CENTRO FEDERAL DE EDUCAO TECNOLGICA DE MINAS GERAIS

DEPARTAMENTO DE QUMICA COORDENAO DE ENSINO PROFISSIONAL LABORATRIO DE QUMICA ORGNICA

CROMATOGRAFIA EM PAPEL - SEPARAO DE PIGMENTOS DE COUVE -

Professor: Rodrigo Verly Turma: QUI3A T2 ALUNOS: Maria Luiza Andrade Aquino e Mariana Gabriela de Oliveira

Belo Horizonte

02 de maro de 2011

I. Introduo Cromatografia uma tcnica de separao e de anlise de substncias em soluo, mediante um processo de adsoro seletiva. Ela funciona de acordo com as interaes entre molculas de polaridades diferentes, que podem ser ou no arrastadas da fase estacionria para a fase mvel em diferentes intensidades. A tcnica foi descoberta em 1906 pelo botnico russo Mikahail Tswett, mas no foi largamente utilizada at os anos 30. Tswett separou pigmentos de plantas adicionando um extrato de folhas verdes em ter de petrleo sobre uma coluna com vrios slidos em p em um tubo de vidro vertical. Enquanto a soluo percorreu atravs da coluna, os componentes individuais da mistura migraram para baixo em diferentes taxas de velocidades e ento a coluna apresentou-se marcada com gradientes de cores. A esse gradiente deu-se o nome de cromatograma. O exemplo de cromatografia mais clssico a cromatografia de papel. uma das tcnicas mais simples e que requer menor instrumentao para realizao, porm apresenta restries para realizao em termos analticos. Neste tipo de cromatografia, depois de demarcada a amostra no papel, o eluente flui verticalmente pelo fenmeno de micro capilaridade, e os componentes da amostra depositam-se em locais especficos. Utiliza-se o papel de filtro de celulose, por ser altamente hidrfilo, mantendo um revestimento de gua imperceptvel. Esse revestimento a fase estacionria e o solvente utilizado a fase mvel. A couve uma hortalia que tem sido de fundamental importncia desde a antiguidade. Conhecida pelos celtas e os gregos, foi mencionada nos scripts de dramaturgos como Epicharmus (S. VI A. C), cujos personagens aconselhavam o seu uso na cura de doenas. No Imprio Romano, mencionado por Cato, em seu livro "De re rustica" como um remdio para problemas intestinais e pulmonares, e, sobretudo, para aumentar a produo de leite em mulheres que esto amamentando. uma excelente fonte de vitamina C e beta-caroteno, que o corpo humano transforma em vitamina A. Uma xcara de couve contm o dobro das necessidades dirias desses nutrientes. Outros nutrientes presentes na couve so vitamina E, folato, clcio, ferro e potssio. Alm disso, a couve contm mais ferro e clcio que quase qualquer outra verdura; seu alto teor de vitamina C aumenta a capacidade de absoro destes minerais pelo organismo. As clorofilas so molculas formadas por complexos derivados da porfirina, tendo como tomo central o Mg. Esse composto uma estrutura macrocclica assimtrica totalmente

insaturada constituda por quatro anis de pirrol. Esses anis numeram-se de 1 a 4 ou de a a d, de acordo com o sistema de numerao de Fisher (SCHOEFS, 2002). As clorofilas a e b encontram-se na natureza numa proporo de 3:1, respectivamente, e diferem nos substituintes de carbono C-3. Na clorofila a, o anel de porfirina contm um grupo metil (-CH 3) no C-3 e a clorofila b (considerada um pigmento acessrio) contm um grupo aldedo (CHO), que substitui o grupo metil-CH3. A estabilidade da clorofila b deve-se ao efeito atrativo de eltrons de seu grupo aldedo no C-3 (VON ELBE, 2000). Os cloroplastos so organelas vegetais onde ocorrem duas reaes vitais para as plantas: a fotoqumica, nas membranas dos tilacides e a bioqumica, no estroma do cloroplasto. Tais organelas, alm das clorofilas, contm outros pigmentos como os carotenides (carotenos e xantofilas). As ligaes entre as molculas de clorofilas so muito frgeis (no-covalentes), rompendo-se com facilidade ao macerar o tecido em solventes orgnicos. O carter hidroflico/hidrofbico de uma substncia influi diretamente na escolha do melhor solvente para a sua extrao. Os solventes polares como a acetona so os mais eficazes para a extrao completa das clorofilas. No caso das clorofilas a e b, o aumento da polaridade da clorofila b em relao clorofila a deve-se ao substituinte aldedo (VON ELBE, 2000; MUSSI, 2003), como observado na Figura 02. As tcnicas cromatogrficas so essenciais para a separao de substncias puras de misturas complexas e so amplamente utilizadas nas anlises de alimentos, drogas, sangue, produtos derivados de petrleo e produtos de fisso nuclear. Sendo assim, o objetivo dessa prtica determinar o melhor eluente para a separao das substncias responsveis pelos pigmentos da couve, atravs da cromatografia de papel e medir seus Rf.

II. Materiais e Reagentes

- 1 bquer - 4 Pipetas de Pasteur - 8 tiras (16x1 cm) de papel poroso - 8 tubos de ensaio - Almofariz e pistilo - Capilar - estante para tubos de ensaio

- 1 mL de acetato de etila - 1 mL de lcool etlico - 1,25 mL de ter etlico - 2 mL de diclorometano - 3,20 mL de hexano - Acetona - Couve

III. Metodologia e resultados A separao dos pigmentos da couve, atravs da tcnica de cromatografia, exigiu que fosse preparado o extrato do vegetal, as tiras de papel poroso (fase estacionria) e que se escolhesse o eluente (fase mvel) mais adequado para a separao. Primeiramente, preparou-se o extrato adicionando-se a pequenos pedaos de couve fresca cerca de 50 mL de acetona. O material foi prensado em almofariz, com um pistilo, obtendose um lquido esverdeado, o qual foi utilizado no processo. A fase estacionria consistiu numa tira de papel poroso adequado ao recipiente utilizado, no caso, o tubo de ensaio. Foram cortadas oito tiras de papel de 16 cm de altura e cerca de 1 cm de largura. Em cada tira, foi marcado 1 cm da extremidade inferior e 1,5 cm da extremidade superior do papel, que representam respectivamente o volume limite de eluente adicionado ao tubo de ensaio e a altura limite de eluio. Na extremidade inferior do papel, no centro da marcao e com o auxlio do capilar, aplicouse o extrato de couve, formando uma mancha circular com dimetro com cerca de 5 mm, para que o extrato estivesse em maior concentrao, facilitando a separao e visualizao dos pigmentos. Nos tubos de ensaio 1, 2, 3, 4 e 5 adicionou-se, respectivamente, 1 mL de hexano, de diclorometano, de ter etlico, de acetato de etila e de lcool etlico, observando-se a ordem de polaridade dos solventes, a fim de facilitar a escolha do mais adequado. Aps adio dos eluentes, introduziram-se as placas de papel em cada tubo de ensaio e observou-se a eluio. Na placa 1, tendo hexano como eluente, houve separao dos pigmentos verdes dos amarelos, porm no houve grande eluio, ou seja, a amostra continuou concentrada no ponto de aplicao. Na placa 2, tendo diclorometano como eluente, observou-se que os pigmentos verdes eluiram pela placa, acompanhando o solvente, enquanto os amarelos permaneceram concentrados no ponto de aplicao da amostra. Nas placas 3 e 4, com ter etlico e acetato de etila, respectivamente, observou-se o mesmo que ocorrido na placa 2, porm na placa 4 a distncia percorrida pelo pigmento verde foi maior. Na placa 5, ambos os pigmentos percorreram a mesma distncia, observando uma cauda amarelada na parte inferior da placa. Observando os resultados obtidos anteriormente, constatou-se que os eluentes que obtiveram resultados mais satisfatrios foram o hexano (placa 1) e o diclorometano (placa 2). Dessa forma, adicionou-se 1 mL da mistura de hexano e diclorometano 2:1 v/v em outro tubo de ensaio, a fim de observar a separao promovida por ambos eluentes, atuando

paralelamente. Nessa placa (6), houve separao dos pigmentos amarelos, porm os verdes eluiram juntos. De acordo com os resultados verificados anteriormente, verificou-se que a polaridade do eluente deveria aumentar um pouco para que a separao dos pigmentos verdes ocorresse. Adicionou-se ento 1 mL da mistura de hexano e diclorometano, agora na proporo 1:1 v/v, em outro tubo de ensaio (7), observando-se a separao dos quatro pigmentos. Os pigmentos verdes (clorofilas) apresentaram maiores distncias percorridas.

Figura 01. Cromatograma das separaes dos pigmentos da couve utilizando diferentes eluentes

IV.Discusso e concluso O eluente mais adequado aquele que promove a separao dos quatro pigmentos, dois esverdeados (clorofila-a e clorofila-b) e dois amarelados (carotenides: carotenos e xantofilas). Para constatar que a mistura feita no tubo 7 consistia no eluente mais adequado, adicionouse ao tubo de ensaio (8) 1 mL da mistura de hexano e ter etlico 3:1 v/v, sendo o ter mais polar que o diclorometano. Observou-se a separao dos pigmentos verdes, porm os amarelos eluiram juntos. A separao cromatogrfica e extrao de produtos naturais podem ser utilizadas para ilustrar vrios fenmenos envolvendo interaes intermoleculares. Ambos os processos

dependem diretamente dessas interaes estabelecidas entre os componentes da mistura e as fases estacionria e mvel. Na medida em que o solvente (fase mvel) passa pela mistura, os componentes qumicos so arrastados, de forma que a substncia que possuir maior afinidade qumica com ele ser deslocada a uma velocidade maior. A amostra analisada, obtida por macerao das folhas de couve, tinha pigmentos verdes e amarelos, sendo, respectivamente, clorofila-a e clorofila-b; e carotenides (carotenos e xantofilas). A extrao foi feita com a acetona (propanona), porque a gua, por exemplo, muito polar, sendo necessrio utilizar um extrator com grau de polaridade intermedirio, capaz de extrair o mximo possvel de pigmentos tanto lipossolveis quanto hidrossolveis.

Figura 02. Estrutura das clorofilas a e b

Os carotenos, como o beta-caroteno (Figura 03), so hidrocarbonetos apolares, nos quais prevalecem interaes intermoleculares do tipo Foras de Van der Waals. Esses hidrocarbonetos devem, portanto, ser eludos com facilidade por fases mveis de baixa polaridade e, durante a corrida cromatogrfica, so os que mais se distanciam do ponto de aplicao da amostra, no caso de a fase estacionria ser polar, como o papel hidrfilo, utilizado nesse experimento.

As xantofilas monooxigenadas apresentam apenas um grupamento hidroxila (Figura 03) e tm moderada afinidade com a fase estacionria utilizada nesse experimento, j que a hidroxila pode formar ligaes de hidrognio com a gua adsorvida no papel. Assim, apresentam certa tendncia reteno pela fase estacionria e, durante a corrida cromatogrfica, distanciam-se moderadamente do ponto de aplicao da amostra.

Figura 03. Estrutura dos carotenides: beta-caroteno e xantofila

Os eluentes utilizados primeiramente para observao foram, de acordo com a ordem representada na Figura 01, hexano, diclorometano, ter etlico, acetato de etila, lcool etlico. O hexano no foi capaz de arrastar com eficincia os quatro pigmentos, porm observou-se separao das clorofilas dos carotenides, j que se obteve duas cores distintas. Dentre todos os solventes utilizados, este apresentava menor polaridade, por isso foi capaz de arrastar os carotenides, j que estes so pouco polares, enquanto a fase estacionria (papel hidrfilo) reteve as clorofilas, j que estas apresentam maior polaridade. A eluio no foi totalmente eficiente, pois os carotenides possuem certa polaridade, o que dificultou a interao com o solvente apolar. O diclorometano no foi capaz de separar os pigmentos verdes e amarelos, porm conseguiu arrastar as clorofilas, mostrando-se assim que sua polaridade foi suficiente para interagir com estas, porm no foi capaz de interagir com os carotenides.

Sendo assim, constatou-se que a polaridade do melhor eluente estaria entre o hexano e o diclorometano, j que o ter etlico, o acetato de etila e o lcool etlico so mais polares que o ltimo, tornado-se desnecessria a anlise dos resultados obtidos em 3, 4 e 5 (Figura 01). Testou-se ento, uma mistura de hexano e diclorometano 2:1 v/v, acreditando-se que a apolaridade do hexano separaria os quatro pigmentos, enquanto a polaridade do diclorometano promoveria o arraste, evidenciando a separao das cores. Porm a polaridade da mistura no foi suficiente para separar a clorofila b da clorofila a, j que a primeira mais polar que a segunda, enquanto a apolaridade foi suficiente para a separao dos carotenos das xantofilas. A partir dos resultados obtidos anteriormente, constatou-se que era necessrio aumentar a polaridade da mistura. Desta forma, fez-se uma mistura de hexano e diclorometano na proporo de 1:1 v/v. Percebeu-se assim a separao dos quatro pigmentos (Figura 01/7). A clorofila b foi a mais retida, em decorrncia de sua maior afinidade com a fase estacionria (gua), j que ela a mais polar das substncias em anlise, estabelecendo, assim, ligaes de hidrognio com a gua. A clorofila a foi mais arrastada que a clorofila b por apresentar uma polaridade inferior em relao ltima, porm foi retida pela fase estacionria antes dos carotenides, por ser mais polar que estes. A xantofila foi retida acima das clorofilas por possuir uma polaridade um pouco maior que os carotenos, j que esta possui grupos OH, que no esto presentes nestes, lhe conferindo essa propriedade. Por ltimo, tm-se os carotenos, mais apolar das substncias analisadas que teve uma maior afinidade pela fase mvel (menos polar que a gua). O resultado acima pode ser conferido atravs dos Rfs das amostras, onde a clorofila b teve um Rf 0,07, a clofofila a 0,48, a xantofila 0,79 e o caroteno 0,89. Atravs do Rf tambm possvel concluir que o solvente no foi o ideal, j que o Rf da clorofila b ficou muito prximo de 0. Assim, fez-se uma nova mistura, aumentando a polaridade do solvente para que este pudesse arrastar mais a clorofila b, afastando-a do ponto de aplicao. Essa mistura foi feita com hexano e ter etlico na proporo 3:1 v/v. Porm no houve uma separao ntida das cores, observando que a cauda de uma substncia interferiu no ponto de maior concentrao de outra substncia. Sendo assim, a mistura que apresentou resultado mais satisfatrio, separao ntida dos quatro pigmentos, foi a de hexano e diclorometano na proporo de 1:1, sendo essa de mdia polaridade.

V. Referncias bibliogrficas FRACETO, Leonardo Fernandes; LIMA, Slvio Lus Toledo de. Aplicao da Cromatografia em papel na separao de corantes de pastilhas de chocolate. Qumica Nova na Escola, So Paulo, n 18, p. 46-48, nov. 2003. FONSECA, Sebastio F.; GONALVES, Caroline C. S. Separao de pigmentos do espinafre e separao em coluna de acar comercial. Qumica Nova na Escola, So Paulo, n 20, p. 55-58, nov. 2004. AGRIZZI, Tiago; NASCIMENTO, Isabella Oliveira; FERRAZ, CECLIA. Cromatografia em Papel/ Espectrometria De Absoro Atmica/ Espectroscopia de Ressonncia Magntica do Infravermelho. Universidade Federal do Esprito Santo, Centro Universitrio Norte do Esprito Santo Curso de Agronomia. 2009. Disponvel em: <http://www.conteudojuridico.com.br/?artigos&ver=2.29699>. Acesso em: 11 mar. 2011 Cromatografia em papel. Pontifica Universidade do Rio Grande do Sul. Disponvel em: <http://www.pucrs.br/quimica/professores/arigony/cromatografia_FINAL/CROMA_PAPEL>. Acesso em: 11 mar. 2011 A Separao de Compostos por Cromatografia. <http://alkimia.tripod.com/cromatografia>. Acesso em: 11 mar. 2011. Disponvel em: