de
0,2210,698 o que equivale a uma transmitância de 2060% ( Ayres, 1949 ). Isto
corresponde à concentração de DPPH de cerca de 2570 uM ( Fig. 1 ). Uma série de
trabalhadores têm utilizado DPPH concentrações muito além da precisão
espectrofotométrica, mesmo até 250 uM ( Tabela 1 ). Utilizouse uma concentração
DPPH de 50 mM, em consonância com as exigências da precisão das medições
spectrophotomteric ( Ayres, 1949 e Sloane e William, 1977 ). A absorvância de DPPH
sem quaisquer adições mantevese estável durante 30 min. Além disso, o solvente
adequado para o ensaio de DPPH foi metanol ou metanol tamponado para o ensaio de
actividade antioxidante dos compostos não polar / menos polares e polares / extractos,
respectivamente. Além disso, determinouse a actividade de eliminação de radicais
DPPH de ácido ascórbico, BHT e galato de propilo ( Fig. 2 , Fig. 3 e Fig. 4 ), três
antioxidantes comuns usados como padrões para comparar o potencial antioxidante (
Kano et ai., 2005 , mimicaDukic et al., 2004 , Ricci et ai., 2005 , Soares et al., 2003 e
Sökmen et al., 2004 ). O IC 50 para o ácido ascórbico foi de 11,8 pM e 11,5 pM, quando a
reacção foi feita em metanol e tamponado metanol, respectivamente. O perfil de
eliminação de radicais de ácido ascórbico foi comparável em metanol tamponado e
metanol como solventes. No entanto, o IC 50 Os valores foram relativamente baixos em
comparação com os relatados por trabalhadores anteriores como 56 uM ( Kano et ai.,
2005 ), e 629 ^ M ( Ricci et ai., 2005 ). O perfil de eliminação de radicais DPPH de BHT é
mostrado na Fig. 3 . A IC 50 valor foi de 60,0 uM e 9,7 uM, quando a reacção foi feita em
metanol e tamponado metanol, respectivamente. Os relatórios anteriores de IC 50 de
BHT são 25 uM ( MimicaDukic et al., 2004 ), 90 uM ( MimicaDukic et al., 2004 e
Sökmen et al., 2004 ) e 393 uM ( Ricci et ai., 2005 ). O perfil de DPPH de galato de propilo
é mostrado na Fig. 4 . As IC 50 Os valores foram de 4,4 pM e 4,7 uM em metanol e
metanol tamponado como meio de reacção, respectivamente. Actividade de eliminação
de DPPH de compostos fenólicos é positivamente correlacionada com o número de
grupos hidroxilo ( Sroka & Cisowski, 2003 ). Esta observação explica o CI relativos 50
valores de BHT e galato de propilo. Galato de propilo com três grupos hidroxilo tem mais
baixos de IC 50 Os valores para BHT, em comparação com um grupo hidroxilo. Ao
contrário de ácido ascórbico e gaiato de propilo, a actividade de eliminação de radicais
DPPH de BHT foi marcadamente elevada em metanol tamponado, em comparação com
que só em metanol ( Fig. 3 ). Actividade de eliminação de radicais DPPH é influenciada
pela polaridade do meio de reacção, a estrutura química do neutralizador de radical, e o
pH da mistura de reacção ( Ozcelik et al., 2003 , Saito et ai., 2004 e Shizuka e Jun
Kawabata, 2005 ) . A diferença entre os IC 50 Os valores de BHT em metanol e metanol
tamponado pode ser devido a um ou mais destes factores.
FIG. 1.
A absorvância a 517 nm de soluções preparadas DPPH em metanol, etanol e metanol tamponado.
Figura opções
FIG. 2.
Limpeza de DPPH radical de ácido ascórbico. solução de ácido ascórbico (1 mM) foi preparada em
metanol ou metanol tamponado. Diferentes alíquotas foram tomadas e o volume foi completado até 3,0 ml
com metanol ou metanol tamponado. A reacção foi iniciada pela adição de 1,0 ml de solução de solução
de DPPH 200 uM em metanol ou metanol tamponado. A mistura de reacção foi mantida a 30 ° C durante
30 min e a absorvância foi medida a 517 nm.
Figura opções
FIG. 3.
Limpeza de DPPH radical por BHT. solução de BHT (1 mM) foi preparada em metanol ou metanol
tamponado. Diferentes alíquotas foram tomadas e o volume foi completado até 3,0 ml com metanol ou
metanol tamponado. A reacção foi iniciada pela adição de 1,0 ml de solução de solução de DPPH 200 uM
em metanol ou metanol tamponado. A mistura de reacção foi mantida a 30 ° C durante 30 min e a
absorvância foi medida a 517 nm.
Figura opções
FIG. 4.
Limpeza de DPPH radical de galato de propilo. solução gaiato de propilo (100? M) foi preparado em
metanol ou metanol tamponado. Diferentes alíquotas foram tomadas e o volume foi completado até 3,0 ml
com metanol ou metanol tamponado. A reacção foi iniciada pela adição de 1,0 ml de solução de solução
de DPPH 200 uM em metanol ou metanol tamponado. A mistura de reacção foi mantida a 30 ° C durante
30 min e a absorvância foi medida a 517 nm.
Figura opções
A reacção de eliminação de radicais de ácido ascórbico com DPPH foi, essencialmente,

instantânea ( Fig. 5 ). Por outro lado, a reacção de eliminação de radicais de BHT com
DPPH foi bastante lento e a absorvância continuou a diminuir até um período de 90
minutos de observação ( Fig. 5 ). A reacção de DPPH com galato de propilo também foi
muito rápido, mas mais lenta quando comparada com a com ácido ascórbico ( Fig. 5 ).
Por uma questão de uniformidade, um intervalo de tempo de 30 min foi feita para o ácido
ascórbico, BHT e gaiato de propilo radicais medições de capacidade de eliminação. É
importante fazer um curso de tempo de atividade sequestradora de radicais durante o
uso radical DPPH para o ensaio de atividade antioxidante. Em conclusão, o ensaio anti
oxidante baseado em eliminadora de radical DPPH numa concentração de DPPH a 50?
M em metanol ou metanol tamponado, dependendo da solubilidade do composto sob
investigação, é recomendado. Todas as operações devem ser feito à luz escuro ou dim (
Ozcelik et al., 2003 ). A extensão da inibição é influenciada pelo solvente. Isto é evidente
a partir dos dados para eliminação de radicais DPPH por BHT em solução metanólica
metanólica ou tamponado ( Fig. 3 ). Além disso, os nossos dados sobre a reacção
comparativa de ácido ascórbico, BHT e galato de propilo ( Fig. 5 ) indica que o curso de
tempo de inibição também tem de ser determinado. O protocolo aqui descrito, assim,
cuida da gama de sensibilidade espectrofotométrica, além de DPPH sensibilidade à luz,
o pH e a solubilidade do composto.
FIG. 5.
curso de tempo de limpeza de radical livre DPPH por ácido ascórbico, BHT e galato de propilo. A mistura
de reacção (4,0 ml) em metanol tamponado continha DPPH (50 uM) sozinho ou na presença de ácido
ascórbico (11,5 uM), BHT (9,7 uM) ou gaiato de propilo (4,7 uM). A absorvância foi medida a 517 nm.
Figura opções
Reconhecimento
Agradecemos Ms Jyoti Dhar, Assistente Técnico, para o excelente suporte técnico

nestes estudos.
Referências
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O tempo de incubação (min)

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A reacção de eliminação de radicais de ácido ascórbico com DPPH foi, essencialmente,

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Ayres de 1949 GH Ayres

Chien et al., 2007 PJ Chien, F. Sheu, WT Huang, MS Su

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Droge, 2002 W. Droge

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Takebayashi et al., 2006 J. Takebayashi, A. Tai, E. Gohda, I. Yamamoto

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Artigo | PDF (273 K) | Ver Record em Scopus | artigos citando (55)

Valko et ai., 2007 M. Valko, D. Leibfritz, J. Moncol, MT Cronin, M. Mazur, J. Telser

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