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INTERNACIONAL ISO
PADRÃO 1871

Segunda edição
2009-09-01

Produtos alimentícios e rações —

Diretrizes gerais para a determinação
de nitrogênio pelo método Kjeldahl
Alimentos e rações para animais — Diretrizes gerais para a
determinação de nitrogênio pelo método de Kjeldahl

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ISO 1871:2009
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Número de referência
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Publicado na Suíça

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Prefácio

ISO (International Organization for Standardization) é uma federação mundial de organismos nacionais de normalização (órgãos
membros da ISO). O trabalho de preparação de Normas Internacionais é normalmente realizado por meio de comitês técnicos da
ISO. Cada órgão membro interessado em um assunto para o qual um comitê técnico foi estabelecido tem o direito de ser
representado nesse comitê. Organizações internacionais, governamentais e não governamentais, em articulação com a ISO,
também participam dos trabalhos. A ISO colabora estreitamente com a Comissão Eletrotécnica Internacional (IEC) em todos os
assuntos de padronização eletrotécnica.

As Normas Internacionais são elaboradas de acordo com as regras dadas nas Diretivas ISO/IEC, Parte 2.

A principal tarefa dos comitês técnicos é preparar as Normas Internacionais. Projetos de Normas Internacionais adotadas pelos
comitês técnicos são distribuídos aos órgãos membros para votação. A publicação como Norma Internacional requer a aprovação
de pelo menos 75% dos órgãos membros com direito a voto.

Chama-se a atenção para a possibilidade de alguns dos elementos deste documento poderem ser objecto de direitos de patente. A
ISO não será responsabilizada pela identificação de nenhum ou de todos esses direitos de patente.

A ISO 1871 foi elaborada pelo Comitê Técnico ISO/TC 34, Produtos alimentícios.

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Esta segunda edição cancela e substitui a primeira edição (ISO 1871:1975), que foi revisada tecnicamente.

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Introdução

A análise de produtos de origem animal ou vegetal, como os utilizados em alimentos e rações, geralmente inclui a determinação
de seu teor de nitrogênio de acordo com o método Kjeldahl.

Este método pode ser padronizado em princípio, pois é geralmente aceito que diferentes aparelhos ou métodos operacionais
são equivalentes se seus resultados forem semelhantes.

O objetivo deste documento é descrever as várias etapas do método, os pontos críticos associados e os objetivos mínimos a
serem alcançados para garantir que o método seja aplicado corretamente.

Este documento fornece diretrizes gerais; não se destina a substituir os padrões internacionais existentes que estão em uso.

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PADRÃO INTERNACIONAL ISO 1871:2009(E)

Produtos alimentícios e rações — Diretrizes gerais

para a determinação de nitrogênio pelo método Kjeldahl

AVISO — O uso desta Norma Internacional pode envolver materiais, operações e equipamentos perigosos. Esta Norma
Internacional não pretende tratar de todos os problemas de segurança associados ao seu uso. É responsabilidade do usuário
desta Norma Internacional estabelecer práticas apropriadas de segurança e saúde e determinar a aplicabilidade das limitações
regulatórias antes do uso.

1 Escopo

Esta Norma Internacional fornece diretrizes gerais para a determinação de nitrogênio pelo método Kjeldahl. Aplica-se a alimentos e
rações contendo compostos nitrogenados que podem ser diretamente determinados pelo método Kjeldahl.

NOTA Este princípio de medição não leva em consideração o nitrogênio de nitratos e nitritos.

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2 Princípio
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Digestão de uma porção de teste com ácido sulfúrico concentrado na presença de catalisadores para converter o
nitrogênio orgânico em sulfato de amônio. O excesso
liberarde hidróxido
a amônia de1871:2009
ISO sódio é adicionado aoliberada
. A amônia digesto éresfriado para
destilada em
um excesso de solução de ácido bórico e, em seguida, titulada com uma https://standards.iteh.ai/catalog/standards/
sist/30a9936d-6958-40fb-ac4c solução padrão de ácido sulfúrico ou clorídrico. O teor de
nitrogênio é calculado a partir da quantidade de amônia 98225761e80a/iso-1871-2009 produzida.

NOTA No texto a seguir, o termo “nitrogênio” refere-se ao nitrogênio orgânico.

3 Reagentes

Use apenas reagentes de grau analítico reconhecido, salvo indicação em contrário, e água destilada ou desmineralizada ou água de
pureza equivalente.

3.1 Ácido sulfúrico, praticamente isento de compostos nitrogenados e de densidade mássica 1,84 g/ml. r 20 = 1,83 g/ml a

3.2 Catalisadores (ver 5.2.1).

3.3 Solução de ácido bórico (10 g/l a 40 g/l dependendo do aparelho utilizado). Se estiver usando a titulação de
ponto final colorimétrico, a solução de ácido bórico deve conter indicador (o pH ou a cor desta solução misturada deve
ser ajustada antes do uso).

3.4 Ácido clorídrico padrão (0,02 mol/l a 0,50 mol/l) ou solução de ácido sulfúrico (0,01 mol/l a 0,25 mol/l). O título da solução, ct ,
deve ser conhecido com pelo menos 0,001 mol/l.

3.5 Indicadores, que devem mudar de cor entre pH 4 e pH 5.

NOTA Vários indicadores estão disponíveis. Um indicador misto de vermelho de metila e verde de bromocresol é o mais comumente usado.
Soluções de ácido bórico prontas para uso contendo indicadores mistos estão disponíveis.

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3,6 Peróxido de hidrogênio (H2O2), mín. 30 % fração de massa.

3.7 Solução de hidróxido de sódio, min. 30 % fração de massa.

3.8 Agentes antiespumantes.

EXEMPLO Silicone, parafina líquida.

3.9 Sulfato de amônio ou cloreto de amônio (pureza mínima 99,9 %).

Imediatamente antes do uso, secar o sulfato de amônio ou cloreto de amônio a 104 °C ± 4 °C por pelo menos 2 h.
Deixe esfriar em temperatura ambiente em um dessecador.

NOTA Soluções de concentração conhecida podem ser usadas.

3.10 Triptofano ou acetanilida ou cloridrato de lisina (pureza mínima 99% da fração em massa).

Esses reagentes devem ser mantidos longe da umidade.

AVISO — Não seque esses reagentes em um forno antes de usar.

3.11 Sacarose, com teor de nitrogênio inferior a uma fração de massa de 0,002 %.

AVISO — Não seque a sacarose em um forno antes de usar.

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4 Aparelhos e materiais
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Aparelhos usuais de laboratório e, em particular, os seguintes.
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https://standards.iteh.ai/catalog/standards/sist/30a9936d-6958-40fb-
ac4c 4.1 Balança analítica, capaz de pesar com precisão de 0,001 g. 98225761e80a/iso-1871-2009

4.2 Sistemas de digestão, destilação a vapor e titulação.

Eles são usados para executar as operações descritas na Cláusula 5 e para garantir que os objetivos de desempenho descritos
em 5.5.3 e 5.5.4 sejam atendidos.

4.3 Reguladores do ponto de ebulição (se necessário), por exemplo, grãos de pedra-pomes, esferas de vidro, óxido de
alumínio (corindo) ou carboneto de silício.

4.4 Papel ou meio de pesagem, isento de compostos nitrogenados e adequado para a porção de teste e tipo de produto.

5 Método operacional
NOTA De acordo com a natureza da amostra, pode ser necessário preparar previamente a amostra para obter uma amostra homogênea (moagem,
homogeneização, etc.).

5.1 Parte de teste

A porção de ensaio, cuja quantidade depende do teor presumido de azoto determinado pelo método de Kjeldahl, deve ser
representativa da amostra e conter entre 0,005 g e 0,2 g de azoto.

A porção de teste pode ser obtida por pesagem na balança analítica (4.1), para dar a massa, m, em gramas ou por meio de
uma pipeta, para dar o volume, Vt , em mililitros.

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A porção de teste pode ser inserida no tubo diretamente ou através de um suporte (4.4).

A quantidade da porção de teste pode ser ajustada de acordo com a composição do produto sob teste e a quantidade de ácido sulfúrico (ver
5.2.2).

5.2 Digestão

5.2.1 Catalisadores

É importante diferenciar entre as substâncias utilizadas para elevar o ponto de ebulição do líquido durante a digestão e os próprios catalisadores
que facilitam a digestão. Os primeiros são geralmente sulfato de potássio ou, possivelmente, sulfato de sódio. Eles são introduzidos em
quantidade suficiente para elevar o ponto de ebulição do ácido entre 380 °C e 430 °C. O catalisador mais comumente usado é o cobre na
forma de sulfato de cobre sozinho ou misturado com óxido de titânio.

A adição opcional de peróxido de hidrogênio (3.6) na base de 3 ml a 5 ml por tubo antes do aquecimento acelera a digestão, mas deve ser
usada com o máximo cuidado para garantir que nenhum nitrogênio seja perdido na forma de vapor. Além disso, muito cuidado deve ser tomado
ao adicionar peróxido de hidrogênio aos tubos, pois isso causa uma forte reação exotérmica.

A quantidade de sulfato de potássio fornecida pelo catalisador não deve ser inferior a 7 g.

Dependendo dos setores de atividade, são utilizadas várias composições. Devem atender aos requisitos do ensaio em branco (5.5.2) e dos
ensaios de controle (5.5.3 e 5.5.4).
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Os operadores devem lidar com catalisadores à base de selênio e condições de resíduos com cuidado.

(standards.iteh.ai)
NOTA Catalisadores compostos prontos para uso estão disponíveis no mercado (por exemplo, na forma de comprimido ou pastilha).

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5.2.2 Adição de ácido
https://standards.iteh.ai/catalog/standards/sist/30a9936d-6958-40fb-ac4c
98225761e80a/iso-1871-2009 É importante usar uma
quantidade suficiente de ácido sulfúrico para garantir a digestão após:

ÿ consumo de ácido pela matéria orgânica da amostra, tendo em vista que 1 g de gordura consome 10 ml de ácido sulfúrico, 1 g de proteína
consome 5 ml de ácido sulfúrico, 1 g de carboidrato consome 4 ml de ácido sulfúrico;

ÿ consumo de ácido pelos reagentes (sais);

ÿ perdas ácidas por evaporação.

A adição de 20 ml a 25 ml de ácido (3.1) é geralmente suficiente para uma boa digestão e para manter o excesso de ácido no final da reação.

5.2.3 Aquecimento

ADVERTÊNCIA — As operações a seguir devem ser realizadas sob uma capela bem ventilada.

As instruções do fabricante relativas ao uso do equipamento devem ser geralmente seguidas. O sistema de digestão deve ser homogêneo, por
exemplo, criando um diagrama de processo de eficiência térmica ou de digestão (5.5.3).

Agentes produtores de espuma devem ser levados ao ponto de ebulição aumentando a temperatura gradualmente ou em etapas.
Também podem ser usadas três a quatro gotas de agente antiespumante por tubo (3.8).

Para produtos “secos” (ou seja, sem umidade visível), os tubos podem ser colocados diretamente em uma unidade pré-aquecida.

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Os vapores ácidos devem ser removidos com um sistema de extração adequado ao equipamento utilizado. Extração excessiva pode causar
cristalização e perda de nitrogênio (ver Anexo A).

Em todos os casos, a temperatura e o tempo de digestão devem ser determinados para atender aos requisitos do teste de controle da digestão
(5.5.3).

NOTA 1 O aquecimento a 420 °C por duas horas é apropriado para várias matrizes.

A digestão obtida deve ser límpida e isenta de partículas pretas.

Ao final do processo de digestão, deixe os tubos esfriarem de qualquer possível contaminação. Nesta fase, as porções de teste podem ser
armazenadas e destiladas posteriormente.

NOTA 2 A etapa de diluição com água conforme descrito em 5.3.1 pode ser feita nesta etapa para evitar a cristalização.

5.3 Destilação de amônia

5.3.1 Alcalinização

Diluir o digerido com água e depois alcalinizar adicionando pelo menos 3,5 ml de solução de hidróxido de sódio (3.7) por mililitro de ácido
sulfúrico (3.1) utilizado para o processo de digestão.

NOTA O volume da solução de hidróxido de sódio adicionada (3.7) pode ser menor se sua fração mássica for superior a 30%.

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ATENÇÃO — Deve-se ter cuidado ao adicionar a solução, pois o meio fica muito quente.

5.3.2 Destilação
(standards.iteh.ai)
Realize a destilação com o aparelho em questão em sua condição usual. Recolher o destilado na solução de ácido bórico ISO 1871:2009 (3.3),
que deverá conter o indicador (3.5). Ajuste o pH até que haja mudança da
cor https://standards.iteh.ai/catalog/standards/sist/30a9936d-6958-40fb-ac4c para cinza (indicador verde bromocresol + vermelho de metila)
antes de iniciar a destilação. 98225761e80a/iso-1871-2009

Existem vários critérios para determinar quando o processo de destilação é concluído, por exemplo, quando um volume específico de destilado
foi coletado, após um tempo de destilação fixo e assim por diante. Certifique-se de que, de acordo com os testes de controle (5.5), a destilação
da amônia esteja completa e que não haja excesso por arrastamento do líquido alcalino.

5.4 Titulação

O destilado obtido é titulado com ácido sulfúrico (3.1) ou ácido clorídrico (3.4); isso pode ser feito simultaneamente ou após a destilação. A
titulação pós-destilação deve ser realizada o mais rápido possível após a destilação.

Existem dois métodos para detectar o ponto final.

ÿ Por colorimetria visual ou usando um sistema de medição ótica: O ponto final é alcançado quando o indicador muda de cor. No caso da
colorimetria visual, é importante titular cada teste referente às condições obtidas no teste em branco.

ÿ Por análise potenciométrica com um sistema de medição de pH: Dependendo do equipamento ou métodos operacionais, o ponto final pode
ser um pH fixo (geralmente pH 4,6, que corresponde ao ponto de inflexão da curva de titulação), o pH obtido na teste em branco, ou o
pH original da solução de ácido bórico.

Em ambos os casos, a validade das operações de titulação deve ser verificada conforme descrito em 5.5.4.

Registre os volumes de titulante obtidos: V0 para o teste em branco e V1 para as amostras.

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5.5 Testes de controle

5.5.1 Geral

Um teste em branco e pelo menos um teste de controle de destilação e um teste de controle de digestão devem ser incluídos em cada conjunto
de testes de determinação de nitrogênio.

5.5.2 Teste em branco

Realizar um teste em branco usando o método operacional descrito acima, substituindo a porção de teste líquida pelo mesmo volume de água
e adicionando a quantidade apropriada de sacarose (3.11).

NOTA Nos ensaios em branco e controle de digestão, a sacarose é utilizada como matéria orgânica para consumir uma quantidade de ácido
sulfúrico equivalente à de uma porção de teste durante a digestão.

5.5.3 Teste de digestão

Realizar um teste de controle da digestão pelo método operacional descrito acima, substituindo a porção de teste por uma quantidade de
triptofano ou acetanilida ou cloridrato de lisina (3.10) igual à quantidade de nitrogênio nas amostras e adicionando a quantidade apropriada de
sacarose (3.11).

Calcule a fração de massa percentual de nitrogênio recuperado, que deve estar entre 98% e 101%.

5.5.4 Testes de destilação-titulação

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Realize um teste de destilação-titulação em branco usando o método operacional descrito em 5.3, mas sem uma porção de teste.
(standards.iteh.ai)
O volume obtido deve ser subtraído ao da prova de destilação-titulação.

Realizar um teste de controle de destilação-titulação nas mesmas condições em uma porção de teste de sal de amônio (3.9) ISO 1871:2009
correspondente à quantidade de nitrogênio nas amostras. https://standards.iteh.ai/catalog/standards/sist/30a9936d-6958-40fb-ac4c
98225761e80a/iso-1871-2009

Calcule a fração de massa percentual de nitrogênio recuperado, que deve estar entre 99% e 101%.

6 Expressão de resultados

O teor de nitrogênio, expresso como fração de massa percentual ou em gramas por 100 ml, é igual a:

( VVc
) tÿ ×× × 10 14 100
×m
1000

ou

( VV
) c 14 100 ÿ ×× × 10 t 1000
V×t

Onde

m é a massa, em gramas, da porção de teste;

ct é o título, em moles por litro, do ácido clorídrico ou ácido sulfúrico;

V0 é o volume, em mililitros, de ácido clorídrico ou ácido sulfúrico utilizado na titulação do teste em branco;

V1 é o volume, em mililitros, de ácido clorídrico ou ácido sulfúrico utilizado na titulação da porção teste;

Vt é o volume, em mililitros, da porção de teste.

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