Extração de DNA

Extração de DNA
A extração de DNA é muitas vezes o primeiro passo para a realização da maioria das
metodologias de biologia molecular, este processo é essencial para obter a eficiência desejada
na amplificação dos protocolos que usam PCR.
A técnica de extração de DNA consiste basicamente por duas etapas. A primeira etapa é a
extração na qual ocorre o rompimento das membranas celulares e consequentemente
exteriorização do DNA. A segunda consiste na purificação do DNA, ou seja, “retirada” dos
outros componentes celulares da solução (restos de membrana, proteínas, RNA).
Procedimento Operacional Padrão
Materiais
 Sangue total
 Álcool Isopropílico
 Álcool 70%
 Microtubos de1,5 mL
 Ponteiras com filtro 10 μL, 200 μL e 1000 μL
 Pipetas manuais de volume variados (0,2 – 2 μL, 20 - 200μL, 100 – 1000 μL)
 Centrífuga de microtubos de 1,5 mL
 Agitador orbital (Vórtex) para microtubos de 1,5 mL
 Termobloco
 Cabine de segurança biológica
 Kit de extração Wizard® Genomic DNA Purification
 EPIs (Touca, jaleco, luvas, óculos de proteção e máscara)
 Estante para tubos de 1,5 mL
 Água livre de nucleases
Preparação do ambiente de trabalho para realização da extração de DNA
 Limpar toda a superfície interna da cabine de segurança biológica com álcool 70%;
 Verificar se existem pipetas, ponteiras e tubos de 1,5 mL suficientes para o ensaio;
 Ligar a luz UV por 15 minutos antes do uso;
Extração do DNA Sangue total
1. Identificar 2 microtubos de 1,5 mL com o nome da amostra;

2. Adicionar 900 µL da Solução de Lise Celular (Cell Lysis Solution) em um tubo de 1,5 mL;
3. Inverter suavemente o tubo de sangue contendo a amostra do paciente, até misturar
bem;
4. Adicionar 300 µL do sangue total no tubo contendo a Solução de Lise Celular. Inverter
o tubo 5 a 6 vezes para misturar;
5. Incubar a mistura por 10 minutos à temperatura ambiente (inverter uma única vez o
microtubo durante a incubação) para que ocorra a lise dos glóbulos vermelhos.
6. Centrifugar a amostra por 20 segundos a 13.000–16.000 × g em temperatura
ambiente;
7. Com auxílio de uma pipeta remova e descarte o máximo de sobrenadante possível sem
perturbar o pellet branco visível. Aproximadamente 10 a 20 µL de líquido residual
deverá permanecer no tubo;
8. Agitar de 10 a 15 segundos o tubo vigorosamente no vortex até que os glóbulos
brancos sejam ressuspensos;
9. Adicionar 300 µL de Solução de Lise Nuclear (Nuclei Lysis Solution) ao tubo contendo
as células ressuspensas. Pipetar a solução 5 a 6 vezes para que ocorra a lise dos
glóbulos brancos. A solução deverá ficar muito viscosa;
10. Adicionar 1,5 µL da Solução de RNase (RNase Solution) no tubo contendo a amostra,
misture invertendo o tubo de 2 a 5 vezes;
11. Incubar a mistura no termobloco por (37°C) durante 15 minutos e depois resfriar a
temperatura ambiente;
12. Adicionar 100 µL da Solução de Precipitação de Proteína (Protein Precipitation
Solution);
13. Agitar em vórtex de 10 a 20 segundos;
14. Centrifugar durante 3 minutos, a 13.000–16.000 × g em temperatura ambiente;
15. Adicionar 300 µL de isopropanol em temperatura ambiente em um novo tubo limpo
de 1,5ml;
16. Com auxílio de uma pipeta transfira o sobrenadante do tubo contendo a amostra para
o novo tubo contendo o isopropanol. Ao remover o sobrenadante do tubo original,
deixe uma pequena porção de liquido residual para evitar a contaminação da solução
de DNA com a proteína precipitada;
17. Misturar delicadamente a solução por inversão até se forme uma massa visível de fios
brancos;
18. Centrifugar durante 1 minuto, a 13.000–16.000 × g em temperatura ambiente. O DNA
será visível como um pequeno pellet branco no fundo do tubo;
19. Descarte todo o sobrenadante;
20. Adicionar 300 µL de Álcool 70% em temperatura ambiente ao tubo;
21. Inverter suavemente o tubo várias vezes para lavar o pellet de DNA e os lados do tubo;
22. Desprezar todo o álcool presente no tubo;
23. Inverter o tubo em um papel absorvente e deixe o pellet secar de 10 a 15 minutos;
24. Reidratar o DNA Adicionando 60 µL de Água livre de nucleases ao tubo contendo o
pellet;
25. Incubar a amostra por no mínimo 4 horas em temperatura de 2 a 8 °C.

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