FEV 2022

Catalogação na Publicação (CIP)

(BENITEZ Catalogação Ass. Editorial, MS, Brasil)
Genética descomplicada [livro eletrônico] / Danielle
Seabra Ramos...[et al.] ; [editores] Danyelly
Bruneska Gondim Martins, José Luiz de
Lima Filho, Simone Cristina Soares Brandão. –
1.ed. – Recife, PE : Mariola Comunicação, 2021.
PDF.

Outros autores : Eduardo Braz, Francielle Maria

de Araújo Barbosa, Gabriela da Silva Arcanjo, Kelly
Monteiro dos Santos, Mariana Dubeux, Raíssa Nogueira
Bernardo.
Bibliografia.
ISBN : 978-65-993541-5-1

1. Genética. 2. Genética – Estudo e ensino.

3. Medicina. I. Ramos, Danielle Seabra. II. Braz,
Eduardo. III. Barbosa, Francielle Maria de Araújo.
IV. Arcanjo, Gabriela da Silva. V. Santos, Kelly Monteiro
dos. VI. Dubeux, Mariana. VII. Bernardo, Raíssa
Nogueira. VIII. Martins, Danyelly Bruneska Gondim.
IX. Lima Filho, José Luiz. X. Brandão, Simone Cristina
Soares.
04-2022/18 CDD 616.042
Índice para catálogo sistemático:
1. Genética : Medicina 616.042
Bibliotecária : Aline Graziele Benitez CRB-1/3129
 AU TO R E S

DANIELLE SEABRA RAMOS

Doutoranda em cirurgia na UFPE

Graduada em medicina pela UFPE e apaixonada

pela ciência, segui a jornada acadêmica no
mestrado em saúde da comunicação humana
nesta instituição e agora no doutorado cirurgia
encontrei mais uma oportunidade fascinante
que foi aprofundar conhecimentos nesta área
fascinante e abrangente que é a Genética
@danielleseabraotorrino humana!

EDUARDO BRAZ
Acadêmico de medicina da UFPE

A genética desvela a complexidade e a conexão

que formamos com cada fenômeno que
experienciamos e organismo que tivemos
contato em nossa existência. Estudar medicina
é acompanhar essa dinâmica sob o prisma de
apenas um desses numerosos atores desse
processo, podendo, assim, alterar o rumo de
todos que tocamos, é, portanto, um mecanismo
“epigenético” criado pela humanidade. Esse
@eduardohvbraz
E-book traz um pouco dessa história e de como
podemos ser protagonistas dela.

1
 FRANCIELLE MARIA DE ARAÚJO BARBOSA
Formada em Biomedicina pela UFPE

Durante a graduação desenvolvi projetos de

iniciação científica na área de epigenética,
na busca de biomarcadores para o câncer de
mama. A genética humana é uma grande paixão,
e poder contribuir para a disseminação desse
conhecimento em uma linguagem mais acessível
e com informações tão atualizadas foi muito
@franciellemaria_ prazeroso.

GABRIELA DA SILVA ARCANJO

Biomédica formada pela UFPE

Na Universidade e na Pós-graduação me
tornei mestre e atualmente sou doutoranda
em Genética e biologia molecular. Foi nesta
segunda casa que pude aprender e vivenciar a
Ciência, bem como descobrir que além das leis
da hereditariedade, a Genética tem impacto e
aplicações em diversas áreas de interesse da vida.
@arcanjo.ela

KELLY MONTEIRO DOS SANTOS

Mestranda no Programa de Pós Graduação em
Cirurgia pela UFPE

Fui aluna de graduação em enfermagem pela

UFPE, residente em Oncologia e retorno à UFPE
como mestranda em Cirurgia. Sempre fui curiosa
e a ciência nos acolhe nessa curiosidade. Trabalho
com Pesquisa Clínica onde me encontro todos
os dias na rotina que mais amo e a Genética
Humana está presente em tudo, logo, fazer
parte do desenvolvimento deste E-book foi uma
@kellymonteeiro
oportunidade ímpar de desbravar essa ciência
brilhante e de uma forma descomplicada.

2
 MARIANA DUBEUX
Acadêmica de Medicina da UFPE

Escolhi Medicina porque sempre fui apaixonada

por resolver problemas, especialmente através
da lógica e da ciência. Para isso, acredito que
a educação deve ser sobre compreensão e
não reprodução: entender o mundo e passar
a informação adiante é a melhor forma de
desbravá-lo - tudo isso começando pela
curiosidade. Esse ebook é um dos frutos dessa
@mmpdubeux
crença.

RAÍSSA NOGUEIRA BERNARDO

Mestranda em Genética/PPGG pela UFPE

Graduada em enfermagem e pós graduada em

Oncologia e estética. Graduanda em Big Data e
Inteligência Analítica. Trabalho como enfermeira
da Pesquisa Clínica. A área de Pesquisa, a ciência
sempre me atraiu, antes mesmo de entrar
na graduação de enfermagem. Apaixonada
pela Genética, assim que abriu a seleção para
ingressar no mestrado, nem pensei duas vezes.

@raissanogueirab O E-book foi uma ótima oportunidade de

escrever sobre algo que gosto e que tem muito
da minha realidade diária, além de trazer de forma
clara um pouco desse mundo da Genética

3
 E D I TO R E S

DANYELLY BRUNESKA GONDIM MARTINS

Professora Associada da Bioquímica da UFPE
e Pesquisadora do LIKA. Bióloga pela UNICAP,
Mestre em Genética e Doutora em Ciências
Biológicas pela UFPE. Sempre quis ser cientista
e tenho o privilégio de trabalhar no que amo. O
nosso grupo de pesquisa, Prospecção Molecular
e Bioinformática, conta com profissionais das
mais diferentes áreas na busca marcadores
moleculares que permitam entender o
funcionamento das células nas diferentes
@danyellybruneska
doenças.

JOSÉ LUIZ DE LIMA FILHO

Médico pela UFPE, doutorado em St. Andrews,
treinamento na Alemanha, Japão e USA em
Biotecnologia, professor titular de Bioquímica,
membro das Academias de Ciência e de Medicina
de Pernambuco, diretor do laboratório de
Imunopatologia Keizo Asami - LIKA da UFPE,
membros de várias sociedades de pesquisa,
consultor de agências de fomentos nacionais e
internacionais, em 2010 recebeu o título de Grão-
mestre da ordem Nacional do Mérito Científico.
Já formou mais de 100 mestres e doutores. Gosto
@zeluiz60
muito de ensinar, fazer pesquisa e dar felicidade
as pessoas.

SIMONE CRISTINA SOARES BRANDÃO

Professora associada de medicina do centro de
ciências médicas e da Pós Graduação em Cirurgia
da UFPE. Especialista em Medicina Nuclear pela
SBMN e em Cardiologia pela SBC. Especialista
em Patologias Cardiovasculares pela Université
Paul Sabatier, Toulouse, França. Doutora em
Cardiologia pela USP. Chefe do serviço de
medicina nuclear do hospital das clínicas da UFPE.
“Fui aluna de Medicina, residente e hoje sou
médica e professora desta Instituição. A UFPE é a
@dra.simonebrandao minha segunda casa. Nela consigo ensinar e fazer
pesquisa, tudo que mais amo.”

4
 OBJETIVO DO E-BOOK

Proporcionar um fácil entendimento sobre a evolução da

genética e suas aplicações na prática clínica.

AG R A D EC I M E N TO S

Nossos sinceros agradecimentos a pós-graduação em Cirurgia

da UFPE pelo convite e a oportunidade de implantar a disciplina
MÉTODOS DIAGNÓSTICOS E TERAPÊUTICOS EM CIRURGIA
para seus alunos. Este e-book é fruto da primeira turma de 2021.

D E D I C AT Ó R I A

Dedicamos este livro digital a todas as pessoas que priorizam

o estudo e a ciência como os meios mais importantes para o
avanço e o bem-estar da humanidade.

5
 “
I have always focused on
basic research, motivated
by a desire to understand
the world

Jennifer Doudna
Prêmio Nobel de Química, 2020
(ao lado de Emmanuelle Charpentier desenvolveu
um método que revolucionou a edição de genes)

6
 P R E FÁ C I O

A Genética é uma área em constante evolução, e os avanços

tecnológicos têm contribuído cada vez mais para que os
conhecimentos adquiridos nas universidades e empresas
cheguem à população na forma de serviços e produtos.

No entanto, muitas vezes a Genética é vista como complexa

e de difícil compreensão, desestimulando a disseminação de
informações e a compreensão sobre tudo que envolve esse
tema.

Genética descomplicada é um e-book que aborda os princípios

básicos da Genética, com uma linguagem simples e clara, e tem
por intuito divulgar esse campo da biologia que estuda parte dos
processos que ocorrem no nosso organismo. O texto que você
tem na sua tela é fruto do trabalho e dedicação de estudantes
de diferentes áreas da saúde, que se apaixonaram pelo tema e se
uniram para mostrar que você também pode compreender esse
universo.

Aqui são apresentados tópicos básicos, como os aspectos da

hereditariedade e o mecanismo de funcionamento da célula,
que foram estabelecidos desde o início do século XX. A partir
destes conceitos, você vai entender como alterações genéticas
podem estar relacionadas às doenças, e até mesmo como
podem impactar nos mais modernos tratamentos (como
no caso dos diferentes tipos de câncer). Aqui também são
abordados os mecanismos envolvidos na Epigenética, um
termo utilizado desde os anos 90 para uma área da biologia
que estuda alterações genéticas (que sofrem grande influência
do ambiente) e podem ser repassados por gerações, apesar

7
de não ocorrerem na estrutura do DNA. Os capítulos finais do
e-book trazem exemplos da aplicação dos conhecimentos
advindos do campo da Genética, apresentando dados científicos
gerados em diversas universidades e centros de pesquisa. Tais
conhecimentos tem auxiliado no desenvolvimento de métodos
de diagnóstico e tratamento mais eficientes, nos diferentes tipos
de doenças, fazendo parte do nosso dia a dia.

Enriquecido com figuras ilustrativas e didáticas, além de termos

de relevância em negrito, o presente e-book vai auxiliar você
na fixação das informações mais importantes para ampliação
do seu conhecimento sobre a Genética, de forma intuitiva e
objetiva.

Finalmente, desejamos que você leitor possa desfrutar de uma

leitura agradável e um aprendizado tranquilo, despertando em
você uma satisfação crescente pelo entendimento deste tema
tão presente nas nossas vidas.

8
 SUMÁRIO

1. Bases mendelianas da genética 10

2. Natureza química e física do

19
DNA

3. Código genético e o dogma

central da biologia molecular 29

4. Mutações: a chave da
36
variabilidade genética

5. Epigenética: onde estamos e

para onde vamos ? 41

6. Marcadores genéticos: como,

quando e para quê? 52

7. Terapia Gênica 67

8. Conclusões 77

9. Referências 83
 C A P Í T U LO 1

Bases Mendelianas da Genética

No início do século XX, a Genética foi institucionalizada como

ciência para reunir os conhecimentos acerca da hereditariedade
e variabilidade individuais. Com origens baseadas no estudo de
Gregor Mendel em ervilhas, a genética evoluiu e caracterizou o
gene, unidade física da informação genética, e a molécula que
compõe o material genético: o ácido desoxirribonucleico (DNA).
Hoje, sabe-se que o alfabeto molecular dos genes determina
as características físicas que nos distinguem como indivíduos,
além da ocorrência e risco aumentado para diversas doenças
congênitas e adquiridas. Dito isso, no capítulo 1 e no capítulo 2
serão descritas a descoberta e evolução do gene como unidade
hereditária, estrutura química e física e por fim, como sequência
decodificada de pares de bases, figura 1.

10
Timeline: Dos estudos de Mendel ao projeto Genoma Humano
Gregor Mendel estudando características de cultivos de ervilhas, descobre os princípios bá-
1866 sicos da genética: Fatores invisíveis herdáveis determinavam as características físicas das
plantas.

1869 Friedrich Miescher isolou a nucleína de leucócitos humanos. Hoje sabemos que a nucleína é
o ácido desoxirribonucleico.

1900 Carl Correns, Hugo de Vries, e Erich von Tschermak redescobrem o trabalho de Mendel e
corroboram seus achados.
Theodor Boveri e Walter Sutton postulam que as unidades de hereditariedade estão localiza-
1902 das nos cromossomos.
1909 Wilhelm Johannsen usa a palavra gene para descrever as unidades de hereditariedade.

1928 Frederick Griffith postula que um princípio transformador permite que características de um
tipo de bactéria possam ser transferidas para outra.

1929 Phoebus Levene identifica os componentes do DNA, incluindo as quatro bases adenina, cito-
sina, guanina e timina.
1944 Oswald T. Avery descobre que o princípio transformador é o DNA.

1950 Erwin Chargaff descobriu que as bases no DNA estão sempre presentes em razões fixas: o
número de adenina é o mesmo que timina e o número de citosina é o mesmo que guanosina.

1953 Rosalind Franklin e Maurice Wilkins utilizando a técnica de difração de raios X sugeriram a
natureza helicoidal e repetitiva do DNA.
1953 James Watson e Francis Crick descrevem a estrutura molecular do DNA.
1957 Francis Crick propõe o dogma central da biologia molecular.
1977 Frederick Sanger desenvolve uma técnica para sequenciamento do DNA.

1990 Tem início o projeto genoma humano com objetivo de determinar a sequência do DNA da
espécie humana.
2003 O projeto genoma humano é finalizado.

Tabela 1: Timeline especificando os principais eventos que levaram ao

surgimento da Genética, descoberta do DNA e desenvolvimento da biologia
molecular.

1 . 1 Os experimentos de Mendel

Em 1866, um monge austríaco desconhecido estabeleceu os

princípios básicos da hereditariedade, e formou os alicerces para
os estudos em Genética. Gregor Johann Mendel (1822 – 1884)
conduziu uma série de experimentos com linhagens de ervilhas
(Pisum sativum) cultivadas nas estufas do mosteiro em Brno,
hoje cidade da República Tcheca (1,2).

Mendel selecionou variedades de ervilhas parentais “puras”, isto

é, que sempre produzem descendentes com características
idênticas às dos progenitores. As linhagens de ervilhas puras

11
diferiam entre si em aspectos morfológicos distintos e
bem definidos, e dessa forma Mendel pode selecionar sete
características para estudo individual: textura da semente (lisa
ou rugosa), cor das sementes (amarela ou verde), cor da flor
(branca ou roxa), posição da flor (axiais ou terminais), cor da
vagem (verde ou amarela), formato da vagem (lisa ou enrugada)
e altura da planta (alta ou baixa) (3).

1 . 2 Entendendo os termos Dominante e

Recessivo

Em seus experimentos, Mendel inicialmente promoveu o

cruzamento entre linhagens de progenitores (P) que diferiam
em apenas uma característica, por exemplo a altura da planta
(3), e os descendentes produzidos (geração filial F1), sempre
conservavam características de apenas uma das formas
parentais - esse padrão foi observado para todas as sete
características. Mendel chamou a característica que é expressa
na geração F1 de dominante e a característica que desaparece
de recessiva (3) (Ver quadro 1 Conceitos em Genética).

Para descobrir se a característica recessiva de fato desapareceu,

Mendel permitiu a autofecundação das plantas da geração
F1, produzindo uma geração F2, que mostrava um resultado
inesperado – a característica recessiva havia reaparecido em
aproximadamente 25% das plantas. Assim, a cada quatro plantas,
três eram altas (característica dominante), e uma planta era
baixa (característica recessiva), produzindo uma proporção de
3:1, que se repetiu para as outras 6 características (Figura 1.1) (3).

12
Figura 1.1: Cruzamento de unidades parentais (P), gerando geração filial
(F1) com características apenas dominantes (Superfície lisa). Em seguida,
cruzamento de unidades filiais (F1) com produção de geração filial (F2), com a
proporção de fenótipo 3:1.

A partir desses resultados, Mendel deduziu que as características

das ervilhas eram determinadas por fatores que existem em
pares - hoje denominados genes. A linhagem de progenitores
é chamada de diplóide, pois possuem um par de cada gene e,
durante a formação dos gametas, o par é reduzido a uma cópia
de cada gene, em células haplóides. Essas cópias, uma de cada
progenitor, se unem na fecundação, formando uma nova célula
diplóide com uma possível nova combinação.

Cada gene pode existir em duas versões, ou alelos, que são

formas alternativas de um gene. Assim, alta (dominante), e
baixa (recessiva) são propriedades determinadas por dois alelos
diferentes do gene que expressa a característica altura, assim
como lisa e rugosa são dois alelos da característica textura da
semente (3).

Para ilustrar sua hipótese, Mendel representou seus fatores

utilizando símbolos – A para a forma dominante e a para a forma
recessiva. Os fatores podem ser combinados de diferentes

13
maneiras: dois dominantes (AA), dois recessivos (aa) ou um
dominante e um recessivo na geração de híbridos (Aa) (Figura
1.2). Dessa forma, um progenitor que fosse dominante puro
(AA) produziria apenas gametas com o alelo dominante (A), e
um progenitor recessivo puro (aa) produziria apenas gametas
com o alelo recessivo (a) (Ver quadro 1 Conceitos em Genética).
Os progenitores híbridos (Aa), entretanto, produziriam dois
tipos de gametas: 50% com o alelo dominante (A) e 50% o alelo
recessivo (a). Durante a fertilização, os gametas com diferentes
alelos combinam-se aleatoriamente. Esses achados permitiram
explicar o reaparecimento da característica recessiva na prole de
híbridos F2 (4).

Figura 1.2: Explicação da ilustração de Mendel, sendo o alelo A (dominante) responsável pela
forma circular e o alelo a (recessivo) responsável pela forma amorfa. A geração P, por ser formada
por indivíduos puros, só produz combinações Aa, contudo, o cruzamento dos híbridos promove 3
pareamentos diferentes - AA, Aa e aa - explicando assim os achados iniciais.

14
1 . 3 Princípio da segregação
independente

Tomemos como exemplo a característica textura das sementes,

para exemplificar os achados de Mendel: A característica
dominante lisa é representada pelo alelo R (de roundness) e a
característica recessiva rugosa por r (5). A linhagem parental
pura com sementes lisas possui duas cópias para o alelo R (RR),
enquanto a linhagem pura de sementes rugosas possui duas
cópias para o alelo r (rr), portanto ambas são homozigotas,
pois possuem duas cópias idênticas de um mesmo alelo para o
gene que controla a textura das sementes. Todos os gametas
produzidos pelas linhagens puras de sementes lisas terão uma
cópia do alelo R, e todos produzidos pela linhagem de sementes
rugosas terão uma cópia do alelo r. Os híbridos F1 originados
do cruzamento entre as linhagens parentais puras, serão todos
Rr, ou heterozigotos, pois possuem dois alelos diferentes (Ver
quadro 1 Conceitos em Genética) (1,2).

As diferentes formas de constituição alélica observadas nas

linhagens (por exemplo, RR, Rr e rr) são chamadas de genótipos.
Os genótipos determinam as características físicas observadas –
sementes lisas ou rugosas – ou fenótipo. Nota-se, contudo, que
diferentes genótipos (por exemplo, RR e Rr) podem determinar
o mesmo fenótipo (sementes lisas), pois a característica
dominante, neste caso, é expressa quer esteja em uma ou duas
cópias (1,2).

As plantas na geração F1 Rr, produzem, portanto, metade dos

gametas com alelo R e metade com o alelo r, distribuídos
aleatoriamente. Durante a autofertilização, os gametas se
combinam de todas as formas possíveis, produzindo uma
geração F2 com os seguintes genótipos: RR, Rr, rR e rr. Com base
nestes achados, Mendel pode concluir que o alelo recessivo

15
não é perdido e nem modificado na geração F1, mas sim
ambos os alelos de um heterozigoto segregam-se de forma
independente e são distribuídos aleatoriamente em iguais
proporções quando da formação dos gametas (Figura 1.3). Esses
achados ficaram conhecidos como princípio da segregação
independente, ou primeira lei de Mendel (1-3).

Figura 1.3: Esquematização do princípio da segregação independente. Geração

parental Rr gera gametas com alelo dominante R e alelo recessivo r, os quais se
combinam de todas as formas possíveis gerando indivíduos RR, Rr e Rr, com
características do alelo dominante, e rr, com características recessivas.

1 . 4 Princípio da distribuição aleatória

Buscando entender a distribuição de duas características

distintas ao mesmo tempo, Mendel estendeu seus estudos para
cruzamentos diíbridos. Inicialmente selecionou duas linhagens
puras para as seguintes características: uma com sementes lisas

16
(RR) e amarelas (YY) (características dominantes) e outra com
sementes rugosas (rr) e verdes (yy) (características recessivas).
O cruzamento dessas duas linhagens produziu uma linhagem F1
de sementes lisas e amarelas com genótipo híbrido Rr Yy. Uma
vez que os gametas em F1 possuem uma cópia de cada alelo
para cada gene, os seguintes genótipos em iguais proporções
foram observados: RY, Ry, rY e ry. A autofertilização da geração
F1 produziu uma geração F2 com variados fenótipos na seguinte
proporção: 9 sementes amarelas e lisas: 3 verdes e lisas: 3
amarelas e rugosas: 1 verde e rugosa (Figura 1.4). Observa-se que
dois fenótipos eram iguais aos da geração parental (sementes
amarelas e lisas e sementes verdes e rugosas), enquanto outras
duas novas variedades recombinantes surgiram (sementes
verdes e lisas e sementes amarelas e rugosas). Essas relações
numéricas, sugeriu Mendel, indicavam que os alelos de diferentes
genes segregam-se e são distribuídos independentemente
durante a formação dos gametas. Este ficou conhecido como
princípio da distribuição aleatória ou diibridismo, ou ainda
segunda lei de Mendel (1 – 3).

Figura 1.4: Ilustração do princípio do diibridismo, onde o alelo dominante R

define a superfície lisa e o alelo recessivo r a superfície amorfa/rugosa, assim
como o alelo Y dominante define a coloração amarelada e o alelo y recessivo a
tonalidade verde. O cruzamento de dois indivíduos duplo homozigotos geram 4
híbridos idênticos, os quais cruzados entre si geram uma proporção fenotípica
de 9:3:3:1.

17
Mendel publicou seus achados em 1866 sob o título de
“Experimentos em hibridização de plantas” (Versuche über
Plflanzenhybriden), sem saber que mudaria definitivamente
os conceitos de biologia da época (3). Embora revolucionário,
o significado dos seus achados permaneceu na obscuridade
científica e incompreendido por mais de 30 anos. Foi somente
em 1900 que o alemão Carl Correns, o holandês Hugo de
Vries e o austríaco Erich von Tschermak, redescobriram
independentemente e confirmaram os achados de Mendel
(6–8). Tão logo redescoberto, o trabalho de Mendel ganhou, na
figura do biologista inglês William Bateson, seu maior defensor
(9,10).

Com um número de adeptos crescente, Bateson em 1906, para

designar “a ciência da hereditariedade e variação” baseada nos
princípios do Mendelismo, cunhou pela primeira vez o termo
“genética”, institucionalizando a ciência em nascimento (11). As
unidades de hereditariedade de Mendel receberam em 1909, a
definição de “gene” por Wilhelm Johannsen baseado no termo
pangene de Hugo de Vries (12). Finalmente, a comprovação
citológica cromossômica das leis de Mendel por Thomas
Hunt Morgan (13), viriam a consolidar as ideias do Mendelismo
e materializar em estruturas físicas filamentares os fatores
invisíveis descobertos nas ervilhas de Mendel.

18
 C A P Í T U LO 2

Natureza química e física do DNA

2 . 1 Desvendando a dupla hélice

Muito antes da genética se estabelecer como ciência, Johann

Friedrich Miescher, um jovem suíço em 1868, ao estudar a
composição química de leucócitos extraídos de pus de ataduras
hospitalares, isolou uma substância ácida desconhecida do
núcleo das células que ele chamou de nucleína (1). A nucleína
de Miescher, diferente dos tipos de proteínas conhecidas, era
resistente à digestão proteolítica, não tinha enxofre, e possuía
altas quantidades de fósforo na sua composição (2). Miescher
tinha descoberto uma nova substância, que ele ainda acreditava
que fazia parte de uma nova classe de compostos orgânicos,
posteriormente chamados de ácidos nucléicos.

Depois da descoberta da nucleína, ficou provado que os

cromossomos, estruturas filamentosas localizadas no núcleo
das células, são formados por proteínas e ácidos nucléicos
(3). No início do século XX, a teoria cromossômica da
hereditariedade relacionou o padrão de segregação dos
cromossomos na reprodução sexuada com a transmissão dos
genes, mostrando que os genes se localizam nos cromossomos
(3,4). Apesar desses achados, até meados da década de 1940,
acreditava-se que moléculas complexas como as proteínas,
seriam as responsáveis por transportar a informação do material
genético dos genes.

19
 2 . 2 Natureza química do DNA

As evidências de que seria o DNA a molécula que representa

a natureza química do gene começaram a aparecer em 1928
com os experimentos do bacteriologista inglês Frederick
Griffith. Estudando uma estratégia vacinal para a pneumonia
pneumocócica em ratos, Griffith descobriu que uma cepa não
virulenta de bactérias pneumocócicas poderia ser transformada
em uma cepa virulenta por meio da exposição a um extrato
de células mortas da cepa virulenta. Griffith concluiu que de
alguma forma um “princípio transformador” havia passado de
uma cepa a outra, promovendo sua transformação (5). Foi
somente em 1944 que a natureza do princípio transformador
foi determinada por Oswald T. Avery, Colin MacLeod e Maclyn
McCarty, em um trabalho clássico, considerado uma das maiores
descobertas do século XX. Repetindo os experimentos com
cepas da bactéria pneumocócica, os pesquisadores cultivaram
as bactérias e purificaram o princípio transformador. Com
grande surpresa, os resultados mostraram que a substância que
promovia modificação genética nas bactérias não parecia ser
uma proteína, um carboidrato ou um lipídio, mas sim um ácido
nucléico de Miescher, o ácido desoxirribonucleico ou DNA
(Figura 2.1) (6).

Figura 2.1: Ilustração de uma fita de DNA.

Ao passo que a natureza do DNA como principal componente

do material genético celular era desvendada, a compreensão
de sua composição química evoluiu. Compreendeu-se que
os ácidos nucleicos podiam existir em duas formas, o ácido

20
desoxirribonucleico ou DNA e o ácido ribonucleico ou RNA.
Ambas consistem em longas cadeias feitas de subunidades
quimicamente semelhantes e repetidas, os nucleotídeos.

Cada nucleotídeo é formado por três componentes: 1. Um grupo

fosfato; 2. Uma pentose, açúcar contendo cinco átomos de
carbono (sendo uma ribose para o RNA e uma 2’-desoxirribose
para o DNA); e 3. Uma base nitrogenada (composto nitrogenado
cíclico). A pentose ocupa a porção central no nucleotídeo
e seus átomos de carbono são numerados como de 1’ a 5’,
estando a base nitrogenada conectada ao carbono 1’ em uma
extremidade, enquanto o grupo fosfato liga-se ao carbono 5’
no outro pólo. No DNA, os nucleotídeos diferem entre si pela
presença de 4 tipos diferentes de bases nitrogenadas: adenina
(A), guanina (G), timina (T) e citosina (C), enquanto no RNA
observamos também as bases A, G e C, no entanto no lugar
da T, encontramos a base uracila (U) (Figura 2.2). Tais bases
nitrogenadas são agrupadas em dois conjuntos básicos de
acordo com sua estrutura: as purinas (adenina e guanina) são
bases com anel heterocíclico duplo; enquanto as pirimidinas
(citosina, timina e uracila) são bases com anel heterocíclico
simples. Muitas dessas descobertas são creditadas ao
bioquímico russo Phoebus Levene (7).

Figura 2.2: Ilustração de nucleotídeos, monômeros dos ácidos nucleicos, pareados por pontes de
hidrogênio. Em destaque, nucleotídeos do DNA, com bases nitrogenadas Adenina, Timina, Guanina e
Citosina; em detalhe, bases do RNA, Adenina, Uracila, Guanina e Citosina.

21
Em extensão ao trabalho de Levene e inspirado pelos achados
de Avery e colaboradores, o bioquímico Erwin Chargaff pôs-se
a investigar a natureza química do DNA em diferentes espécies,
chegando, entre 1949 e 1950, a duas importantes conclusões: 1.
As proporções dos quatro nucleotídeos variam entre diferentes
espécies e 2. Dentro de uma mesma espécie, as bases do DNA
estão sempre presentes em razões fixas: o número de resíduos
de A era sempre igual ao número de resíduos de T, assim como o
número de resíduos de C era igual ao de G. Além disso, os dados
ainda mostravam que a concentração de purinas era sempre
igual à concentração de pirimidinas (8,9). Esses achados ficaram
conhecidos com as regras de Chargaff e serviram de base para
desvendar a estrutura tridimensional do DNA.

2.3 Estrutura física do DNA

As descobertas feitas a respeito do DNA ainda não respondiam

as principais questões sobre o mecanismo de atuação dos
ácidos nucleicos: De que forma se organizavam os blocos
construtores da molécula de DNA e como sua estrutura permitia
o armazenamento e transmissão de informação genética
hereditária na célula? Além dos experimentos de Chargaff, os
estudos de cristalografia e difração de raios X sobre a estrutura
do DNA, foram determinantes para solucionar essas questões
(10).

A técnica de difração de raios X consistia em irradiar raios X em

um sólido cristalino para determinar seu posicionamento atômico
e a estrutura molecular (11). Em 1946, Maurice Wilkins, físico
neozelandês, utilizou-se desta técnica para tentar desvendar
a estrutura espacial do DNA. Wilkins obteve as primeiras
imagens de cristalografia de raios-X de DNA no King’s College

22
em Londres. A técnica era laboriosa, e o material mostrava-se
difícil de fotografar. Nesta época, Rosalind Franklin, especialista
na técnica de difração de raios X, juntou-se ao laboratório de
biofísica do King’s College para estudar a estrutura do DNA.
Franklin aprimorou a técnica desenvolvida por Wilkins permitindo
a obtenção de imagens mais nítidas (12,13). Trabalhando com seu
assistente Raymond Gosling, Franklin pode obter imagens do
DNA com qualidade e clareza até então nunca vistas.

Em Cambridge, os jovens ingleses James Watson e Francis Crick,

inspirados por uma fotografia de difração de raios X produzida
por Wilkins, puseram-se a trabalhar na questão da estrutura do
DNA. Enquanto isso, o grande químico americano Linus Pauling
em 1953, publicou seu modelo para a estrutura DNA. Pauling
propôs uma estrutura em tripla hélice com as bases nitrogenadas
apontando para fora (14,15). Com grande surpresa, Watson e
Crick constataram que o modelo de Pauling era impossível e
energeticamente instável, e então conceberam o modelo da
dupla hélice. Para os dois, o DNA tinha que ser composto por
duas cadeias helicoidais entrelaçadas, e assim, em 1953, Watson
e Crick publicaram na revista Nature, seu artigo descrevendo
a estrutura do DNA (16). Esta publicação seguiu-se a outra um
mês depois, descrevendo as implicações genéticas do modelo
(17).

Embora tenham sido feitas algumas pequenas alterações

no modelo de Watson e Crick, as principais características
permanecem as mesmas até hoje: O DNA é composto por
duas fitas de polinucleotídeos entrelaçadas na forma de dupla
hélice dextrogira (torcida para a direita). Os nucleotídeos de
cada uma das duas cadeias de polinucleotídeos são unidos por
ligações fosfodiéster, associando desoxirriboses adjacentes,
criando dessa forma o esqueleto externo de açúcar-fosfato.
As duas cadeias de polinucleotídeos são mantidas unidas em
configuração helicoidal por ligações de hidrogênio entre as

23
bases nitrogenadas dos filamentos opostos. A ligação entre
as bases é específica – adenina sempre se pareia com a timina
por meio de duas ligações de hidrogênio e citosina sempre
pareia com guanina por meio de três ligações de hidrogênio.
Dessa forma, os filamentos de DNA de uma dupla hélice são
complementares entre si (Figura 2.3). Esta característica do
modelo de Watson e Crick explica como a informação genética
pode ser copiada e transmitida. Durante a replicação do DNA,
as duas fitas se separam e ambas servem de molde, seguindo
a regra de complementaridade de bases, para a síntese de uma
nova fita (16,17).

Figura 2.3: Diagrama da estrutura da molécula de DNA. A molécula de DNA é formada por uma
dupla-fita de polinucleotídeos arranjada em hélice. As subestruturas ou nucleotídeos repetem-se ao
longo da cadeia em intervalos de 0,34 nanômetros. Cada volta da hélice possui aproximadamente 10,5
nucleotídeos (3,4 nanômetros). Em detalhe é mostrada a natureza antiparalela e a complementaridade
das cadeias. A dupla fita permanece unida por meio de ligações de hidrogênio entre as bases
nitrogenadas paralelas. Adenina (A) pareia com timina (T), por meio de duas ligações de hidrogênio e
citosina (C) pareia com guanina (G) por meio de três ligações de hidrogênio. P = um grupo fosfato.

Em pouco mais de 50 anos desde a redescoberta dos achados

de Mendel e o primeiro uso da palavra gene, a genética, já
estabelecida como ciência, evoluiu com avanços marcantes.
Apoiados pelas descobertas de cientistas predecessores,

24
Watson e Crick foram os primeiros a juntar as peças do quebra-
cabeça e descrever com precisão a estrutura do DNA. Os genes,
outrora unidades invisíveis de hereditariedade, agora possuíam
uma natureza química e estrutura física bem definidas.

2 . 4 O Genoma Humano – Genes como

informação decodificada

Mais de 10 anos antes do artigo seminal de Watson e Crick,

em 1941, George Beadle e Edward Tatum davam as primeiras
evidências do mecanismo pelo qual uma cadeia de nucleotídeos
com apenas 4 diferentes formas (A, T, C, G) poderia determinar
características fenotípicas. Estudando o metabolismo do fungo
Neurospora crassa, eles mostraram que mutações gênicas
causavam defeitos em funções metabólicas específicas
por alteração da atividade de uma única enzima. Dada essa
informação, Beadle e Tatum associaram que os genes atuavam
controlando a síntese de enzimas específicas (18), o que ficou
conhecido como a hipótese de “um gene – uma enzima”.

Entre os anos 1950 e 1960, a biologia molecular se desenvolveu

rapidamente. Especulava-se que para a informação do gene
ser convertida em proteína, seria necessária a presença de uma
molécula intermediária, e posteriormente ficou provado que esta
molécula era o RNA, ou mais precisamente o RNA mensageiro
(19). Para ilustrar o fluxo da informação genética, Crick em 1958
propôs o Dogma Central da Biologia Molecular, no qual a
informação genética presente no DNA dos genes é transcrita ou
copiada na forma de RNA, que fornece instruções para tradução
da informação em aminoácidos e proteínas (Figura 2.4) (20,21) -
tais processos serão melhor elucidados no capítulo a seguir.

25
Figura 2.4: Representação do dogma central da biologia molecular. A RNA polimerase transcreve a
parte do DNA escolhida em RNA mensageiro, o qual é traduzido por ribossomos em proteínas a partir
da correspondência de tríades de bases nitrogenadas com aminoácidos.

Outro grande passo para a biologia molecular na segunda

metade do século XX, foi o advento e aprimoramento
das ferramentas tecnológicas. Em 1977 Frederick Sanger
desenvolveu a técnica de sequenciamento do DNA (Ver
quadro 1 Conceitos em Genética) (22). As ferramentas de
sequenciamento permitiram a descoberta e mapeamento da
sequência do conteúdo total de DNA ou genoma, de inúmeras
espécies de organismos eucariotos e procariotos.

O Projeto Genoma Humano como ficou conhecido, foi uma

iniciativa inédita que reuniu esforços do mundo todo para
desvendar o alfabeto molecular da nossa espécie. O projeto
iniciado em 1990 foi publicado em 2001, primeiro como um
rascunho com 90% da sequência decodificada (23,24) e, em
seguida, em sua forma final em 24 de outubro de 2004 (25),
com 99% da sequência do genoma humano determinada. A
forma final do genoma contém aproximadamente 2.85 bilhões
de nucleotídeos distribuídos em 23 pares de cromossomos e
codifica cerca de 20.500 genes. Surpreendentemente, 98%
do genoma humano não é composto por regiões codificantes,

26
ou éxons. Grande parte é composta por regiões de DNA
intercalado entre os genes (DNA intergênico) ou dentro de
genes (íntrons) (Figura 2.5). Hoje sabe-se que fragmentos do
DNA que eram vistos como sem funcionalidade, na verdade
são bioquimicamente funcionais e estão relacionados com
mecanismos de regulação da expressão gênica e proteção
celular.

Figura 2.5: Representação dos éxons e íntrons na molécula de DNA.

O advento do sequenciamento permitiu, portanto, o estudo

de genes isolados e regiões específicas dos genes. Tornou-
se possível associar mudanças de um único nucleotídeo a
doenças monogênicas graves. Definir um painel de variações de
nucleotídeo único que avalia susceptibilidade a alguns tipos de
câncer. Estudar as relações evolutivas entre diferentes espécies
e solucionar diversas outras dúvidas no campo da genética.

27
 Fique por dentro - Conceitos básicos
Macromoléculas ácidas formadas por unidades repetidas, os nucleotíde-
os.  Os ácidos nucleicos podem ser de dois tipos: o DNA (ácido desoxir-
Ácidos nucleicos ribonucleico) e o RNA (ácido ribonucleico).
Sequência específica de uma cadeia de DNA que contém as informações
Gene necessárias para a síntese de uma proteína ou de uma cadeia de RNA.
 
Formas alternativas de um mesmo gene geradas por mutações que ocor-
Alelo rem em regiões específicas do gene.
Representa o conjunto de genes de um indivíduo.
Genótipo
Características observáveis de um indivíduo que resultam da expressão
do genótipo combinado com a influência de fatores epigenéticos e am-
Fenótipo bientais.
Quando o indivíduo apresenta dois alelos iguais de um mesmo locus
Homozigoto gênico (AA ou aa).
Quando o indivíduo apresenta dois alelos diferentes de um mesmo locus
Heterozigoto gênico (Aa).
Quando um alelo de um gene determina um fenótipo estando em homo-
Dominante zigose ou em heterozigose (AA ou Aa).
Quando um alelo determina um fenótipo em apenas homozigose (aa).
Recessivo
Estrutura física altamente organizada e compacta, formada por uma lon-
Cromossomos ga molécula de DNA associada a proteínas.
Tipo de cromossomo que determina o sexo da maioria dos indivíduos.
Cromossomos Um par de cromossomos X e Y (XY) determina o sexo masculino en-
sexuais quanto um par de cromossomos X (XX) determina o sexo feminino.
Células que possuem apenas um conjunto cromossômico, ou seja, ape-
Células haploi- nas um par de cada cromossomo (n). Em seres humanos, as células
des haplóides ou gametas são o espermatozóide e o ovócito.
Células que possuem conjunto completo de cromossomos, ou seja, os
Células cromossomos estão dispostos aos pares (2n). Todas as células do nosso
diploides corpo, com exceção dos gametas, são diplóides.

Sequenciamento Processo realizado para determinar a sequência de nucleotídeos de uma

de DNA molécula de DNA.

Quadro 1: Resumo dos principais conceitos em genética.

28
 C A P Í T U LO 3

Dogma central da biologia molecular e

código genético

Francis Crick em 1958, na tentativa de relacionar o DNA, o

RNA e as proteínas (1) postulou o Dogma Central da Biologia
Molecular. Para definir tal modelo, Crick partiu do princípio que
o DNA pode se replicar e dar origem a novas moléculas de DNA
e que a informação contida em seus pares de bases também
pode ser transcrita em RNA, e este subsequentemente
traduzido em aminoácidos para formar proteínas, criando um
fluxo da informação gênica. Detalhamos o Dogma Central a
seguir.

3 . 1 Replicação do DNA

O modelo espacial do DNA proposto por Watson e Crick oferece

a vantagem de explicar como novas moléculas de DNA idênticas
podem ser exatamente copiadas da molécula preexistente
(2). Durante este processo, as duas fitas de DNA de cada
cromossomo são desenroladas e a replicação então se inicia
em locais específicos, conhecidos como origens de replicação
(3). As helicases são enzimas que reconhecem esses locais e
ao ligarem-se a eles, abrem as duas fitas de DNA, formando a
forquilha de replicação. Em seguida, a DNA polimerase faz a
síntese do DNA no sentido 5’-3’, permitindo a cada fita de DNA
a síntese de outra complementar a ela, gerando duas novas fitas

29
duplas idênticas à molécula original. Tal modelo de replicação
é chamado de replicação semiconservativa (Figura 3.1), pois
cada nova fita dupla contém um filamento da molécula-mãe e
uma fita de DNA recém sintetizada (4).

Figura 3.1: DNA sendo replicado pela DNA polimerase em uma replicação semiconservativa no sentido
5’3’.

No entanto, a DNA polimerase não consegue iniciar a produção

de uma nova fita usando apenas umas das fitas de DNA aberta,
também é necessário que, aderido a esse molde, exista uma
sequência curta de RNA chamada primer ou oligonucleotídeo
iniciador, os quais serão retirados após a polimerização por
uma outra isoforma da enzima DNA polimerase (5). Mais uma
enzima participa da replicação, a DNA ligase, responsável
pelo fechamento final das ligações fosfodiéster, que não são
fechadas pela DNA polimerase, após o processo de replicação.

3 . 2 Transcrição do mRNA

Neste processo, a função primária do DNA é produzir uma

molécula que possa ser utilizada para produção de uma cadeia
polipeptídica de RNA. Como o DNA se encontra no núcleo

30
das células, enquanto a síntese proteica ocorre no citoplasma,
faz-se necessária a transferência de suas informações para
moléculas de RNA mensageiro (mRNA), capazes de atravessar
a membrana nuclear para coordenar a produção citoplasmática
de proteínas. Esse processo de transferência de informações é
denominado transcrição, e ocorre onde o trecho da molécula
de DNA que contém um gene a ser transcrito abre-se, iniciando
o emparelhamento de nucleotídeos por ação da enzima RNA-
polimerase (3).

Diferentemente da replicação, onde um conjunto de moléculas

(primers, helicase e ligase) participa do processo, na transcrição
a enzima RNA polimerase é responsável por todo o trabalho.
Porém, apenas quando todas as subunidades da enzima se
agrupam sobre o DNA, em uma condição chamada formação da
enzima RNA polimerase holoenzima, o processo é iniciado (7).

A RNA polimerase faz com que as pontes de hidrogênio entre

as bases complementares sejam desfeitas, permitindo a
separação das duas fitas e expondo os nucleotídeos a serem
transcritos. Desse modo, a formação da molécula de RNA
mensageiro (mRNA) se dá na direção 5’ → 3’ pela incorporação
de nucleotídeos, os quais são complementares aos de uma das
fitas do DNA (Figura 3.2). Esta fita chama-se fita sense, e pode
ser reconhecida pela RNA polimerase por possuir uma sequência
de bases específica. A transcrição prossegue até ser encontrado
um ponto de terminação, então a enzima e a molécula de
mRNA são liberadas e a molécula de DNA se refaz por meio da
reconstrução das pontes de hidrogênio (4). Vale ressaltar que
a fita de mRNA produzida pode conter partes não codificantes
(íntrons) que precisam ser posteriormente removidas através de
um processo de splicing, produzindo assim um mRNA maduro.

31
Figura 3.2: RNA polimerase usando a fita sense como base e gerando a
molécula de RNA mensageiro.

3 . 3 Tradução do mRNA

A tradução é um processo bem mais complexo que a replicação

e transcrição do DNA, pois envolve a participação de mais de
uma centena de macromoléculas.

Inicialmente o mRNA, transcrito a partir do DNA, com sua fita

simples polinucleotídica pode ser funcionalmente subdividido
em várias sequências de três bases nitrogenadas, denominadas
códons. Uma vez no citoplasma celular, o mRNA se associará
ao RNA transportador (tRNA), o menor RNA da célula, que
possui uma sequência de três bases denominada anticódon,
capaz de reconhecer o códon de início no mRNA, uma sequência
AUG de bases nitrogenadas que marca o ponto onde começará
a síntese proteica. Neste modelo, cada códon é responsável
pela incorporação de um aminoácido à estrutura da proteína
sintetizada e a tradução começa próximo à extremidade 5’ do
RNA, que corresponde a porção amino terminal da proteína,
e prossegue em direção à extremidade 3’, que corresponde
a porção carboxi terminal da proteína. O produto final é um
polipeptídeo cuja sequência de aminoácidos reflete a sequência
de códons do mRNA (5-7) (Figura 3.3).

32
Figura 3.3: Ribossomo fazendo a leitura do mRNA e coordenando a formação do polipeptídeo, etapa
final da transferência de informação do DNA para moléculas estruturais e funcionais das células.

Assim, a tradução é compreendida em três etapas: iniciação,

alongamento e terminação.

• Iniciação: Etapa na qual o ribossomo se junta ao mRNA

e ao primeiro tRNA para que a tradução possa ter início,
formando o complexo de iniciação, a configuração molecular
necessária para começar a síntese de uma nova proteína;

• Alongamento: Nessa fase, os aminoácidos são trazidos ao

ribossomo pelos tRNA e são ligados entre si para formar uma
cadeia polipeptídica, tornando o polipeptídeo mais longo;

• Terminação: Em conclusão, o polipeptídeo final é liberado

para que possa cumprir sua função na célula, podendo entrar
no núcleo, ficar no citoplasma ou ser exportado para o meio
extracelular, dependendo de sua função.

33
 3 . 4 Código Genético

No dicionário Aurélio, a palavra Código é definida como um

sistema de símbolos usados para representar um significado pré-
estabelecido, às vezes secreto, por isso, visto que a sequência
de nucleotídeos no DNA e a ordem dos aminoácidos nas
proteínas são organizadas por um conjunto de regras, essas são
conhecidas como Código Genético (8).

Inicialmente, supôs-se que cada unidade codificadora seria

formada pela combinação de duas bases nitrogenadas, porém
quando se calculam combinações possíveis encontramos apenas
dezesseis, menor que o número de aminoácidos existentes,
um total de 20, o que inviabilizou tal hipótese. Após várias
experimentações, chegou-se à conclusão de que são trincas
(códons) de bases nitrogenadas que codificam os aminoácidos:
código de trincas ou tríades.

Considerando o código de trincas, são possíveis 64

combinações distintas de bases. Porém, um mesmo aminoácido
pode ser codificado por mais de uma trinca - por isso, se diz
que o código genético é degenerado, já que existem trincas
sinônimas (Figura 3.4). Além disso, existem três trincas que não
codificam aminoácidos, mas determinam o fim do polipeptídeo,
e atualmente está largamente demonstrado que o código
genético é universal (9).

34
Figura 3.4: Exemplo da degeneração do código genético, expondo os 4 códons distintos que podem
codificar o aminoácido valina.

35
 C A P Í T U LO 4

Mutações: a chave da variabilidade

genética

DNA é a fonte de informação genética, e a célula investe

muito na manutenção dessa informação, dispondo de vários
mecanismos altamente eficientes que proporcionam reparação
ao DNA modificado ou danificado (1).

Mutações representam as bases de toda variabilidade genética,

e, portanto, servem como matéria-prima aos processos de
melhoramento genético e evolução. Dada a hereditariedade
das mutações, essas devem ocorrer ao nível do gene,
provocando alterações do mesmo e, com isso, produzindo novas
formas alternativas, os chamados alelos, os quais já citamos
anteriormente (2).

4.1 Definindo Mutações

Denominamos mutação qualquer alteração na sequência de

DNA do genoma causada espontaneamente ou por agentes
chamados mutagênicos, que podem atingir células somáticas,
ou células germinativas (gametas) e, portanto, transmitidas aos
descendentes. Tais mutações podem ocorrer em qualquer gene
e em qualquer local do gene, sendo classificadas como gênicas,
quando alteram uma sequência de nucleotídeos do DNA e
cromossômica, quando alteram a estrutura ou o número de

36
cromossomos. Assim, as mutações são compreendidas como
“erros” na replicação do DNA que não foram identificados pelas
enzimas de reparo (3,4).

No entanto, as mutações também são responsáveis pela

capacidade das espécies de responderem às alterações
ambientais ao longo do tempo e, em certos casos, tais mutações
permitem uma produção de diferentes formas proteicas
adaptadas a novas condições ambientais, o que caracteriza o
polimorfismo (do grego “poli” que significa muitas ou múltiplos
e “morphos” que significa formas). Arbitrariamente, quando
ocorre uma alteração em único par de bases de DNA com
frequência superior a 1% na população, denominamos esta
alteração de polimorfismo de nucleotídeo único (do inglês,
SNP - “Single “Nucleotide Polymorphism”), atribuímos aos SNPs
a propriedade de variabilidade natural genética (4,5).

Assim, as mutações podem ser interpretadas quanto ao seu

potencial de efeito sobre o fenótipo como mutações de perda
de função, quando as alterações reduzem ou eliminam a
expressão de um produto gênico, ou como mutações de ganho
de função, que seriam as alterações adaptativas capazes de
gerar produtos gênicos mais eficientes (5).

4.2 Como classificamos mutações

As mutações que ocorrem em um único nucleotídeo são

classificadas como mutações pontuais e afetam apenas uma
base. Essas mutações podem ocorrer por substituição de bases,
nestes casos quando uma purina é substituída por outra purina
(A ‹–› G) ou uma pirimidina, por outra pirimidina (T ‹–› C),
chamamos de mutações do tipo transição. Em contrapartida,

37
quando ocorre a substituição de uma purina por uma pirimidina,
ou o inverso, chamamos mutação do tipo transversão (5).

As consequências de uma mutação pontual podem ser

catastróficas, alterando a sequência de aminoácidos que
compõe uma proteína (mutação de sentido trocado -
missense) ou produzindo um códon de parada (UAA, UAG
ou UGA), impedindo desta forma a síntese adequada da
proteína (mutação sem sentido – nonsense). Por outro lado,
pela particularidade do código genético de ser degenerado,
o que significa que um aminoácido pode ser codificado por
mais de um códon distinto, algumas mutações não promovem
nenhuma alteração na síntese proteica, e são ditas silenciosas
ou sinônimas (5).

Uma mutação de substituição ou sentido trocado acontece,

por exemplo, na anemia falciforme, doença genética resultante
da alteração de um nucleotídeo no gene da cadeia beta da
hemoglobina, que promove a substituição do ácido glutâmico
por valina. Essa troca leva à alteração na estrutura tridimensional
da proteína, e consequentemente à uma organização diferente
na cadeia da hemoglobina e à uma deformidade das hemácias,
com repercussão importante na oferta de oxigênio aos tecidos
(Figura 4.1).

Figura 4.1: Substituição do aminoácido Ácido Glutâmico por Valina altera a

estrutura da hemoglobina, deformando a hemácia.

38
Do mesmo modo que ocorrem pontualmente, as modificações
no DNA podem acontecer em fragmentos cromossômicos,
denominadas mutações cromossômicas estruturais, que podem
resultar dos processos de deleção, inversão, translocação
e duplicação (Figura 4.2) (4). Um exemplo de mutação
cromossômica por deleção ocorre na síndrome de “Cri du
chat” ou “miado do gato”, distúrbio raro, causado por deleção
no braço curto do cromossomo 5 com graves repercussões no
desenvolvimento neuropsicomotor da criança (6).

Figura 4.2: Exemplificação esquemática de um cromossomo que sofreu

deleção (à esquerda) e dois que sofreram translocação (à direita) de
fragmentos.

Na mutação por inversão, uma determinada região

cromossômica é quebrada, invertida 180 graus e re-inserida no
cromossomo (como acontece na rara síndrome de deficiência
intelectual ligada ao X conhecida como síndrome de Opitz-
Kaveggia (7). A translocação envolve a troca de segmentos
entre cromossomos e pode ser observada classicamente
no aparecimento da leucemia mielóide crônica, doença
hematopoiética onde há translocação entre os braços longos
dos cromossomos 9 e 22, formando o chamado cromossomo
Philadelphia (Ph) (8). Enquanto na duplicação, ocorre a
repetição de um fragmento cromossômico, causando um
aumento do número de genes (4).

39
As mutações decorrentes de duplicação ou deleção de
áreas cromossômicas inteiras relativamente grandes são
chamadas de variação do número de cópias (CNVs) e
distinguem-se de ganhos ou perdas de cromossomos inteiros
as chamadas mutações cromossômicas numéricas que
podem envolver todo o genoma (euploidia - na espécie
humana são relacionadas a abortos espontâneos) ou um ou
mais cromossomosos de um determinado par (aneuploidias,
como a conhecida trissomia do cromossomo 21 caracterizando a
síndrome de Down) (9).

As CNVs podem representar variações normais do genoma

humano ou patogênicas: as primeiras são geralmente pequenas
e intergênicas, isto é, não envolvem um gene inteiro, ao passo
que as últimas são tipicamente muito grandes e contém vários
genes - fenótipos anormais em até 20% dos indivíduos podem
ser explicados pelas CNVs (9).

Fique por dentro → Tipos de Mutações

mutação pontual, na qual a troca de uma base nitrogenada na sequência do
missense (senti- DNA , altera a sequência de aminoácidos codificada no mRNA ex: UUU (feni-
do trocado) lalanina) → UUA (leucina).

nonsense mutação pontual, na qual a troca de uma base nitrogenada insere um códon
de terminalização no mRNA (UAA, UAG e UGA), finalizando precocemente a
(sem sentido) síntese protéica.

mutação pontual, na qual a troca de uma base nitrogenada na sequência do

silenciosas DNA mantém a tradução do RNA no mesmo aminoácido.
ex: UUU (fenilalanina) → UUC (fenilalanina).
mutação na estrutura cromossômica devido à perda de uma sequência poli-
deleção nucleotídica
mutação que envolve a troca de segmentos entre cromossomos, de maneira
translocação recíproca, isto é, cada cromossomo recebe um fragmento do outro, ou não-
-recíproca, onde um cromossomo sofre uma deleção e o outro uma inserção.

mutação resultante da repetição de um fragmento cromossômico e subse-

duplicação quente aumento do número de genes.

mutações numéricas caracterizadas pela perda de um cromossomo ou

aneuploidia ausência de separação de um par de cromossomos durante a divisão celular
para formação dos gametas.

40
 C A P Í T U LO 5

Epigenética: Onde estamos e para onde

vamos?

A Epigenética nasceu da necessidade em explicar como um

organismo complexo com múltiplas células de fenótipos
distintos pode originar-se a partir de um único óvulo fertilizado.
Após a descoberta dos cromossomos no final do século XIX por
Flemming, fortes evidências comprovaram que tais estruturas
carreavam as informações para o desenvolvimento celular,
enquanto estudos com genes de Drosophila demonstraram
que modificações hereditárias nos genes poderiam justificar
mudanças correspondentes em fenótipos (1).

Em 1970, artigo publicado por Laskey e Gurdon demonstrou

que o DNA contido no núcleo de uma célula somática ao ser
introduzido em um ovo enucleado seria capaz de coordenar a
embriogênese, deixando claro que todas as células somáticas de
um indivíduo adulto carregam a mesma informação genética,
e portanto, algo além de mutações na sequência de DNA estaria
envolvido com a regulação da expressão fenotípica de cada
célula específica (1).

Dentro do núcleo celular eucariótico encontraremos DNA

intimamente ligado a proteínas histonas H1, H2A, H2B, H3, H4,
formando a cromatina, cuja regulação culmina com processos
de modificação no DNA tais como transcrição, replicação,
reparo, mitose e apoptose (2). Apesar de existirem diferenças
entre o DNA das células somáticas e aquele da linhagem
germinativa com consequências para o fenótipo celular, o

41
estudo da epigenética se concentra em modificações nas
bases e proteínas complexadas ao DNA, e que podem ser
clonalmente transmitidas por mitose ou meiose, explicando
alterações na expressão gênica que não envolvem mudanças
na sequência do DNA (1).

Grande parte das alterações hereditárias se instala durante a

diferenciação celular e são mantidas por múltiplas divisões
celulares, sendo assim, esse processo permite que as células
tenham identidades variadas, mesmo contendo a informação
genética igual. Esse padrão de expressão genética ocorre pelas
modificações epigenéticas, como acetilação, fosforilação
de histonas, ubiquitinação, metilação de DNA, microRNAs e
remodelação da cromatina (Figura 5.1) (3).

Figura 5.1: Resumo de mecanismos epigenéticos: acetilação, metilação e

miRNAs que influenciam tanto na expressão gênica quanto nos processos de
transcrição do mRNA e tradução de proteínas.

42
O ambiente externo influencia o epigenoma e cada indivíduo
modula determinada resposta para estes fatores externos.
Nesse contexto, em toda fase da vida, desde o nascimento até a
morte, somos expostos a ambientes que promovem mudanças
químicas capazes de ativar ou desativar a expressão de
genes. Estas interações podem contribuir para alterações
epigenéticas positivas (atividade física, dieta, entre outros) ou
negativas (estresse, drogas, álcool, entre outros). A epigenética
também está sendo estudada para doenças psicossociais como
a depressão e a dependência química (3).

5 . 1 Mecanismos Epigenéticos

Os mecanismos epigenéticos apresentam um papel central

em diversos distúrbios médicos e comportamentais, incluindo
doenças metabólicas, mentais, reprodutivas e câncer
(4,5). As assinaturas epigenéticas cumprem vários critérios
importantes para um biomarcador, pois apresentam
estabilidade em longo prazo e são relativamente fáceis de
detectar, além disso, são altamente seletivas e são sensíveis
aos estressores ambientais, fornecendo informações sobre
mudanças na exposição em momentos diferentes (6,7).

As modificações epigenéticas podem acontecer através de

processos distintos incapazes de alterar a sequência de bases
do DNA, como a metilação de nucleotídeos, acetilação e
modificação na configuração das histonas, sendo o primeiro
um processo transmissível, capaz de funcionar como alelos
verdadeiros e o último, um padrão não transmissível (3). Outro
mecanismo associado à Epigenética é a síntese de microRNAs
(miRNAs), que são RNAs de aproximadamente 22 nucleotídeos
não codificantes e capazes de exercer funções reguladoras

43
em regiões especificamente associadas a metilação do DNA e
implicada em diversas patologias como o câncer (Figura 5.1) (8).

5 . 1 . 1 Metilação do DNA

A regulação da expressão gênica é a função primordial da

metilação do DNA, processo que consiste em transferir um
grupo metil da S-adenil-metionina para o quinto carbono de
um resíduo de citosina, produzindo assim a 5-metil-citosina
(5mC) através de enzimas catalizadoras denominadas DNA
metiltransferases (DNMTs). Dentre elas, a DNMT1 (Figura
5.2) se associa aos focos de replicação do DNA e replica
precisamente o padrão de metilação original adicionando grupos
metil à fita filha recém-formada, garantindo assim a manutenção
do padrão de metilação do DNA (9).

As enzimas que participam da metilação do DNA podem ser

distribuídas em três classes: as escritoras, são as DNMTs que
catalisam a adição de grupos metil aos resíduos de citosina, as
apagadoras, removem o grupo metil causando a desmetilação
e por fim, as leitoras, enzimas que reconhecem o DNA metilado
e se ligam a ele para regular a expressão gênica. A maioria
da metilação do DNA ocorre em citosinas que precedem um
nucleotídeo guanina ou sítios CpG. Essas regiões estão por todo
o DNA e possuem um comprimento de 1000 pares de bases
e contêm cerca de 70% dos genes promotores, que modulam
a expressão gênica por meio da regulação da estrutura de
cromatina e ligação a fatores de transcrição (9).

44
Figura 5.2: A DNA metiltransferase 1 (DNMT1) é a responsável pela conversão do ácido nucléico citosina
em 5-metil citosina, sendo responsável pela metilação desse resíduo e consequente silenciamento dos
genes que compõem a porção do DNA metilada.

No câncer, tanto a presença de uma hipometilação quanto

aumentos localizados de metilação são observados. A
hipometilação ocorre predominantemente em regiões
repetitivas e demonstrou ser um processo cancerígeno por si só
(10). A hipometilação também promove instabilidade genômica,
causando desregulação dos cromossomos durante a divisão
celular (11). A hipermetilação por outro lado, pode conduzir ao
silenciamento de supressores tumorais chave (12) ou regiões
regulatórias dentro do genoma, levando à desregulação do
crescimento celular ou resposta alterada a terapias contra o
câncer (13).

O DNA está disposto em torno de proteínas conhecidas

como histonas, formando pequenos pacotes denominados
nucleossomos. Quanto mais forte for a ligação entre DNA e
histonas, menos permissivo ele será para a expressão gênica.
Uma das características comuns das ilhas CpG é que elas

45
contêm menos nucleossomos do que outros trechos de DNA,
e estes poucos nucleossomos apresentam geralmente histonas
modificadas que aumentam a expressão gênica através de uma
maior ligação ao fator de transcrição. Desta forma, a metilação
em ilhas CpG atua silenciando genes (Figura 5.2) ao prejudicar
a ligação de ativadores transcricionais (9).

Durante a gametogênese e o desenvolvimento embrionário

ocorre metilação das ilhas CpG. Evidências sugerem que os
padrões de metilação existem durante toda vida reprodutiva
do organismo. Para o sexo masculino tais padrões devem ser
propagados através das inúmeras divisões mitóticas sofridas
pelas espermatogônias anteriormente à meiose, enquanto nas
células germinativas femininas, a metilação de novo, isto é, a
remetilação após primeiro processo de desmetilação sofrido
pelas células germinativas primordiais em proliferação, ocorre
nos oócitos interrompidos na meiose I, os quais permanecerão
nesta fase, sem sofrerem divisões mitóticas até a fertilização.
Como resultado deste dimorfismo sexual, muitos distúrbios
genéticos esporádicos são causados principalmente por
mutações citosina –› timina em dinucleotídeos CpG metilados
de alelos paternos (14).

5 . 1 . 2 Acetilação de histonas

As histonas são proteínas carregadas positivamente devido

ao seu alto teor de resíduos de lisina e arginina. A acetilação
geralmente ocorre em resíduos de lisina, neutralizando sua
carga positiva e, assim, fazendo com que as histonas se afastem
do DNA, que possui uma carga negativa. A estrutura liberada
facilita o acesso à maquinaria de transcrição, como fatores
de transcrição e RNA polimerase II (15). Estudos têm sido

46
realizados sobre quando e como as modificações das histonas
controlam a expressão dos genes, exacerbando, acelerando ou
retardando o progresso das lesões ateroscleróticas, por exemplo
(16). Além disso, a desregulação desses processos pode alterar o
equilíbrio da expressão gênica e, portanto, são frequentemente
observados em cânceres humanos, seja por ganho ou perda
de função, superexpressão, supressão por hipermetilação
do promotor, translocação cromossômica ou mutações das
enzimas/complexos modificadores de histonas (17,18).

Dois grupos de enzimas, lisina acetiltransferases (HATs) e

lisina desacetilases (HDACs), funcionam de forma antagônica
para controlar o equilíbrio entre a acetilação e a desacetilação
(Figura 5.3) (17).

Figura 5.3: Acetilação e desacetilação de histonas. A lisina acetiltransferases

(HATs) promove a acetilação dos resíduos de lisina da proteína histona,
promovendo um relaxamento da cromatina nessa região, permitindo uma
maior facilidade na transcrição gênica dessa região acetilada. Por outro
lado, as enzimas lisina desacetilases (HDACs) vão atuar desacetilando esses
resíduos, favorecendo um estado de maior condensação da cromatina e,
consequentemente, uma repressão transcricional.

47
As modificações sofridas pelas histonas após a tradução (post-
transcriptional modifications - PTMs) obedecem a um padrão
que dá forma à cromatina e sua desregulação está associada
com a etiologia de diversas doenças como o câncer (19).

Alterações no nível de transcrição de várias HDACs foram

observadas em vários cânceres, como câncer colorretal, gástrico,
de esôfago, mama, ovário, pulmão, pâncreas, tireóide, próstata
e oral, bem como melanoma maligno (20). Vários inibidores
de Histonas Desacetilases (IHDA) (belinostat, romidepsina,
panobinostat, vorinostat e chidamida) que obtiveram a
aprovação da Food and Drug Administration (FDA) (20) já
foram aplicados isoladamente ou com outros medicamentos
terapêuticos no tratamento clínico de vários tumores
hematológicos.

5 . 1 . 3 MicroRNA (miRNAs)

RNAs de fita simples de 21-25 nucleotídeos são denominados

microRNAs (miRNAs) e são sintetizados a partir da ação
de duas proteínas do tipo ribonucleases II (RNase II), as
proteínas Drosha e Dicer. A síntese (Figura 5.4) acontece a
partir de miRNAs primários (pri-miRNAs), estes por sua
vez são transformados pela Drosha, RNase nuclear, em um
precursor primário chamado pré—miRNA, subsequentemente
transportado ao citoplasma onde será processado para a forma
ativa do miRNA por ação da Dicer e carregados por uma família
de proteínas Argonautas (Ago 1-4) (21).

Modelos animais demonstraram que a ligação do miRNA

48
maduro à proteínas Ago 1-4 ocorre em duas fitas de miRNA,
a fita passageira que será degradada e a fita guia que
efetivamente atua como miRNA através de um complexo efetor
denominado mi-RISC (complexo de silenciamento induzido
por RNA). O mi-RISC passa a reconhecer especificamente o
RNA mensageiro (mRNA) na região 3 não traduzida (3ʹ UTR)
e regula negativamente a expressão gênica através de dois
mecanismos pós-transcricionais: a repressão traducional ou a
clivagem do mRNA (21).

Dessa forma os miRNAs atuam como mecanismos epigenéticos

ao promoverem modificações na expressão gênica por sua
influência no mRNA, sem promover alterações na sequência
de bases do DNA, e têm se tornado um importante foco de
interesse como alvos terapêuticos para várias doenças, desde
Alzheimer a diabetes e câncer (8).

Figura 5.4: Processamento do miRNA. A transcrição dos genes que codificam o microRNA é realizada
pelas enzimas RNA polimerase II e III. Em seguida, é transcrito uma sequência de microRNA primário
(Pri-miRNA) a qual será clivada pela proteína Drosha. Após isso, essa molécula que já é denominada
de Pré-miRNA é, então, exportada do núcleo para o citoplasma da célula, por meio da Exportina-5.
Nesse citoplasma a proteína Dicer cliva o Pré-miRNA em uma fita dupla de miRNA (miRNA duplex) que
vai gerar duas fitas: a passageira e a guia. A fita passageira será degradada no citoplasma e reciclada,
enquanto que a fita guia será carreada pela proteína Argonauta-2 (Ago2) que formará o complexo de
mi-RISC (Complexo de silenciamento induzido por RNA) que vai maturar o microRNA. Por fim, esse
microRNA vai poder exercer suas funções na célula que são: Clivar o mRNA e a repressão traducional.

49
 5 . 2 Impacto na Saúde

Algumas doenças que acometem o homem violam as leis

mendelianas de herança genética e passam a ser explicadas
por mecanismos epigenéticos. Um destes mecanismos é a
impressão genômica ou impressão parental, onde apenas
um alelo transmitido por um dos genitores é expresso, enquanto
o outro é silenciado através de um processo de metilação do
DNA (22).

Estima-se que existam 100 a 200 genes de impressão parental,

e o primeiro deles a ser identificado foi o gene do fator de
crescimento semelhante à insulina 2 (IGF2) cujo alelo
paterno expressa-se enquanto o alelo materno é metilado
e consequentemente inativado. Este padrão de metilação
está suscetível a interferência de agentes ambientais como
fatores nutricionais, por exemplo, o que pôde ser observado
em um experimento com camundongos submetidos a dieta
sintética após desmame demonstrando a hipermetilação nos
alelos paternos renais do gene IGF2. Vários outros modelos
experimentais têm demonstrado como a dieta materna durante
a gestação, bem como estressores ambientais no período
neonatal podem influenciar os processos de metilação de genes
promotores impactando em doenças que vão se expressar ao
longo da vida. Este padrão de influência nutricional perinatal na
metilação do IGF2 foi também demonstrado em humanos por
meio de estudo de coorte na década de 40 onde indivíduos
que foram expostos à fome no período pré-natal tiveram, seis
décadas depois, menos metilação do DNA do gene IGF2 em
comparação com seus irmãos não expostos do mesmo sexo.
Apesar dos estudos epigenéticos enfatizarem a metilação
do DNA, a acetilação de histonas também exerce influência
na expressão gênica, tanto reprimindo quanto promovendo
alguns genes, assim como os miRNAs através de um feedback

50
cíclico, onde se por um lado, a expressão de certos miRNAs
é controlada pela metilação do DNA, os próprios miRNAs
são capazes de modificar os mecanismos de metilação e
a expressão de proteínas envolvidas nas modificações das
histonas e assim parecem desempenhar um papel na gênese do
câncer (23).

Embora os miRNAs possam atuar como oncogenes ou genes

supressores tumorais, evidências suportam que a expressão
de miRNA está suprimida globalmente em células tumorais
quando comparadas ao tecido normal. De fato, os componentes
responsáveis pelo processamento de miRNA como as RNase
III estão diminuídos em alguns tipos de câncer, como câncer de
pulmão e câncer de ovário e neuroblastoma, correlacionando-
se com um pior prognóstico clínico em alguns casos. Assim
miRNAs são reconhecidos como agentes capazes de controlar
a proliferação celular, diferenciação, sobrevivência,
metabolismo, estabilidade do genoma, inflamação, invasão
e angiogênese no desenvolvimento do tumor, e portanto, são
potenciais alvos terapêuticos para o desenvolvimento de novos
medicamentos no atual cenário da terapia gênica (24).

51
 C A P Í T U LO 6

Marcadores genéticos: como, quando e

para quê?

A palavra biomarcador foi usada pela primeira vez por

Karpetsky, Humphrey e Levy em abril de 1977 (1). Em 2001,
o termo biomarcador foi definido por um grupo de trabalho
do National Institutes of Health como: “uma característica
que é objetivamente medida e avaliada como um indicador
de processos biológicos normais, processos patogênicos ou
resposta a uma intervenção terapêutica” (2). Uma definição
mais recente caracteriza um biomarcador como: “uma variante
funcional ou índice quantitativo de um processo biológico que
prevê ou reflete a evolução ou predisposição para uma doença
ou uma resposta à terapia” (3). Dessa forma, os biomarcadores
podem ser classificados de acordo com suas aplicações para
fins diagnósticos, prognósticos e preditivos (4), podendo ser
utilizados potencialmente ao longo da história natural de uma
doença (Figura 6.1).

Os biomarcadores podem ser células, moléculas, genes

específicos, produtos genéticos, enzimas ou hormônios (5).
Biomarcadores moleculares têm sido usados por décadas em
pesquisas pré-clínicas e clínicas. Uma vez que esses testes se
tornaram testes de rotina, eles foram totalmente automatizados
em animais e humanos. Entre os testes mais comuns estão os
que avaliam a função hepática (por exemplo, transaminases,
bilirrubina, fosfatase alcalina) e função renal (por exemplo,
creatinina sérica, depuração de creatinina). Outros incluem
marcadores de músculo esquelético (por exemplo, mioglobina)

52
ou lesão do músculo cardíaco (por exemplo, creatina quinase
MB, troponina I ou T) (6). A avaliação dessas moléculas fornece
importantes ferramentas para rastrear a atividade biológica
geral.

Figura 6.1. Uso potencial de biomarcadores na história natural da doença.

Adaptado de LIPPI; MATTIUZZI (2015). O biomarcador pode ser utilizado
para fins diagnósticos e prognósticos entre o início de uma doença e a sua
progressão, por exemplo, no caso de uma síndrome coronariana aguda, ele
pode ser utilizado com esse objetivo entre o evento agudo que causou essa
síndrome e a necrose miocárdica. No entanto, entre a progressão da doença e
a terapia a ser administrada, esse biomarcador tem a função de monitoramento
terapêutico, no exemplo apresentado esse momento seria durante o período
que ocorreu a necrose miocárdica e o tratamento de revascularização. Por
fim, após a administração da terapia até o desfecho clínico, esse biomarcador
determinará o prognóstico do paciente, que no caso apresentado pode ser
avaliado desde o tratamento de revascularização até o desfecho clínico (morte,
insuficiência cardíaca, sobrevivência).

53
 6 . 1 Tipos de biomarcadores

Um biomarcador de diagnóstico detecta ou confirma

a presença de uma doença ou condição de interesse, ou
identifica um indivíduo com um subtipo da doença. Este tipo de
biomarcador pode ser útil em um conjunto de circunstâncias
clínicas, nas quais diferentes características podem ser
consideradas. Em doenças de baixa prevalência, como câncer
de pâncreas ou ovário, para as quais um novo diagnóstico é
psicologicamente devastador ou exigiria avaliação invasiva, um
biomarcador precisa ter uma taxa de falso-positivos muito baixa.
Por outro lado, no rastreamento de doenças comuns, como
hipertensão e hiperlipidemia, para as quais avaliações repetidas
podem ser feitas com pouco risco, taxas de falso-positivo mais
altas são toleráveis e o foco de preocupação pode estar nas
taxas de falso-negativo (7).

Biomarcadores preditivos permitem prever a resposta

do paciente a uma terapia direcionada e, assim, definir
subpopulações de pacientes que provavelmente se beneficiarão
de uma terapia específica. Por outro lado, biomarcadores
de valor prognóstico representam uma característica clínica
ou biológica que fornece informações sobre o provável curso
da doença, fornecendo informações associadas a desfechos
diferenciais da doença no paciente (8). Desta forma, a distinção
entre marcadores prognósticos e preditivos é extremamente
importante ao avaliar os resultados prováveis da doença com o
tratamento.

Dentre os biomarcadores epigenéticos, os miRNAs são

os mais atrativos, pois podem ser detectados em pequenos
volumes de amostra, são estáveis ​​e podem ser obtidos no
plasma, soro, saliva e urina. Curiosamente, eles são altamente
conservados, o que permite uma comparação confiável entre

54
pacientes e modelos animais de doença. Portanto, embora
todos os mecanismos epigenéticos estejam sendo intensamente
investigados, os miRNAs são os mais avaliados quanto ao seu uso
como biomarcadores preditivos (Figura 6.2) (9). As evidências
sugerem que eles podem desempenhar um papel essencial
como biomarcadores no câncer (10,11), em neurologia para o
diagnóstico e prognóstico da doença de Alzheimer (12), para
pacientes com epilepsia (13) ou doenças neurodegenerativas
(14). Também poderia ser usado como um meio mais rápido e
preciso de diagnóstico de doença cardiovascular aguda ou
insuficiência cardíaca (15,16) e, no caso de doenças infecciosas,
para o diagnóstico de sepse (17).

Figura 6.2 miRNAs envolvidos em doenças humanas. Adaptado de

Chakraborty et al. (2020) (18).

Um dos principais fatores que limitam o uso de miRNAs como

ferramenta diagnóstica em ambientes clínicos na oncologia

55
está associado ao fato de que biomarcadores de miRNA
frequentemente relatados são detectados em pacientes com
diferentes tipos de tumor (19). Por isso, à medida que mais
miRNAs são testados em estudos de validação em grande
escala e ensaios clínicos, nos aproximamos de biomarcadores de
miRNA clínicos eficazes, tornando-se uma realidade.

Biomarcadores genéticos são derivados de tecnologias que

avaliam mudanças genômicas, como o sequenciamento do
exoma e do genoma completo, reação em cadeia da polimerase
(PCR) e hibridização fluorescente in situ (FISH). Eles podem
identificar com precisão polimorfismos de nucleotídeo único
(SNPs), variações do número de cópias (CNVs) e variações
estruturais no genoma e delinear seu significado funcional na
fisiopatologia de um fenótipo definido. Essas tecnologias têm
sido fundamentais para encontrar marcadores de estratificação
em oncologia e algumas delas já estão na prática clínica (20 -
22).

6 . 2 Biomarcadores e a medicina
personalizada

A medicina personalizada promete uma determinação

mais precisa da predisposição à doença, diagnóstico,
prognóstico, intervenções preventivas, terapêuticas
precoces e um processo de desenvolvimento de medicamentos
mais eficiente e mais seguro. Estudos com combinação de
diferentes abordagens “ômicas” (genômica, proteômica,
transcriptômica e metabolômica) para medir a atividade
molecular em diferentes níveis de complexidade alteram a
compreensão da saúde e da doença e ajudam nos avanços
de busca por uma medicina personalizada, acelerando o

56
ritmo em avanços relevantes para a pesquisa translacional,
sendo os biomarcadores ferramentas essenciais para a sua
implementação (23).

Padrões entre conjuntos de dados genéticos,

transcriptômicos, epigenéticos, metabolômicos e de
proteínas gerados a partir de coortes de pacientes podem ser
usados ​​para identificar potenciais biomarcadores de câncer
(Tabela 6.1) (24,25,26).

Fique por dentro → “ÔMICAS”

Polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs) associados a doenças ou re-
Genômica sultados clínicos.
ex: SNPs e câncer de mama (27).
Bioassinaturas de expressão gênica para classificação de paciente
Transcriptômica ex: assinatura de expressão gênica no câncer de mama (28).
Perfil metabólico do soro ou plasma para estratificação de risco
Proteômica ex: proteínas séricas nos diferentes estágios do câncer de mama (29).
Bioassinaturas de proteoma do plasma para avaliação de risco e diagnóstico
Metabolômica ex: perfil metabolômico de câncer de mama (30).

Tabela 6.1. Principais tipos de informações “ômicas” usadas para implementar

biomarcadores diagnósticos ou prognósticos.

6 . 3 Biomarcadores na prática clínica

O câncer é uma das principais causas de morte em todo o

mundo, sendo responsável por quase 10 milhões de mortes
em 2020 (31), e por isso é considerado um problema de saúde
pública mundial.

As células cancerosas exibem uma ampla gama de alterações

genéticas que incluem rearranjos gênicos, mutações
pontuais e amplificações gênicas, levando a perturbações
nas vias moleculares que regulam o crescimento, sobrevivência

57
e metástase celular. Quando as alterações são encontradas
na maioria dos pacientes com um tipo específico de tumor,
podem ser usados como biomarcadores para detecção e
desenvolvimento de terapias direcionadas, além de antecipar
respostas a diversos tratamentos (32,33).

Desde então, inúmeros esforços têm sido dedicados à

identificação de biomarcadores metabólicos em oncologia.
Espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR),
cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC),
radioimunoensaio, espectrometria de massa de cromatografia
líquida (LCMS), espectrometria de massa de cromatografia
gasosa (GCMS) e imunoensaio enzimático são fundamentais
para analisar os níveis de metabólitos em resposta à mudança
fisiopatológica ou tratamento (34).

Diferente das medições bioquímicas e histopatológicas

únicas tradicionais, os biomarcadores de expressão
(transcriptômico) representam uma impressão digital
contendo vários marcadores, que coletivamente indicam uma
fisiopatologia particular. A maioria dos estudos de marcadores
de câncer examina variáveis ​​genéticas individuais, alterações do
transcriptoma e função prejudicada da proteína como fatores
de risco e prognóstico distintos. As abordagens simplificadas
para a descoberta de biomarcadores podem ser atribuídas
aos métodos analíticos disponíveis, que avaliam o genoma
(DNA), o transcriptoma (RNA) ou a composição de proteínas
separadamente (24-26,35).

Tecnologias de alto rendimento, como perfil de expressão de

microarray bem estabelecido e tecnologias de sequenciamento
de RNA mais recentes são capazes de identificar a expressão
diferencial de um genoma inteiro em qualquer amostra
específica (35).

58
O plasma humano detém a maior fonte de proteoma e
tecnologias que podem medir pequenas alterações de
certas proteínas são ferramentas inestimáveis para identificar
biomarcadores de proteína no sangue. A aplicação da
proteômica na descoberta de biomarcadores oncológicos pode
ser exemplificada por HER2 derivado da imunohistoquímica,
um marcador prognóstico e preditivo para a sensibilidade à
terapia com trastuzumabe (Anticorpo monoclonal IgG1 contra o
receptor HER-2) no câncer de mama (36).

O sequenciamento do gene KRAS e a PCR foram usados para

descobrir o papel preditivo e prognóstico da mutação KRAS no
câncer colorretal e câncer de pulmão para resistência à terapia
anti-EGFR, sendo assim, um dos primeiros de caráter preditivo a
alcançar a prática clínica (21) (Tabela 6.2).

Fique por dentro → Biomarcadores

Biomarcador Terapia
EGFR Cetuximab, Eriotinib, Gefitinib, Panitumumab
HER 2 Lapatinib, Trastuzumab, Pertuzumab
PDGFR Imatinib
RE Fulvestrant
ALK Crizotinib
KRAS Cetuximab, Panitumumab
BRAF Vemurafenib
CD20 Tositumumab
CD25 Denileukin difitox
CD30 Brentuximab vedotin
C-kit Imatinib
PML-RARa Arsenic troixide
BCR-ABL Desatinib

Tabela 6.2: biomarcadores de estratificação para terapia direcionada em oncologia (37).

59
 6 . 3 Biomarcadores epigenéticos

A metilação do DNA tem grande potencial para ser usada

como biomarcador em muitas aplicações. Como os grupos
metil nas citosinas são parte da estrutura covalente do DNA,
eles podem ser transferidos com relativa facilidade de um
ambiente de laboratório de pesquisa para diagnósticos de rotina
devido à natureza amplificável e estável do DNA. Uma vez
que a metilação é adquirida, é na maioria dos casos química
e biologicamente estável ao longo do tempo, além disso as
assinaturas de metilação podem ser detectadas em muitos
fluidos corporais, incluindo soro/plasma, aspirado de fluido
mamilar, fluido vaginal e urina, o que é importante para o uso
clínico de biomarcadores de metilação de DNA (38,39).

Se o padrão de metilação for específico para um determinado

tipo de tumor e/ou correlaciona-se com parâmetros
clinicamente importantes na ausência de correlação com
a inativação do gene, a metilação do DNA pode ser um
biomarcador útil para o diagnóstico de tumor ou avaliação
de risco. (40). A escolha da região a ser estudada é um dos
desafios críticos para estabelecer um biomarcador de metilação
de DNA que seja clinicamente útil. Idealmente, a região
investigada deve atender aos seguintes critérios: primeiro, a
região deve ser não metilada em casos normais e metilada
em casos de câncer; e segundo, os níveis de metilação dessa
região devem permitir claramente a classificação de uma
amostra como normal ou cancerosa.

Foi demonstrado que a hipermetilação e o silenciamento

de SMAD1 predizem a resistência à quimioterapia em
pacientes com linfoma difuso de grandes células B de alto
risco (41). O silenciamento epigenético do gene da septina 9
(SEPT9) por metilação do promotor no plasma demonstrou

60
ser um biomarcador promissor para a detecção de câncer
colorretal com sensibilidade e especificidade aprimoradas em
comparação com os testes de sangue oculto nas fezes (42).
Outro biomarcador de metilação do DNA para a detecção
precoce do câncer colorretal é o gene da vimentina (VIM). O
VIM foi escolhido como biomarcador porque era metilado em
cânceres colorretais, mas não na mucosa colorretal normal ou em
outros tecidos saudáveis. Foi demonstrado que era prontamente
detectável nas fezes e se tornou a base do primeiro teste
de diagnóstico baseado em metilação de DNA disponível
comercialmente (43,44).

CDKN2A (inibidor de cinase dependente de ciclina 2A)

foi o primeiro gene supressor de tumor a ser inativado
pela metilação do promotor no câncer de pulmão (45). O
silenciamento transcricional de CDKN2A por metilação do
promotor é um evento precoce durante a tumorigênese
pulmonar, independentemente do subtipo histológico. Além
disso, a metilação de CDKN2A foi detectada em pacientes com
câncer de pulmão, tanto de fumantes quanto de não fumantes
(46).

A metilação de SHOX2 é um biomarcador emergente para o

diagnóstico de câncer de pulmão, particularmente nos casos
em que os resultados da histologia e da citologia fornecem um
diagnóstico inconclusivo. Uma avaliação quantitativa do status
de metilação do gene SHOX2 em aspirados brônquicos ajudou
a distinguir entre câncer de pulmão maligno e várias doenças
pulmonares benignas (47).

Uma exceção importante é a metilação de PITX2, que é um

biomarcador de prognóstico promissor no câncer de mama e
de próstata. Por meio de vários estudos, pacientes com câncer
de mama com linfonodo negativo e receptor de estrogênio
positivo com um promotor PITX2 metilado foram associados

61
a um resultado ruim sem qualquer terapia adjuvante (48), bem
como a um risco aumentado de recorrência após a cirurgia
quando tratadas com tamoxifeno (49,50).

As amostras desses biomarcadores para serem analisadas

podem ser: urina, saliva, sangue, escovados, fragmentos
de biópsias e são realizadas pelos Métodos de Análise dos
Processos Epigenéticos (51):

• Enzimas de restrição sensíveis à metilação + PCR

• Acetilação

• PCR-metilação específica (MS-PCR)

• Sequenciamento

• Microarray

• HRM (High Resolution Melting)

O envolvimento de microRNAs (miRNAs) em processos

celulares essenciais, como proliferação e morte celular, e o
conhecido controle negativo sobre a expressão de numerosas
oncoproteínas, o que os tornam os principais candidatos
a biomarcadores de câncer. Também foi relatado que
miRNAs específicos do câncer são detectados no sangue nos
estágios iniciais do desenvolvimento do tumor e aumentam na
concentração conforme o tumor progride ao longo do tempo,
tornando-os um indicador do crescimento do tumor. Além disso,
ao contrário de outros tipos de biomarcadores, os miRNAs são
notavelmente estáveis na ​​ circulação e no tecido embebido
em parafina fixada em formalina, tornando-os potenciais
biomarcadores de oncologia (52).

62
As vantagens dos marcadores epigenéticos, como os
microRNAs, é que eles são acessíveis em fluidos corporais
(Figura 6.3), evitando, assim, a necessidade de amostras de
biópsia coletadas para o desenvolvimento e monitoramento de
biomarcadores transcricionais. Os mecanismos epigenéticos
estão geralmente envolvidos nos estágios iniciais do
desenvolvimento da doença e, portanto, são marcadores
que têm o potencial de ser mais adequados do que os
biomarcadores transcricionais para o diagnóstico precoce.
Diferentes estágios e tipos de câncer têm assinaturas de
metilação exclusivas, e tais assinaturas podem ser alvos no
desenvolvimento de biomarcadores específicos e precisos para
auxiliar na avaliação do tipo de tumor, bem como no prognóstico
e no gerenciamento da doença (53-55).

Figura 6.3 Alterações genômicas que podem ser utilizadas em biópsia líquida.

Os avanços na metodologia e na análise de conjunto de dados

grandes (big data) identificaram novos mecanismos e alvos
envolvidos em inúmeras doenças, permitindo a elaboração de
mapas epigenéticos mais individualizados para diagnóstico

63
e tratamento personalizados. Isso abre caminho para o que
é chamado de farmacoepigenética, que prevê a resposta ao
medicamento e desenvolve uma terapia sob medida com base
nas diferenças na base epigenética de cada paciente. (56)

Nesse contexto, a farmacoepigenômica investiga variações

no epigenoma do câncer para determinar o fenótipo de
resposta à droga do tumor (57). Até agora, a pesquisa em
farmacoepigenômica tem se concentrado nas mudanças de
metilação do DNA para determinar as variações na resposta
do medicamento quimioterápico. A metilação de BRCA, por
exemplo, mostrou sensibilizar as linhas de células de câncer
de mama para o tratamento com inibidores de Poli Adenosina
difosfato Ribose (PARP) (58).

6 . 5 Validação de um biomarcador

A avaliação da validade de um biomarcador é complexa.

SCHULTE e PERERA (59) sugerem três aspectos para validade
de medição (Figura 6.4):

1) Validade de conteúdo, que mostra o grau em que um

biomarcador reflete o fenômeno biológico estudado.

2) Validade de construto, que pertence a outras características

relevantes da doença, por exemplo, outros biomarcadores ou
manifestações da doença.

3) Validade de critério, que mostra até que ponto o

biomarcador se correlaciona com a doença específica e é
geralmente medido pela sensibilidade, especificidade e poder
preditivo.

64
Figura 6.4 Etapas de validação de um biomarcador. Adaptado de DAVIS, (2017) (60). A primeira
etapa denominada de fase pré-analítica, consiste na coleta, processamento e armazenamento dessas
amostras que serão avaliadas o nível de sensibilidade/especificidade, linearidade, precisão, limite de
detecção nas amostras, reprodutibilidade, repetibilidade e robustez dos ensaios realizados. A partir
da geração dessas informações esses dados serão analisados em conjunto e/ou contexto por meio
de tecnologias digitais, tais quais o Big Data. Em seguida, parâmetros clínicos deverão ser avaliados,
entre eles, a sensibilidade/especificidade clínica, valor preditivo positivo e negativo clínico, AUC/ROC
(Curva que representa o quanto a molécula interage com o receptor específico alvo), ponto de corte
(quanto esses valores podem ser considerados na prática clínica), estabelecimento e estratificação de
características individuais que vão definir se o paciente é respondedor ou não à técnica empregada,
validação externa (teste aplicado em outro laboratório/clínica e pacientes multicêntricos). Por fim,
define-se a possibilidade do uso clínico desse biomarcador, ou seja, se ele influencia o prognóstico
e o diagnóstico e, em seguida, segue para a aprovação dos agentes regulatórios do país, como por
exemplo a ANVISA no Brasil.

Diferentes aplicações de biomarcadores requerem

direcionamento no método de validação. A validação de
marcadores é normalmente obtida por meio do uso de coortes
de amostra independentes. A replicação dos resultados
em diferentes populações de amostra é essencial. Muitos
estudos hoje são realizados tanto em coorte para identificar
loci de suscetibilidade e uma coorte de validação para
replicar e validar os resultados, ambos no âmbito da mesma
investigação. Esses estudos de replicação podem ser difíceis
por causa da complexidade envolvida no controle ambiental
e fatores entre diferentes populações. Assim, um marcador
biológico pode contribuir para a doença em uma população e

65
pode não se replicar em outra população que estava sujeita a
uma diferença de fator ambiental. Em contraste com a validação,
a qualificação do biomarcador se concentra na evidência que
liga um biomarcador com a biologia da doença e, conforme
apropriado, com os desfechos clínicos (61).

66
 C A P Í T U LO 7

Terapias direcionadas e gênicas

7. 1 Terapia direcionada

A terapia direcionada consiste em medicamentos que foram

elaborados com o objetivo de ação em alterações genéticas
específicas, e tem se destacado como um grande avanço na
área oncológica. As terapias-alvo visam os genes, proteínas
ou o ambiente tecidual específico do tumor que colaboram
para o crescimento e sobrevida do tumor (1). Anticorpos
monoclonais são anticorpos produzidos e excretados pelo
linfócito B. Diferentes tipos de anticorpos monoclonais podem
ser gerados em laboratório e possuem como alvo a ligação aos
antígenos de interesse. Os anticorpos monoclonais não são
utilizados somente nos casos de câncer, a terapia direcionada
também desempenha um papel importante no tratamento
de doenças cardiovasculares, quando envolve por exemplo
a mutação de um gene, além de ser usado em doenças
reumatológicas (2).

O mecanismo de ação dos anticorpos monoclonais possui 4

frentes: inicia-se pela ativação da resposta imune aos tecidos
anormais. Os anticorpos monoclonais se ligam ao epítopo alvo
e podem mediar a citotoxicidade celular dependente de
anticorpos, citotoxicidade mediada por complemento ou
inibir diretamente sinais anormais de células (3). Na segunda
opção ocorre a inibição da sobrevivência dos tecidos
patogênicos, os anticorpos monoclonais podem se ligar aos
fatores de crescimento e bloquear a angiogênese dos tecidos
lesados, como é o exemplo do Bevacizumabe. A terceira pelo
bloqueio de sinais inibitórios das células efetoras: A interação

67
entre o receptor da proteína 1 de morte celular programada
(PD-1) e seu ligante (PD-L1) resulta na disfunção das células T,
que pode ser recuperada por certos anticorpos monoclonais
através do bloqueio do sinal PD-1 / PD-L1, o Nivolumabe. E a
quarta ocorre o acoplamento com as drogas terapêuticas:
os anticorpos monoclonais equipados com radiofármacos
ou quimioterápicos podem ajudar a entregar e liberar drogas
após a ligação às moléculas alvo (exemplos: trastuzumabe,
entansina) (3, 4). Ver tabela 7.1

Tabela 7.1: Alguns anticorpos monoclonais e os seus respectivos mecanismos

de ação.

68
Com isso podemos perceber que os anticorpos monoclonais
foram um avanço na genética para diversas áreas,
proporcionando qualidade de vida e esperança para algumas
patologias que antes não tinham opção de tratamento. Vários
estudos estão em andamento em diversas fases clínicas (1, 2, 3 e
4) voltados para essa linha de medicamento que vem trazendo
benefícios e com poucos efeitos colaterais (5).

7. 2 Terapia gênica

Em 1944 um estudo realizado por Oswald T. Avery mostrou

que a transferência de genes é possível (ver capítulo 2). Com
estas descobertas existiam bases para investigar uma forma de
inserir genes saudáveis em indivíduos com genes defeituosos
ou ausentes. Em 1969 foi realizado o primeiro isolamento do
gene por Jon Beckwith, na Universidade de Harvard. Ao mesmo
tempo que cientistas defendiam essa possibilidade, houve
uma grande polêmica em relação a segurança da engenharia
genética que durou por toda década de 1970 e acabou dando
origem na elaboração de legislações em diversos países para
que houvesse segurança neste procedimento. Foi criado em
1972, por Theodore Friedmann e Richard Roblin, o conceito
de terapia gênica, “Terapia genética para doenças genéticas
humanas?’’ (6,7).

Um grande marco foi em 1977, Michael Wigler e Richard Axel

apresentaram sucesso pela primeira vez na correção genética
em células de mamíferos cultivadas in vitro. A técnica realizada,
mesmo com evidência, não era tão eficiente e, com isto, a
proposta citada de utilização de vírus não-patogênicos como
vetores transportadores de genes ficou mais forte. Em 1983 e
1984 a proposta foi com os vetores de três espécies de vírus,

69
sendo eles: Adenovírus - material genético DNA dupla-hélice,
Retrovírus - forma de RNA, e Vírus adeno associados -
genoma de DNA de fita simples (7,8).

Em Agosto de 2017 foi aprovada a primeira terapia gênica no

mundo, nos EUA pela FDA – Agência Federal de Alimentos e
Medicamentos dos EUA para uma forma de Leucemia Agressiva.
Já no Brasil foi aprovada em Agosto de 2020 pela ANVISA
- Agência Nacional de Vigilância Sanitária a primeira terapia
gênica. O uso foi para distrofia hereditária da retina, uma
doença que leva a perda da visão (9).

7. 2 . 1 Definição

A terapia gênica ou terapia genética trata-se da realização de

melhoramento genético, ou seja, é realizado modificando
o DNA com genes mutados fazendo a substituição,
transferência desse gene defeituoso ou na ausência de um
gene. Atualmente existem vários estudos com terapia gênica
para diversas doenças. Uma verdadeira esperança para as
pessoas que sofrem de doenças raras ou doenças genéticas de
forma geral. Com significativas descobertas de como manipular
o DNA, os estudos pré-clínicos e estudos clínicos com terapia
gênica são possíveis (10) .

Ainda em fase experimental, não se pode afirmar que a

terapia gênica cura, mas ao utilizá-la se deseja obter a cura. O
tratamento pode ser realizado de forma sistêmica ou local. A
introdução de gene pode se dar das seguintes formas:

• In vivo: o vetor é introduzido no organismo de forma direta,

sendo considerada a mais eficiente e com menor custo.

70
 Nesta forma há a necessidade de encaminhamento correto,
como por exemplo: se um gene é destinado a um órgão é
importante ter certeza que ele irá chegar neste órgão e não
em outro.

• Ex vivo: são retiradas células do indivíduo, em seguida

modificadas e inseridas novamente no organismo. Esta
técnica é mais complicada, mas tem mais facilidade de
controle.

A Terapia Gênica pode ser dividida em dois tipos (10,11):

• Germinativa: quando ocorre a introdução dos genes no

zigoto ou nos óvulos e espermatozóides. O objetivo é que
células originadas de células germinativas terão o gene de
interesse genoma.

• Somática: introdução de genes nas células somáticas (células

não germinativas). Estas células estão em maior quantidade
no organismo. Esta técnica é mais utilizada. Não ocorre
transmissão dos genes para os descendentes, como acontece
na germinativa.

7. 2 . 2 Vetores utilizados na Terapia

Genética

A eficiência da entrega de genes é bastante importante para

uma terapia genética bem-sucedida. Para este fim, vários
vetores virais e não virais foram projetados, incluindo vírus,
bactérias e lipossomas replicantes e não replicantes. Cada
uma varia em relação ao tipo de célula-alvo, capacidade de

71
transporte de DNA, eficiência de transferência gênica in vivo
e resposta inflamatória induzida. Embora nenhum vetor seja
adequado para todas as doenças, pode-se adaptar o vetor à
doença específica de interesse (12).

Os Adenovírus recombinantes são os vetores mais

amplamente utilizados para a replicação. Várias características
do vetor adenoviral o tornam atraente para a terapia gênica
do câncer, como: uma ampla gama de células alvo, elevadas
taxas de eficiência, e capacidade de realizar transferência de
genes de alto nível, mas de forma transitória (12, 13).

Em relação aos Retrovírus, as principais vantagens desse vetor

derivam de sua capacidade de realizar uma transferência gênica
eficiente in vitro em uma ampla gama de células-alvo, com a
capacidade de conseguir integração no genoma do hospedeiro
e expressão de longo prazo. No entanto, os vetores retrovirais
podem atingir a transferência de genes apenas para células em
divisão e são instáveis in vivo, uma vez que o complemento e
outros componentes inativam o vírion (13).

Para contornar a incapacidade dos retrovírus de infectar células

que não se dividem, foram desenvolvidos sistemas de vetores
baseados no gênero Lentivírus de retrovírus, que inclui o vírus
da imunodeficiência humana (HIV). Como estes vírus são mais
complexos do que outros retrovírus, e devido a óbvias questões
de segurança, o desenvolvimento tem sido lento e cauteloso
(13).

Vírus adeno associado

Outro vetor viral que gerou interesse é o vírus adeno-associado

(AAV), um parvovírus defeituoso com um genoma de DNA
de fita única e uma capa proteica. AAV não foi associado a
qualquer estado de doença humana conhecido, sugerindo uma

72
margem de segurança significativa para este vetor.

Vetores Vaccinia

Vaccinia é um vírus de DNA de fita dupla cujo ciclo de vida

ocorre no citoplasma das células infectadas. Devido ao seu
papel na erradicação da varíola, tem sido amplamente utilizado
em humanos e é muito seguro. Vaccinia está sendo explorada
como um vetor para a entrega de genes terapêuticos do
câncer, como um transportador para antígenos tumorais e/
ou moléculas imunoestimuladoras para desenvolver vacinas
contra o câncer e como um vírus oncolítico específico para
tumor, seletivo para replicação.

Como alternativa aos vetores virais, uma variedade de vetores

não-virais também foi desenvolvida para a entrega de genes
in vivo e in vitro. Várias estratégias gerais foram desenvolvidas
para atingir esse objetivo, incluindo lipossomas, polímeros
e conjugados moleculares. Na maioria das vezes, essas
estratégias parecem ser menos eficientes do que os vários
vetores virais e não resultam em expressão prolongada do
transgene (14).

Um outro modelo é a Terapia anti-sentido, baseado na inibição

da expressão gênica, realizada com um oligonucleotídeo
direcionado administrado por via intravenosa ou intratumoral
levando a uma diminuição da transcrição do mRNA
complementar. O oligonucleotídeo é geralmente modificado
para aumentar a estabilidade (15).

7. 2 . 3 Edição gênica - CRISPR

73
O CRISPR é um termo utilizado para referir a edição de
genoma, sendo considerado uma vertente da terapia gênica.
CRISPR significa repetições palindrômicas curtas agrupadas
e regularmente inter-espaçadas. Este sistema está presente
dentro das bactérias e arqueobactérias (bactérias que aguentam
temperaturas mais elevadas e pouco oxigênio). As repetições
palindrômicas são sequências de nucleotídeos simétricas,
permitindo que a mesma leitura seja realizada da direita para a
esquerda, assim como da esquerda para a direita. As sequências
espaçadoras que estão entre as regiões palindrômicas
tem origem tanto de plasmídeo quanto de vírus, como os
bacteriófagos. Estes vírus infectam apenas bactérias e, quando
não conseguem destruí-las, inserem seu material genético nas
bactérias, desta forma, torna-se parte do DNA bacteriano, que
acabam duplicando material genético do vírus junto (16).

A inserção do DNA do vírus no genoma bacteriano ocorre em

sequências palindrômicas, intercalando-as. As bactérias que
tinham esse DNA viral inserido não eram mais infectadas pelos
vírus, ou seja, os vírus não conseguiam mais invadir as bactérias.
Nesse contexto, o sistema CRISPR funciona como um “arquivo”
de DNA, onde a bactéria “guarda” o DNA do vírus (16,17).

O funcionamento deste mecanismo depende da endonuclease

Cas9 (proteína 9 associada a CRISPR). A transcrição do material
genético, tanto bacteriano como o material viral inserido,
leva a formação do RNA transativador (trackrRNA), sendo
reconhecido pela enzima Cas9. A ligação do trackrRNA e a
enzima Cas9 permite identificar e cortar o DNA viral em uma
reinfecção (16,17). Desta forma, ele perde sua funcionalidade e
o vírus não consegue mais invadir as bactérias. Sendo assim, o
sistema CRISPR/Cas9 funciona como um sistema de memória,
um sistema imune adaptativo das bactérias. Todo DNA que é
colocado como sendo espaçador das regiões palindrômicas
seriam complementares a patógenos invasores permitindo

74
combatê-los com base na sequência de DNA. Então, esse
sistema permite às bactérias se protegerem de transposons,
que são elementos móveis, se protegerem de vírus e plasmídeos
(17,18).

O sistema CRSPR/Cas9 já existia há muito tempo, mas em

meados de 2012 os cientistas resolveram fazer dessa técnica
a mais importante da engenharia genética da década (18). Os
pesquisadores descobriram que podiam ligar e desligar genes.
Em um teste utilizando células cancerígenas, utilizaram o Cas9 e
ligaram ao DNA de células cancerígenas, que foram inseridas em
pacientes portadores de câncer. Neste teste, o Cas9 conseguiu
destruir o DNA das células cancerígenas. Usando infecção por
HIV como modelo, os cientistas mostraram que o CRISPR/Cas9
interrompe o genoma viral de forma latente, favorecendo uma
defesa adaptativa a longo prazo contra nova infecção viral.
Este mecanismo mostrou-se uma nova ferramenta que pode
ser utilizada como estratégia terapêutica contra infecções virais
(17,18, 19).

Figura 7.1: Adaptado de Vieira GV, Cecílio NT, Arruda LM, Sales KU. Visão geral
do mecanismo básico de ação da CAS9.

75
Vale salientar que já era possível fazer cortes no DNA com
enzimas de restrições, através de um processo complexo, com
valor elevado, e pouco preciso quando comparado ao CRISPR,
além de levar anos para alcançar o resultado esperado. Com o
CRISPR os resultados podem ser observados em semanas, o
custo mais baixo, e a possibilidade de fazer várias opções com
o genoma. Com esta técnica será possível editar células, ligar
e desligar genes, inserir genes de interesse, tratar doenças
genéticas. Apesar de todos os benefícios, é importante ter
responsabilidade ética na pesquisa e na aplicação clínica (20).

76
 C A P Í T U LO 8

Conclusões

• Bases mendelianas da genética

» Mendel foi um monge austríaco que estabeleceu os

princípios básicos da hereditariedade. Dentre seus
achados, dois se destacam: o princípio da segregação
independente, que dita que os genes existem em
pares e segregam independentemente um do outro
para formarem gametas, e o princípio da distribuição
aleatória, que versa sobre diferentes genes que
segregam-se e são distribuídos independentemente entre
si durante a formação dos gametas.

• Natureza química e física do DNA

» Johann Friedrich Miescher, um jovem suíço em

1868, descobriu e isolou a nucleína, que futuramente
entendemos como ácidos nucleicos. Estes são a base
dos cromossomos, os representantes químicos da
hereditariedade e onde estão os genes - a teoria
cromossômica da hereditariedade.

» Os ácidos nucléicos existem em duas formas: o DNA e o

RNA. Ambas são formadas por subunidades chamadas
nucleotídeos, os quais possuem 3 componentes: um
grupo fosfato, uma pentose e uma base nitrogenada.

» No DNA a pentose é uma 2’-desoxiribose e no RNA

a pentose é uma ribose. No DNA os nucleotídeos são:

77
 adenina (A), guanina (G), timina (T) e citosina (C) , e no
RNA a Uracila (U) substitui a Timina.

» As bases nitrogenadas são divididas em purinas (adenina

e guanina - com anel heterocíclico duplo) e pirimidinas
(citosina, timina e uracila - com anel heterocíclico simples)

» Os nucleotídeos de cada uma das duas cadeias de

polinucleotídeos são unidos por ligações fosfodiéster
e, no DNA, as duas cadeias de polinucleotídeos são
mantidas unidas em configuração helicoidal por ligações
de hidrogênio entre as bases nitrogenadas dos filamentos
opostos.

• Código genético e o dogma central da biologia molecular

» Crick em 1958 propôs o Dogma Central da Biologia

Molecular, no qual a informação genética presente no
DNA dos genes é transcrita ou copiada na forma de RNA,
que fornece instruções para tradução da informação em
aminoácidos e proteínas.

» A replicação do DNA se inicia com as helicases abrindo a

fita dupla formando a forquilha de replicação. Em seguida,
a DNA polimerase faz a síntese do DNA no sentido
5’-3’ em cada fita, a partir de um primer, gerando uma
replicação semiconservativa. Por fim, a enzima DNA
ligase reune as ligações fosfodiester, terminando de
restaurar a molécula de DNA original.

» Na transcrição, as informações do DNA são transferidas

para moléculas de RNA mensageiro (mRNA) por ação da
enzima RNA-polimerase.

78
 » Na tradução, temos 3 etapas: a iniciação, quando o
ribossomo se junta ao mRNA e ao primeiro tRNA para
que a tradução possa ter início, formando o complexo
de iniciação; o alongamento, quando aminoácidos são
trazidos ao ribossomo pelos tRNA e são ligados entre si
para formar uma cadeia polipeptídica; e a terminação,
quando polipeptídeo final é liberado para que possa
cumprir sua função na célula.

» O Código Genético é um código de tríades de bases

nitrogenadas que codifica aminoácidos para a síntese de
proteínas.

» Como as trincas de bases com 4 tipos de bases possuem

64 combinações distintas, percebeu-se que mais de uma
trinca codifica o mesmo aminoácido - por esse motivo, o
código genético é degenerado.

• Mutações: a chave da variabilidade genética

» Mutações são alterações na sequência do DNA do

genoma humano que fogem aos mecanismos de controle
da célula e representam as bases de toda variabilidade
genética.

» As mutações que ocorrem em um único nucleotídeo

são classificadas como mutações pontuais e afetam
apenas uma base. Quando uma purina é substituída por
outra purina chamamos de transição, e quando ocorre
a substituição de uma purina por uma pirimidina, ou o
inverso, chamamos mutação do tipo transversão.

» Do mesmo modo que ocorrem pontualmente, as

modificações no DNA podem acontecer em fragmentos
cromossômicos, os quais podem sofrer processos de

79
 deleção, inversão, translocação ou duplicação.

» Algumas áreas do genoma são mais susceptíveis a

processos mutagênicos, os hotspots, especialmente
regiões com sequências repetidas de trinucleotídeos.

• Epigenética: onde estamos e para onde vamos?

» A epigenética surge em um momento de impasse nas

descobertas acerca do DNA e suas funções desde a
proposição do modelo de dupla-hélice proposto por
Watson e Crick, que abriu novos caminhos para se pensar
e repensar os modelos tidos como garantidos existentes
sobre as funções do DNA, o que pavimentou a ideia
por trás do seguinte paradoxo: As células possuem o
mesmo DNA, contudo há uma miríade de tipos celulares
e funções diferentes, como isso é possível? Diante
desse questionamento, abriu-se um caminho para a
proposição de teorias acerca da presença de elementos
regulatórios desse sistema, delimitando-se, assim, o
conceito de “Expressão gênica” que foi sendo ampliado
com a descoberta de enzimas e mecanismos específicos
que regulam esse processo. Dentre eles destaca-se os
fatores ambientais que se provaram de grande relevância
no silenciamento e superexpressão de genes e que estão
envolvidos em patogêneses diversas, desde doenças
degenerativas ao câncer.

» Nesse cenário, o estudo dos mecanismos epigenéticos

tem tido seu apogeu num contexto cujas tecnologias de
estudo e mapeamento genético despontaram devido
à descoberta do CRISPR/Cas9 e do aperfeiçoamento
das “Ômicas” que permitiram uma compreensão da

80
 complexidade envolvendo o microambiente celular.

» Dessa forma, mecanismos como acetilação de histonas,

metilação do DNA e sequências de miRNAs específicas
podem ser utilizados para a detecção precoce dessas
doenças, estimar o prognóstico do paciente, além de
poderem ser alvos terapêuticos da farmacoepigenética.

• Marcadores genéticos: como, quando e para quê?

» Biomarcador pode ser definido como “uma variante

funcional ou índice quantitativo de um processo biológico
que prevê ou reflete a evolução ou predisposição para
uma doença ou uma resposta à terapia”. Além disso, os
biomarcadores podem ser classificados de acordo com
suas aplicações para fins diagnósticos, prognósticos, e
preditivos. Nessa conjuntura, essas moléculas podem ser
utilizadas nos estudos da medicina personalizada, por
meio da análise dos padrões genéticos, transcriptômicos,
epigenéticos, metabolômicos e de proteínas, que estão
sendo aperfeiçoados com o avanço das “Ômicas”
que estão tornando possível a detecção mais rápida
e precisa desses elementos celulares específicos de
cada paciente. Associado a isso, temos o despontar
das tecnologias como a BigData que tem permitido
uma análise dessa grande quantidade de dados de uma
forma mais sistemática e ampliada, o que muito contribui
para o aprimoramento dessas técnicas. Com isso, esses
marcadores são tidos como o futuro das terapêuticas,
sobretudo o câncer.

• Terapias direcionada e gênica

» Desde a descoberta da possibilidade de inserir genes

saudáveis em pacientes com células mutadas, muita

81
coisa tem sido descoberta sobre as maneiras de se
realizar a transferência. Definitivamente a descoberta do
CRISPR/Cas9 foi um marco importante no isolamento de
sequências de genes de interesse de forma mais barata
e rápida, o que permitiu e viabilizou técnicas de terapia
gênica que antes eram inviáveis. Os vetores utilizados na
terapia gênica são alvo de grande interesse, sobretudo na
área da oncologia, doenças raras e congênitas nas quais
o paciente pode se beneficiar com a edição genética,
portanto, esse tipo de terapia é um campo promissor de
estudos e que deve permitir uma maior democratização
no acesso à essas terapias nos próximos anos.

82
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