UNIVERSIDADE DOS AÇORES

Faculdade de Ciências e Tecnologia

Departamento de Biologia
Ano Letivo de 2022-23

Técnicas de Biologia Molecular

Amélia Fonseca (Professora Auxiliar - DB - FCT)

 Sequenciação de DNA

Determinação da sequência de nucleótidos dos ácidos nucleicos é uma das técnicas mais
utilizadas em Biologia Molecular.

Atualmente a sequenciação de DNA é automatizada, podendo ser considerada um

método rápido, preciso, rotineiro e relativamente económico de análise de DNA.

A sequenciação de DNA surgiu da necessidade de sequenciação sistemática e em grande

escala de genomas completos.

Existem muitos laboratórios comercializam este serviço.

Qualquer tipo de ácido nucleico pode ser sequenciado (DNA, RNA).

A sequenciação é a determinação da ordem dos nucleótidos num fragmento de DNA.

A partir dos anos 70 vários métodos foram desenvolvidos de forma a permitir uma rápida
sequenciação do DNA. Mas só dois métodos foram mais utilizados.

Métodos indiretos (sequenciação manual):

Método de Clivagem Química (Maxam & Gilbert, 1977)

Método de Terminação de Cadeia ou Método de Sanger (Frederick Sanger, 1977)

Método de Clivagem Química ou Método de Maxam-Gilbert
Hidrolisa especificamente a cadeia de DNA marcada com 32P, sob
condições experimentais determinadas (quebra química da cadeia
dupla de DNA) e somente num tipo de nucleótido.

Método de Terminação de Cadeia ou Método de Sanger

Este é o método mais comum de sequenciação de DNA e é
um método de sequenciação que utiliza como molde uma
cadeia simples (sequenciação enzimática) e pode
sequenciar até 500 nucleótidos.
Sequenciação segundo Método de Clivagem Química

Este método baseia-se na modificação química do DNA e subsequente clivagem em sítios

específicos das bases.
Pouco utilizado, só em situações especiais.

1- Marcação do DNA com isótopos radioativos 32P e

35S

2- Separação das duas cadeias de DNA

3- Distribuição por 4 tubos e aplicação de reagentes químicos (em cada tubo irão ocorrer
alterações químicas específicas para uma base).
Por exemplo, no tubo em que o tratamento foi direcionado para a adenina, após a
clivagem, a extremidade do fragmento de DNA marcada com o radioisótopo apresentará
uma base que corresponde à que precede a adenina.
Alteração Química das Bases, Remoção e Clivagem

Base Modificação específica

Metilação de N7 com dimetil sulfato a um pH 8.0, torna possível a

G
clivagem da ligação C8-C9 da base.

A piperidina a um pH 2.0 enfraquece a ligação glicosídica entre a

A+G
adenina e a guanina

A hidrazina abre os anéis das pirimidinas, que são transformados

C+T
numa forma que é suscetível à remoção

Na presença de NaCl a 1.5 M, só a citosina reage especialmente com a

C
hidrazina.

O NaOH a 90o provoca uma quebra muito forte na base de adenina e

A>C
enfraquece a clivagem na base de citosina.
Separação dos fragmentos por eletroforese em gel de poliacrilamida

Cada tubo é separado em gel de eletroforese e a sequência é lida a partir do próprio gel.
Os fragmentos menores são clivados mais próximo da extremidade 5’ enquanto os
fragmentos maiores são clivados mais próximo da extremidade 3’
Sequenciação de DNA segundo o Método de Sanger

Baseia-se na paragem prematura da síntese de DNA in vitro, tendo como molde o DNA a
sequenciar, em cadeia simples, catalisada pela DNA polimerase.

Esta paragem resulta da inclusão de trifosfatos de didesoxinucleótido (ddNTPs).

Enquanto a síntese normal de cadeias de DNA utiliza dNTPs, o método de Sanger usa
ddNTPs.
Sequenciação de DNA segundo o Método de Sanger

Nos didesoxinucleótidos ou ddNTPs falta o grupo hidroxilo (OH) no carbono 3’ da

desoxirribose.

Esta posição é normalmente o local onde um nucleótido se liga ao outro para formar a
cadeia de DNA.

Se falta o grupo 3’-OH, a adição de mais nucleótidos fica impedida de se realizar (não se
forma ligação fosfodiéster).

Ocorre a paragem prematura da síntese de DNA.

Manual ou automática
1- O processo inicia-se com a síntese de uma cadeia que é complementar ao DNA molde
que queremos analisar

2- É adicionado um primer específico que vai ligar-se ao DNA

3- A reação obtida é dividida por 4

tubos e, a partir daqui, serão levados
a cabo 4 reações de sequenciação em
separado, correspondentes aos 4
nucleótidos:

ddGTP + dNTPs
ddATP + dNTPs
ddCTP + dNTPs
ddTTP + dNTPs
São utilizadas baixas concentrações de
ddNTPs e altas concentração de dNTPs

São utilizados 4 tubos identificados cada um

só com um tipo de ddNTP:

G: com ddGTP, sem ddATP, ddCTP e ddTTP

A: com ddATP, sem ddCTP, ddGTP e ddTTP

C: com ddCTP, sem ddATP, ddGTP e ddTTP

T: com ddTTP, sem ddATP, ddCTP e ddGTP

4- A cada um dos tubos, para além do DNA a sequenciar em cadeia simples é adicionado 1
dos 4 didesoxinucleótidos, os 4 desoxinucleótidos normais e a DNA polimerase (cada
didesoxinucleótido ou ddNTP encontra-se marcado radioactivamente 33P, mas na
sequenciação automática cada ddNTP está marcado por um cromóforo fluorescente
distinto)

5- A incorporação em todos os tubos de um didesoxinucleótido leva à paragem da síntese

de DNA. A base seguinte não pode ser incorporada devido à ausência do grupo hidroxila
na posição 3’, necessária para a extensão da cadeia de DNA pela DNA polimerase
6- O resultado é a formação de vários cadeias de tamanho diferentes, nas 4 misturas de
moléculas de DNA marcadas, cada uma delas terminando numa base específica
(correspondente ao nucleótido didesoxil presente nessa mistura de reação) e permitindo
que a sequência seja determinada

7- Os fragmentos de DNA sintetizados nos 4

tubos são separados por eletroforese num gel
de poliacrilamida, de acordo com o seu
tamanho.

Cada poço (linha) corresponde a um tubo de

reação (dATP, dCTP, dGTP, ou dTTP)
Eletroforese: Cerca de 5 ml de cada reação (4 tubos: G, A, C, T) são submetidos à
eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (ureia) e sob temperaturas elevadas
(40-50oC). Estas condições desnaturantes não permitem que haja o emparelhamento das
cadeias simples do DNA em cadeia dupla.

8- A deteção dos fragmentos é feita por exposição do gel a uma película de raio X:

8.1- o gel de poliacrilamida é fixado a uma folha de papel de filtro e este deve ser
desidratado sob vácuo e a alta temperatura
8.2- o papel de filtro seco com o gel de poliacrilamida aderente é transferido para um
cassete de exposição juntamente com uma película de raio X

8.3- A revelação do filme demora 2 a 3 dias (dependendo da atividade radioativa).

9- A autorradiografia resultante permite determinar a sequência do DNA com base no

tamanho dos fragmentos detetados nas 4 diferentes colunas correspondentes a cada uma
das 4 misturas reacionais.

9.1- A sequência de DNA é lida da base para o topo, ou seja do fragmento mais pequeno
para o maior = na direção 5’  3’.
Autorradiografia de um gel de sequenciação de DNA.

As amostras foram preparadas segundo o método de

Sanger.
Fazer a leitura do seguinte gel:

Sequência de DNA

5’- TCCAGTCATTGATGTTGCCAGAGACAAAGCT-3’
 Método de Terminação de Cadeia Método de Clivagem Química
Método de Sanger
(F. Sanger, 1977) (Maxam & Gilbert, 1977)

Utiliza ddNTPs Utiliza reagentes químicos

Terminação específica
Sem terminação específica
de uma base

Uso de gel poliacrilamida Uso de gel poliacrilamida

Método mais utilizado na

Método pouco utilizado, mais complexo
sequenciação
Envolve degradação da
Síntese de novas cadeias
cadeia original de DNA
Sequenciação Manual/Automática de DNA
 Sequenciação Automática de DNA

Surgiu devido ao crescimento em grande escala de sequenciação de DNA.

10 vezes mais rápido que os métodos anteriores.

A sequenciação automática (ABI PRISM) é realizado segundo o mesmo princípio do

Método de Sanger.

Os iniciadores são marcados a frio com diferentes moléculas fluorescentes.

É possível realizar uma eletroforese de mistura de todos os fragmentos sintetizados de

novo (fluorescentes com uma cor diferente).

Durante a separação através do gel, os fragmentos passam por raios laser que excitam os
marcadores fluorescentes.
Sequenciador Automático de DNA

A luz emitida em resultado dessa excitação é

detetada num fotomultiplicador.

Os sinais são armazenados num computador

e analisados através de um software
apropriado.
Sequência de DNA
 Aplicações da Sequenciação de DNA

Evolução da sequenciação de DNA de vírus, bactérias, parasitas e de organismos

eucariotas.

Identificação de patologias de DNA associadas a doenças humanas.

Análise filogenética (realização de estudos comparativos entre espécies; Projeto do

Genoma Humano).

Localização de genes, mutações e diagnósticos pré-natais (a partir da análise de DNA no

líquido amniótico).

Estudos epidemiológicos.

Descoberta de novos fármacos.

 Aplicações da Sequenciação de DNA

Sequenciação de DNA de organismos já extintos.

DNA Barcoding (criação de códigos de barras de todas as espécies vivas do planeta a

partir da sequenciação de DNA mitocondrial – gene COI).

Ciências forenses (identificação de potenciais suspeitos de crimes).

Estudos de paternidade ou outras relações familiares.

Genética de populações (comparar genomas e variantes genes específicos)

etc.
Sequenciação de nova geração - Next-Generation Sequencing (NGS)

As novas tecnologias de sequenciação denominadas sequenciação de nova geração,

começaram a ser comercializadas a partir de 2005 e estão a evoluir rapidamente.

Sequenciação de DNA de milhões pares de bases numa só corrida.

Atualmente são amplamente utilizadas: 454 FLX da Roche e a Solexa da Illumina.

Tem em comum a característica de poder de gerar informação em grandes quantidades,

(mais que a sequenciação de Sanger) com uma grande economia de tempo e de custo por
base por sequenciação.
Sequenciação de nova geração - Next-Generation Sequencing (NGS)

Genome Analyser Iix (GAIIx), HiSeq2000, HiSeq2500, MiSeq – Illumina

Genome Sequencer FLX System (454) – Roche

SOLID 5500xl System – Applied Biosystem

HeliScope ™ Single molecule Sequencer – Helicos

PacBio RS – Pacific Bioscience

Personal Genome Machine, Ion Proton – Ion Torrent

GridION, MinION – Oxford Nanopore

 Análise de Sequências

Nos últimos anos foram determinados um elevado número de sequências de genomas e

genes de vários organismos.

Criação e manutenção de bases de dados computorizados, onde toda a informação é

compilada de uma forma organizada e disponibilizada (através da Internet).

Às sequências é atribuído um número de acesso para identificação na base de dados e

citação em publicações científicas.

Para armazenar a grande quantidade de sequências existentes foram criados Bases de

Dados.
Principais Bases de dados disponíveis:

GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov)

Sediada nos EUA, é a base de dados usada por muitos grupos de investigação em todo o
mundo para submeter sequências de genes previamente à sua publicação.

EMBL (www.embl.de)

European Molecular Biology Laboratory, sediada em Heidelberg, na Alemanha, que é

também um banco de sequências de nucleótidos.

DDBJ (www.ddbj.nig.ac.jp)

Sediado no Japão, banco de dados sobre sequências de nucleótidos.

Bibliografia:

 Hartl D. & E. W. Jones, 2005. Genetics. Analysis of genes and genomes, 6th Ed. Jones and
Bartlett Publishers, Sudbury, Massachusetts.

 Lima N. & Mota M. (Eds), 2003. Biotecnologia: fundamentos e aplicações. Lidel – Edições
Técnicas, Lda, Lisboa.

 Winfrey M.R., Rott M.A. & Wortman A.T., 1997. Unraveling DNA: molecular biology for
the laboratory. Prentice Hall, Inc., New

https://www.youtube.com/watch?v=jFCD8Q6qSTM

https://www.youtube.com/watch?v=fCd6B5HRaZ8