Manual ANVISA - Detecção de Mecanismos de Resistência

MICROBIOLOGIA CLÍNICA PARA O
CONTROLE DE INFECÇÃO RELACIONADA À

ASSISTÊNCIA À SAÚDE
Módulo 10 – Detecção dos Principais Mecanismos
de Resistência Bacteriana aos Antimicrobianos pelo
Laboratório de Microbiologia Clínica
Agência Nacional de Vigilância Sanitária | Anvisa

AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA – ANVISA
MICROBIOLOGIA CLÍNICA PARA

O CONTROLE DE INFECÇÃO
RELACIONADA À ASSISTÊNCIA À SAÚDE
Módulo 10 – Detecção dos Principais
Mecanismos de Resistência Bacteriana
aos Antimicrobianos pelo Laboratório de
Microbiologia Clínica
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1ª edição – 2020
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R
Afonso Luís Barth – Hospital de Clínicas de Porto Alegre e Universidade
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Federal do Rio Grande do Sul; Ana Cristina Gales – Universidade Federal
Daniela Marreco Cerqueira
de São Paulo/Escola Paulista de Medicina; Elizabeth de Andrade Marques
Patricia Oliveira Pereira Tagliari
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nologia e Parasitologia - Universidade de Estado do Rio de Janeiro (UERJ);
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Guilherme Antônio Marques Buss
Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo; Juliana Caierão – Uni-
versidade Federal do Rio Grande do Sul; Marcelo Pillonetto - Laboratório
Gerente de Vigilância e Monitoramento em Serviços de Saúde –
Central do Estado do Paraná (LACEN/PR) e Pontifícia Universidade Católica
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do Paraná (PUCPR)
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Redação:
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cias Biomédicas, Universidade de São Paulo; Afonso Luís Barth – Hos- Ana Paula D’Alincourt Carvalho Assef – Laboratório de Pesquisa em
pital de Clínicas de Porto Alegre e Universidade Federal do Rio Grande Infecção Hospitalar (LAPIH)/Instituto Oswaldo Cruz – Fiocruz; Andreza
do Sul; Ana Paula D’ Alincourt Carvalho Assef – Laboratório de Pesquisa Francisco Martins – Universidade Federal do Rio Grande do Sul; Cláudio
em Infecção Hospitalar LAPIH), Instituto Oswaldo Cruz – Fiocruz; Darlan Marcos Rocha de Souza – Instituto Oswaldo Cruz; Marcelo Pillonetto
Augusto da Costa Rocha – Grupo Fleury Setor de Pesquisa e Desenvol- – Laboratório Central do Estado do Paraná (LACEN/PR) e Pontifícia
vimento; Doroti de Oliveira Garcia – Centro de Laboratório Regional de Universidade Católica do Paraná (PUCPR); Otávio von Ameln Lovison –
Marília – Instituto Adolfo Lutz; Fernanda Esposito – Faculdade de Ciên- Universidade Federal do Rio Grande do Sul
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liana Caierão – Universidade Federal do Rio Grande do Sul; Melise Cha- Camila Contarato Burns – Anvisa
ves Silveira - Instituto Oswaldo Cruz; Nilton Lincopan – Departamento
Ficha Catalográfica
Brasil. Agência Nacional de Vigilância Sanitária

Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção Relacionada à Assistência à Saúde. Módulo 10 – Detec-
ção dos Principais Mecanismos de Resistência Bacteriana aos Antimicrobianos pelo Laboratório de Microbio-
logia Clínica/Agência Nacional de Vigilância Sanitária.– Brasília: Anvisa, 2020.
160p.: il.10 volumes
1. Infecção Relacionada à Assistência à Saúde – Controle. 2. Infecção em Serviços de Saúde. 3. Microbiolo-

gia Clínica. 4. Vigilância Sanitária em Serviços de Saúde. 5. Resistência microbiana. I. Título.
SUMÁRIO
Apresentação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
Capítulo 1: Introdução. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.1 Referências bibliográficas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
Capítulo 2: Bases moleculares da resistência bacteriana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

2.1 Mecanismos de resistência aos antimicrobianos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.1.1 Alteração da permeabilidade celular ao antimicrobiano. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.1.2 Remoção do antimicrobiano por bombas de efluxo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.1.3 Alteração do sítio de ação do antimicrobiano. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.1.4 Modificação ou inativação enzimática do agente antimicrobiano. . . . . . . . . . 20
2.2 Principais mecanismos de transferência horizontal de genes e elementos genéticos
móveis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.2.1 Conjugação. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.2.2 Transformação. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.2.3 Transdução. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.3 Outras formas de transferência de genes e elementos genéticos móveis. . . . . . . . . . 26
2.3.1 Transposição . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.3.2 Integrons. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
2.4 Referências bibliográficas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
Capítulo 3: Microrganismos multirresistentes de importância clínica e suas

resistências intrínsecas e adquiridas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.1 Introdução. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.2 Resistência intrínseca. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
3.3 Resistência adquirida. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
3.3.1 Staphylococcus spp.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
3.3.2 Enterococcus spp. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
3.3.3 Streptococcus spp.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
3.3.4 Enterobacterales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
3.3.5 Bacilos Gram-negativos não fermentadores da glicose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
3.3.6 Neisseria spp. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
3.3.7 Micobactérias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
3.4 Referências bibliográficas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
Capítulo 4: Teste de sensibilidade aos antimicrobianos (TSA). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

4.1 Método qualitativo: disco-difusão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
4.1.1 Etapas do Ensaio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
4.1.2 Instruções específicas para a leitura do teste de disco-difusão. . . . . . . . . . . . . 92
Agência Nacional de Vigilância Sanitária – Anvisa
4.2 Métodos quantitativos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93

4.2.1 Microdiluição em caldo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
4.2.2 Fitas de gradiente de concentração de antimicrobianos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
4.2.3 Ágar diluição . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
4.3 Critérios de interpretação de resultados do TSA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
4.3.1 Área de Incerteza Técnica (AIT). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
4.4 Precauções e cuidados especiais na realização do TSA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
4.5 Pontos críticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
4.6 Referências Bibliográficas‑. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
APÊNDICE CAPÍTULO 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
Capítulo 5: Outros testes para detecção fenotípica de resistência bacteriana aos

antimicrobianos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
5.1 Testes para a detecção de ESBL. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
5.1.1 Métodos alternativos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
5.2 Testes para a detecção de AmpC. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
5.3 Testes para detecção de carbapenemases. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
5.3.1 Triagem da produção e caracterização de carbapenemases em
Enterobacterales pelo método de disco-difusão. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
5.3.2 Identificação fenotípica de carbapenemases por disco-difusão com
inibidores adicionados aos discos de sensibilidade. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
5.3.3 Métodos acidimétricos para detecção de carbapenemases. . . . . . . . . . . . . . . 126
5.3.4 Detecção da hidrólise de carbapenêmicos por espectrometria de massas .128
5.3.5 Testes imunocromatográficos para detecção de carbapenemases . . . . . . . . 128
5.3.6 Detecção de carbapenemases em sistemas de automação. . . . . . . . . . . . . . . 129
5.4 Testes alternativos para a detecção de resistência às polimixinas. . . . . . . . . . . . . . . . . 129
5.5 Referências bibliográficas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
Capítulo 6: Testes genotípicos para a detecção de mecanismos de resistência e

avaliação da similaridade genética . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141
6.1 Detecção de marcadores genéticos de resistência. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141
6.1.1 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141
6.1.2 Sequenciamento de DNA: Método de Sanger. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148
6.2 Métodos para avaliação da epidemiologia molecular de bactérias
multirresistentes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150
6.2.3 Metodologias baseadas em padrões de bandas: macrorrestrição de DNA
seguida de PFGE. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150
6.2.4 Técnicas baseadas em sequenciamento de genes: MLST. . . . . . . . . . . . . . . . . .152
6.2.5 Técnicas baseadas em Sequenciamento de Nova Geração . . . . . . . . . . . . . . . 153
6.3 Referências bibliográficas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156
Capítulo 7: Vídeos Ilustrativos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157

6
Módulo 10 – Detecção dos Principais Mecanismos de Resistência Bacteriana aos Antimicrobianos
APRESENTAÇÃO
A resistência microbiana (RM) aos antimicrobianos é um grave problema mundial, estando as-
sociada ao aumento do tempo de internação, dos custos do tratamento e das taxas de morbi-
dade e mortalidade dos pacientes. A RM ocorre quando microrganismos (como bactérias, fun-
gos, vírus e parasitas) mudam quando são expostos aos antimicrobianos (como antibióticos,
antifúngicos, antivirais, antimaláricos e anti-helmínticos). Como resultado, os medicamentos
tornam-se ineficazes e as infecções persistem no corpo, aumentando o risco de propagação
a outras pessoas e de causar sérias complicações e óbitos nos pacientes. A RM ocorre natural-
mente ao longo do tempo, geralmente por meio de alterações genéticas, no entanto, o uso
indevido e excessivo de antimicrobianos está acelerando esse processo.
A RM é um problema complexo que afeta toda a sociedade e é impulsionada por muitos fato-
res que estão interligados. Intervenções isoladas possuem impacto limitado. É necessária uma
ação coordenada para minimizar o surgimento e a disseminação da RM. O uso indiscriminado
e incorreto dos antimicrobianos na comunidade, na agricultura, na criação de animais e nos
serviços de saúde são reconhecidamente importantes fatores de risco para o surgimento e a
disseminação da RM.
Nesse contexto, insere-se o Laboratório de Microbiologia, que tem como objetivo não apenas
apontar o responsável por um determinado estado infeccioso, mas também indicar, por meio
do monitoramento de populações microbianas, qual o perfil dos microrganismos que estão
interagindo com o organismo humano, possibilitando a indicação de tratamentos mais efeti-
vos. Para o desempenho satisfatório dessa função, é fundamental que os laboratórios de mi-
crobiologia possuam estrutura capaz de estabelecer informações sobre a melhor amostra bio-
lógica, reconhecer a microbiota e os contaminantes, identificar microrganismos associados à
infecção ou com propósitos epidemiológicos, obter resultados em tempo oportuno em casos
de emergências, realizar o transporte seguro e rápido das amostras e manter uma educação
contínua em relação aos aspectos das infecções relacionadas à assistência à saúde.
Tendo em vista esses aspectos e considerando que a microbiologia é um campo muito dinâ-
mico, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária – Anvisa, em colaboração com especialistas
do Brasil, disponibiliza o Módulo 10 – Detecção dos Principais Mecanismos de Resistência Bac-
teriana aos Antimicrobianos pelo Laboratório de Microbiologia Clínica, da série Microbiologia
Clínica para o controle de infecção relacionada à assistência à saúde, composta por outros
nove módulos: Módulo 1 – Biossegurança e manutenção de equipamentos em laboratório de
microbiologia clínica; Módulo 2 – Controle externo da qualidade; Módulo 3 – Principais Síndro-
mes Infecciosas; Módulo 4 – Procedimentos laboratoriais: da requisição do exame à análise mi-
crobiológica e laudo final; Módulo 5 – Tecnologias em Serviços de Saúde: descrição dos meios
de cultura empregados nos exames microbiológicos; Módulo 6 – Detecção e identificação de
bactérias de importância médica; Módulo 7 – Detecção e identificação de micobactérias de
7
importância médica; Módulo 8 – Detecção e identificação de fungos de importância médica e

Módulo 9 – Infecções virais.
A Anvisa espera com esta nova publicação contribuir para que os laboratórios de microbio-
logia possam assimilar e alcançar novos níveis de complexidade laboratorial, atendendo às
exigências e características próprias de cada serviço de saúde, além de subsidiar a adoção de
procedimentos básicos padronizados nesses serviços que possam, em última instância, forne-
cer informações mais confiáveis e seguras para apoiar a prática clínica e a tomada de decisão
local e nacional para a prevenção e o controle da resistência microbiana nos serviços de saúde
do país.
8
Capítulo 1:
Introdução
Afonso Luís Barth
Juliana Caierão
A descoberta da penicilina, em 1928, por Alexander Fleming, deu origem à Era dos
Antimicrobianos1. Os anos que se seguiram trouxeram uma euforia generalizada à
comunidade científica e médica, perfeitamente justificável, já que houve a descober-
ta de um número expressivo de novas moléculas com aplicabilidade clínica, fossem
elas naturais, semissintéticas ou totalmente sintéticas. De fato, o cenário era tão oti-
mista que pouca atenção foi dada aos primeiros relatos de resistência bacteriana à
penicilina e de disseminação, por via horizontal, dessa característica de resistência
entre bactérias distintas2.
De acordo com Charles Darwin, a premissa básica da evolução é a adaptação, o que,

a propósito, as bactérias fazem com maestria. Basta um olhar retrospectivo para os
quase 80 anos de uso clínico de antimicrobianos para perceber que as bactérias de-
senvolveram mecanismos de resistência a virtualmente todos esses compostos, va-
riando apenas o tempo necessário para o aparecimento dos fenótipos de resistência.
Esse processo evolutivo culminou no cenário atual, onde coexistimos com bactérias
multirresistentes, para as quais opções terapêuticas podem ser escassas ou até mes-
mo inexistentes3,4.
De fato, enfrentamos hoje uma situação peculiar e preocupante no que diz respeito
a infecções por bactérias multirresistentes. De acordo com o macroeconomista britâ-
nico Jim OŃeill, caso o panorama atual não sofra alterações consideráveis, infecções
por bactérias multirresistentes serão a principal causa de morte no mundo, sendo
que, em 2050, 10 milhões de pessoas morrerão anualmente em decorrência dessas
infecções, as quais matarão mais que câncer, diabetes e acidentes de trânsito, por
exemplo5.
9
A Organização Mundial da Saúde (OMS) e o“Centers for Disease Control and Prevention”
(CDC) norte-americano reconhecem alguns microrganismos como mais relevantes
no contexto da multirresistência aos antimicrobianos. Bacilos Gram-negativos resis-
tentes aos carbapenêmicos e Neisseria gonorrhoeae resistentes às fluoroquinolonas
e às cefalosporinas de terceira geração são apenas alguns desses exemplos (que se-
rão discutidos no Capítulo 3 deste módulo) e demonstram que a problemática da
resistência bacteriana engloba não somente infecções classicamente relacionadas à
assistência à saúde, mas, também, a infecções comunitárias.
A ocorrência e emergência de bacilos Gram-negativos multirresistentes tem se reve-

lado um importante desafio para os serviços de saúde exigindo um grande esforço
de gestores e profissionais de saúde de todas as especialidades na busca de medidas
inovadoras e eficazes de prevenção e controle desses microrganismos6.
No Brasil, de acordo com dados do Boletim de Segurança do Paciente e Qualidade

em Serviços de Saúde n° 20 (Avaliação dos indicadores nacionais das Infecções
Relacionadas à Assistência à Saúde (IRAS) e Resistência microbiana do ano de 2018),
Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter spp. e Pseudomonas aeruginosa estão entre os
principais microrganismos causadores de infecções primárias de corrente sanguínea
relacionadas à infecção de cateter venoso central confirmadas laboratorialmente em
Unidades de Terapia Intensiva (UTI) adulto. Corroborando com o panorama mundial,
em nosso país, a resistência aos carbapenêmicos é o principal desafio entre esses mi-
crorganismos, sendo que aproximadamente 79%, 44,30% e 41,40% dos Acinetobacter
spp., K. pneumoniae e P. aeruginosa foram resistentes aos carbapenêmicos, respecti-
vamente, conforme dados do Boletim citado acima7.
São várias e graves as consequências de infecções por essas e outras bactérias multir-
resistentes, incluindo aumento de morbidade e mortalidade, maior tempo de hospi-
talização e aumento dos custos com os cuidados com a saúde. Reconhecendo e preo-
cupada com esse cenário, a OMS tem, frequentemente, ressaltado o tema da multir-
resistência aos antimicrobianos, por meio do lançamento de campanhas e de progra-
mas de vigilância epidemiológica. Um desses programas é o “Global Antimicrobial
Resistance Surveillance System” (GLASS), uma plataforma para o compartilhamento
de dados sobre resistência aos antimicrobianos em nível mundial. A OMS tem incen-
tivado a participação de todos os países com o objetivo de obter um panorama glo-
bal da resistência bacteriana aos antimicrobianos. São peças-chave desse programa
os sistemas de vigilância nacionais, bem como os laboratórios de bacteriologia na-
cionais de referência. Reconhecer a epidemiologia mundial de infecções associadas
a microrganismos multirresistentes é essencial em um contexto onde o fluxo de pes-
soas e mercadorias ocorre em uma intensidade sem precedentes. Até outubro de
2019, 88 países já haviam aderido ao GLASS, inclusive o Brasil8.
10
De fato, nos últimos anos, esforços foram feitos para que sistemas de vigilância da
resistência microbiana no Brasil se tornassem mais robustos, já que a subnotificação
é um desafio que precisa ser vencido. Nesse sentido, em 2005 a Agência Nacional de
Vigilância Sanitária (Anvisa) criou a Rede Nacional de Monitoramento da Resistência
Microbiana em Serviços de Saúde (Rede RM), com o objetivo de tornar a assistência à
saúde mais efetiva por meio da detecção, prevenção e controle da emergência de re-
sistência aos antimicrobianos em serviços de saúde no Brasil. Já, em 2013, a Anvisa e
o Ministério da Saúde (MS) instituíram a Sub-rede Analítica de Resistência Microbiana
em Serviços de Saúde (Sub-rede RM) com o objetivo de estabelecer, ao longo do
tempo, o histórico evolutivo das cepas multirresistentes de infecções relacionadas
à assistência à saúde humana. Todos esses esforços têm culminado em uma maior
notificação da ocorrência de bactérias multirresistentes, fazendo com que os dados
epidemiológicos nacionais estejam se tornando mais sistemáticos nos últimos anos.
É imprescindível ressaltar que não apenas a ampla utilização de antimicrobianos em

medicina humana tem atuado como pressão seletiva para a emergência e dissemina-
ção de bactérias multirresistentes. O uso de antimicrobianos em medicina veterinária
e, também, na agropecuária são fatores determinantes que reforçam o cenário atual
de alta prevalência de bactérias resistentes aos antimicrobianos. É nesse contexto
que, nos últimos anos, tem sido salientado o conceito de Saúde Única (“One Health”),
definido como um esforço integrativo de diferentes áreas atuando localmente, nacio-
nalmente e globalmente para obter uma saúde ótima para pessoas, animais e o meio
ambiente9,10.
Realmente, é necessário que se tenha uma visão holística da problemática da resis-

tência bacteriana aos antimicrobianos. Isso porque 2/3 de todo os antimicrobianos
consumidos no mundo são utilizados no contexto agropecuário e veterinário, como
agentes terapêuticos e/ou profiláticos funcionando como promotores de crescimen-
to. Muitas vezes, esses antimicrobianos são utilizados em doses subterapêuticas, fa-
vorecendo a seleção de bactérias resistentes que, eventualmente, são transmitidas
aos humanos, seja de forma direta (por contato/manipulação) ou indireta (produtos
alimentares, solo e água contaminada)9,10.
Entendendo a importância fundamental desse olhar global sobre a questão da re-

sistência aos antimicrobianos, o Ministério da Saúde, em parceria com a Anvisa e ou-
tros órgãos nacionais, publicou, em 2018, o Plano de Ação Nacional de Prevenção e
Controle da Resistência aos Antimicrobianos no Âmbito da Saúde Única (2018-2022),
o PAN-BR11. Esse plano foi elaborado em convergência com os objetivos definidos pela
aliança tripartite entre a OMS, a Organização das Nações Unidas para a Alimentação e
a Agricultura (FAO) e a Organização Mundial de Saúde Animal (OIE), e tem como um
dos objetivos garantir que se mantenha a capacidade de tratar e prevenir infecções
com antimicrobianos seguros e eficazes, com qualidade assegurada e utilizados de
11
forma responsável, no contexto da Saúde Única. Para tal, foram estabelecidos pelo
PAN-BR 14 objetivos principais, com 33 intervenções estratégicas e 75 atividades, en-
globando profissionais e gestores com atuação nas áreas de saúde humana, animal e
ambiental. A participação de gestores é fundamental para que programas de Saúde
Única sejam implementados de forma efetiva e para que os objetivos traçados pelo
PAN-BR sejam alcançados.
Nesse sentido, foi proposto pela Secretaria de Vigilância em Saúde a criação do

BR-GLASS – Programa Nacional de Monitoramento da Resistência Antimicrobiana no
Brasil. O programa está previsto no Objetivo 4 do PAN-BR, item 4.2.3. (Desenvolver um
sistema nacional de informação integrada para a vigilância e monitoramento da re-
sistência aos antimicrobianos), cujo propósito é complementar às ações da Anvisa ci-
tadas anteriormente, uma vez que pretende avaliar o perfil de sensibilidade de todos
os isolados dos hospitais sentinela, tanto de origem nosocomial como comunitários.
A vigilância integrada e a abordagem em Saúde Única são as tônicas do Programa,
que iniciou o Projeto-Piloto no Paraná em 2019 e deve ser expandido para outros
quatro estados em 2020, com o objetivo de atingir 95 hospitais sentinela até 202211.
As bactérias apresentam mecanismos de resistência complexos, que envolvem a di-

minuição da concentração intracelular do antimicrobiano, a alteração nos sítios de
ligação dessa molécula na célula bacteriana, ou a produção de enzimas que alteram
ou degradam o antimicrobiano. Tais mecanismos estão associados a genes localiza-
dos nos cromossomos ou plasmídeos bacterianos e que apresentam formas distintas
de expressão e de transmissão entre as bactérias. Essa transmissão ocorre entre os di-
ferentes ecossistemas (humanos, animais e meio ambiente), ressaltando, novamente,
a importância da abordagem da Saúde Única12. Os mecanismos moleculares da re-
sistência bacteriana e sua disseminação serão discutidos em detalhes no Capítulo 2.
Diante do cenário apresentado, nunca o laboratório de Microbiologia Clínica foi tão

exigido no que diz respeito aos resultados dos testes de sensibilidade aos antimicro-
bianos. Assim, microbiologistas devem ser capazes de reconhecer e utilizar as me-
todologias mais adequadas e padronizadas para obtenção de resultados acurados,
a fim de, efetivamente, auxiliar no tratamento e na prevenção da disseminação de
infecções bacterianas. Da mesma forma, gestores devem estar cientes da problemá-
tica da resistência bacteriana aos antimicrobianos, para que compreendam a neces-
sidade de investimentos constantes, sempre sendo capazes de avaliar criticamente o
custo-benefício dos investimentos.
É importante, por exemplo, que os laboratórios tenham ferramentas que permitam o

correto gerenciamento dos dados no contexto da vigilância epidemiológica. Assim,
a partir de uma parceria da Coordenação Geral de Laboratórios de Saúde Pública
(CGLAB) com o Departamento de Informática do Sistema Único de Saúde (DATASUS)
12
e a Secretaria de Vigilância em Saúde (SVS), foi criado o sistema Gerenciador de

Ambiente Laboratorial (GAL), com o objetivo de informatizar os Laboratórios de
Vigilância Epidemiológica e Vigilância em Saúde Ambiental, proporcionando geren-
ciamento das rotinas, o acompanhamento das etapas para realização dos exames e a
obtenção de relatórios epidemiológicos.
Em relação às técnicas de determinação da sensibilidade das bactérias aos antimi-

crobianos, experimentos de diluição de antimicrobianos em caldo e em ágar foram
uma das primeiras ferramentas utilizadas na prática da microbiologia, iniciado em
1870. Nos anos 1940, essas técnicas foram aprimoradas e, posteriormente, padroni-
zadas e recomendadas pelos comitês de padronização ao redor do mundo, permi-
tindo a determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) dos antimicrobianos.
Entretanto, têm a desvantagem de serem tecnicamente trabalhosas para serem reali-
zadas rotineiramente no laboratório de Microbiologia Clínica, especialmente aqueles
com alta demanda13.
Por sua vez, o teste de disco-difusão, desde a sua descrição original (na década de
1920) até a forma que conhecemos e utilizamos atualmente, passou por inúmeras
modificações, tendo a contribuição de diferentes autores. Vários métodos foram pro-
postos, todos apresentando limitações importantes, especialmente no que dizia res-
peito à reprodutibilidade. Até que, em 1966, Kirby & Bauer estabeleceram uma me-
todologia confiável e padronizada para ser utilizada para determinar a sensibilidade
das bactérias aos antimicrobianos. O teste de “Kirby & Bauer” ainda é o método mais
rotineiramente utilizado mundialmente, por ser de fácil execução, baixo custo e por
responder, de forma geral, às necessidades da equipe médica13.
Ö Em 1991, foi desenvolvido o primeiro método comercial (Teste Epsilométri-

co – Etest®) baseado em fitas plásticas não porosas com um gradiente de
concentração de antimicrobianos, o qual permite determinar a CIM dos an-
timicrobianos sem a necessidade de uso de técnicas de diluição. Atualmen-
te, existem outras empresas que também fabricam fitas com gradientes de
concentração de antimicrobianos, utilizando o mesmo princípio do Etest.
Metodologicamente fácil de executar, essa técnica é, na maioria das situa-
ções clínicas, uma forma muito prática de realização de teste quantitativo
(determinação de CIM) 13. As peculiaridades dos testes citados, bem como as
metodologias detalhadas e suas limitações, serão discutidas no Capítulo 4.
Nem todos os testes descritos até aqui são adequados para todas as bactérias. A sen-
sibilidade às polimixinas em enterobactérias, por exemplo, não é determinada, de
forma confiável utilizando-se o teste de disco-difusão ou as fitas de gradiente de con-
centração, e isso se deve às características moleculares do antimicrobiano14. Além dis-
so, algumas situações clínicas ou epidemiológicas podem exigir a caracterização de
13
mecanismos de resistência específicos, e, para isso, testes adicionais são necessários.

Assim, por exemplo, o teste de disco-difusão define se uma determinada bactéria
é resistente a um carbapenêmico, mas não é capaz de elucidar se essa resistência
está ou não associada à produção de carbapenemases (enzimas que hidrolisam car-
bapenêmicos), muito menos estabelecer qual o tipo de enzima está sendo produzi-
do15. Essas e outras particularidades serão oportunamente discutidas ao longo do
Capítulo 5.
A exemplo da descoberta dos antimicrobianos, a Biologia Molecular foi outro avanço

notável ocorrido no século passado nas ciências médicas. Muitas das técnicas mole-
culares foram utilizadas experimentalmente na Microbiologia Clínica e, com o passar
dos anos, algumas demonstraram aplicabilidade limitada, enquanto outras se conso-
lidaram como ferramentas úteis para os laboratórios.
A Reação em Cadeia da Polimerase (“Polymerase Chain Reaction” – PCR) pode ser

utilizada, por exemplo, para identificação rápida e acurada de marcadores genéticos
específicos de resistência. A técnica de PCR é uma metodologia que requer equipa-
mentos e materiais de consumo que nem sempre estão disponíveis em laboratórios
de microbiologia e, por isso, não é utilizada na rotina da maioria dos laboratórios.
Compreender as vantagens e limitações dessa e de outras metodologias moleculares
é essencial para a utilização assertiva desses métodos16.
As ferramentas de Biologia Molecular também podem ser utilizadas para compreen-

der e, eventualmente, evitar a disseminação dos microrganismos multirresistentes.
Atualmente, vivemos em um mundo globalizado e o trânsito de pessoas e mercado-
rias facilitou, sobremaneira, a disseminação desses microrganismos. Nesse contexto,
metodologias têm sido utilizadas para avaliar a relação genética entre bactérias en-
volvidas em infecções, com o objetivo de compreender a dinâmica de disseminação
delas e/ou de seus determinantes genéticos de resistência. Alguns microrganismos
multirresistentes, por exemplo, apresentam predominantemente uma expansão clo-
nal, de abrangência mundial. É o caso da K. pneumoniae ST258, um clone bacteriano
altamente adaptado ao ambiente hospitalar, associado à resistência aos carbapenê-
micos e endêmico em várias regiões do mundo, incluindo o Brasil17. As ferramentas
utilizadas para a determinação da epidemiologia molecular de microrganismos re-
sistentes serão descritas no Capítulo 6, desde a tipagem por PFGE (“Pulsed-Field Gel
Electrophoresis”) e MLST (“MultilocusSequenceTyping”) até o sequenciamento do
genoma completo.
Por fim, compõem este Módulo, materiais ilustrativos, no formato de vídeos com
apresentação prática dos principais tópicos aqui abordados. Assim, espera-se que
este documento possa contribuir para uma melhor compreensão do fenômeno da
resistência bacteriana e para reforçar o papel do laboratório de Microbiologia nesse
14
processo, escolhendo e executando de forma adequada as metodologias atualmente

disponíveis.
Diante do exposto, fica claro que a resistência bacteriana aos antimicrobianos é um

problema de abrangência mundial, que coloca em risco a saúde humana. Para o en-
frentamento adequado desse cenário, uma abordagem pautada na saúde única é
essencial. Nesse contexto, se torna imprescindível a participação de profissionais da
saúde, juntamente com gestores, para que se tenham sistemas de vigilância epide-
miológica robustos e para que medidas efetivas de prevenção e controle das infec-
ções por essas bactérias possam ser estabelecidas. Laboratórios de Microbiologia
têm papel fundamental em todo esse contexto, já que a detecção acurada do per-
fil de sensibilidade das bactérias aos antimicrobianos, bem como de seus mecanis-
mos de resistência, são essenciais para que todas as demais providências possam ser
tomadas.
1.1 Referências bibliográficas

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their use in isolation of B. influenzae, Br J Exp Pathol. 1929; 10: 226-236.
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pneumoniae. PNAS. 2014; 11: 4988-4993.
16
Capítulo 2:
Bases moleculares da resistência bacteriana
Ana Paula D’ Alincourt Carvalho Assef
Orlando Carlos da Conceição Neto
Entende-se por resistência bacteriana a capacidade de um microrganismo de se de-

senvolver in vitro na presença da concentração alcançada pelo antimicrobiano na
corrente sanguínea, após administração de dose padrão.
As bactérias podem apresentar resistência intrínseca ou adquirida aos antimicrobia-

nos. Resistência intrínseca é a característica inata de determinada espécie ou gêne-
ro bacterianos onde todos os indivíduos de um mesmo gênero ou espécie apresen-
tam resistência a um determinado agente antimicrobiano, devido a particularidades
estruturais ou funcionais1.
Resistência adquirida ocorre quando uma bactéria previamente sensível a deter-

minado antimicrobiano desenvolve resistência, podendo ser consequência de mu-
tações em genes cromossômicos ou de aquisição de elementos genéticos móveis,
como plasmídeos e transposons que contenham genes associados à resistência, por
transferência horizontal de genes1.
2.1 Mecanismos de resistência aos antimicrobianos
A resistência aos antimicrobianos pode ocorrer por diferentes mecanismos, tais

como: alteração da permeabilidade celular ao antimicrobiano; expulsão do antimi-
crobiano por bombas de efluxo; alteração do sítio de ação do antimicrobiano e inati-
vação enzimática do agente antimicrobiano. Esses mecanismos podem coexistir em
uma mesma cepa bacteriana, tornando-a resistente a diferentes classes de antimicro-
bianos, gerando um perfil de multirresistência1,2. A seguir, esses mecanismos serão
discutidos detalhadamente.
17
2.1.1 Alteração da permeabilidade celular ao antimicrobiano

A permeabilidade da membrana celular é essencial para que o antimicrobia-
no tenha acesso a seu sítio de ação. Alterações nessa permeabilidade podem
levar a uma diminuição da concentração do antimicrobiano dentro da célula
bacteriana2.
A membrana externa das bactérias Gram-negativas é a primeira linha de de-

fesa contra compostos tóxicos, tais como os antimicrobianos. Devido à per-
meabilidade limitada da membrana externa, que é uma característica inata,
os bacilos Gram-negativos são intrinsecamente resistentes a vários antimi-
crobianos como penicilina, eritromicina, clindamicina e vancomicina2.
A entrada de muitos antimicrobianos, como por exemplo os β-lactâmicos, na

célula bacteriana é controlada pelas porinas, que são proteínas de membra-
na externa – “Outer Membrane Proteins” (OMPs) – capazes de formar canais
constituídos de água no seu interior, o que permite a difusão passiva de solu-
tos hidrofílicos através da membrana externa. Assim, algumas bactérias po-
dem desenvolver resistência adquirida a determinados antimicrobianos por
meio de mutações nos genes codificadores ou reguladores de determinadas
porinas, levando à redução dos níveis de expressão ou alteração da estrutu-
ra dessas proteínas, o que limita a entrada do antimicrobiano. Geralmente,
essas mutações conferem um aumento da concentração inibitória mínima
(CIM) do antimicrobiano, mas muitas vezes esse aumento não é suficiente
para que seja observada uma resistência clínica ao composto3,4.
Um exemplo é o desenvolvimento de resistência ao imipenem em Pseudo-

monas aeruginosa devido a mutações no gene que codifica a porina OprD
(responsável pela entrada desse antimicrobiano dentro da célula bacteria-
na). A diminuição ou ausência da expressão desta porina confere resistên-
cia de baixo ou moderado nível ao imipenem. Nesses casos, também ocorre
o aumento da CIM para o meropenem, mas não em níveis suficientes para
causar resistência, e a bactéria continua sendo classificada como sensível ao
meropenem 5.
Algumas vezes, as alterações na expressão de determinadas porinas podem

levar à resistência a diferentes classes de antimicrobianos, tornando a bac-
téria multirresistente. Isso porque uma mesma porina pode servir de canal
de acesso ao interior da célula por diferentes compostos antimicrobianos.
Como exemplo, em Klebsiella pneumoniae tem sido descrito que mutações
nos genes que codificam as porinas OmpK35 e OmpK36 causam diminuição
da sensibilidade a alguns β-lactâmicos como os carbapenêmicos, mas tam-
bém às fluoroquinolonas, ao cloranfenicol e à tetraciclina4,6.
18
No entanto, a associação da diminuição da permeabilidade com outros me-

canismos de resistência pode conferir maiores níveis de resistência, pois as
mutações e/ou as alterações na expressão de porinas atuam limitando a en-
trada de um antimicrobiano dentro da célula, permitindo uma melhor ação
de outros mecanismos de resistência, como bombas de efluxo e degrada-
ção enzimática. Por exemplo, Serratia marcescens pode se tornar resistente
ao meropenem pela perda da porina OmpF associada à hiperexpressão da
β-lactamaseAmpC7.
2.1.2 Remoção do antimicrobiano por bombas de efluxo

Os sistemas de efluxo atuam na remoção de compostos tóxicos de dentro
da célula bacteriana. O aumento da expressão desses sistemas é um impor-
tante mecanismo de resistência aos antimicrobianos podendo causar resis-
tência simultânea a diferentes classes de antimicrobianos (multirresistência).
Ao contrário da diminuição da permeabilidade celular (mecanismo presente
exclusivamente em bactérias Gram-negativas), os sistemas de efluxo podem
estar presentes em micobactérias, bactérias Gram-positivas e Gram-negati-
vas, sendo mais relevante neste último grupo de bactérias2.
Os sistemas de efluxo são formados por transportadores proteicos que fun-

cionam através de consumo de energia. Em Gram-positivos são constituídos
por um único polipeptídeo localizado na membrana citoplasmática. Já em
Gram-negativos, a maioria dos sistemas é composto por três proteínas, uma
inserida na membrana citoplasmática, outra na membrana externa e uma
proteína de ligação no espaço periplasmático8.
Existem cinco grandes famílias de sistemas de efluxo classificadas de acordo

com a fonte de energia utilizada, a relação filogenética e a especificidade
de substratos: ABC (“ATP BindingCassette”), MFS (“Major Facilitator Superfa-
mily”), SMR (“Small Multidrug Resistance”), MATE (“Multidrug and Toxic Com-
pound Extrusion”) e RND (“Resistance-NodulationDivision”). Os sistemas de
efluxo da família ABC utilizam a hidrólise de ATP (adenosina trifosfato) como
fonte de energia, enquanto as outras famílias usam a força motriz de pró-
tons8. Dentre as cinco grandes famílias, a que mais se destaca na resistência
aos antimicrobianos em bactérias Gram-negativas é a família RND9.
Enquanto alguns sistemas de efluxo são específicos para um determinado

substrato, como TetA e CmlA que expulsam apenas tetraciclina e cloranfeni-
col, respectivamente, outros sistemas podem exportar uma gama de subs-
tratos distintos como, por exemplo, o sistema de efluxo MexAB-OprM de P.
aeruginosa, que quando hiperexpresso, pode gerar resistência aos β-lactâ-
micos, quinolonas, tetraciclina e cloranfenicol8.
19
A maioria dos sistemas de efluxo é codificada por genes cromossômicos, po-

rém alguns são adquiridos em elementos genéticos móveis, como é o caso
do gene qepA, que codifica uma bomba de efluxo em K. pneumoniae e tem
sido associada à resistência às quinolonas8.
2.1.3 Alteração do sítio de ação do antimicrobiano

Cada antimicrobiano possui um alvo específico na célula bacteriana para
realizar a sua ação e essa interação (antimicrobiano/sítio de ação) é muito
específica. Assim, alterações nos sítios de ação fazem com que a bactéria
se torne resistente ao antimicrobiano. Essas alterações podem ocorrer por
(i) mutações em genes que codificam as proteínas-alvo, levando a ausência,
alteração da estrutura ou da expressão do sítio de ação; ou (ii) por aquisição
de genes que codificam alguma proteção ao sítio de ação2.
A resistência à oxacilina em Staphylococcus spp. é um exemplo desse tipo

de mecanismo de resistência. O gene mecA codifica uma nova transpepti-
dase, denominada PBP2a (“Penicillin-Binding Protein” 2a) ou PBP2’, que pos-
sui baixa afinidade pelos β-lactâmicos. Esta PBP é suficiente para manter a
integridade da parede celular durante o crescimento bacteriano, enquan-
to as outras PBPs constitutivas são inativadas pelos β-lactâmicos10,11. Outro
exemplo de alteração no sítio de ligação ocorre na resistência às polimixinas.
Por mutações em genes cromossômicos ou aquisição de genes plasmidiais
(mcr), a porção do lipídeo A do lipopolissacarídeo das bactérias Gram-nega-
tivas sofre uma redução nas cargas negativas, diminuindo ou impedindo a
ligação das polimixinas, que são antimicrobianos catiônicos, ao seu alvo12.
2.1.4 Modificação ou inativação enzimática do agente antimicrobiano

A modificação/inativação enzimática do antimicrobiano é o principal meca-
nismo de resistência em bacilos Gram-negativos. Têm sido descritas milhares
de enzimas que podem degradar ou modificar antimicrobianos de diferen-
tes classes. Existem três estratégias químicas que as enzimas utilizam para
promover a inativação do antimicrobiano: transferência de grupos químicos
(que ocorre em diferentes classes de fármacos), mecanismos de oxidação
(que ocorre com as tetraciclinas) e hidrólise (que ocorre principalmente com
os β-lactâmicos)2.
Enzimas que inativam antimicrobianos através da transferência de grupos

químicos, incluindo fenômenos de fosforilação, glicosilação, ribosilação e
transferência de grupos thiol, são bastante comuns causando resistência aos
aminoglicosídeos, cloranfenicol e macrolídeos, por exemplo. Um dos prin-
cipais grupos de enzimas que modificam antimicrobianos são as enzimas
modificadoras de aminoglicosídeos (EMAs), que alteram a estrutura química
20
desses compostos, inativando a sua ligação com as subunidades do ribos-

somo (sítio de ação na bactéria). Geralmente as EMAs conferem resistência
a altas concentrações de aminoglicosídeos. Existem três principais classes
de EMAs: acetiltransferases, fosfotransferases e nucleotidiltransferases. Essas
classes são evolutivamente diversas e variam em relação aos aminoglicosí-
deos que podem modificar e à região da molécula que será modificada1,2.
Ö β-lactamases
As β-lactamases são as enzimas de maior importância clínica. Constituem

um grupo diverso de enzimas e estão amplamente distribuídas entre bac-
térias Gram-positivas e negativas, sendo o mais importante mecanismo de
resistência aos β-lactâmicos em bactérias Gram-negativas. Esse fato se deve
ao acúmulo dessas enzimas no espaço periplasmático das bactérias Gram-
-negativas, enquanto em Gram-positivas essas enzimas são liberadas para
o meio externo. Isso faz com que a inativação do antimicrobiano seja mais
efetiva em Gram-negativos, antes de sua ligação às PBPs na membrana cito-
plasmática13,14.
O mecanismo de ação dessas enzimas é a hidrólise do anel β-lactâmico, pre-

sente no núcleo estrutural de todos os β-lactâmicos. Os genes codificadores
de β-lactamases podem possuir localização cromossômica ou plasmidial e
muitas vezes estão associados a outros elementos genéticos móveis, como
integrons, transposons e sequências de inserção. A localização desses genes
nesses elementos com mobilidade facilita sua disseminação13.
Diferentes tipos de β-lactamases já foram descritos e inúmeras tentativas de

estabelecer um sistema de classificação foram propostas. Atualmente, têm
sido consideradas duas classificações: A classificação de Ambler (1980)15,
com base na estrutura molecular e na sequência de aminoácidos, resultando
em quatro grandes classes (A, B, C e D); e a classificação de Bush & Jacoby
(2010) que é baseada na atividade enzimática relacionando substrato prefe-
rencial e características estruturais14,16.
As β-lactamases de classe A possuem serina no sítio de ação e são chamadas

de serino-β-lactamases. Englobam as penicilinases, a maioria das β-lactama-
ses de espectro estendido (“Extended-Spectrum β-Lactamases” – ESBLs) e as
serino-carbapenemases, como a KPC (“Klebsiella pneumoniae carbapenema-
se”). As penicilinases são enzimas com capacidade de hidrólise restrita, agin-
do apenas sobre as penicilinas. Alguns exemplos de enzimas dessa classe
são as penicilinases produzidas por Staphylococcus spp. e Enterococcus spp.
(PC1)13.
21
As ESBLs são capazes de hidrolisar todas as penicilinas, as cefalosporinas

incluindo as de terceira e quarta gerações e monobactâmicos. A grande
maioria das β-lactamases desse grupo é susceptível à ação de inibidores de
β-lactamases, tais como o ácido clavulânico, o sulbactam ou o tazobactam.
Atualmente, existem mais de 500 diferentes ESBLs descritas, sendo a maioria
derivada das enzimas CTX-M, TEM e SHV, principalmente em Escherichia coli,
Klebsiella pneumoniae e outras espécies de Enterobacterales13.
As carbapenemases de classe A são divididas em quatro representantes

principais: GES (43 variantes, algumas com atividade de ESBL e outras com
atividade de carbapenemase, como por exemplo GES-2, GES-4, GES-5, GES-
8, GES-11, GES-16, GES-18, GES-19 e GES-20), SME (5 variantes), IMI/NMC (18
variantes) e KPC (46 variantes). Algumas dessas variantes foram descritas
pela primeira vez no Brasil, como é o caso da GES-16. As carbapenemases hi-
drolisam uma ampla variedade de antimicrobianos β-lactâmicos, incluindo
os carbapenêmicos, cefalosporinas, penicilinas e monobactâmicos (aztreo-
nam) e podem ser inibidas pelo ácido clavulânico e tazobactam13,17,18. As en-
zimas do tipo KPC são as de maior importância clínica e epidemiológica. De
fato, KPC-2 é a carbapenemase mais comumente detectada mundialmente,
sendo que, no Brasil, essa variante é endêmica17. Tais enzimas apresentam
elevada capacidade hidrolítica contra carbapenêmicos e são rapidamente
disseminadas por elementos genéticos móveis, justificando seu caráter en-
dêmico18,19.
As enzimas da classe C também são denominadas de AmpC β-lactamase.

Geralmente têm localização cromossômica, mas existem enzimas AmpC
plasmidiais. Os microrganismos que hiperexpressam AmpC são tipicamente
resistentes às penicilinas, às combinações de β-lactâmicos com inibidores
de β-lactamases e às cefalosporinas de primeira e terceira gerações, mas ge-
ralmente mantêm a sensibilidade às cefalosporinas de quarta geração (ce-
fepima), quando não existe associação com outros mecanismos, como a al-
teração nas proteínas de membrana externa. Algumas espécies de bactérias
possuem intrinsecamente genes que codificam AmpC que são induzíveis na
presença de beta-lactâmicos13. As principais enterobacterias que possuem
AmpC induzível incluem Citrobacter freundii, Enterobacter spp., Serratia mar-
cescens e Providencia spp, um grupo tradicionalmente conhecido pela sigla
“CESP”. A sigla “MYSPACE” também é utilizada visto que outras bactérias
como Morganella morgannii, Yersinia sp, Aeromonas sp e Pseudomonas aeru-
ginosa também podem apresentar AmpC induzível.
Por sua vez, as β-lactamases de classe B são chamadas de metalo-β-lacta-

mases (MBLs). São caracterizadas por apresentarem um ou dois átomos de
22
zinco em seu sítio de ação, o que faz com que sejam inibidas por quelantes
como o EDTA ou compostos derivados do ácido tiólico. Essas β-lactamases
são capazes de hidrolisar todos os β-lactâmicos, com exceção dos mono-
bactâmicos, possuindo uma alta atividade contra os carbapenêmicos além
de serem resistentes aos inibidores de β-lactamases, como sulbactam e cla-
vulanato. Como todas as β-lactamases, as MBLs podem ser codificadas por
genes localizados no cromossomo bacteriano ou transferidos através de ele-
mentos genéticos móveis. As famílias mais comuns de MBLs relatadas em
isolados clínicos incluem as subclasses VIM (incluindo 67 variantes), IMP (79
variantes), GIM (2 variantes), SIM (2 variantes), NDM (20 variantes) e SPM (1
variante) (13,17,19). A SPM foi descrita pela primeira vez no Brasil em 2002,
de um isolado recuperado em 1999, e tem sido descrita como a principal
MBL em amostras brasileiras de P. aeruginosa devido à disseminação de um
clone endêmico, ST 277, em hospitais brasileiros20.
As β-lactamases de classe D ou oxacilinases (OXA) possuem uma serina em

seu sítio de ação. Dentre elas, há enzimas com perfil de penicilinases, que
hidrolisam penicilinas e cloxacilina (ex.: OXA-1), perfil de ESBLs, que hidro-
lisam cefalosporinas de amplo espectro (ex. OXA-15) e também com perfil
de carbapenemases (ex.: OXA-23 e OXA-48). Essas enzimas são fracamente
inibidas pelo ácido clavulânico13,17,19.
23
Tabela 1. Classificação das β-lactamases (adaptado de Bush and Fisher, 201116)

Inibida
Grupo Classe por ácido Inibida
Exemplos Características
Funcional Molecular clavulânico ou por EDTA
tazobactam
1 C AmpC de E. coli e P. Cefalosporinases AmpC Não Não
aeruginosa, CMY-2, FOX-1, cromossômicas e plasmidiais
MIR-1 Hidrolisam cefalosporinas e
cefamicinas.
1e C GC1, CMY-37 Hidrolisam penicilinas, cefamicinas, Não Não
cefalosporinas de amplo espectro e
monobactâmicos.
2a A PC1 e outras penicilinases Penicilinases Sim Não
de Staphylococcus spp. e
Enterococcus spp.
2b A SHV-1, TEM-1, TEM-2, Hidrolisam penicilinas e Sim Não
TEM-90 cefalosporinas de primeira geração
(cefazolina e cefalotina).
2be A CTX-M-15, CTX-M-44, ESBLs – Hidrolisam penicilinas, Sim Não
PER-1, SFO-1, SHV-5, cefalosporinas de amplo espectro e
TEM-10, TEM-26 monobactâmicos.
2br A TEM-30, TEM-76, TEM- Enzimas que hidrolisam penicilinas Não Não
103, SHV-10, SHV-26 e cefalosporinas de primeira
geração.
2ber A TEM-50, TEM-68, TEM-89 ESBLs – Hidrolisam penicilinas, Não Não
cefalosporinas, monobactâmicos.
2c A PSE-1, CARB-3 Hidrolisam penicilinas e Sim Não
carbenicilina.
2d D OXA-1, OXA-10 Hidrolisam a cloxacilina e oxacilina. Variável Não
2de D OXA-11, OXA-15 Hidrólise de penicilinas e Variável Não
cefalosporinas de amplo espectro.
2df D OXA-23, OXA-48 Carbapenemases – Hidrolisam Variável Não
carbapenêmicos e outros
β-lactâmicos
2e A CepA Cefalosporinases Sim Não
2f A IMI-1, KPC-2, KPC-3, Carbapenemases – Hidrolisam Sim Não
SME-1, GES-2 carbapenêmicos e outros
β-lactâmicos
3a B IMP-1, L1, NDM-1, VIM-1, Carbapenemases – Hidrolisam Não Sim
SPM-1 todos os β-lactâmicos exceto
monobactâmicos.
3b B CphA, Sfh-1 Carbapenemases – Hidrolisam Não Sim
preferencialmente carbapenêmicos.
24
2.2 Principais mecanismos de transferência horizontal de genes e

elementos genéticos móveis
Embora os eventos de mutação contribuam para a evolução e adaptação bacteriana,

a transferência horizontal de genes é a principal responsável pela rápida proliferação
de genes de resistência aos antimicrobianos entre bactérias, podendo haver transfe-
rência entre microrganismos de uma mesma espécie e também entre espécies e gê-
neros distintos. A transferência horizontal de genes ocorre através da conjugação, da
transformação ou da transdução e envolve diferentes elementos genéticos móveis
como plasmídeos, transposons, sequências de inserção, integrons, bacteriófagos e
ilhas genômicas21–23.
2.2.1 Conjugação
O mecanismo mais comum pelo qual os genes de resistência são transferi-
dos entre as bactérias é a conjugação, que é mediada por plasmídeos. Para
que aconteça a conjugação, é necessário contato célula a célula, através de
um pilus sexual especializado, codificado por um plasmídeo conjugativo.
Após o contato, uma das fitas do DNA plasmidial passa para a célula recepto-
ra através do pilus. A fita simples começa a ser replicada à medida que entra
na célula. Ao final do processo, as duas células bacterianas terão uma cópia
do plasmídeo conjugativo completo24.
Plasmídeos são DNAs extracromossômicos circulares e autorreplicantes. Há

uma grande variabilidade quanto ao tamanho dos plasmídeos, expresso em
número de pares de bases. Os plasmídeos podem ter de 1 a >100kbp. Embo-
ra sejam geralmente acessórios, os genes transportados por esses elementos
genéticos são, em algumas condições, fundamentais para a sobrevivência e
o crescimento da célula bacteriana. Entre as características mais observadas
conferidas por plasmídeos, encontram-se: resistência aos antimicrobianos,
resistência aos metais pesados e a outros agentes tóxicos, produção de toxi-
nas, dentre outras21,25.
Vários genes de resistência aos antimicrobianos são carreados por plasmí-

deos, como por exemplo, os genes que codificam as ESBL, e os genes codifi-
cadores das carbapenemases (blaKPC, blaNDM, blaSPM e blaOXA). Além disso, mui-
tas vezes esses plasmídeos carreiam também determinantes de resistência
para outros grupos de antimicrobianos como quinolonas, sulfonamidas, tri-
metoprima, cloranfenicol, tetraciclinas e aminoglicosídeos, tornando a cepa
bacteriana multirresistente21–23.
25
2.2.2 Transformação
Na transformação, há a captação de DNA do meio extracelular pelas células
bacterianas. Para que ocorra a transformação, são necessárias algumas con-
dições: o DNA precisa estar livre no meio extracelular; a bactéria receptora
precisa ser capaz de internalizar (estar em estado de competência) o DNA
livre e este precisa ser integrado ao DNA cromossômico para que fique está-
vel21,26.
Algumas bactérias são constitutivamente competentes, como é o caso de

Streptococcus pneumoniae. Outras espécies bacterianas capazes de transfor-
mação natural podem desenvolver competência sob certas condições, tais
como a presença de peptídeos ou autoindutores, o estado nutricional ou
outras condições estressantes. A exposição a antimicrobianos também pode
induzir competência em muitas espécies de bactérias estimulando a trans-
formação22,23.
2.2.3 Transdução
O mecanismo de transdução compreende a transferência genética com au-
xílio de bacteriófagos (vírus que infectam bactérias). Existem duas formas de
transdução: a generalizada e a especializada. Na transdução generalizada,
um fragmento aleatório de DNA da célula hospedeira é inserido na partícula
do bacteriófago durante o processo de lise celular. A transdução especializa-
da é mediada por fagos lisogênicos ou temperados. Quando ocorre a excisão
do profago (DNA viral incorporado ao DNA bacteriano), este pode carrear
um fragmento de DNA bacteriano que estava adjacente. Quando ocorre a
infecção em outra bactéria, o DNA viral contendo o fragmento de DNA bac-
teriano pode ser incorporado ao DNA da bactéria receptora22,27.
A mobilização de genes de resistência através de transdução tem sido des-

crita para algumas espécies bacterianas como, por exemplo, a transferência
de resistência à tetraciclina e gentamicina em Enterococcus spp22,23.
2.3 Outras formas de transferência de genes e elementos genéticos

móveis
2.3.1 Transposição
A transposição é a transferência de genes dentro de uma mesma célula
através de transposons (DNA). Os transposons são sequências de DNA que
possuem pelo menos um gene que codifica uma transposase, enzima capaz
de reconhecer sequências de DNA repetidas e invertidas (IR) localizadas nas
extremidades dos transposons. As transposases excisam os transposons e os
26
inserem em ontro ponto do cromossomo ou plasmídeos. Eles carregam toda

a informação genética necessária para sua transposição. A presença des-
ses elementos é um fator importante de alterações no genoma bacteriano,
como inversões e deleções, que podem ser causadas pela recombinação ho-
móloga entre transposons. Além disso, podem ocorrer fusões de elementos
de DNA diferentes, tais como um plasmídeo e um cromossomo, se transpo-
sons similares estiverem presentes em ambos os elementos.
Existem, basicamente, três tipos de elementos transponíveis: sequências de

inserção, transposons simples e transposons compostos. Considerando a
problemática da resistência antimicrobiana, algumas sequências de inserção
podem atuar como promotores da expressão de genes de resistência, como
por exemplo, a presença da sequência de inserção ISAba1 localizada logo a
montante dos genes que codificam as carbapenemases OXA-51 e OXA-23,
em Acinetobacter baumannii resultam em uma hiperexpressão desses ge-
nes28.
Os transposons desempenham um papel importante na disseminação dos

genes de resistência a antimicrobianos. A disseminação do gene que codi-
fica a carbapenemase KPC, por exemplo, tem sido associada ao transposon
Tn4401. Tal transposon, pertence à família dos transposons Tn3, e na maioria
das vezes, encontra-se inserido em plasmídeos conjugativos22,23.
2.3.2 Integrons
Integrons são elementos genéticos capazes de integrar ou mobilizar cassetes
gênicos por mecanismos de recombinação sítio-específico. Tais elementos
estão amplamente distribuídos entre as bactérias Gram-negativas, associa-
dos a diferentes elementos móveis, como sequências de inserção, transpo-
sons e plasmídeos. Diferentes classes de integrons já foram descritas, sendo
os integrons de classe 1 os mais comumente associados à resistência aos
antimicrobianos.
A estrutura básica dos integrons é formada pelo gene da integrase (intI), que
possui atividade de recombinação sítio-específica; uma região reguladora,
chamada de região P; e um sítio específico de recombinação attI. Adjacente
a região attI do integron, encontra-se a região variável que pode conter um
ou mais cassetes gênicos. Os cassetes gênicos são unidades que contêm um
gene, normalmente um gene de resistência a antimicrobianos, e um sítio de
recombinação (attC) que é reconhecido pela integrase codificada pelo inte-
gron. Alguns integrons possuem vários cassetes gênicos inseridos sequen-
cialmente a partir do sítio attI conferindo resistência a diferentes classes de
antimicrobianos23,29,30.
27

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30
Capítulo 3:
Microrganismos multirresistentes de importância clínica e suas
resistências intrínsecas e adquiridas
Adriana Cardenas
Fernanda Esposito
Raquel Regina Bonelli
Jorge Luiz Mello Sampaio
Nilton Lincopan
3.1 Introdução
A distribuição das bactérias é ubiquitária na natureza, onde fazem parte da micro-

biota dos diversos hospedeiros e ecossistemas que integram a vida no planeta. A
adaptação aos diferentes ambientes que podem colonizar é dependente do mosaico
de genes intrínsecos e adquiridos que compõem o genoma bacteriano (cromosso-
mo e plasmídeos), sendo que a recombinação de genes pode acontecer de forma
espécie-inespecífica1.
Em ambientes ou condições que propiciam a competitividade entre as bactérias para

seleção/estabelecimento do seu nicho ecológico, algumas espécies se perpetuam
graças à produção de metabólitos secundários com atividade antibacteriana (sejam
antimicrobianos ou bacteriocinas) que exercem uma pressão seletiva. Portanto, na
natureza, fungos e bactérias que produzem compostos antimicrobianos são intrin-
secamente resistentes a eles, uma vez que carregam os genes que codificam esse
mecanismo de resistência específico1.
Por outro lado, a versatilidade genética das bactérias permite que muitas espécies
incorporem genes de resistência necessários para subsistir em ambientes com alta
pressão seletiva. Consequentemente, a interação entre espécies clinicamente impor-
tantes e bactérias intrinsecamente resistentes, presentes na natureza, tem favorecido
os processos de recombinação genética, resultando na emergência e disseminação
de patógenos resistentes aos antimicrobianos comercialmente disponíveis1.
Nos anos 80, a introdução e o uso massivo das cefalosporinas de amplo espectro, es-
táveis à degradação por β-lactamases TEM-1 e SHV-1, contribuíram para a seleção de
isolados que albergavam mutações nos genes blaTEM-1, blaTEM-2 e blaSHV-1, as quais deram
31
origem às novas variantes de β-lactamases, com alterações conformacionais no seu

sítio catalítico e expansão do espectro de atividade. Essas variantes passaram a hi-
drolisar as cefalosporinas de amplo espectro e monobactâmicos e, por essa razão, fo-
ram denominadas β-lactamases de espectro estendido (“Extended-Spectrum β-lac-
tamase” – ESBLs). Paralelamente, a versatilidade genética dessas espécies também
favoreceu a aquisição de genes codificadores de ESBLs, a partir de espécies intrinse-
camente resistentes às cefalosporinas como Kluyvera spp2. De fato, tem sido demons-
trado que a origem de variantes de ESBLs do tipo CTX-M, amplamente disseminadas
em K. pneumoniae e E. coli, foi a partir de Kluyvera ascorbata, Kluyvera cryocrescens, e
Kluyvera georgiana, onde a mobilização de genes blaKLU (intrínsecos em Kluyvera spp.
e precursores dos genes blaCTX-M) para plasmídeos, provavelmente foi mediada por
elementos genéticos móveis do tipo ISEcp12.
Atualmente, o uso massivo de carbapenêmicos e polimixinas tem contribuído para o

surgimento de linhagens de E. coli e K. pneumoniae produtoras de carbapenemases
(majoritariamente KPC-2) e resistentes às polimixinas, pela aquisição de mutações ou
genes que codificam para a produção de fosfoetanolamina transferases, como mcr-13.
A incorporação de genes blaCTX-M e blaKPC-2 no cromossomo dessas bactérias tem sido
um evento cada vez mais frequente, suportando a teoria de que o fenômeno da resis-
tência intrínseca em bactérias clinicamente significantes pode ser uma característica
própria da evolução bacteriana e exposição contínua aos antimicrobianos2.
O perfil de resistência apresentado por uma determinada espécie bacteriana tem

dado origem a critérios interpretativos de multirresistência (MDR), resistência extre-
ma (XDR) e pan-resistência (PDR). MDR se define quando uma espécie apresenta re-
sistência a antimicrobianos pertencentes a três ou mais diferentes classes (ex., β-lac-
tâmicos, aminoglicosídeos, quinolonas, sulfas, tetraciclinas, dentre outras). Já uma
espécie bacteriana extensivamente resistente pode apresentar sensibilidade apenas
a antimicrobianos pertencentes, no máximo, a duas classes; enquanto uma espécie
bacteriana pan-resistente, pode apresentar resistência a todos os agentes antibacte-
rianos disponíveis, pertencentes às diferentes classes4.
Recentemente, a Organização Mundial da Saúde (OMS) (5) publicou uma lista de

“patógenos prioritários” resistentes aos antimicrobianos para pesquisa e desenvol-
vimento de novos antimicrobianos, na qual se incluem 12 famílias de bactérias que
ameaçam a saúde humana (Quadro 1). O grupo de prioridade crítica inclui bacté-
rias multirresistentes que têm importância clínica principalmente em hospitais, ca-
sas de repouso, e em pacientes submetidos a processos invasivos, cateterização,
e/ou ventilação mecânica. Nesse grupo de patógenos se incluem Acinetobacter bau-
mannii, Pseudomonas aeruginosa e Enterobacterales, tais como Klebsiella spp., E. coli,
Enterobacter spp., Serratia spp., Proteus spp., Providencia spp. e Morganella spp. Tais
32
bactérias podem produzir infecções graves como bacteremia, sepse e pneumonia e

estão associadas a elevados índices de morbidade e mortalidade.
Quadro 1. Patógenos prioritários resistentes aos antimicrobianos (OMS, 2017)5.

Prioridade 1: CRÍTICA • Acinetobacter baumannii resistente aos carbapenêmicos
• Pseudomonas aeruginosa resistente aos carbapenêmicos
• Enterobacterales* resistente aos carbapenêmicos, às cefalosporinas de terceira geração
Prioridade 2: ELEVADA • Enterococcus faecium resistente à vancomicina
• Staphylococcus aureus resistente à meticilina (oxacilina), com sensibilidade intermediária ou
resistência à vancomicina
• Helicobacter pylori resistente à claritromicina
• Campylobacter spp. resistente às fluoroquinolonas
• Salmonella spp. resistente às fluoroquinolonas
• Neisseria gonorrhoeae resistente às cefalosporinas e às fluoroquinolonas
Prioridade 3: • Streptococcus pneumoniae não sensível à penicilina
MÉDIA • Haemophilus influenzae, resistente à ampicilina
• Shigella spp. resistente às fluoroquinolonas
* Klebsiella spp., E. coli, Enterobacter spp., Serratia spp., Proteus spp., Providencia spp. e Morganella spp.
3.2 Resistência intrínseca
Para algumas espécies bacterianas, a resistência intrínseca é uma característica na-

tural mediada pela presença de um gene específico que confere a expressão do me-
canismo de resistência, ou decorrente da composição estrutural, ou metabolismo
da bactéria (Tabela 1 e Tabela 2). De fato, nas bactérias Gram-negativas, a própria
membrana externa, aniônica e de alta hidrofobicidade, pode ser uma barreira física
para alguns antimicrobianos que possuem uma estrutura físico-química de natureza
aniônica ou altamente hidrofílica. Por outro lado, alguns antimicrobianos, como as
polimixinas catiônicas (colistina e polimixina B), se ligam por interação eletrostática
a seu alvo, a membrana externa (lipídeo A) presente em bactérias Gram-negativas.
Portanto, bactérias Gram-positivas são intrinsecamente resistentes às polimixinas. Da
mesma forma, pelo tipo de estrutura química, bactérias Gram-negativas são intrin-
secamente resistentes aos glicopeptídeos (vancomicina e teicoplanina), já que são
moléculas excessivamente grandes para penetrarem a membrana externa6.
Bactérias anaeróbias estritas apresentam resistência intrínseca aos aminoglicosídeos

devido ao fato de que esses antimicrobianos requerem transporte ativo de elétrons
para serem captados pelas células, portanto, em condições anaeróbias estritas, as
moléculas de aminoglicosídeo podem não ser absorvidas pela bactéria6.
O conhecimento da resistência intrínseca apresentada por algumas espécies bacte-

rianas pode ser utilizado para confirmar a identificação prévia de uma espécie, assim
como pode ser a base para a preparação de meios de culturas seletivos.
33
Tabela 1. Resistências intrínsecas em bactérias Gram-negativas de importância clínica

(adaptado do documento do EUCAST)7
Bactéria Resistências intrínsecas
Complexo Acinetobacter baumannii/ Ampicilina, amoxicilina, amoxicilina/ácido clavulânico, aztreonam, cefalosporinas 1ª geração,
Acinetobacter calcoaceticus ertapenem, trimetoprima, cloranfenicol, fosfomicina
Aeromonas spp. Ampicilina, amoxicilina
Bacteroides spp. Penicilina, ampicilina, aminoglicosídeos
Complexo Burkholderia cepacia Ampicilina, amoxicilina, ticarcilina, piperacilina, amoxicilina/ácido clavulânico, ampicilina/
sulbactam, cefalosporinas 1ª geração, ertapenem, colistina, polimixina B, aminoglicosídeos,
fosfomicina
Campylobacter jejuni, Trimetoprima
Campylobacter coli
Citrobacter freundii Ampicilina, amoxicilina, amoxicilina/clavulânico, ampicilina/sulbactam, cefalosporinas 1ª
geração, cefuroxima, cefoxitina
Citrobacter koseri, Ampicilina, amoxicilina, ticarcilina
Citrobacter diversus
Citrobacter amalonaticus (grupo)
Elizabethkingia meningoseptica Todos os β-lactâmicos com exceção da piperacilina/tazobactam
Enterobacterales Penicilina G, glicopeptídeos, macrolídeos, clindamicina, linezolida, estreptograminas
(quinupristina/dalfopristina), mupirocina
Enterobacter spp. Ampicilina, amoxicilina, amoxicilina/ácido clavulânico, cefalosporinas 1ª geração, cefoxitina
Haemophilus influenzae Penicilina G, eritromicina, clindamicina
Hafnia alvei Ampicilina, amoxicilina/ácido clavulânico, ampicilina/sulbactam, cefalosporinas 1ª geração,
cefamicinas (cefoxitina)
Klebsiella pneumoniae, Ampicilina, amoxicilina, carbenicilina, ticarcilina
K. variicola, K. oxytoca
Klebsiella aerogenes Ampicilina, amoxicilina/ácido clavulânico, ampicilina/sulbactam, cefalosporinas 1ª geração,
cefamicinas (cefoxitina)
Moraxella catarrhalis Trimetoprima, lincosamidas, cefalosporinas 1ª e 2ª gerações
Morganella morganii Ampicilina, amoxicilina, amoxicilina/ácido clavulânico, cefalosporinas 1ª geração, cefuroxima,
colistina, polimixina B, nitrofurantoína, tetraciclinas, tigeciclina
Neisseria spp. Lincosamidas, colistina, polimixina B
Providencia spp. Ampicilina, amoxicilina, amoxicilina/ácido clavulânico, cefalosporinas 1ª geração, gentamicina,
netilmicina, tobramicina, colistina, polimixina B, nitrofurantoína, tetraciclinas, tigeciclina
Proteus mirabilis Colistina, polimixina B, nitrofurantoína, tetraciclinas, tigeciclina
Proteus vulgaris Ampicilina, amoxicilina, cefalosporinas 1ª geração, cefuroxima, colistina, polimixina B,
nitrofurantoína, tetraciclinas
Pseudomonas aeruginosa Ampicilina, amoxicilina, amoxicilina/ácido clavulânico, ampicilina/sulbactam, cefalosporinas 1ª e
2ª gerações, cefotaxima, ceftriaxona, ertapenem, ácido nalidíxico, nitrofurantoína, trimetoprima,
tetraciclinas (tigeciclina)
Raoultella spp. Ampicilina, ticarcilina
Salmonella spp. Cefuroxima e aminoglicosídeos (ativo in vitro, mas não ativo in vivo)
Serratia spp. Ampicilina, amoxicilina, amoxicilina/ácido clavulânico, ampicilina/sulbactam, cefalosporinas 1ª
geração, cefuroxima, cefoxitina, colistina
Stenotrophomonas maltophilia Todos os β-lactâmicos, aminoglicosídeos, trimetoprima, fosfomicina
Yersinia enterocolitica Ampicilina, amoxicilina, carbenicilina, ticarcilina, cefalosporinas 1ª geração
34
Tabela 2. Resistências intrínsecas em bactérias Gram-positivas de importância clínica

(adaptado de EUCAST)7
Bactéria Resistência intrínseca
Todas as Gram-positivas Aztreonam, colistina, ácido nalidíxico
Staphylococcus saprophyticus Ácido fusídico, ceftazidima e fosfomicina

Streptococcus spp. Aminoglicosídeos*, ceftazidima
Enterococcus faecium Carbenicilina, ticarcilina, oxacilina, todas as cefalosporinas aminoglicosídeos*,
macrolídeos, mupirocina, clindamicina, trimetoprima, sufametoxazol
Enterococcus faecalis Carbenicilina, ticarcilina, oxacilina, todas as cefalosporinas aminoglicosídeos*, macrolídeos
mupirocina, clindamicina, trimetoprima, sufametoxazol, estreptograminas (quinupristina/
dalfopristina)
Enterococcus gallinarum Vancomicina, carbenicilina, ticarcilina, oxacilina, todas as cefalosporinas,
E. casseliflavus aminoglicosídeos*, mupirocina, clindamicina, trimetoprima, sufametoxazol,
estreptograminas (quinupristina/dalfopristina)
Listeria monocytogenes Cefalosporinas de 3ª geração, fluoroquinolonas
Clostridium spp. Aminoglicosídeos
Clostridioides difficile
*Baixo grau de resistência. Combinações de aminoglicosídeos com inibidores da parede celular (penicilinas e glicopeptídeos) são sinérgicas e bactericidas
contra isolados que são sensíveis aos inibidores da parede celular e não apresentam alto grau de resistência aos aminoglicosídeos
3.3 Resistência adquirida
3.3.1 Staphylococcus spp.

Bactérias do gênero Staphylococcus compõem a microbiota de seres hu-
manos e animais, habitando pele e mucosas. São patógenos oportunistas
e estão associados a infecções brandas, tais como infecções de pele e into-
xicações alimentares, mas também podem causar infecções graves, poten-
cialmente fatais, como pneumonias, bacteremias e infecções relacionadas a
dispositivos médicos invasivos. Dentre as espécies, Staphylococcus aureus é a
mais patogênica por possuir uma diversidade de fatores de virulência8.
Em Staphylococcus spp., o mecanismo de resistência mais importante para

os β-lactâmicos está relacionado com a resistência a oxacilina/meticilina me-
diada pelo gene mecA, o que se traduz em resistência a todos os β-lactâmi-
cos, com exceção das novas cefalosporinas ceftobiprole e ceftarolina (Tabela
3). O gene mecA codifica uma proteína ligadora de penicilina (“Penicillin-bin-
ding Protein” – PBP) alterada, a PBP2a, que apresenta baixa afinidade pelos
β-lactâmicos, mas que preserva sua atividade de transpeptidase. Assim, é
possível manter a síntese adequada da parede celular de Staphylococcus
spp., mesmo na presença de β-lactâmicos8,9.
35
Os pontos de corte para interpretar essa resistência, assim como os métodos

de avaliação, variam segundo a espécie: S. aureus, Staphylococcus pseudinter-
medius (de importância em medicina veterinária) e Staphylococcus schleiferi,
Staphylococcus epidermidis ou as demais espécies coagulase negativa7,10.
Para macrolídeos, lincosamidas e estreptogramina B (MLSB), o mecanismo de

resistência mais prevalente é a produção de metilases mediadas por genes
erm. Para fluoroquinolonas, mutações pontuais em topoisomerases, e a ex-
pressão de bombas de efluxo como NorA, são os principais mecanismos de
resistência9.
Para glicopeptídeos (vancomicina, teicoplanina) têm sido descritas cepas de

S. aureus com sensibilidade intermediária (Glycopeptide-Intermediate Staphy-
lococcus aureus – GISA), expressa de forma homogênea ou heterogênea, atra-
vés de um complexo mecanismo que envolve o espessamento da parede ce-
lular bacteriana e a produção de terminais D-alanil-D-alanina (D-Ala-D-Ala)
livres. O alto grau de resistência aos glicopeptídeos (“Glycopeptide-Resistant
Staphylococcus aureus”– GRSA ou “Vancomycin-Resistant Staphylococcus au-
reus”- VRSA) relaciona-se à síntese de precursores de peptidoglicano con-
tendo o D-Ala-D-Lac, ao invés da composição constitutiva D-Ala-D-Ala. Essa
substituição do aminoácido alanina por lactato é codificada pelo gene vanA,
localizado em transposons presentes em plasmídeos conjugativos9.
Para oxazolidinonas, tais como a linezolida, a resistência está associada a

mutações nos genes que codificam porções específicas no RNAr, alterações
nesse sítio causadas por genes plasmidiais ou, mais recentemente, pela pre-
sença de proteínas da família ARE ABC-F (poxtA)11.
36
Tabela 3. Fenótipos e mecanismos de resistência em Staphylococcus spp.9,11

Antimicrobiano Mecanismo de resistência Incidência
β-lactâmicos
PEN OXA AMP AMC CFO
S S S S S Sensível Baixa
R S R S S Penicilinase Muito alta
R 1
R 1
R 1
R 1
R 1
PBP2a (mecA) Alta
Macrolídeos-Lincosamidas-EstreptoGraminas (MLS)
ERI AZI SPI CLD STGB STGA
S S S S S S Sensível Alta
R R R R R S Metilase RNAr 23S (ermA, ermC): cMLSB Moderada
R R S/R S/R S/R S Metilase RNAr 23S (ermA, ermC, ermY): iMLSB2 Baixa
I/R I/R S S S/R S Bomba de efluxo (msrA, msrB, mphC, erpA): M, MS Baixa
S S S S/I/R S S Inativação (inuA, inuB, inuC) Muito baixa
S S S S/I/R S I/R Modificação do alvo (cfr) 3
Muito baixa
S S S S S R Inativação (vatA, vatB, vatC) Muito baixa
Bomba de efluxo (vgaA, vgaB)
S S S S R S Inativação (vgbA, vgbB) Muito baixa
Oxazolidinonas
LZD
R Mutações em L3 e RNAr 23S Muito baixa
R Alteração no síto de ação (cfr) Muito baixa
R Proteína da família ARE ABC-F (poxtA) Muito baixa
Aminoglicosídeos*
STR GEN TOB AMI CAN NET
S R R R R R Inativação enzimática [AAC(6’), APH(2’’)] Moderada (alta em
MRSA)
S S S S/R R S Inativação enzimática [APH(3’)-III] Baixa
R S S S S S Inativação enzimática [ANT(6)] Baixa
R S S S/R R S Inativação enzimática [ANT(6) + APH(3’)-III] Baixa
Glicopeptídeos Lipopeptídeos
VAN TEI DAP
S S S Sensível Alta
I/R I/R S vanA Muito baixa
R R R Mutações em mprF e walK, e no operon dltABCD Muito baixa
(mudança de carga e repulsão eletrostática)
Tetraciclinas
TET DOX
R R Bomba de efluxo (tetK, tetL) Baixa/
Proteína de proteção ribossomal (tetM, tetO) Moderada
AMC, amoxicilina/ácido clavulânico; AMI, amikacina; AMP, ampicilina; AZI, azitromicina; CLD, clindamicina; DAP, daptomicina; DOX, doxiciclina; ERI,
eritromicina; CFO, cefoxitina; GEN, gentamicina; CAN, kanamicina; LZD, linezolida; NET, netilmicina; OXA, oxacilina; PEN, penicilina; SPI, espiramicina;
STGA, estreptogramina grupo A (dalfonopristina); STGB, estreptogramina grupo B (quinopristina); STR, estreptomicina; TEI, teicoplanina; TET, tetraciclina;
TOB, tobramicina; VAN, vancomicina.
1
Cepas de estafilococos resistentes à oxacilina ou cefoxitina devem ser consideradas resistentes para todos os β-lactâmicos, com exceção ao ceftobiprol
e ceftarolina.
2
Em cepas com fenótipo MLSB induzível (iMLSB) a eritromicina induz o mecanismo de resistência conferindo resistência a todos os antimicrobianos MLSB.
3
A expressão do gene cfr confere resistência aos fenicóis, lincosamidas, oxazolidinonas, pleuromutilinas (tiamulina e valnemulina) e estreptogramina A.
*
Há uma diversidade grande de enzimas modificadoras de aminoglicosídeos. A tabela apresenta apenas alguns exemplos.
37
3.3.2 Enterococcus spp.

Enterococcus spp. fazem parte da microbiota intestinal de animais e seres
humanos, bem como do ambiente. As duas espécies mais importantes, En-
terococcus faecium e Enterococcus faecalis, são frequentemente associadas
a diferentes infecções em animais e seres humanos imunocomprometidos,
tais como endocardites, bacteremia, sepse, infecções do trato urinário, infec-
ção de sítio cirúrgico e, mais raramente, meningites. Outras espécies como
Enterococcus gallinarum, Enterococcus avium, Enterococcus casseliflavus e En-
terococcus durans são clinicamente de menor importância12.
Em Enterococcus spp. o principal mecanismo de resistência aos β-lactâmicos

está relacionado a mutações nos genes que codificam PBPs, especificamen-
te do tipo PBP5, que têm baixa afinidade pelos antimicrobianos desta classe
(Tabela 4). Como consequência dessas mutações, todos os Enterococcus spp.
apresentam resistência de alto nível às penicilinas semissintéticas e à maioria
das cefalosporinas13,14. Adicionalmente, alguns isolados de Enterococcus spp.
também podem produzir uma β-lactamase idêntica à β-lactamase estafilo-
cócica, porém, devido ao baixo nível de produção, ela não pode ser detecta-
da por testes de sensibilidade de rotina, como métodos de diluição ou difu-
são. Para sua detecção, em casos de suspeita, é possível utilizar: i) discos de
nitrocefina; ou ii) discos de ampicilina e ampicilina-sulbactam, onde o teste
é interpretado como positivo quando há um aumento de ≥ 4 mm no halo de
inibição de ampicilina-sulbactam7,10.
No caso de macrolídeos, lincosamidas e estreptogramina B (MLSB), dentre os

mecanismos de resistência mais prevalentes estão a expressão de metilases
mediadas por genes erm, e expressão de bombas de efluxo mediadas pelo
gene lsa. Para fluoroquinolonas, mutações pontuais nos genes parC e gyrA
resultam em alterações no sítio alvo de topoisomerases. Por outro lado, a
expressão de bombas de efluxo, mediadas pelo gene norA, também pode
contribuir para a resistência a este tipo de antibacterianos14.
Para oxazolidinonas (linezolida), a aquisição do gene cfr e mutações no do-

mínio V da subunidade 23S do ribossomo são apontados como principais
mecanismos de resistência11. No caso dos lipopeptídeos (daptomicina), os
principais mecanismos de resistência são associados a mutações nos genes
liaF, gdpD e cls, que estão relacionadas ao reparo do dano causado pelo lipo-
peptídeo na célula bacteriana15. Novos genes de resistência, mediados por
plasmídeo, o optrA e poxtA, foram identificados em isolados de E. faecalis e
E. faecium resistentes à linezolida e à tedizolida. Eles codificam um transpor-
tador ABC que confere resistência a oxazolidinonas e fenicóis. Além disso,
poxtA caracteriza sensibilidade diminuída às tetraciclinas16,17.
38
Tabela 4. Fenótipos e mecanismos de resistência aos antimicrobianos em Enterococcus

spp.12–19
Antimicrobianos Mecanismo de Resistência Incidência
β-lactâmicos
PEN AMP AMC IMP
S S S S Sensível Alta (E. faecalis)
Moderada (E. faecium)
R R R R Alteração ou superprodução de PBP5 Muito baixa (E. faecalis)
Alta (E. faecium)
R R Sa S β-lactamase Muito baixa
Macrolídeos-Lincosamidas-Estreptograminas (MLSs)
ERI AZI SPI CLD STGA STGB
S S S S (R) S S Sensível Moderada/baixa
R R R R S R Metilase RNAr 23S (ermB): MLSB Alta
R R R R R R Metilase RNAr 23S (ermB): MLSA/B Baixa (E. faecium)b
+ inativação enzimática (vatD e vatE)
I/R I/R S S S S Bomba de efluxo (mef) Muito baixa
Aminoglicosídeos
STR GEN TOB AMI CAN NET
R S S S S S Inativação enzimática [ANT(6), ANT(3″)] ou mutação Alta
ribossomal
S S S S/R R S Inativação enzimática [APH(3’)-III] Moderada
R S S S/R R S Inativação enzimática [ANT(6’) + APH(3’)-III] Moderada
S R R S/R R R Inativação enzimática [AAC(6’), APH(2″)] Alta/moderada
S S R S R R Inativação enzimática [AAC(6’)-Ii e variantes] Intrínseca em E. faecium,
E. durans, E. hiraec
S R R S R R Inativação enzimática [APH(2″)-Ib, APH(2″)-Id, APH(2″)- Muito baixa
Ie]
S R R S R S Inativação enzimática [APH(2″)-Ic] Muito baixa
Glicopeptídeos
VAN TEI
S S Sensível Alta
R R vanA Moderada (todas as
espécies)
I/R S vanBd Baixa (E. faecalis, E.
faecium, E. durans, E.
gallinarum)
I/R S vanD, vanE, vanG, vanL Muito baixa (E. faecalis,
E. faecium)
R S vanM Muito baixa (E. faecium)
S/I/R S vanC-1 e
Intrínseco em E.
gallinarum
S/I/R S vanC-2e Intrínseco E. casselifavus
S/I/R S vanC-3e Intrínseco E. flavescens
Lipopeptídeos
DAP
39

S Sensível Alta
R Alteração de carga e repulsão de DAP [mutações Muito baixa
em yvcRS, oatA, liaFSR e/ou gene cls (cardiolipina
sintetase)]
Oxazolidinonas
LNZ
S Sensível Alta
R Metiltransferase (cfr) e/ou mutações no RNAr 23S Muito baixa
R Proteína da família ARE ABC-F (poxtA e optrA) Muito baixa
AMC, amoxicilina/ácido clavulânico; AMI, amikacina; AMP, ampicilina; AZI, azitromicina; CLD, clindamicina; DAP, daptomicina; ERI, eritromicina; GEN, gen-
tamicina; IMP: imipenem; CAN, canamicina; LNZ, linezolida; NET, netilmicina; PEN, penicilina; SPI, espiramicina; STGA, estreptogramina grupo A; STGB,
estreptogramina grupo B; STR, estreptomicina; TEI, teicoplanina; TOB, tobramicina; VAN, vancomicina.
a
A confirmação deste fenótipo requer a detecção de β-lactamase utilizando nitrocefína.
b
E. faecalis é intrinsecamente resistente às estreptograminas (quinupristina/dalfopristina).
c
Variantes do gene aac(6’)-Ii tem sido identificados em E. faecium, E. hirae e E. durans.
d
Cepas com fenótipo VanB são sensíveis à teicoplanina, mas o uso de teicoplanina para tratamento de infecções associadas não é recomendado.
e
Para cepas com Concentração Inibitória Mínima (CIM) baixas para vancomicina, a detecção do gene vanC é recomendável, assim como o teste de moti-
lidade (positiva para as espécies E. gallinarum, E. casseliflavus e E. flavescens).
O fenótipo de resistência de maior importância clínica entre os Enterococ-

cus spp. é a resistência aos glicopeptídeos, especialmente à vancomicina
(“Vancomycin-Resistant Enterococci” – VRE). Essa resistência, conforme des-
crito para VRSA, está associada à alteração na biossíntese dos precursores
de peptideoglicano, mediada pelos genes van, especialmente vanA e vanB,
conforme detalhado no Quadro 2. Esse quadro apresenta os fenótipos mais
comuns de resistência à vancomicina, VanA, VanB, VanC, VanD e VanE, e suas
características genéticas. Além desses, existem outros fenótipos menos co-
muns, associados aos genes vanG, vanH, vanL, vanM, vanN. Dependendo do
gene associado, haverá a substituição de D-Ala-D-Ala por D-Ala-D-Lac ou
D-Ala-D-Ser na formação do peptidoglicano18,19. Os dipeptídeos terminados
em lactato ou serina têm baixa afinidade pela vancomicina, impedindo sua
ligação ao sítio-alvo, levando à resistência.
Quadro 2. Fenótipos e genótipos de resistência aos glicopeptídeos mais comuns em

Enterococcus spp.12,14,18
Fenótipo (µg/mL)
Espécie envolvida Genótipo Expressão
Vancomicina Teicoplanina
E. faecalis 64 16 vanA Induzível (plasmidial)
E. faecium
E. faecalis 4 0,5 – 1 vanB Induzível (plasmidial)
E. faecium
E. gallinarum 2 – 32 0,5 – 1 vanC1 Constitutiva
E. casseliflavus 4 – 16 0,5 – 1 vanC2 Constitutiva
E. gallinarum 4 – 16 0,5 – 1 vanC3 Constitutiva
E. faecalis 64 – 128 4–8 vanD Não determinado
E. faecium 16 0,5 – 1 vanE Não determinado
40
3.3.3 Streptococcus spp.

Dentre todas as espécies do gênero Streptococcus, as de maior importância
clínica são Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes e Streptococcus
agalactiae. Enquanto os estreptococos β-hemolíticos, S. pyogenes e S. aga-
lactiae apresentam virtualmente 100% de sensibilidade aos β-lactâmicos, a
resistência (plena ou intermediária) às penilicinas em Streptococcus pneumo-
niae ocorre em frequência variável e representa um desafio no tratamento
das infecções por esse patógeno. O principal mecanismo de resistência aos
β-lactâmicos está relacionado a mutações nos genes codificadores de PBPs,
associados com a expressão do gene murM (Tabela 5). O nível de resistência
pode variar de acordo com o tipo de mutação presente em cada isolado;
entretanto, um único isolado pode apresentar diferentes mutações nos ge-
nes codificadores das PBPs, gerando genes mosaico, resultando em uma di-
minuição das opções terapêuticas. No gênero, ainda não existem relatos de
resistência às cefalosporinas de quinta geração (ceftobiprol e ceftarolina)20.
No caso dos macrolídeos, lincosamidas e estreptogramina B (MLSB), os prin-

cipais mecanismos de resistência estão relacionados com a expressão de
metilases mediadas por genes erm; e expressão de bombas de efluxo codifi-
cadas por genes mef (Tabela 5)20.
Para fluoroquinolonas, mutações pontuais nos genes codificadores de to-

poisomerase, principalmente em parC e gyrA, são comuns. Já para glicopep-
tídeos, o principal mecanismo de resistência está relacionado à uma muta-
ção que leva à perda da função do gene vncS, um gene codificador de histi-
dina-quinase20.
41
Tabela 5. Fenótipos e mecanismos de resistência aos antimicrobianos em Streptococcus

pneumoniae20
β-lactâmicos Concentração Inibitória Mínima – CIM (µg/mL) e disco-difusão
PEN CTX OXA (disco 1 μg, mm)
≤0,06 S <0,5 S >20 Sensível Alta
0,12–1 I <0,5 S <19 Alterações PBP 1a, 2x, 2b e MurM Moderada/Alta
≥2 R <0,5 S <19 Baixa
≥2 R 1/>2 I/R <19 Baixa
0,12–0,5 I >4 R <19 Alterações PBP 1a, 2x (Thr550Ala), 2b e MurM Muito baixa
Macrolídeos-Lincosamidas-Estreptograminas
ERI AZI SPI CLD STRB
S S S S S Sensível Alta
R R R R R Metilase rRNA 23S (ermB): cMLSB Moderada
R R S/R S/R R/S Metilase rRNA 23S (ermB): iMLSBa Baixa
R R S/R S/R R/S Metilase rRNA 23S (ermA): iMLSB, cMLSB Muito baixa
I/R I/R S S S Bombas de efluxo (mefE) Baixa
AZI, azitromicina; CLD: clindamicina; CTX, cefotaxima; ERI, eritromicina; OXA, oxacilina; PEN, penicilina; SPI, espiramicina; STGA, estreptogramina grupo
A; STGB, estreptogramina grupo B.
a
Em cepas com fenótipo MLSB induzível (iMLSB) a eritromicina induz resistência a todos os antimicrobianos do grupo MLSB.
3.3.4 Enterobacterales
A ordem Enterobacterales engloba bacilos Gram-negativos pertencentes às
famílias Enterobacteriaceae, Morganellaceae, Yersiniaceae, dentre outras. Essa
ordem é um grupo heterogêneo de bacilos Gram-negativos que têm grande
relevância clínica, estando associados a uma diversidade de infecções rela-
cionadas aos cuidados com a saúde ou comunitárias. Tais bactérias podem
apresentar fenótipos de multirresistência aos antimicrobianos, associados a
diversos mecanismos de resistência21.
O principal mecanismo de resistência aos β-lactâmicos e aminoglicosídeos

entre Enterobacterales é a produção de enzimas específicas que têm a capa-
cidade de alterar a estrutura do antimicrobiano, resultando em sua inativa-
ção. Para β-lactâmicos, a alteração química é resultante de um processo de
hidrólise do anel β-lactâmico mediado por β-lactamases, secretadas no es-
paço periplásmico. Para aminoglicosídeos, a modificação química é mediada
por transferases que catalisam a O-acetilação, N-acetilação, O-fosforilação,
O-nucleotidilação ou O-glicosilação de resíduos que compõem a estrutura
do antimicrobiano6.
Por outro lado, a resistência às fluoroquinolonas e polimixinas está relaciona-

da principalmente a mutações pontuais no cromossomo, sendo frequente-
mente decorrentes da pressão seletiva devido à administração incorreta do
antimicrobiano. Adicionalmente, a aquisição de genes carreados por plas-
42
mídeos tem conferido a capacidade de produzir enzimas modificadoras do

alvo (ribossomo), ou proteínas alostéricas que protegem o sítio de ligação
das topoisomerases6.
Ö β-lactâmicos e β-lactamases
Os β-lactâmicos constituem um dos grupos de antimicrobianos mais utiliza-

dos na clínica, sendo composto por 4 subclasses: i) penicilinas; ii) cefalospo-
rinas; iii) monobactâmicos; e iv) carbapenêmicos. Essa classe de antimicro-
bianos possui ação bactericida, já que inibem a síntese do peptideoglicano,
causando instabilidade de membrana e consequente morte celular6.
Em bactérias Gram-negativas, o principal mecanismo de resistência aos

β-lactâmicos é a produção de β-lactamases classificadas de acordo com as
características moleculares, sendo subdivididas em: i) classificação simples,
ii) classificação baseada na similaridade na sequência de aminoácidos, iii)
classe molecular, que é composta por quatro grupos (A, B, C e D), apresen-
tando diferentes níveis evolutivos; iv) estrutura molecular; v) sequência de
nucleotídeos; e vi) de acordo com as características funcionais baseadas no
perfil de substrato, susceptibilidade a inibidores, características físicas como
ponto isoelétrico, e peso molecular (Figura 1)22.
43
β-lactamases
Característica
do sítio ativo Serino Metalo (Zn2+)
Classe
molecular A C D B
Grupo 2 1 2d 3
funcional
Principal
subgrupo 2a 2b 2be 2br 2c 2f 1 1e 2d 2de 2df 3a 3b
funcional
Substratos P P, Cf P, Cf, P P P, Cf Cf Cf, Cfe P P, Cfe P, Cb P, Cf, Cb

conhecidos Cfe, M Cb, Cfe M Cfe, Cb
M
Perfil de AVI, APB + + + + + +/+ + + + + + - -

inibição CLA + + + - +/- +/- - - +/- +/- - - -
EDTA - - - - - - - - - - - + +
Exemplo de enzimas PC1 TEM-1 ESBLs SHV-10 CARB-1 KPC AmpC GC1 OXA-1 OXA-11 OXA-23 IMP CphA
ou família de enzimas SHV-1 CTX-M, BKC CMY OXA-10 OXA-15 OXA-48 VIM
TEM, SHV) SME OXA-51 SPM
GES=5 OXA-143 NDM
P P, Cf P, Cf, P P P, Cf Cf Cf, Cfe P P, Cfe P, Cb P, Cf, Cb

Cfe, M Cb, Cfe M Cfe, Cb
M
CLA, ácido clavulânico; AVI, avibactam; APB, ácido fenilborônico; EDTA, ácido etilenodiamino tetra-acético. Antimicrobianos: Cb, carbapenêmico; Cf, cefa-
losporina; Cfe, cefalosporina de espectro estendido; M, monobactâmico; P, penicilina. Adaptado de Bush, 201323.
Figura 1. Classificação molecular e funcional de β-lactamases.
Produção de β-lactamases de espectro limitado ou reduzido
A produção de β-lactamases da classe A, denominadas β-lactamases clás-

sicas (ex.: TEM-1, TEM-2 e SHV-1), confere resistência a aminopenicilinas e
carboxipenicilinas (carbenicilina e ticarcilina), e sensibilidade diminuída ou
intermediária às ureidopenicilinas (piperacilina). As cepas que apresentam
apenas esse mecanismo de resistência mantêm sua sensibilidade às cefalos-
porinas, monobactâmico e carbapenêmicos, porém, a hiperprodução des-
sas enzimas confere resistência a cefalosporinas de primeira e segunda gera-
ções, exceto cefamicinas como a cefoxitina. Além disso, uma diminuição da
sensibilidade à associação de amoxicilina-ácido clavulânico também pode
ser observada22.
44
Produção de β-lactamase de espectro estendido (ESBL)
As primeiras enzimas do tipo ESBLs descritas foram variantes das β-lacta-

mases clássicas mencionadas anteriormente. No entanto, outras famílias de
ESBL surgiram, como CTX-M, cuja origem é relacionada a genes presentes
no cromossomo de espécies como Kluyvera ascorbata, Kluyvera cryocrescens,
ou Kluyvera georgiana2. Curiosamente, essa nova família de ESBLs tem sido
rapidamente disseminada em diferentes espécies, por todo o mundo, sendo
identificadas em isolados provenientes de animais silvestres, de companhia
e de produção, de ambientes aquáticos, de alimentos e de humanos24,25.
ESBLs são capazes de inativar todas as cefalosporinas, com exceção das cefa-
micinas; sendo assim, isolados que apresentam apenas esse mecanismo de
resistência mantêm a sensibilidade a: i) associação de β-lactâmicos com ini-
bidores de β-lactamases, como por exemplo, amoxicilina-ácido clavulânico;
ii) cefamicinas; e iii) carbapenêmicos22,23.
É importante frisar que a maioria das ESBLs são relativamente fáceis de de-
tectar. Entretanto, a visualização do fenótipo pode ser comprometida caso
haja presença de outro mecanismo de resistência, como uma β-lactama-
se clássica, que pode conferir resistência a β-lactâmicos com inibidores de
β-lactamases, ou a produção de carbapenemases. Há também uma maior
dificuldade na detecção de ESBLs em Enterobaterales que produzem uma
β-lactamase cromossômica induzível, a AmpC (ex.: Citrobacter freundii, Ente-
robacter spp., Serratia spp., Providencia spp., Hafnia alvei, e Morganella mor-
ganii)22,23.
Produção de carbapenemases
As carbapenemases são β-lactamases com maior capacidade hidrolítica,

sendo capazes de inativar praticamente todos os β-lactâmicos disponíveis
no mercado, com algumas exceções que incluem a enzima SME (Serratia
marcescens enzima) e oxa-carbapenemases de Acinetobacter spp. A incidên-
cia dessas enzimas em Enterobacterales é muito alta, sendo mundialmente
disseminadas22,26.
Atualmente, o grupo de carbapenemases é composto por três diferentes

classes enzimáticas: i) classe A, que são classificadas como serino-β-lactama-
ses, como por exemplo, a Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC), que é
capaz de inativar os carbapenêmicos ertapenem e imipenem, apresentando
menor atividade hidrolítica contra meropenem; ii) classe B, classificadas tam-
bém como metalo-β-lactamases (MBL), por exemplo New Delhi metalo-β-
45
-lactamase (NDM), Verona imipenemase (VIM) e imipenemase (IMP), que são

capazes de hidrolisar todos os carbapenêmicos, mas não possuem atividade
contra monobactâmico (aztreonam); e iii) classe D, que também faz parte do
grupo de serino-β-lactamases, como por exemplo as oxacilinases OXA-23,
OXA-48, OXA-143, que possuem perfil de hidrólise similar as carbapenema-
ses de classe A (Figura 1). Recentemente, BKC-1 (Brazilian Klebsiella carbape-
nemase-1), uma nova carbapenemase da classe A de Ambler, foi isolada de
amostras clínicas de K. pneumoniae, no Brasil27–29.
Na Tabela 6, são apresentados os principais fenótipos de resistência aos β-lac-

tâmicos em Enterobacterales. Embora E. coli e Shigella spp. sejam portadoras
de uma β-lactamase cromossômica da classe C de Ambler, que naturalmente
não são expressas, ambas espécies, assim como Salmonella enterica e P. mira-
bilis, apresentam sensibilidade a quase todos os β-lactâmicos.
Klebsiella spp. (exceto Klebsiella aerogenes), Citrobacter koseri e Citrobacter

amalonaticus, entre outras espécies, apresentam: i) baixa resistência às ami-
nopenicilinas (ampicilina, amoxicilina) e às carboxipenicilinas (carbenicilina
e ticarcilina); ii) sensibilidade diminuída ou intermediária a ureidopenicili-
nas (piperacilina); e iii) sensibilidade às cefalosporinas, aos monobactâmi-
co (aztreonam), aos carbapenêmicos, e às associação de β-lactâmicos com
inibidores de β-lactamase (ex., amoxicilina-ácido clavulânico). O fenótipo de
resistência intrínseca desse grupo é relacionado à produção de uma β-lacta-
mase cromossômica de espectro restrito, pertencente à classe A de Ambler.
No caso de K. pneumoniae, esta enzima tem sido identificada principalmen-
te como SHV-1. Isolados de K. oxytoca possuem genes cromossômicos que
codificam enzimas cromossômicas do grupo OXY. Quando ocorre a hiper-
produção dessas enzimas, o perfil de sensibilidade similar ao de uma ESBL é
observado30,31.
Enterobacter spp., K. aerogenes, Proteus vulgaris, Proteus penneri, Citrobacter

freundii, Providencia spp., Hafnia alvei, Serratia spp. e Morganella morganii,
apresentam uma cefalosporinase cromossômica induzível que, de forma
geral, confere resistência a classe de aminopenicilinas e cefalosporinas de
primeira geração (C1G). Entretanto, esse grupo de enterobactérias permane-
ce sensível a ureidopenicilinas, carboxipenicilinas, cefalosporinas de terceira
geração (C3G) e quarta geração (C4G), monobactâmico, e carbapenêmicos
(Tabela 6).
P. penneri e P. vulgaris possuem β-lactamases cromossômicas da classe A,

as quais conferem resistência à cefuroxima. Entretanto, ambas as espécies
46
apresentam sensibilidade à cefoxitina e às associações de β-lactâmicos com

inibidores de β-lactamase7.
Yersinia enterocolitica produz duas enzimas diferentes pertencentes às clas-

ses A e C de Ambler. Portanto, a maioria das cepas dessa espécie apresentam
um fenótipo induzível de produção de penicilinase e cefalosporinase, sendo
resistentes a carboxipenicilinas, aminopenicilinas, amoxicilina-ácido clavulâ-
nico, e cefalosporinas de primeira e segunda gerações7.
Em todas essas espécies, a existência de outros mecanismos, como a dimi-

nuição de permeabilidade da membrana externa, também pode conferir re-
sistência aos β-lactâmicos32.
Tabela 6. Principais padrões de resistência aos β-lactâmicos em função da β-lactamase

produzida por Enterobacterales22–31
Perfil de resistência aos β-lactâmicos
Fenótipo Incidênciaa Observações
AMP AMC TIC PIP C1G FOX CXM C3G C4G CBP
E. coli, Shigella, P. mirabilis, Salmonella
Intrínseco S S S S S S S S S S Moderada Produção basal de AmpC em
E. coli e Shigella. Salmonella
e Shigella são consideradas
clinicamente resistentes a C1G
e C2G.
IntrínsecoH R R R R R R R r/R S S Baixa Hiperprodução de AmpC em E.
coli e Shigella.
β-lactamase de R S R r S/r S S S S S Alta TEM-1, TEM-2 e SHV-1.
espectro restrito
β-lactamase de R r R R R S S S S S Alta A produção de SHV-1 pode
espectro restritoH chegar a afetar ligeiramente a
ação da ceftazidima.
ESBL R S R R R S R S/R S/R S Alta CTX-M-15, CTX-M-2, CTX-M-8,
CTX-M-27
pAmpC R R R R R R R r/R S S Alta CMY-2
adquirida
Carbapenemase R R R R R R R r R R Alta KPC-2, NDM-1, IMP-1, VIM-2.
Cepas produtoras de MBL
apresentam sensibilidade ao
aztreonam.
K. pneumoniae, K. quasipneumoniae, K. variicola, K. oxytoca
Intrínseco R S R r S/r S S S S S Alta SHV-1, LEN ou OKP em K.
pneumoniae, K. variicola
ou K. quasipneumoniae,
respectivamente. Enzimas OXY
em K. oxytoca.
OXYH R S/R R R R S r S/r S S Baixa OXY-1 e OXY-2 em K. oxytoca.
Quando houver resistência
ao aztreonam, o isolado será
considerado resistente a C3G.
Adicionalmente, é observada
sinergia com o ácido clavulânico
47
Perfil de resistência aos β-lactâmicos

Fenótipo Incidênciaa Observações
AMP AMC TIC PIP C1G FOX CXM C3G C4G CBP
β-lactamase de R r R R R S S S S S Baixa A hiperprodução de SHV-1 pode
espectro restritoH interferir ligeiramente na ação da
ceftazidima
ESBL R S/r R R R S R S/R S/R S Alta CTX-M-15, CTX-M-2, CTX-M-59
pAmpC R R R R R R R r/R S S Moderada CMY-2
adquirida
Carbapenemase R R R R R R R R R R Alta KPC-2, NDM-1, IMP-1, VIM-2,
BKC-1. Cepas produtoras de
MBL apresentam sensibilidade
ao aztreonam e são resistentes
a ceftazidima/avibactam.
Variantes KPC-3 (KPC-23, KPC-
31, KPC-36) podem conferir
resistência a ceftazidima/
avibactam.
Enterobacter, C. freundii
Intrínseco R R S S R R r S S S Alta AmpC induzível. Considerar
a possibilidade de seleção de
cepas resistentes a CG3 e
monobactâmico.
IntrínsecoH R R R R R R R r/R S S Alta Perfil de resistência similar ao
de isolados com pAmpC
ESBL R R R R R R R r/R S/R S Alta CTX-M-15, CTX-M-8
Carbapenemase R R R R R R R r r R Alta KPC-2, NDM-1, IMP-1, VIM-2.
aztreonam.
S. marcescens, M. morganii, Providencia spp.
Intrínseco R R S S R S R S S S Alta AmpC induzível. Considerar
a possibilidade de seleção
de cepas resistentes a G3 e
monobactâmico.
β-lactamase de R R R R R S R S S S Moderada As enzimas mais frequentes
espectro restritoH são TEM-1, TEM-2 e SHV-1.
Considerar a possibilidade de
seleção de cepas resistentes a
G3 e monobactâmico.
ESBL R R R R R r/R R r/R S/R S Moderada CTX-M-15
Carbapenemase R R R R R R R r r r Moderada NDM-1, KPC-2, IMP-1, VIM-2.
aztreonam.
P. vulgaris, P. penneri
Intrínseco R S R S R S R S S S Alta Produção da β-lactamase
cromossômica de classe A
Penicilinase R S R R R S R S S S Alta As enzimas mais frequentes são
TEM-1, TEM-2 e SHV-1
AMC: amoxicilina/ácido clavulânico; AMP: ampicilina; ESBL: β-lactamase de espectro estendido; CBP: carbapenêmicos; CXM: cefuroxima; C1G: cefalos-
porinas de primeira geração; C3G: cefalosporinas de terceira geração e monobactâmico; C4G: cefalosporinas de quarta geração; CFO: cefoxitina; PIP:
piperacilina; TIC: ticarcilina.
R: resistente; r: halos reduzidos ou CIM alta em relação ao fenótipo selvagem, mas dentro da faixa de sensibilidade; S: sensível.
H
Hiperprodução.
Raro: 0-1%; Baixo: 1 a 15%; Moderado: 15-60%; Alta: 60%. Essa incidência pode variar dependendo da população estudada.
48
Ö Aminoglicosídeos
O principal mecanismo de ação dos aminoglicosídeos é a inibição da síntese

proteica, pela ligação à subunidade 30S do ribossomo, levando a uma leitura
defeituosa do código genético dos códons do mRNA. Os principais amino-
glicosídeos são amicacina, arbecacina, gentamicina, tobramicina, canamici-
na, neomicina, netilmicina e estreptomicina6,33.
A maioria das espécies da ordem Enterobacterales são intrinsecamente sen-

síveis aos aminoglicosídeos, exceto Providencia stuartii, espécie que carreia o
gene aac(2’)-Ia no cromossomo, o que resulta em um perfil de resistência a
gentamicina, netilmicina e tobramicina, mas não à amicacina33.
O mecanismo de resistência adquirida mais importante, e comum, em En-

terobacterales de importância clínica é a inativação enzimática decorrente
de alteração estrutural do aminoglicosídeo, mediada por enzimas modifica-
doras de aminoglicosídeos (EMA). Estas enzimas modificam o aminoglicosí-
deo por: i) acetilação, onde as enzimas, denominadas de acetiltransferases
(AAC) acetilam um grupo amino do antimicrobiano; ii) adenilação, onde as
enzimas, denominadas de nucleotidiltransferases (ANT), adenilam um grupo
hidroxila; e iii) fosforilação, onde as enzimas, denominadas de fosfotransfera-
ses (APH), fosforilam um grupo hidroxila. Interessantemente, cada uma das
enzimas citadas acima é capaz de reconhecer um certo número de amino-
glicosídeos, resultando em um fenótipo de resistência específico (Tabela 7),
o qual pode ser predito através da interpretação adequada do antibiogra-
ma33,34.
Outro mecanismo de resistência aos aminoglicosídeos em Enterobacterales é

a produção de enzimas do tipo metiltransferases (ArmA, RmtA, RmtB, RmtC,
RmtD, RmtE, RmtF, RmtH e NpmA), responsáveis pela metilação da subuni-
dade 16S do rRNA34.
49
Tabela 7. Fenótipos de resistência aos aminoglicosídeos em Enterobacterales, associados

com a produção de enzimas modificadoras ou metiltransferases33,34
Fenótipo Enzima Incidência Interpretação do antibiograma
Str APH(3”) Alta Resistência a estreptomicina. Para detecção da enzima, um disco de espectinomicina
pode ser adicionado ao antibiograma como discriminador entre APH(3”) e a ANT(3”),
uma vez que a enzima APH(3”) não confere resistência a espectinomicina
Str/Spc ATN(3”) Moderada
C, Nm APH(3’)-I Moderada Alto nível de resistência a canamicina e neomicina. A enzima do tipo I é mais
frequente que a enzima do tipo II.
APH(3’)-II Baixa
G AAC(3)-I Baixa Observa-se pequena redução do halo de inibição de gentamicina.
C, G, T ANT(2”) Baixa Redução do halo de inibição de canamicina, gentamicina. No caso da tobramicina,
observa-se uma redução menor do halo de inibição quando comparado aos demais
aminoglicosídeos.
C, T, G, Nt AAC(3)-II Moderada Alto nível de resistência a gentamicina e tobramicina. Observa-se redução significativa
do halo de inibição de netilmicina e moderada para canamicina.
AAC(3)-IV Baixa
C, T, A, Nt AAC(6’) Baixa Alto nível de resistência a canamicina, tobramicina e netilmicina. Resistência
moderada para amicacina. É possível diferenciar das demais enzimas, pois
não confere resistência a gentamicina. Mecanismo de resistência apresentado
essencialmente por Serratia spp.
G, T, Nt, Nm AAC(2’) Baixa Resistência moderada a gentamicina, netilmicina, tobramicina e neomicina. Difícil
detecção. Resistência intrínseca em Providencia spp.
A: amicacina; G: gentamicina; C: canamicina; Nm: neomicina; Nt: netilmicina; Str: estreptomicina; Spc: espectinomicina; T: tobramicina.
Raro: 0-1%; Baixo: 1 a 15%; Moderado: 15-60%; Alta: 60%. Essa incidência pode variar dependendo da população estudada.
Ö Quinolonas e fluoroquinolonas
Quinolonas (ácido nalidíxico) e fluoroquinolonas (ciprofloxacina, norfloxa-

cina, ofloxacina, levofloxacina e moxifloxacina) agem inibindo as enzimas
topoisomerases, classificadas como topoisomerases II (DNA girase) e topoi-
somerases IV, levando à morte celular. Com relação a isso, as topoisomerases
são enzimas heterotetraméricas que participam nos processos de replicação
e empacotamento de DNA, e são constituídas por 2 subunidades denomi-
nadas A e B. Os genes gyrA e gyrB codificam as subunidades A e B da enzima
DNA girase, enquanto os genes parC e parE codificam as subunidades A e B
da topoisomerase IV35.
Os mecanismos de resistência a esses compostos estão associados a muta-

ções dos alvos, proteção alostérica que impede a ligação da quinolona/fluo-
roquinolona ao alvo, e/ou bombas de efluxo35.
50
Resistência mediada por mutação
Um dos principais mecanismos de resistência a essa classe de antimicrobia-

nos é o desenvolvimento de mutações nos genes codificadores das subuni-
dades das enzimas DNA girase e topoisomerase IV. Adicionalmente, bombas
de efluxo podem retirar o antimicrobiano do interior da bactéria, impedindo
que ele interaja com seu sítio-alvo. Em geral, a hiperexpressão de bombas
de efluxo resulta em fenótipos de baixo nível de resistência; entretanto, esse
mecanismo poderia facilitar a instauração de mutações nas topoisomerases,
aumentando o nível de resistência e contribuindo para a seleção de isolados
resistentes, ao longo prazo. De fato, as mutações relacionadas à resistência a
esses compostos acontecem de forma cumulativa35.
Em Gram-negativos, a DNA girase parece ser o primeiro alvo de todas as

quinolonas/fluoroquinolonas. Em geral, alterações no alvo acontecem es-
pecificamente em uma região da enzima, denominada QRDR (“Quinolone
Resistance-Determining Regions”, região determinante da resistência à qui-
nolonas). Alterações nas regiões QRDR em ambas as subunidades da DNA gi-
rase e topoisomerase IV estão relacionadas a um aumento da Concentração
Inibitória Mínima (CIM) para todas as quinolonas/fluoroquinolonas35,36.
Na interpretação do antibiograma, nos casos onde seja observada a resistên-

cia a qualquer fluoroquinolona, é importante considerar que o isolado po-
derá ter redução da sensibilidade a outras fluoroquinolonas, uma vez que os
mecanismos de resistência conferem um fenótipo de resistência cruzada36.
Resistência mediada por plasmídeos
A resistência às quinolonas mediada por plasmídeo (“Plasmid-Mediated

Quinolone Resistance” – PMQR) foi reportada em 1998. Desde então, genes
PMQR têm sido identificados em diversas espécies pertencentes à ordem
Enterobacterales, principalmente em Klebsiella spp., E. coli, Salmonella spp., e
Enterobacter spp. Três mecanismos são incluídos dentro do conceito PMQR:
i) Qnr; ii) AAC(6’)-Ib-cr; e iii) bombas de efluxo QepA e OqxAB35.
O primeiro gene PMQR foi identificado em um isolado de K. pneumoniae

no Alabama, nos Estados Unidos da América, e foi denominado qnrA; ele
foi associado com um baixo grau de resistência à ciprofloxacina. Genes da
família qnr são normalmente encontrados em plasmídeos que carreiam ou-
tros genes de resistência, como, por exemplo, genes codificadores de ESBLs,
carbapenemases e/ou pAmpC. Proteínas da família Qnr (QnrA, QnrB, QnrS,
QnrC, QnrD, QnrE, QnrVC) conferem resistência às quinolonas/fluoroquino-
51
lonas mediante uma proteção alostérica da DNA girase e topoisomerase

IV35–37.
A variante “cr” do gene aac(6’)-Ib codifica uma aminoglicosídeo acetiltrans-

ferase que confere sensibilidade reduzida à ciprofloxacina, pela N-acetilação
do resíduo amina do grupo piperazinil. Aac(6’)-Ib-cr contém 2 modificações
de aminoácidos (Trp102Arg e Asp179Tyr), os quais são necessários e sufi-
cientes para capacitar essa enzima a realizar a acetilação da ciprofloxacina38.
Quando qnrA e aac(6’)-Ib-cr estão presentes em um isolado, a CIM pode au-

mentar até 1 µg/mL. Adicionalmente, a presença de aac(6’)-Ib-cr aumenta a
frequência de seleção de mutantes QRDR expostas a ciprofloxacina35.
Um outro mecanismo PMQR está relacionado com bombas de efluxo do tipo

OqxAB, que tem localização cromossômica em K. pneumoniae mas plasmi-
dial em E. coli, e QepA, codificadas pelos genes oqxAB e qepA, respectiva-
mente. Ambas têm sido relacionadas à diminuição da sensibilidade às qui-
nolonas/fluoroquinolonas e seleção de mutantes com níveis de resistência
mais elevadas, resultando na falha terapêutica. Em cepas que não possuem
mutação QRDR, a expressão isolada de genes PMQR pode resultar em uma
diminuição da sensibilidade às fluoroquinolonas, sem gerar resistência ao
ácido nalidíxico. Contudo, existe grande probabilidade de seleção de mu-
tantes com fenótipo de alto nível de resistência, sendo sugerido que esses
isolados sejam considerados, pelo menos, com fenótipo de sensibilidade
intermediária às quinolonas. A hiperexpressão de OqxAB confere também
resistência a outros antimicrobianos, tais como tigeciclina, nitrofurantoína e
cloranfenicol, além de desinfetantes39.
Ö Polimixinas
A resistência às polimixinas, colistina (polimixina E) e polimixina B tem au-

mentado drasticamente nos últimos anos, principalmente em K. pneumoniae
produtora de KPC40–43. Essa resistência envolve a adição de 4-amino-deoxia-
rabinose (L-Ara4N) e/ou fosfoetanolamina (PEtN) ao lipídeo A do lipopolissa-
carídeo (LPS), resultando na diminuição da atração eletrostática entre as po-
limixinas e o LPS. No contexto genético, essa resistência surge por mutações
nos genes que codificam os sistemas de dois componentes PhoPQ e PmrAB.
Estes sistemas regulam a expressão de pmrC e do operon pmrHFIJKLM, res-
ponsáveis pelo processo bioquímico de adição dos resíduos PEtN e Ara4N ao
lipídeo A. Outras mutações associadas à resistência às polimixinas afetam os
genes mgrB e crrB, que regulam o sistema PhoPQ, e pmrC e o operon pmrH-
FIJKLM, respectivamente.
52
No Brasil, os principais eventos genéticos associados com resistências às po-

limixinas em K. pneumoniae têm sido mutações em PmrB (R256G, T246A),
PhoQ (L26del, V27del, D90E, T84K, L37P, H410Y), CrrB (C68S, S195N, Q296L),
e inativação insercional do gene mgrB pelos elementos ISKpn25, IS903 e IS544.
Em E. coli, o principal mecanismo de resistência às polimixinas é mediado

por genes mcr (“mobile colistin resistance”) carreados por plasmídeos. Genes
mcr codificam a produção de fosfoetanolamina transferases, enzimas que
transferem um resíduo de fosfoetanolamina à porção do lipídeo A do LPS,
o que diminui a afinidade deste alvo pelas polimixinas carregadas positiva-
mente, devido à repulsão eletrostática outorgada pela diminuição da carga
negativa do lipídeo A.
Existem 10 variantes descritas do gene mcr, das quais a mais prevalente é

a mcr-1. No Brasil, variantes mcr-1, mcr-3, mcr-5 e mcr-9 têm sido identifica-
das em medicina humana e veterinária, em isolados de E. coli e Enterobacter
kobei (BioProject PRJNA615090) coprodutores de ESBL45,46. Por outro lado, o
gene mcr-1 tem sido encontrado em Salmonella spp. e Klebsiella pneumo-
niae, nesta última espécie em linhagens coprodutoras de KPC-2, caracteri-
zando fenótipos pan-resistentes.
3.3.5 Bacilos Gram-negativos não fermentadores da glicose

Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii e Stenotrophomonas
maltophilia são protótipos de bactérias não fermentadoras da glicose mul-
tirresistentes. Em P. aeruginosa, a expressão de bombas de efluxo (MexAB-
-OprM), a produção de β-lactamase intrínseca, a permeabilidade reduzida
da membrana, as alterações nas topoisomerases e a versatilidade na aqui-
sição de genes de resistência têm contribuído com esse fenótipo. De forma
similar, A. baumannii geralmente se caracteriza pela hiperprodução de ce-
falosporinase cromossômica (AmpC) ou da oxacilinase OXA-51, associadas
à presença de ISAba1 na região promotora dos genes, como também pela
aquisição de várias β-lactamases de espectro restrito e/ou espectro estendi-
do. Finalmente, a resistência intrínseca de S. maltophilia aos antimicrobianos
de amplo espectro como carbapenêmicos (mediada pelas β-lactamases L1 e
L2) e aminoglicosídeos (mediada por enzimas modificadoras de aminoglico-
sídeos) configuram-se como um limitante para antibioticoterapia47–50.
53
Ö Pseudomonas aeruginosa
Resistência intrínseca
A resistência intrínseca de P. aeruginosa se deve a múltiplos fatores, como:

i) baixa permeabilidade da célula aos fármacos (deleção da porina OprD); ii)
expressão constitutiva de vários sistemas de bombas de efluxo (principal-
mente MexAB-OprM e MexXY-OprM); e, iii) presença de uma β-lactamase
cromossômica induzível, tipo AmpC. A participação conjunta desses fatores
promove a resistência intrínseca às penicilinas, às aminopenicilinas, aos ini-
bidores de β-lactamases, às cefalosporinas de primeira e segunda geração,
cefotaxima, ceftriaxona, cloranfenicol, nitrofurantoína, sulfonamidas, trime-
toprima, tetraciclina, tigeciclina, e ácido nalidíxico. Por outro lado, a perda ou
redução da expressão da porina OprD também contribui para resistência aos
carbapenêmicos47,48.
Resistência aos β-lactâmicos
Na ausência de β-lactamases adquiridas, P. aeruginosa apresenta sensibilida-

de a carboxipenicilinas (carbenicilina, ticarcilina), ureidopenicilinas (pipera-
cilina), ceftazidima, cefepime, cefoperazona, aztreonam e carbapenêmicos
(imipenem, meropenem, doripenem).
O mecanismo de resistência adquirida aos antimicrobianos β-lactâmicos

mais importante nesta espécie é a produção de β-lactamases classe A, C, D
(serino-β-lactamases) e B (metalo-β-lactamases)6.
β-lactamase AmpC
P. aeruginosa produz uma β-lactamase cromossômica induzível de classe C

(AmpC), codificada pelo gene ampC, de forma similar que em algumas es-
pécies da ordem Enterobacterales. Em condições normais, essa enzima com
atividade cefalosporinase é produzida em quantidades mínimas (baixo nível
de expressão), e é responsável pela resistência a aminopenicilinas e cefalos-
porinas de primeira geração. Esta enzima não é inibida pela ação do ácido
clavulânico, sulbactam ou tazobactam. Sua produção é induzida na presença
de β-lactâmicos, como cefoxitina ou imipenem, embora esta hiperexpressão
possa ser reversível quando o agente indutor é removido. A hiperexpressão
de AmpC pode acontecer quando ocorrem mutações cromossômicas que
afetam as proteínas envolvidas no processo de indução, o que determina
uma expressão constitutiva de alto nível51.
54
Quando a produção de AmpC aumenta significativamente, P. aeruginosa ex-

pressa resistência a todos os β-lactâmicos, exceto carbapenêmicos. Contra-
riamente do que acontece com Enterobacterales, a hiperprodução de AmpC
em P. aeruginosa também afeta o cefepima51.
β -lactamases da classe A
Várias enzimas que compõem esse grupo já foram descritas em P. aerugino-

sa, tais como: TEM-1, TEM-2, PSE-1 (CARB-2), PSE-4 (CARB-1), CARB-3, CARB-
4. As cepas produtoras de carbenicilinases (CARB) podem apresentar uma
sensibilidade variável à cefepima e ao aztreonam, mas, na ausência de ou-
tros mecanismos de resistência, exibem sensibilidade à ceftazidima e car-
bapenêmicos (Tabela 8).
Em P. aeruginosa, variantes ESBLs das enzimas TEM, SHV, CTX-M, PER, VEB,
GES, e BEL, têm sido identificadas no cromossomo, plasmídeos ou integrons
(Tabela 8). Dentre as ESBLs do tipo GES, a GES-1 é caracterizada por apresen-
tar atividade catalítica de baixo nível e baixa afinidade para a maioria dos
substratos. Ao contrário da maioria das ESBLs da classe A, essa enzima tem
uma forte afinidade pela cefoxitina. Já, GES-2 e GES-5 podem hidrolisar os
carbapenêmicos, portanto essas variantes devem ser consideradas como
carbapenemase de classe A. Outras carbapenemase classe A identificada em
P. aeruginosa são as enzimas KPC, principalmente KPC-252.
β -lactamases da classe D (oxacilinases)
As oxacilinases (OXA) são enzimas da classe D que pertencem ao grupo fun-

cional 2d. Elas representam um grande grupo de enzimas com um espectro
hidrolítico diverso que geralmente é codificado por genes integrados em
plasmídeos ou integrons. Com exceção da OXA-18, essas enzimas são difí-
ceis de detectar no laboratório em virtude da ausência da inibição por ácido
clavulânico, sulbactam ou tazobactam. Oxacilinases podem ser divididas de
acordo com seu espectro de atividade e diversidade genética. As enzimas
clássicas OXA (OXA-1, OXA-2, OXA-10) podem determinar a resistência às
carboxipenicilinas e ureidopenicilinas, mas não ceftazidima53.
O subgrupo OXA-1 inclui OXA-31, que deriva de OXA-1 pela substituição

de dois aminoácidos. Ambas as enzimas têm a capacidade de hidrolisar a
cefepima, mas não a ceftazidima. As oxacilinases com maior importância
clínica são aquelas que expressam um espectro de atividade hidrolítica es-
tendida (OXA-11, OXA-14, OXA-15, OXA-19, OXA-32) que inclui cefotaxima,
ceftazidima, cefepima, cefpiroma e aztreonam. A maioria dessas oxacilinases
55
têm sido identificadas exclusivamente em P. aeruginosa, sendo variantes de

β-lactamases OXA de espectro restrito que sofreram uma mutação pontual,
que confere maior atividade hidrolítica contra ceftazidima, e uma atividade
hidrolítica variável contra cefepima e aztreonam (Tabela 8)53.
β -lactamases da classe B (Metalo-β-lactamases)
As carbapenemases dependentes de Zn2+, conhecidas como metalo-β-lac-

tamases da classe B, conferem resistência a praticamente todos os antimi-
crobianos β-lactâmicos, incluindo os carbapenêmicos (Tabela 8). Os mono-
bactâmicos, como o aztreonam, não são afetados pela atividade hidrolítica
dessas enzimas. As metalo-β-lactamases não são inibidas por ácido clavu-
lânico ou tazobactam e, em vez disso, são inibidas por quelantes catiônicos
divalentes, como o EDTA. Sete tipos de metalo-β-lactamases têm sido iden-
tificados em P. aeruginosa (AIM, DIM, GIM, IMP, NDM, SPM e VIM). Especifica-
mente no Brasil, SPM-1, VIM-2, e IMP-1 têm sido comuns em P. aeruginosa54.
Alteração da permeabilidade (porinaOprD)
A porina OprD, em P. aeruginosa, é a principal via de entrada de carbapenê-

micos. Portanto, a perda dessa porina leva a uma diminuição na sensibilida-
de a esses antimicrobianos. Em comparação com o imipenem, a entrada na
célula do meropenem parece ser menos afetada, pois em cepas sem OprD, a
CIM do imipenem tem um valor entre 8–32 μg/mL e a do meropenem entre
2 – 4 μg/mL (Tabela 9).
Sistemas de bombas de efluxo
A análise do genoma de P. aeruginosa revela que esse microrganismo possui

vários sistemas de bombas de efluxo integrados em 5 superfamílias, embora
predominem aqueles pertencentes à família RND (“Resistance-nodulation-
-cell division”). Este sistema é formado por três componentes básicos: i) uma
proteína localizada na membrana citoplasmática, que atua como transpor-
tador; ii) um segundo componente representado por uma proteína de mem-
brana externa e, iii) uma terceira proteína localizada no espaço periplásmi-
co que une as outras duas proteínas. Os sistemas de bomba de efluxo mais
frequentes em P. aeruginosa são MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN e
MexXY-OprM. Essas bombas afetam em maior ou menor grau a atividade
não apenas dos antimicrobianos β-lactâmicos e carbapenêmicos, mas tam-
bém de outros antimicrobianos como fluoroquinolonas, tetraciclinas, tigeci-
clina e cloranfenicol48.
56
A hiperexpressão de MexAB-OprM determina uma diminuição na atividade

de carboxipenicilinas, ureidopenicilinas, cefotaxima, ceftazidima, cefepima
e aztreonam (Tabela 10). A hiperexpressão de MexCD-OprJ afeta antimicro-
bianos β-lactâmicos, especialmente as cefalosporinas de quarta geração (ce-
fepime, cefpiroma). Já a superexpressão do operon mexEF-oprN se caracteri-
zada por conferir resistência às fluoroquinolonas e diminuir a sensibilidade
aos carbapenêmicos, especialmente imipenem. Essa perda de sensibilida-
de está associada a uma diminuição da porina OprD. A superexpressão de
mexXY afeta vários antimicrobianos, principalmente cefepima55.
Tabela 8. Fenótipos de resistência aos antimicrobianos β-lactâmicos em Pseudomonas

aeruginosa associados à produção de enzimas47,48,53
Antimicrobianos Mecanismo de resistência
TC TIC PIP PPT CAZ CPM ATM IPM MER (β-lactamase)
S S S S S S S S S -
R R r r r S/r r S S AmpC parcialmente desreprimida
R R R R R r/R R S S AmpC totalmente desreprimida
R S R S S S/r S/r S S β-lactamase classe A (espectro restritoa)
R S/r R S/r R R R S S β-lactamase classe A (ESBLb)
R S R S R R R r/R r/R GES-2, GES-5
r/R r/R r/R r/R S R S S S OXA (espectro restrito)
R R R R R r/R r/R S S OXA (ESBL)
R R R R R R S r/R r/R Metalo-β-lactamasec
R R R R R R R r/R r/R KPC-2
ATM: aztreonam; CAZ: ceftazidima; CPM: cefepima, IPM: Imipenem; MER: meropenem; PIP: Piperacilina; PPT: Piperacilina + Tazobactam; TC: ticarcilina;
TIC: ticarcilina + clavulanato.
R: resistente; S: sensível; r: sensibilidade diminuída.
a
TEM 1, TEM-2, PSE-1, PSE-4, CARB-3, CARB-4.
b
Variantes CTX-M, TEM, SHV, PER, VEB.
c
IMP-1, NDM-1, VIM-2 e SPM-1.
Tabela 9. Fenótipos de resistência aos antimicrobianos β-lactâmicos em Pseudomonas

aeruginosa associados à perda de porinas47,48,53
Fenótipos de resistência Mecanismo de resistência
TC TIC PIP PPT CAZ CPM ATM IPM MER (impermeabilidade)
S S S S S S S R r Perda de Porina OprD
R R r/R r/R r/R r/R r/R S r Sistema MexAB-OprM
r/R r/R r/R r/R r/R R r/R S S Sistema MexCD-OprJ
r/R r/R r/R r/R r/R r/R r/R R r Sistema MexEF-OprNa
r/R r/R r/R r/R r/Rb r/R r/R S S Sistema MexXY-OprM
ATM: aztreonam; CAZ: ceftazidima; CPM: cefepima, IPM: Imipenem; MER: meropenem; PIP: Piperacilina; PPT: Piperacilina + Tazobactam; TC: ticarcilina;
TIC: ticarcilina + clavulanato.
R: resistente; S: sensível; r: sensibilidade diminuída.
a
MexEF-OprN é regulado pelo fator de transcrição MexT, que também regula negativamente a expressão de OprD, de modo que a diminuição na sensibi-
lidade a carbapenêmicos é devida à superexpressão de MexT nesse fenótipo.
b
A sensibilidade à ceftazidima, embora diminuída, é, geralmente, mantida
57
Resistência aos aminoglicosídeos
O mecanismo mais importante de resistência aos aminoglicosídeos em P. ae-

ruginosa é a modificação enzimática do antimicrobiano, com a consequente
diminuição da afinidade desse antimicrobiano pela subunidade 30S do ri-
bossomo (Tabela 10). As enzimas fosforiltransferases (APH), adeniltransfera-
ses ou nucleotidiltransferases (AAD ou ANT), e acetiltransferases (AAC) são
codificadas por genes localizados em plasmídeos.
A metilação da subunidade 16S do RNA ribossômico também pode ser me-

diada por enzimas codificadas por genes mobilizados por plasmídeos. Esse
mecanismo de resistência confere alto nível de resistência à amicacina, to-
bramicina, netilmicina e gentamicina (Tabela 10). No Brasil, as metilases 16S
RNAr RmtD e RmtG têm sido frequentemente reportadas em P. aeruginosa56.
Resistência às fluoroquinolonas
A resistência às fluoroquinolonas em P. aeruginosa ocorre principalmente

por alterações estruturais no alvo (DNA girase e topoisomerase IV) ou pela
expressão de bombas de efluxo. Como para os β-lactâmicos, a superexpres-
são dos sistemas de bombas de efluxo também pode contribuir para a resis-
tência às fluoroquinolonas (Tabela 10).
Tabela 10. Fenótipos de resistência aos aminoglicosídeos e às fluoroquinolonas em

Pseudomonas aeruginosa47,48,53
Antibacterianos
Mecanismo de resistência
GEN TOB NET AMI CIP
S S S S S –
R S S S – AAC(3)-I
R R R S – AAC(3)-II
S/r R R R – AAC(6’)-I
R R R S – AAC(6’)-II
R R S S – ANT(2’)-I
R R R R – Metilação ribossômica (RmtD, RmtG)
r/R r/R r/R r/R r/R Sistema de bomba de efluxo MexXY-OprM
– – – – r/R Sistemas de bombas de efluxo (MexAB-OprM, CD-OprJ, EF-OprN)
– – – – r Mutação em gyrA
– – – – R Mutação em gyrA e parC
AMI: amicacina; CIP: ciprofloxacina; GEN: gentamicina; NET: netilmicina; TOB: tobramicina.
R: resistente; r: sensibilidade diminuída; S: sensível.
58
Resistência às polimixinas
A resistência às polimixinas, embora pouco reportada em P. aeruginosa no

Brasil, pode ser causada por mutações nos sistemas de dois componentes
(PhoP/PhoQ ou PmrA/PmrB), reguladores da transcrição que controlam as
modificações do LPS. Mutações nos genes de outro sistema de dois compo-
nentes, ParRS/CprRS, também podem ter participação no desenvolvimen-
to de resistência às polimixinas57. Adicionalmente, a inativação da proteína
MgrB (regulador de feedback negativo do sistema PhoP-PhoQ) pode contri-
buir para a resistência às polimixinas. Alterações no sistema de dois com-
ponentes podem produzir modificações no LPS, que resultam na adição de
resíduos 4-amino-4-deoxy-L-arabinose na porção do lipídeo A58,59.
Ö Acinetobacter baumannii
A. baumannii é a espécie mais prevalente do gênero em amostras clínicas

humanas, sendo considerado um patógeno oportunista, frequentemente
multirresistente, associado a infecções nosocomiais60. A. baumannii é resis-
tente à maioria dos β-lactâmicos, especialmente penicilinas e cefalospori-
nas. Assim, é atípico encontrar uma cepa com um fenótipo que possua uma
sensibilidade total aos β-lactâmicos.
A resistência à ampicilina, carboxipenicilinas e ureidopenicilinas tem sido as-

sociada à presença de β-lactamases plasmidiais de espectro restrito, como
variantes TEM-1, TEM-2 e SHV-1. No entanto, a superexpressão de uma cefa-
losporinase cromossômica do tipo AmpC, também chamada de ADC (cefa-
losporinase derivada de Acinetobacter), pode ser o mecanismo mais comum
de resistência aos β-lactâmicos, e gera um fenótipo de resistência à ampici-
lina, cefalotina, piperacilina, cefotaxima e ceftazidima (Tabela 11). Essa ce-
falosporinase cromossômica pode ser expressa em um baixo nível e, nes-
ses casos, não confere resistência à ceftazidima. A superexpressão do gene
blaADC está associada à presença de uma sequência de inserção (ISAba1) inse-
rida na região promotora deste gene. A sequência de inserção mencionada
exibe um promotor que é utilizado pela RNA polimerase para expressar a
cefalosporinase. Assim, a hiperprodução de ADC confere resistência à ticarci-
lina, cefotaxima, ceftazidima, cefepima e aztreonam, sem afetar a cefoxitina
ou os carbapenêmicos (Tabela 11). A superprodução de ADC é um fenótipo
comum em A. baumannii. De fato, a sequência de inserção ISAba1 pode ser
encontrada em grande parte dos isolados clínicos, associada com a região
promotora do gene blaADC, conferindo resistência à ceftazidima60.
59
As estirpes resistentes às cefalosporinas de terceira geração, que não exibem

uma superprodução de ADC, podem possuir uma ESBL. Vários tipos de ES-
BLs foram descritos em A. baumannii, dentre os quais encontramos variantes
PER (PER-2), OXA (OXA-37), CTX-M (CTX-M-2, CTX-M-15), TEM (TEM-92), SHV
(SHV-5, SHV-12), e VEB-1.
A produção de carbapenemases, como KPC-2, tem sido cada vez mais re-
portada nesta espécie, porém, carbapenemases do tipo OXA têm sido mais
frequentes. OXA-51 ou suas variantes (OXA-64, OXA-65, OXA-67 OXA-69,
OXA-70, OXA-88, OXA-120, OXA-132 ou OXA-219) são intrínsecas em A. bau-
mannii. Em condições normais, essa enzima tem uma atividade fraca contra
carbapenêmicos. No entanto, a superexpressão do gene blaOXA-51 também
está associada com sequência de inserção ISAba1 que se insere na região
promotora do gene, aumentando a atividade hidrolítica contra carbapenê-
micos61,62.
Além dessa oxacilinase cromossômica com atividade de carbapenemase,

A. baumannii pode adquirir outras 5 classes de oxacilinases com atividade
contra carbapenêmicos: i) oxacilinases do grupo OXA-23 (que inclui OXA-23,
OXA-27 e OXA-49); ii) grupo OXA-24/40 (que inclui OXA-24, OXA-25, OXA-26,
OXA-40, OXA-72, OXA-160 e OXA-182); iii) grupo OXA-58 (que inclui OXA-96
e OXA-97); iv) grupo OXA 235 (com subgrupo OXA-235); e v) OXA-143 (com
variantes OXA-231 e OXA-253). No Brasil, a produção de OXA-23, OXA-58,
OXA-72, OXA-143, OXA-231 e OXA-253 tem sido reportada60-62.
Metalo-β-lactamases IMP-1, IMP-10 e NDM -1, conferindo um alto nível de

resistência aos carbapenêmicos (CIM> 32 µg/mL), além de conferir resistên-
cia a todos os β-lactâmicos exceto o aztreonam, têm sido reportadas em iso-
lados clínicos de A. baumannii e outras espécies do gênero no Brasil63–65. A
expressão reduzida de proteínas de membrana externa confere resistência
ao imipenem. Especificamente, 3 proteínas com peso molecular de 33 a 36
kDa, 29 kDa (CarO), e 43 kDa (homóloga a OprD de P. aeruginosa) têm sido
caracterizadas66.
Diversas enzimas modificadoras de aminoglicosídeos são reportadas em A.

baumannii (Tabela 12). A presença frequente de duas ou mais enzimas em
uma mesma cepa determina, em muitos casos, padrões de resistência difí-
ceis de inferir a partir do antibiograma. A resistência a todos os aminoglico-
sídeos pode ser devido à combinação de várias enzimas modificadoras ou
devido à hiperexpressão de um sistema de bomba de efluxo codificado pelo
60
operon AdeABC. Tal hiperexpressão também afeta a sensibilidade à tigecicli-

na, sendo o principal responsável pelo aumento da CIM de tigeciclina em A.
baumannii67.
Resistência às Fluoroquinolonas e Polimixinas
A resistência às fluoroquinolonas também está associada a mutações nos

genes gyrA, gyrB, parC e parE. Adicionalmente, a hiperexpressão de uma ou
várias bombas de efluxo também pode desempenhar um papel fundamen-
tal na expressão de resistência às fluoroquinolonas. Também já foi descrita a
resistência mediada pelo gene qnrS35,68.
Como para outras espécies Gram-negativas, a resistência à colistina e polimi-

xina B em A. baumannii está associada a mutações no sistema de dois com-
ponentes PmrA/PmrB, com consequente modificação do lipídeo A. Além
disso, recentemente foi descrita a presença do gene plasmidial mcr-4.3 em
isolados dessa espécie69,70.
Tabela 11. Fenótipos de resistência a antimicrobianos β-lactâmicos em Acinetobacter

baumannii49
Antimicrobianos Mecanismo de resistência
AMP TC PIP CTX CAZ CPM IPM (β-lactamase)
R S S S S S S Baixo nível de expressão de AmpC

R R R/r R R R/r S Alto nível de expressão de AmpC
R R R/r R R S S ESBLs*
R R S/R S/R S/R S/R R/r Carbapenemase**
R R R R R R R Carbapenemase + AmpC
AMP: ampicilina; CAZ: ceftazidima; CPM: Cefepime; CTX: cefotaxima; IPM: Imipenem; PIP: piperacilina; TC: ticarcilina.
R: resistente; r: sensibilidade diminuída; S: sensível.
*Padrão gerado pela OXA-37.
**A CIM gerada pela presença de oxacilinases (OXA-23, OXA-58, OXA-72, OXA-143, OXA-231 e OXA-253) com atividade de carbapenemase pode ser
baixa, mas se simultaneamente ocorre uma redução na quantidade de porinas associada à resistência aos carbapenêmicos, poderá haver um aumento
na CIM. Além disso, a associação dessas oxacilinases com hiperexpressão de enzimas ADC ou OXA-51 podem levar à resistência às cefalosporinas e
carbapenêmicos. Carbapenemases do tipo NDM-1 e KPC-2 conferem resistência às penicilinas, cefalosporinas e carbapenêmicos.
61
Tabela 12. Fenótipos de resistência aos aminoglicosídeos e quinolonas/fluoroquinolonas

em Acinetobacter baumannii49
Aminoglicosídeos
Principal mecanismo de resistência
GEN TOB NET AMI SP
S S S S S -
R S S S S AAC(3)-I
R R R S S AAC(3)-II
S R R R S AAC(6’)-I
S S S S R ANT(3″)
R R S S S ANT(2″)-I
S S S R S APH(3’)-VI
R R R R R Enzimas + bomba de efluxo (AdeABC)
Quinolonas/fluoroquinolonas
NAL CIP LVX
S S S -
R R S Mutação em gyrA + bombas de efluxo
R R R Mutações em gyrA e parC+ bombas de efluxo
Aminoglicosideos, AMI: amicacina; GM: gentamicina; NET: netilmicina; SP: espectinomicina; TOB: tobramicina. Quinolonas, CIP: ciprofloxacina; LVX:
levofloxacina; NAL: ácido nalidíxico.
R: resistente; S: sensível.
Ö Stenotrophomonas maltophilia
S. maltophilia é intrinsecamente resistente a vários antimicrobianos, incluin-

do carbapenêmicos. Outro agravante é que esse patógeno tem facilidade
para adquirir genes de resistência a outros antimicrobianos, como tetracicli-
na e aminoglicosídeos, através de elementos genéticos móveis71.
Para S. maltophilia, a impermeabilidade da membrana externa é um fator

que pode contribuir para a resistência intrínseca basal aos antimicrobianos
β-lactâmicos. A baixa permeabilidade pode estar relacionada à redução na
quantidade de porinas. No entanto, vários sistemas de bombas de efluxo
descritos parecem também contribuir com a resistência intrínseca. Por ou-
tro lado, a produção conjunta de duas β-lactamases codificadas por genes
cromossômicos contribui para a resistência intrínseca a todos os β-lactâmi-
cos, incluindo carbapenêmicos (Tabela 13). Com relação a isto, a β-lactamase
cromossômica L1 é dependente do Zn++, e possui notável atividade contra o
imipenem e o meropenem, não hidrolisando o aztreonam. Como o resto das
metalo-β-lactamases, esta enzima não é inibida pelo ácido clavulânico, mas
62
é inibida pelo EDTA. A segunda β-lactamase cromossômica denominada L2

é do tipo serino-β-lactamase, possuindo atividade de cefalosporinase, e adi-
cionalmente, hidrolisa o aztreonam. Esta enzima é sensível aos inibidores de
β-lactamase. Tanto L1 como L2 são induzíveis50.
Alguns isolados de S. maltophilia produzem enzimas que modificam os ami-

noglicosídeos, como acetil ou nucleotidiltransferases, incluindo AAC(6’)Iz,
que inativa a tobramicina e a amicacina. Essas enzimas são prevalentes em
S. maltophilia (Tabela 14). No entanto, o principal mecanismo de resistência
que explica a baixa atividade dos aminoglicosídeos contra S. maltophilia é a
redução da incorporação deste antimicrobiano pela célula bacteriana. Esse
fenômeno pode ser devido a alterações nas proteínas da membrana externa,
ou nos lipopolissacarídeos50.
Resistência às Quinolonas/Fluoroquinolonas
A resistência às quinolonas em S. maltophilia difere de outros patógenos

Gram-negativos não fermentadores da glicose, uma vez que mutações em
genes gyrA e parC parecem ser pouco frequentes no desenvolvimento da
resistência às quinolonas/fluoroquinolonas. No genoma desta espécie exis-
te um gene semelhante ao qnr, comumente descrito em Enterobacterales,
o qual confere resistência às quinolonas pela proteção das topoisomerases.
Esse gene denominado Smqnr confere resistência intrínseca às quinolonas
(Tabela 14)72.
Entre os agentes antimicrobianos com maior atividade contra esse micror-

ganismo está sulfametoxazol-trimetoprima (cotrimoxazol), considerado o
antimicrobiano de primeira escolha, assim como minociclina e doxiciclina.
Tabela 13. Fenótipos de resistência a β-lactâmicos e aminoglicosídeos e quinolonas em

Stenotrophomonas maltophilia50
β-lactâmicos Mecanismo de resistência
AMP TIC PIP CTX IMP ATM
R R R R R S β-lactamase L1
R S r R S R β-lactamase L2
R R R R R R β-lactamases L1 + L2a
AMP: ampicilina; ATM: aztreonam; CTX: cefotaxima; IMP: Imipenem; PIP: piperacilina; TIC: ticarcilina + ácido clavulânico; R: resistente; r: sensibilidade
diminuída; S: sensível.
a
Mecanismo mais comum de resistência
63
Tabela 14. Resumo dos mecanismos de resistência em Stenotrophomonas maltophilia50

Mecanismo Perfil de resistência
β-lactamases L1 e L2 β-lactâmicos
Sulfonamida hidrolase (Sul1, Sul2, Sul3) Sulfonamidas, trimetoprima/sufametoxazol
Expressão de bombas de efluxo SmeDEF, SmeABC Ciprofloxacina/fluoroquinolonas, tetraciclina, meropenem, cloranfenicol
Expressão de bomba de efluxo SmeIJK Tetraciclina, aminoglicosídeos, ciprofloxacina
Expressão de bomba de efluxo SmeOP Aminoglicosídeo, macrolídeos, doxiciclina, quinolonas
Expressão de bomba de efluxo SmeVWX Quinolonas
Expressão de bombas de efluxo SmeYZ” Aminoglicosídeos
Enzimas modificadoras de aminoglicosídeos AAC(6’)–Iz, Aminoglicosídeos
ANT(3″)(9)
Proteína Smqnr Quinolonas e fluoroquinolonas
Mutação na região QRDR na DNA girase e topoisomerase Quinolonas e fluoroquinolonas
IV
Fosfoglicomutase SpgM Ceftazidima, gentamicina, ácido nalidíxico, piperacilina-tazobactam,
polimixina B, colistina, ticarcilina-ácido clavulânico
3.3.6 Neisseria spp.

Entre as várias espécies de Neisseria spp., apenas Neisseria gonorrhoeae e
Neisseria meningitidis são patogênicas ao homem. N. meningitidis causa me-
ningites consideradas muito graves, mas permanece ainda bastante sensível
às terapias antimicrobianas disponíveis. De fato, cobertura vacinal e aces-
so à possibilidade de diagnóstico precoce são os mais críticos aspectos no
controle de infecções por esse microrganismo. Em contraste, N. gonorrhoeae
causa uma infecção com alta incidência, mas de gravidade baixa ou modera-
da, e apresenta alarmantes índices de resistência aos antimicrobianos. N. go-
norrhoeae é o agente causador da infecção sexualmente transmissível (IST)
gonorreia, sendo o ser humano seu único hospedeiro natural. Esta bactéria
é capaz de se aderir às células epiteliais presentes em mucosas, como a oral,
urogenital, retal e conjuntiva.
Por ser uma bactéria Gram-negativa, o envoltório celular de N. gonorrhoeae a

torna intrinsecamente resistente a lincosamidas e aos glicopeptídeos. N. go-
norrhoeae é também resistente às polimixinas, graças à ação de uma enzima
transferase codificada pelo gene lptA que adiciona resíduos de fosfoetano-
laminas aos grupos fosfato de lipídeo A, num mecanismo associado à resis-
tência a defensinas humanas. Além disso, Neisseria spp. são intrinsecamente
menos sensíveis a trimetoprima, uma vez que a enzima dihidrofolato redu-
tase que expressam apresenta baixa afinidade por este antimicrobiano73–76.
64
Na maioria dos países a gonorreia é tratada sem que seja feita cultura para
isolamento do microrganismo ou teste de sensibilidade aos antimicrobia-
nos. Isso torna necessário o estabelecimento de protocolos de tratamento a
partir do diagnóstico sindrômico, o qual é normalmente determinado com
base no perfil de susceptibilidade local, ou, na ausência deste dado, seguin-
do recomendações da OMS77. Até os dias de hoje, cinco antimicrobianos
foram extensivamente usados para o tratamento de gonorreia (penicilina,
tetraciclina, ciprofloxacina, cefalosporinas de terceira geração, como cefixi-
ma e ceftriaxona, e azitromicina) e, para todos estes, N. gonorrhoeae desen-
volveu ou adquiriu mecanismos de resistência. Faz ainda parte da estratégia
terapêutica de muitos países a espectinomicina, antimicrobiano para o qual
relatos de resistência são menos frequentes73–77.
Ö Penicilina
A penicilina, descoberta por Alexander Fleming em 1928, pertence à classe

dos β-lactâmicos. Esses antimicrobianos atuam inibindo a transpeptidação,
reação final da síntese de peptideoglicano, maior responsável pela rigidez
da parede celular bacteriana. A penicilina foi usada para tratar gonorreia des-
de a década de 1940 até a década de 1980. Ao longo desse tempo, um cons-
tante e gradual aumento da CIM foi observado. Desde os primeiros registros
de diminuição de sensibilidade até a resistência plena, a dose eficiente de
penicilina para o tratamento de gonorreia aumentou em 24 vezes (de 2,0
para 4,8 milhões U) e a CIM variou de ≤ 0,015 μg/ml para 2 μg/ml78.
Mecanismos associados a essa variação de CIM estão relacionados a muta-

ções cromossômicas em genes codificadores de transpeptidases como PBP1
(ponA), mas principalmente PBP2 (penA), e a genes codificadores de proteí-
nas relacionadas à regulação da concentração periplasmática do antimicro-
biano. Entre estas, pode-se citar a porina PorB (penB), a secretina de pilus
tipo IV pilQ (penC), e o regulador negativo da expressão da bomba de efluxo
MtrCDE, MtrR (mtrR). Este gene, quando truncado ou não expresso, leva à
hiperexpressão da respectiva bomba. Mutações cumulativas nestes genes
podem elevar a CIM a até 4 μg/ml73,78.
Contudo, a aquisição de plasmídeos carreando β-lactamases aumenta dra-

maticamente a CMI para valores superiores a 16 µg/mL. Até hoje apenas ge-
nes codificadores das β-lactamases TEM-1, TEM-135 e TEM-220 foram iden-
tificados em N. gonorrhoeae. Tais genes têm sido detectados em plasmídeos
geneticamente relacionados, que apresentam tamanhos e sítios de inserção/
deleção diferentes e são nomeados conforme sua origem epidemiológica.
Os plasmídeos Ásia (7.426 pb), África (5.588 pb), e Toronto/Rio (5.154 pb) são
65
os mais descritos associados a blaTEM em N. gonorrhoeae. No entanto, outros

como Nimes (6.798 pb), New Zealand (9.309 pb), Johannesburg (4.865 pb), e
Australian (3.269 pb) também já foram identificados78,79.
Ö Tetraciclina
A tetraciclina, antimicrobiano que se liga à porção 50S do ribossoma, afetan-

do a síntese de proteínas, foi utilizada como alternativa à penicilina durante
cerca de 40 anos. A sensibilidade de N. gonorrhoeae à tetraciclina também
é reduzida pela superexpressão de MtrCDE ou mutações em PorB. Outra
mutação que interfere na ação da tetraciclina é a substituição Val57Met na
proteína ribossômica 10S (rpsJ), o que reduz a afinidade do antimicrobiano
pelo alvo. Combinados, esses mecanismos permitem que cepas gonocócicas
atinjam resistência à tetraciclina com CIM de 2 -8 µg/ml80.
Durante a década de 1980, cepas de N. gonorrhoeae com CIM ≥ 16 µg/mL

passaram a ser detectadas. O mecanismo associado à resistência a altas con-
centrações de tetraciclina é a proteína TetM. TetM tem estrutura semelhante
ao fator de elongação da tradução EF-G, mas com maior afinidade pelo ri-
bossoma. Assim, TetM compete pelo mesmo sítio que o EF-G e a tetraciclina,
bloqueando o acesso do antimicrobiano a seu alvo na subunidade 50S do
ribossoma bacteriano. Esse mecanismo é codificado por genes de ocorrên-
cia plasmidial (tetM). Dois plasmídeos muito parecidos, conhecidos como
American e Dutch, ambos com peso molecular de 25,2 MDa, são associados
a tetM em Neisseria gonorrhoeae.
Ö Ciprofloxacina
Ciprofloxacina, uma fluoroquinolona, interfere na síntese de DNA por se ligar

ao complexo topoisomerases-DNA durante eventos de abertura da dupla
fita para relaxamento de superenrolamento ou decatenação, estabilizando
o complexo e afetando a viabilidade celular. A ciprofloxacina foi o fármaco
recomendado para tratamento de gonorreia na maior parte dos países em
meados da década de 1980, tendo seu uso sido descontinuado gradualmen-
te, devido às altas taxas de resistência a este antimicrobiano.
A resistência a ciprofloxacina em gonococos é causada principalmente por

mutações nos genes gyrA e parC, codificadores da porção que se liga tran-
sientemente ao DNA nas Topoisomerases II e IV, respectivamente. Mutações
que alteram a identidade de aminoácidos na QRDR, mais frequentemente
nas posições 91, 95 e/ou 120 em GyrA, 87 e 91 em ParC, impactam na ação
do antimicrobiano. Duas ou mais mutações nestas regiões podem levar à
66
resistência à ciprofloxacina. Quanto maior o número de mutações na QRDR,

incluindo algumas posições em gyrB e parE, maior é o impacto sobre a CIM
de ciprofloxacina73.
Ö Azitromicina
A azitromicina atua inibindo a síntese proteica, uma vez que se liga ao RNA
ribossômico 23S (23S rRNA), o qual está localizado na subunidade 50S do
ribossoma bacteriano, impedindo a translocação do RNA transportador e,
consequentemente, a formação da cadeia polipeptídica. Azitromicina foi uti-
lizada por poucos anos como monoterapia para tratar infecções sexualmen-
te transmissíveis bacterianas em alguns países. Atualmente, esse antimicro-
biano é prescrito sempre combinado à ceftriaxona ou a outros antimicro-
bianos. Amostras resistentes à azitromicina são reportadas desde o final dos
anos 1990, mas a porcentagem de amostras resistentes tem crescido muito
nos últimos 10 anos em todo o mundo81.
Os mecanismos de resistência à azitromicina presentes no gonococo estão

relacionados a modificações no sítio-alvo desse antimicrobiano no ribosso-
ma ou pela expressão aumentada de bombas de efluxo. A CIM de azitromi-
cina sobre gonococos pode aumentar para 0,5 µg/mL em decorrência da
expressão aumentada da bomba de efluxo MtrCDE, por uma deleção no
promotor ou truncamento do gene que codifica o seu repressor mtrR. Outro
mecanismo adquirido que provoca pequena alteração da CIM é a aquisição
do gene mef, que está localizado em plasmídeos e codifica uma bomba de
efluxo.
A resistência a azitromicina também pode ser mediada por genes erm, ad-
quiridos por transposons conjugativos. Os genes erm codificam enzimas que
induzem a metilação de uma adenina presente no 23S rRNA, bloqueando
a ligação do macrolídeo ao seu alvo ribossomal. Enzimas codificadas pelo
gene erm podem elevar a CIM para 1 – 4 µg/mL. Mutações específicas no
gene rplD, que codifica a proteína ribossomal L4, também podem contribuir
para a resistência a azitromicina. Neste caso, uma vez que essa proteína é
localizada próxima ao domínio V da peptidil transferase, uma substituição
Gly70Asp induz alteração na conformação do mesmo, tornando-o menos
sensível à ação do antimicrobiano.
No entanto, o mais impactante mecanismo de resistência a azitromicina em

gonococos são as mutações C2599T e A2143G no próprio domínio V da pep-
tidil transferase (domínio funcional do 23S rRNA), codificada pelo gene rrl.
N. gonorrhoeae tem 4 alelos deste gene. Quanto maior o número de alelos
67
mutados, maior a CIM para azitromicina, podendo atingir valores de até 256
µg/mL81.
Ö Cefalosporinas de espectro estendido (CEE): cefixima e ceftriaxona
As cefalosporinas de espectro estendido (CEE) são β-lactâmicos e atuam

da mesma forma que as penicilinas, com elevada potência contra bactérias
Gram-negativas. Mecanismos que aumentam a CIM para penicilina, como
mutações no gene porB (especialmente que alteram aminoácidos G101 e
A102) e a expressão aumentada da bomba de efluxo MtrCDE, também inter-
ferem na CIM de CEE, sem, no entanto, levá-la a níveis de resistência.
O mecanismo mais importante de resistência à ceftriaxona em amostras de

N. gonorrhoeae está relacionado à aquisição de diferentes alelos mosaico
do gene penA. Estes mosaicos levam à codificação de uma PBP2 com 60 a
70 mudanças em aminoácidos com relação ao que seria a PBP2 selvagem, a
qual deixa de ser facilmente reconhecida pelas CEE. Acredita-se que mosai-
cos penA tenham sido adquiridos por cepas de gonococos in vivo por meio
de transferência horizontal durante infecções gonocócicas na orofaringe,
por meio de recombinação de DNA de espécies de Neisseria comensais, tais
como Neisseria perflava, Neisseria flavescens e Neisseria sicca. Entre os mais de
2000 alelos penA já descritos, alguns são considerados epidemiologicamen-
te relevantes (como penAX e penAXXXIV), tendo sido relacionados a clones
específicos com baixa susceptibilidade às CEE. A resistência a CEE é geral-
mente alcançada por mutações pontuais nestes mosaicos penA82.
Ö Espectinomicina
A espectinomicina é citada em muitos protocolos terapêuticos para gonor-

reia como uma alternativa às CEEs, por exemplo, no caso de pacientes alérgi-
cos às penicilinas. Este antimicrobiano, um aminoglicosídeo, atua ligando-se
no 16S rRNA da subunidade 30S do ribossoma bacteriano, bloqueando a
translocação do RNA transportador do sítio A para o sítio P inibindo assim a
tradução do mRNA. A interação com o 16S rRNA ocorre na hélice 34 onde há
os pares de bases G1064 – C1192.
A resistência à espectinomicina reportada em isolados de N. gonorrhoeae é

resultado de mutações pontuais na hélice 34 do 16S rRNA, na qual há a subs-
tituição de citosina por timina na posição 1192 (C1192T); ou mutações (dele-
ção Val25, ou substituições Thr24Pro ou Lys26Glu) na proteína ribossomal S5
(codificada pelo gene rpsE), componente da subunidade 30S do ribossoma
bacteriano. Tais alterações na proteína S5 provavelmente interrompem sua
68
ligação ao 16S rRNA. Mutações C1192T e Thr24Pro elevam dramaticamente

a CIM para o espectinomicina (>1.024 µg/mL)73.
Tabela 15. Resumo dos mecanismos de resistência a antimicrobianos adquiridos que

ocorrem em N. gonorrhoeae73–76
Antimicrobiano Ocorrência Mecanismos Incidência Fenótipoa
Penicilina Cromossômica Alterações em PorB Alta SR, r quando combinados
Alterações em PBP1 Baixa
Alterações em PilQ Baixa
Superexpressão da bomba Alta
MtrCDE
Plasmidial β-lactamase blaTEM Moderada R
Tetraciclina Cromossomal Mutações em PorB Alta SR, r quando combinados
Mutações na proteína Baixa
ribossomal 10S
MtrCDE
Plasmidial Proteção ribossomal TetM Moderada R
Azitromicina Cromossomal Mutações na proteína Baixa SR, r quando combinados
ribossomal L4
MtrCDE
Plasmidial Efluxo por bomba mef Baixa SR, r quando combinados
Transposon Metilação do rRNA por genes Baixa
erm
Cromossomal Mutações nos alelos do gene rrl Moderada r/R, dependendo do tipo e
que codifica o 23S rRNA número de mutações
Cefixima e Cromossomal Alterações em PorB Alta SR
Ceftriaxona Alterações pontuais/PBP2 Moderada
mosaico
Superexpressão de MtrCDE Alta
Cromossomal PBP2 mosaico (algumas Baixa r/R
variantes) com ou sem
mutações pontuais adicionais
Espectinomicina Cromossomal Mutações em 16S rRNA Baixa r/R dependendo das

Mutações na proteína Baixa mutações
ribossomal S5
a
SR: sensibilidade reduzida; r: resistência a baixas concentrações do antimicrobiano; R: resistência a altas concentrações do antimicrobiano
3.3.7 Micobactérias
Ö Taxonomia
A revisão das características genômicas das espécies de crescimento rápido

do gênero Mycobacterium resultou na atualização da sua taxonomia, com a
realocação de algumas espécies em quatro novos gêneros designados Myco-
licibacter, Mycolicibacterium, Mycobacteroides, Mycolicibacillus83. A Tabela 16
69
lista as espécies de crescimento rápido mais frequentemente encontradas

como agente de infecções em humanos e sua taxonomia atual. Dentre as mi-
cobactérias de crescimento rápido, os três complexos de maior importância
clínica são Mycobacteroides abscessus, Mycobacteroides chelonae e Mycolici-
bacterium fortuitum. As espécies de crescimento lento não sofreram altera-
ção taxonômica em relação ao gênero, mas algumas espécies novas perten-
centes ao complexo Mycobacterium tuberculosis foram descritas. Atualmente
compõem o complexo M. tuberculosis as espécies M. tuberculosis, M. bovis, M.
africanum, M. caprae, M. microti, M. cannettii e M. pinnipedii; portanto, exceto
onde houver alguma particularidade, as caraterísticas de resistência intrínse-
ca serão descritas em relação ao complexo M. tuberculosis. Outras espécies,
a exemplo de ”M. mungi”, “M. orygis” e “M. suricattae” foram propostas como
membros do complexo M. tuberculosis, mas ainda não foram aceitas na no-
menclatura oficial de procariotos (www.bacterio.net).
Ö Localização dos determinantes genéticos da resistência antimicrobiana

em micobactérias
Nas micobactérias de crescimento rápido várias publicações já demonstra-

ram a presença de plasmídeos com genes de resistência a antimicrobianos,
incluindo resistência a aminoglicosídeos, fosfomicina e tetraciclina84,85 ape-
sar da localização dos genes determinantes de resistência intrínseca ser cro-
mossômica e a resistência adquirida, na maioria absoluta das vezes ser de-
corrente de mutações de genes cromossômicos.
Até o momento, não foram descritos plasmídeos no complexo M. tuberculo-

sis e a resistência antimicrobiana adquirida é, portanto, decorrente de muta-
ções espontâneas, que ocorrem na frequência de 1 a cada 106 bactérias para
isoniazida e pirazinamida e 1 a cada 108 bactérias para rifampicina. Este é o
racional para o uso de três ou quatro antimicrobianos simultaneamente para
o tratamento da tuberculose86.
Ö O envelope celular como uma barreira à penetração de antimicrobianos
A principal estrutura celular que diferencia as micobactérias dos demais gru-

pos de bactérias é o envelope celular que, neste grupo, apresenta conteúdo
lipídico de cerca de 60%, em sua maioria constituída por ácidos micólicos.
Essa estrutura representa uma barreira hidrofóbica à entrada de compostos
hidrofílicos e a sua efetividade é indiretamente comprovada pela observação
de que mutantes deficientes na síntese de lipídeos mostram-se sensíveis aos
antimicrobianos com características hidrofílicas87. Além disso, as micobacté-
rias, quando comparadas aos demais grupos, têm um baixo número de po-
70
rinas em seu envelope celular88, as quais, a princípio, são a via de entrada de

antimicrobianos hidrofílicos a exemplo de aminoglicosídeos e β-lactâmicos.
Tabela 16. Taxonomia atual das espécies de micobactérias de crescimento rápido mais
frequentes em infecções humanas83
Nomenclatura anterior Nomenclatura atual Complexo
Mycobacterium abscessus subsp. abscessus Mycobacteroides abscessus subsp. abscessus M. abscessus
Mycobacterium abscessus subsp. massiliense Mycobacteroides abscessus subsp. massiliense
Mycobacterium abscessus subsp. Bolletii Mycobacteroides abscessus subsp. bolletii
Mycobacterium chelonae Mycobacteroides chelonae M. chelonae
Mycobacterium franklinii Mycobacteroides franklinii
Mycobacterium immunogenum Mycobacteroides immunogenum
Mycobacterium salmoniphilum Mycobacteroides salmoniphilum
Mycobacterium saopaulense Mycobacteroides saopaulense
Mycobacterium boenickei Mycolicibacterium boenickei M. fortuitum
Mycobacterium brisbanense Mycolicibacterium brisbanense
Mycobacterium fortuitum Mycolicibacterium fortuitum
Mycobacterium fortuitum subsp. acetamidolyticum Mycolicibacterium fortuitum subsp. acetamidolyticum
Mycobacterium fortuitum subsp. Fortuitum Mycolicibacterium fortuitum subsp. fortuitum
Mycobacterium houstonense Mycolicibacterium houstonense
Mycobacterium neworleansense Mycolicibacterium neworleansense
Mycobacterium peregrinum Mycolicibacterium peregrinum
Mycobacterium porcinum Mycolicibacterium porcinum
Mycobacterium senegalense Mycolicibacterium senegalense
Mycobacterium septicum Mycolicibacterium septicum
Mycobacterium setense Mycolicibacterium setense
Ö Resistência em micobactérias de crescimento rápido
A disponibilidade do sequenciamento completo dos genomas de várias mi-

cobactérias permitiu que estudos com mutantes deficientes nos genes de
interesse comprovassem o papel das proteínas por eles codificadas, na re-
sistência antimicrobiana intrínseca desse grupo de bactérias. M. abscessus
ss. bolletii pode ser considerada intrinsecamente resistente à claritromicina
por expressão do gene erm virtualmente em todos os isolados41. A maioria
– cerca de 80% – dos isolados de M. abscessus ss. abscessus apresenta um
gene erm funcional41, e são, portanto, resistentes à claritromicina; entretanto,
o restante pode apresentar substituição T28C no gene erm ou interrupção
da sequência codificante, ambas levando à sensibilidade à claritromicina. A
71
RNA-metilase codificada por esse gene metila um resíduo de adenina no sí-

tio peptidil-transferase do rRNA 23S.
M. fortuitum apresenta o gene erm39, que codifica uma RNA-metilase e é

responsável pela resistência intrínseca aos macrolídeos observada nesta es-
pécie. A sensibilidade a essa classe de antimicrobianos pode ocorrer se há
mutação GTG-->CTG no códon de iniciação, que resulta na inatividade trans-
cricional do gene89.
A catalase-peroxidase KatG, que converte a isoniazida em produto com ativi-

dade antimicrobiana, está ausente em M. abscessus, o que explica a resistên-
cia intrínseca a este composto (Tabela 17).
O gene eis2 (“enhanced intracellular survival”) codifica uma N-acetil-transfe-

rase, que leva à resistência de alto nível à capreomicina, com CIMs superiores
a 256 mg/L. A mesma proteína está relacionada à resistência de baixo nível
à amicacina, com CIM abaixo do ponto de corte de sensibilidade atual de 16
mg/L90. Digno de nota, a proteína WhiB7 é necessária para a ativação trans-
cricional dos genes erm e eis241. Por sua vez, a transcrição do gene whiB7
é induzida mesmo por concentrações subinibitórias de claritromicina; por-
tanto concentrações terapêuticas de claritromicina podem induzir elevação
das CIMs tanto para a própria claritromicina por indução da metilase quanto
para amicacina91.
A resistência intrínseca à estreptomicina em M. abscessus é determinada pela

expressão de str(3´), que codifica uma fosfotransferase capaz de modificar
apenas este composto92.
As espécies do complexo M. abscessus expressam uma ADP-ribosiltransfera-

se, codificada pelo gene arr, que adiciona uma ribose à rifampicina, levando
à resistência intrínseca a este composto90.
A resistência intrínseca aos β-lactâmicos em M. abscessus é provavelmente

decorrente da barreira hidrofóbica representada pelo envoltório celular rico
em ácidos micólicos e a baixa afinidade de D,D-transpeptidades aos β-lactâ-
micos. A expressão dessas D,D-transpetidades, em vez de D,L-transpeptida-
ses, em M. abscessus pode explicar as CIMs para imipenem e cefoxitina mais
elevadas neste complexo, diferentemente das demais espécies de micobac-
térias de crescimento rápido93. A β-lactamase Mab de classe A, produzida
por M. abscessus, é capaz de degradar eficazmente amoxicilina, ampicilina,
clavulanato, sulbactam e tazobactam, mas é inibida pelo avibactam e não
degrada imipenem/meropenem94. A resistência adquirida aos carbapenê-
72
micos provavelmente ocorre por mutações espontâneas, diminuindo ainda

mais a afinidade das transpeptidases aos β-lactâmicos93 ou por mutação na
proteína RshA, um regulador negativo da resposta ao estresse e elevação da
temperatura95.
O mecanismo pelo qual o complexo M. abscessus apresenta resistência in-

trínseca às fluoroquinolonas ainda não está elucidado. É possível que um sis-
tema de efluxo ainda não caracterizado seja o principal responsável por esse
fenômeno93. A resistência adquirida às fluoroquinolonas em micobactérias
ocorre por mutações espontâneas no gene gyrA, que codifica a subunidade
A da DNA girase93.
O etambutol atua inibindo a arabinosil-transferase codificada pelo gene emB,

responsável pela síntese de arabinogalactana, resultando na inibição da sín-
tese da parede celular. Na maioria absoluta das espécies de micobactérias de
crescimento rápido, a exemplo de M. abscessus, a resistência intrínseca é expli-
cada pela ocorrência de um resíduo de glutamina na posição 303 (Q303) e um
resíduo de metionina na posição 304 (M304) da arabinosil-transferase Emb.
Os elevados níveis de resistência intrínseca à tetraciclina e doxiciclina obser-

vados em M. abscessus é decorrente da expressão de uma mono-oxigenase
indutiva, codificada pelo gene tetX, capaz de modificar a tetraciclina e doxici-
clina, abolindo a sua capacidade de ligação ao sítio A do ribossomo96.
Tabela 17 Genes implicados na resistência antimicrobiana intrínseca em M. abscessus e

impacto de sua expressão na CIM para esses compostos. Modificado de Luthra et al., 201890
M. abscessus M. abscessus
Antimicrobiano ss. abscessus ss. abscessus Referência
selvagem (mg/L) mutante (mg/L)
Isoniazida >512 katG: 32 Luthra et al., 201890
Rifampicina 128 Δarr: 0,25 Rominski et al., 201897
Capreomicina >256 Δeis2: 4 Rominski et al., 201897
Claritromicina 64 Δerm41: 0,5 Choi et al., 201298
Kanamicina 8 Δaac(2´): 0,125 Rominski et al., 201897
Amicacina 4 Δeis2: 0,25 Rominski et al., 201897
Estreptomicina 32 Δstr(3´): 2 Dal Molin et al., 201792
Tetraciclina 64 ΔtetX: 4 Rudra et al., 201896
Amoxicilina >256 ΔblaMab: 8 Dubeé et al., 201599
Ampicilina >256 ΔblaMab: 4 Dubeé et al., 201599
Etambutol ≥ 64 - Alcaide et al.,1997100
A resistência adquirida às oxazolidinonas em micobactérias de crescimento

rápido ainda é objeto de estudos para elucidação de seus mecanismos. Em
73
estudo recente de uma coleção de M. abscessus resistentes à linezolida, ape-

nas 8,2% apresentavam mutações no rRNA 23S (T2138C, A2271C, C2432T,
G3048A), sítio de ligação deste antimicrobiano. O mesmo estudo demons-
trou o papel dos genes lmrs e mmpL9, que codificam bombas de efluxo, na
resistência à linezolida101.
A resistência adquirida à amicacina, principal aminoglicosídeo utilizado

no tratamento das infecções por micobactérias de crescimento rápido, é
mais frequentemente decorrente de mutação no rRNA 16S, usualmente
A1408G102.
A resistência adquirida à tigeciclina é infrequente. Estudo utilizando mutan-

tes obtidos por pressão seletiva com o antimicrobiano in vitro evidenciou,
por sequenciamento completo dos genomas, que uma mutação pontual no
gene MAB_3542c pode estar implicada na resistência a este antimicrobiano.
O gene codifica a proteína RshA, um regulador negativo da resposta ao es-
tresse e elevação da temperatura95.
Ö Resistência antimicrobiana no complexo M. tuberculosis
O envoltório celular de M. tuberculosis apresenta camada externa espessa de

ácidos micólicos, covalentemente ligada à camada de peptidoglicano por
uma camada de arabinogalactana e, da mesma forma que nas outras mico-
bactérias, é um dos principais determinantes da resistência intrínseca a anti-
microbianos. Esse efeito é maior nos compostos hidrofílicos, mas também é
observado, mesmo para antimicrobianos com características hidrofóbicas103.
A resistência intrínseca à maioria dos β-lactâmicos, incluindo carbapenêmi-

cos, observada em M. tuberculosis, é decorrente da expressão de BlaC, uma
β-lactamase de classe A, inibida por clavulanato104.
M. tuberculosis apresenta resistência intrínseca aos macrolídeos pela expres-

são da RNA-metilase Erm37, que metila os resíduos 2057 a 2059 do rRNA 23S.
M. bovis BCG apresenta resistência intrínseca à pirazinamida por dois meca-

nismos: deficiência no transporte para o espaço intracelular e não expressão
de pirazinamidase, necessária para a ativação da pirazinamida105.
A contribuição dos sistemas de efluxo na resistência antimicrobiana em M.

tuberculosis é controversa, mas há evidências de que a expressão desses sis-
temas varia em função de mudanças ambientais. Por exemplo, as bombas de
efluxo, que são capazes de transportar estreptomicina, rifampicina, isonia-
74
zida, clofazimina, bedaquilina, fluoroquinolonas e etambutol são induzidas

por condições ambientais específicas como o ambiente intracelular do ma-
crófago ou meio contendo antimicrobiano.
A resistência antimicrobiana adquirida em M. tuberculosis é decorrente de

mutações espontâneas, mesmo sem exposição ao antimicrobiano. A exposi-
ção ao antimicrobiano contribui para a seleção de mutantes resistentes86. A
resistência à rifampicina é adquirida por mutações no gene da subunidade
beta da RNA-polimerase, na região designada RRDR, sendo a mais frequen-
te a Ser-450-Leu. A resistência à isoniazida pode ocorrer por mutações no
gene katG, sendo que a mais frequente resulta na substituição Ser-315-Thr,
no gene inhA ou seu promotor, enquanto a resistência à pirazinamida ocorre
por mutações no gene pncA, sendo a mais frequente a que resulta nas subs-
tituições Asp-12-Ala e Asp, Leu-85-Pro da pirazinamidase (Tabela 18)106.
As cepas de M. tuberculosis resistentes à rifampicina e à isoniazida são classi-

ficadas como MDR (resistentes a múltiplos fármacos). Já, cepas classificadas
como XDR (extensivamente resistentes aos fármacos) são aquelas resisten-
tes à rifampicina, isoniazida e a pelo menos 3 das seguintes classes: amino-
glicosídeos, polipeptídios, fluorquinolonas, tiamidas, cicloserina, ácido para-
-aminossalicílico (PAS).
A Tabela 19 detalha os genes envolvidos na resistência aos demais antimi-

crobianos utilizados no tratamento da tuberculose. Mesmo para os antimi-
crobianos introduzidos mais recentemente em uso clínico para o tratamento
da tuberculose, como bedaquilina e pretomanida, há pelo menos dois meca-
nismos de resistência adquirida distintos para cada um deles.
Tabela 18. Determinantes da resistência adquirida aos antimicrobianos de primeira linha

utilizados no esquema 1 de tratamento da tuberculose
Gene ou região Mecanismo
Antimicrobiano Referência
promotora de resistência/alvo ou enzima
Rifampicina rpoB alteração do alvo/subunidade beta da RNA polimerase Telenti et al., 1993107
Isoniazida katG não conversão da isoniazida em composto com Heym et al., 1995108
atividade antimicrobiana/catalase-peroxidase
inhA alteração do alvo/2-trans-enoil-AcpM redutase Hazbón et al., 2006109
promotor de inhA superexpressão de inhA Hazbón et al., 2006109
Etambutol embB alteração do alvo/arabinosil-transferase Telenti et al., 19970110
Pirazinamida pncA não conversão da isoniazida em composto com Scorpio et al., 1996111
atividade antimicrobiana/pirazinamidase
Modificado de Gygli et al., 201786
75
Tabela 19. Determinantes da resistência adquirida aos demais antimicrobianos utilizados

no tratamento da tuberculose. Modificado de Gygli et al., 201786
Gene ou região Mecanismo
Antimicrobiano Referência
promotora de resistência/alvo ou enzima
Etionamida inhA alteração do alvo/2-trans-enoil-AcpM redutase Morlock et al., 2003112
promotor de inhA superexpressão de inhA/2-trans-enoil-AcpM redutase Morlock et al., 2003112
ethA alteração do alvo/mono-oxigenase dependente de Morlock et al., 2003112
flavina adenina dinucleotídeo
Fluorquinolonas gyrA/gyrB alteração do alvo/subunidades A e B da DNA girase Malik et al., 2012113
Estreptomicina rrs alteração do alvo/rRNA 16S Maus et al., 2005114
rpsL alteração do alvo/proteina ribossômica (30S) S12 Maus et al., 2005114
Amicacina Rrs alteração do alvo/rRNA 16S Maus et al., 2005114
Kanamicina Rrs alteração do alvo/rRNA 16S Maus et al., 2005114
promotor de eis superexpressão de eis2/N-acetil-transferase Kambli et al., 2016115
Capreomicina rrs alteração do alvo/rRNA 16S Maus et al., 2005114
tlyA não metilação do rRNA16S e do rRNA23S Monshupanee et al.,
2012116
Ácido p-amino salicílico thyA timidilato sintase folato dependente/não conversão Minato et al., 2015117
do PAS em análogo do folato
folC não conversão do PAS em análogo do folato/di- Minato et al., 2015117
hidrofolato sintase
Cicloserina Ald aumento da disponibilidade do substrato da Desjardins et al., 2016118
racemase/L-alanina-desidrogenase
alr alteração do alvo/L-alanina-racemase Desjardins et al., 2016118
promotor de alr hiperexpressão do alvo/promotor de L-alanina- Desjardins et al., 2016118
racemase
Bedaquilina atpE subunidade C da ATP-sintase/mutação do alvo Petrella et al., 2006119
promotor de superexpressão da bomba/bomba de efluxo Mmpl5 Hartkoorn et al., 2014120
mmpr
Linezolida rplC alteração do alvo/proteína ribossômica L3 Zhang et al., 2016121
Rrl alteração do alvo/proteína ribossômica L4 Zhang et al., 2016121
Delamanida/Pretomanida Ddn não conversão em composto com atividade Haver et al., 2015122
antimicrobiana/nitrorredutase-deazaflavina
dependente
fgd1 não conversão em composto com atividade Manjunatha et al., 200685
antimicrobiana/glicose-6-fosfato-desidrogenase
fbiA/B/C não conversão em composto com atividade Haver et al., 2015122
antimicrobiana/deazarriboflavina sintase
Clofazimina promotor de hiperexpressão da bomba/bomba de efluxo Mmpl5 Hartkoorn et al., 2014120
mmpR
76

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86
Capítulo 4:
Teste de sensibilidade aos antimicrobianos (TSA)
Doroti de Oliveira Garcia
Nos últimos anos, a ocorrência e disseminação de microrganismos multirresistentes

aumentou drasticamente no mundo todo, o que tem levado a comunidade médica e
os órgãos governamentais a adotarem medidas mais eficazes no controle e preven-
ção desses microrganismos.
O primeiro passo para a detecção dessa multirresistência é a realização criteriosa de

testes de sensibilidade aos antimicrobianos (TSA), os quais são utilizados para deter-
minar a sensibilidade total, a sensibilidade diminuída (necessitando o aumento da
exposição ao fármaco) ou resistência de microrganismos frente a antimicrobianos in
vitro. O TSA é de suma importância, pois gera dados que auxiliam a equipe que presta
assistência ao paciente no direcionamento da terapia antimicrobiana, e, em alguns
casos, podem dar indícios dos possíveis mecanismos de resistência envolvidos. Por
meio da realização do TSA são fornecidos dados para que se possa estabelecer o per-
fil microbiológico/epidemiológico da instituição, o que auxilia na prescrição empírica
de antimicrobianos.
O TSA deve ser realizado de acordo com as recomendações de comitês internacio-

nais especializados, tais como o Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) ou
o European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST)1,2. No Brasil, de
acordo com a Portaria no 64, de 11 de dezembro de 2018, do Ministério da Saúde,
devem ser seguidas as orientações contidas no Brazilian Committee on Antimicrobial
Susceptibility Testing (BrCAST), o qual é uma versão brasileira do documento do
EUCAST3,4. Todos os documentos do BrCAST podem ser acessados livremente do site
www.brcast.org.br.
O TSA pode ser desenvolvido através de métodos qualitativos ou quantitativos. Os

métodos qualitativos indicam apenas se o microrganismo é sensível, intermediário
87
(necessitando exposição aumentada ao fármaco) ou resistente a determinado agen-

te antimicrobiano. Por sua vez, os métodos quantitativos, além de gerarem essa mes-
ma informação qualitativa, também determinam a concentração inibitória mínima
(CIM), que é a menor concentração (em mg/mL) do agente antimicrobiano capaz de
inibir o crescimento bacteriano visível in vitro.
A CIM pode ser determinada basicamente por três metodologias diferentes, a saber:
diluição em ágar, diluição em caldo ou utilizando fitas de gradiente de concentração
do antimicrobiano. Para saber qual metodologia é a mais adequada é preciso fazer
uma correta identificação do microrganismo a ser testado, pois a metodologia prefe-
rencial pode variar dependendo do microrganismo e do antimicrobiano. Cabe men-
cionar que existem no mercado diversos meios de cultura e insumos prontos para
uso, os quais devem ser utilizados de acordo com as recomendações do fabricante.
Em relação à seleção dos antimicrobianos a serem testados, sugere-se discutir com

membros da Comissão de Controle de Infecção Hospitalar (CCIH) de cada instituição
para estabelecer qual o painel mais adequado a ser utilizado, evitando, assim, testar
antimicrobianos que não são utilizados na terapêutica clínica daquele local específi-
co. Atenção especial deve ser dada ao sítio de isolamento, pois alguns antimicrobia-
nos só devem ser testados para sítios anatômicos específicos.
4.1 Método qualitativo: disco-difusão
É o método mais difundido e utilizado em rotina laboratorial. Foi primeiramente des-

crito por Bauer & Kirby (1966)5, e o que será detalhado a seguir é baseado no docu-
mento do EUCAST/BrCAST3.
O método de disco-difusão, ou Kirby-Bauer, utiliza discos de papel de filtro impreg-

nados com antimicrobianos. Tais discos são colocados em placas de meio de cultura
sólido previamente semeadas com um inóculo padrão da bactéria a ser testada. O
antimicrobiano se difunde no meio de cultura a partir do disco de forma radial e, de-
pendendo de sua atividade frente à bactéria avaliada, ocorre a formação, ou não, de
um halo de inibição ao redor do disco, que é mensurado em milímetros.
A interpretação do diâmetro do halo de inibição é feita conforme os pontos de corte

estabelecidos pelos comitês de padronização do TSA, sendo que a bactéria pode ser
categorizada como sensível ou resistente ao antimicrobiano. Cabe mencionar que
os pontos de corte variam conforme diferentes bactérias e antimicrobianos, sendo
que, no BrCAST, existem diversas tabelas de interpretação para os principais gru-
pos de bactérias de importância clínica (Ordem Enterobacterales6, Pseudomonas spp,
Acinetobacter spp., Staphylococcus spp., Enterococcus spp., dentre outros). O meio de
88
cultura base mais utilizado no TSA por disco-difusão é o ágar Mueller-Hinton (MH)
sem aditivos para microrganismos não fastidiosos, ou com suplementos nutricionais
para bactérias fastidiosas (nutricionalmente exigentes). O ágar MH-F (MH acrescido
de 5% de sangue lisado de cavalo e 1 mL de solução de β-NAD a 20 mg/L) é o meio
de cultura preconizado pelo EUCAST/BrCAST para bactérias fastidiosas. Para placas
preparadas in house, deve-se atentar para a espessura do meio de cultura, que pode
afetar os resultados do teste. A espessura deve ser de 4 ± 0,5 mm (aproximadamente
25 mL em placas de 90 mm e 70 mL em placas de 150 mm de diâmetro). Detalhes da
preparação desse e outros meios estão descritos no Apêndice ao final desse capítulo.
4.1.1 Etapas do Ensaio

A seguir serão descritas as etapas necessárias para a correta realização do
teste de disco-difusão. Um vídeo educativo sobre as distintas etapas do en-
saio de disco-difusão de acordo com a recomendações do EUCAST/BrCAST
estão disponíveis online na plataforma YouTube (https://www.youtube.
com/watch?v=iiqQcCQDvu8&list=PLQU_kWRWBld694u9cLr4asinonWSzr-
9Rf ). Inicialmente, deve-se ter o cuidado de retirar do freezer ou geladeira
os discos de antimicrobianos que serão testados com 1h de antecedência.
Isso porque eles devem ser utilizados em temperatura ambiente, evitando
a condensação que pode levar a uma rápida deterioração de alguns antimi-
crobianos, como os carbapenêmicos, por exemplo. O armazenamento dos
discos deve ser feito de acordo com as instruções do fabricante.
Para o preparo do inóculo bacteriano, deve-se selecionar 4 a 6 colônias mor-

fologicamente semelhantes de um cultivo recente (24h) e suspendê-las com
alça bacteriológica esterilizada em 2 a 3 mL de solução salina esterilizada a
0,85%. Com isso, deve-se obter uma suspensão com turvação corresponden-
te à escala 0,5 de McFarland. A turbidez é ajustada com auxílio de um den-
sitômetro, turbidímetro, espectrofotômetro (absorbância de 625 nm, faixa
de 0,08 a 0,13) ou visualmente, comparando com o tubo correspondente
à escala 0,5 de McFarland (os quais podem ser confeccionados in house ou
adquiridos comercialmente). Essa turvação corresponde a aproximadamen-
te 1,5 x 108 UFC de Escherichia coli por mililitro). Para facilitar a comparação
visual, recomenda-se a utilização de um fundo branco com linhas pretas.
Algumas exceções a essa preparação de inóculo existem. Para Streptococcus

pneumoniae, se a suspensão for preparada a partir de cultura em ágar cho-
colate, a turbidez do inóculo deve ser equivalente ao padrão 1,0 da escala de
McFarland.
Para todos os microrganismos a suspensão deve ser utilizada preferencial-

mente em até 15 minutos e obrigatoriamente em até 60 minutos após o
89
preparo, garantindo, dessa forma, que a quantidade de bactérias inoculada

esteja dentro do padrão estabelecido. Deve-se seguir a regra dos 15-15-15
minutos: usar a suspensão do inóculo dentro de 15 minutos do preparo, apli-
car os discos dentro de 15 minutos da semeadura e incubar as placas dentro
de 15 minutos da aplicação dos discos.
Para inoculação, umedecer o swab de algodão estéril na suspensão bacteria-

na, girar e pressionar o swab na parede interna do tubo para retirar o exces-
so de líquido antes de efetuar a semeadura nas placas. Entretanto, se a sus-
pensão bacteriana for de bactérias Gram-positivas, não se deve pressionar o
swab na parede interna do tubo. Semear a suspensão na superfície de placas
de ágar Mueller-Hinton, as quais devem estar em temperatura ambiente e
sem umidade excessiva. Caso haja excesso de umidade, recomenda-se colo-
car as placas em estufa com a tampa invertida e parcialmente aberta para a
secagem da superfície do meio antes do uso.
A semeadura deve ser realizada em 3 direções, girando a placa em torno de

60°, ou por meio de inoculador automático, de maneira que, ao final desta
etapa, toda a superfície do ágar esteja coberta uniformemente pela suspen-
são bacteriana, o que garantirá um crescimento confluente. Quando for ne-
cessário utilizar mais de uma placa, deve-se introduzir novamente o swab no
tubo contendo a suspensão e repetir os procedimentos anteriores.
A placa deve ser mantida para secar por 10-15 minutos, em temperatura am-
biente. Todo o excesso de inóculo deve ter sido absorvido, antes da aplicação
dos discos contendo os antimicrobianos. Com o auxílio de uma pinça previa-
mente esterilizada ou dispensador de discos, os discos são, então, aplicados
na superfície da placa. Conforme mencionado anteriormente, a escolha dos
antimicrobianos a serem testados deve ser direcionada pelas tabelas do Br-
CAST e definida pela equipe de profissionais de cada instituição, dependen-
do dos antimicrobianos mais frequentemente utilizados.
É importante observar que os discos devem ficar firmemente aderidos à

superfície do ágar. Portanto, deve-se utilizar uma pinça metálica para pres-
sioná-los levemente em direção ao ágar. Uma vez aplicados, não devem ser
removidos, pois a difusão radial dos antimicrobianos no ágar é instantânea.
A quantidade de discos por placa pode variar dependendo do microrganis-
mo e dos antimicrobianos utilizados. Em geral, utilizam-se 12 discos em uma
placa de 150 mm de diâmetro e 5 discos em placa de 90 mm de diâmetro.
Isso evita que haja sobreposição de halos, o que dificultaria a medida do
diâmetro destes.
90
Após dispensar os discos na superfície do ágar Mueller-Hinton, deve-se in-

verter as placas e incubar a 35 ± 1°C em até 15 minutos. As condições de
incubação, em relação à atmosfera de CO2 e tempo devem seguir as orienta-
ções que constam nas tabelas do EUCAST/BrCAST para cada microrganismo.
Após a incubação, e antes de proceder a leitura, deve-se verificar se o cres-

cimento bacteriano na superfície do ágar está confluente e uniformemente
distribuído. Se for observado crescimento muito espesso ou muito escasso,
o teste deve ser repetido. A leitura das placas de ágar Mueller-Hinton não
suplementadas deve ser feita pelo fundo, com luz refletida contra um fundo
escuro. Placas de ágar Mueller-Hinton suplementadas devem ter as tampas
removidas e a superfície contendo os discos observada sob luz refletida. Não
se deve utilizar luz transmitida (placas observadas contra a luz) ou lupa, ex-
ceto quando indicado. A leitura do diâmetro dos halos de inibição deve ser
feita com uma régua calibrada ou paquímetro, em milímetros (Figura 1). Se a
leitura for realizada com um leitor automático, calibrar com a leitura manual.
Para todos os antimicrobianos, exceto quando indicado, as bordas dos halos

devem ser lidas do ponto de completa inibição do crescimento, visto a olho
nu, com a placa posicionada a cerca de 30 cm dos olhos. A interpretação
dos resultados deve ser feita de acordo com as tabelas de ponto de corte do
EUCAST/BrCAST.
A B
Figura 1. A- Leitura do halo de inibição no teste de disco-difusão; B- placa de teste de

disco-difusão
91
4.1.2 Instruções específicas para a leitura do teste de disco-difusão

A medida dos halos de inibição é uma etapa crítica para garantir a acurácia
dos resultados e existem várias situações laboratoriais que podem interferir
nessa leitura. Em alguns casos, por exemplo, pode haver a ocorrência de halo
duplo ou presença de poucas colônias isoladas dentro do halo de inibição.
Nesse caso, é preciso verificar a pureza do isolado bacteriano e, se necessá-
rio, deve-se repetir o teste.
Ao testar sulfametoxazol-trimetoprima, pode haver a presença de cresci-

mento reduzido dentro do halo de inibição. Esse fato é devido à presença
de altas concentrações de antagonistas (substâncias que inibem a ação do
antimicrobiano) no meio, como timina e timidina, e deve ser ignorado. A lei-
tura do diâmetro do halo deve ser feita a partir da borda mais nítida (Figura
2). Já, para ampicilina, ampicilina-sulbactam e amoxacilina-ácido clavulânico
testados contra isolados da ordem Enterobacterales deve-se ignorar o cresci-
mento de fina película dentro do halo, que ocorre eventualmente em alguns
lotes de ágar Mueller-Hinton.
a-c) Um halo externo pode ser visualizado. Reportar como sensível se o diâmetro do halo for ≥ 16 mm lido a partir da marca branca na figura; d)
crescimento até a borda do disco E sem sinal de halo de inibição externo. Reportar como resistente. Fonte: EUCAST/BrCAST3.
Figura 2. Exemplos de halos de inibição de Stenotrophomonas
maltophilia com sulfametoxazol-trimetoprima.
O gênero Proteus é reconhecido pela formação de véu (swarming) ao cres-

cer em meios de cultura. Tal véu é observado dentro dos halos de inibição
quando se realiza o teste de disco-difusão. Nessas situações, deve-se igno-
rar o véu e realizar a leitura na borda onde ocorrer inibição mais nítida do
crescimento bacteriano. Da mesma forma, a zona de hemólise formada por
estreptococos hemolíticos deve ser ignorada, considerando-se o halo de ini-
bição de crescimento e não da hemólise. Em geral, bactérias que produzem
β-hemólise não apresentam crescimento dentro do halo, enquanto a a-he-
mólise coincide com o crescimento.
As características das bordas do halo são importantes e devem ser avaliadas

com atenção. Por exemplo, na avaliação da sensibilidade de Staphylococcus
aureus à benzilpenicilina, é preciso examinar a borda do halo com a placa
voltada contra a luz (luz transmitida). Isolados com valores de diâmetro do
92
halo de inibição maiores ou igual aos pontos de corte de sensibilidade, mas

com bordas bem definidas, devem ser relatados como resistentes à benzil-
penicilina (Figura 3).
a) borda esfumaçada e diâmetro ≥ 26 mm. Reportar sensível; b) borda bem

definida e diâmetro ≥ 26 mm. Reportar resistente. Fonte: EUCAST/BrCAST3
Figura 3: Exemplos de zonas de inibição para S. aureus com benzilpenicilina.
Conforme mencionado anteriormente, as medidas dos halos de inibição devem ser

realizadas sob luz refletida. Quando utilizada a cefoxitina para detectar resistência à
oxacilina (meticilina) em S. aureus, é preciso aferir o halo em evidência e visualizar se
há presença de colônias dentro do halo, que podem ocorrer devido à cultura mista
ou expressão de resistência heterogênea à oxacilina (meticilina). Por sua vez, para a
leitura do halo de fosfomicina para Escherichia coli, deve-se desconsiderar possíveis
colônias internas e realizar a leitura na borda externa do halo.
4.2 Métodos quantitativos
Conforme mencionado anteriormente, os métodos quantitativos englobam diluição

em caldo, fitas de gradiente de concentração e diluição em ágar. A diluição em caldo
pode ser no formato de microdiluição em placa ou macrodiluição em tubos, sendo
que a diferença entre elas está exclusivamente no volume final da metodologia, 100
mL e 1-2 mL, respectivamente. Por questões de praticidade e economia, os laborató-
rios geralmente realizam microdiluição em caldo.
4.2.1 Microdiluição em caldo

Por meio da exposição da bactéria a concentrações seriadas de antimicro-
bianos é possível determinar a CIM. Com o valor da CIM também é possível
categorizar a bactéria em sensível ou resistente a um determinado antimi-
crobiano, baseado em tabelas de pontos de corte para cada microrganismo
e antimicrobiano, disponibilizadas pelo EUCAST/ BrCAST3.
A microdiluição em caldo é a metodologia indicada pelo EUCAST/BrCAST

para determinar a CIM da maioria dos antimicrobianos listados nas tabelas
de ponto de corte, com algumas exceções como, por exemplo, a sensibili-
93
dade à fosfomicina para membros da ordem Enterobacterales, Pseudomonas

spp. e S. aureus, a qual deve ser avaliada por ágar diluição. A desvantagem
dessa metodologia é a complexidade técnica e a exigência de antimicrobia-
nos em pó, os quais têm, em geral, custo elevado.
Ö Etapas do Ensaio
A microdiluição em caldo utiliza o caldo Mueller-Hinton cátion ajustado

(CMHCA) para bactérias não fastidiosas e o caldo MH cátion ajustado “F” (MH-
F) – com suplemento – conforme mencionado anteriormente, para bactérias
fastidiosas. Para a realização dessa metodologia são utilizadas microplacas
de poliestireno com fundo em “U” (96 poços). Cada poço deverá conter o
meio de cultura, a suspensão bacteriana e o antimicrobiano (em concentra-
ções seriadas na placa).
Para tanto, deve-se dispensar o CMHCA (ou o MH-F), comercial ou preparado

in house, em uma canaleta esterilizada ou placa de Petri descartável esterili-
zada, aproximadamente 5,0 mL de caldo para cada placa com 96 orifícios a
ser testada. A seguir, com uma micropipeta multicanal, dispensar 50 μL de
caldo em cada cavidade da microplaca, exceto nas cavidades da coluna 12,
nas quais deverão ser dispensados 100 μl de caldo com a concentração de
antimicrobiano 2x maior que a máxima (Figura 4). A microplaca não deve ser
submetida a quaisquer tratamentos, nem conter aditivos como polissorbato
80 ou outro surfactante. Para maiores detalhes sobre cálculo de concentra-
ção de antibióticos, consultar o Apêndice que acompanha esse capítulo.
A B
A – Aspiração do caldo da canaleta pelo uso de micropipeta multicanal – 50 µL nas colunas 1 a 11. B – Transferência do caldo para a microplaca.
Figura 4. Transferência do caldo MH cátion ajustado para a microplaca de 96 orifícios.
94
Em seguida, deve-se preparar, em um tubo estéril, uma solução do antimi-

crobiano em CMHCA, com o dobro da maior diluição a ser testada, e distri-
buir 100 μL em cada orifício da coluna 12. Cabe mencionar que o volume
de antimicrobiano a ser testado não pode exceder 5% do volume total do
orifício. Portanto, para testar concentrações muito altas, é necessário fazer
soluções-mãe mais concentradas.
Partindo da coluna 12 até a coluna 3, deve-se proceder às diluições seriadas.

Para isso, deve-se homogeneizar a solução de antimicrobiano com micropi-
peta multicanal e retirar uma alíquota de 50 μL, a qual será dispensada na
cavidade adjacente. Homogeneizar, repetindo o mesmo procedimento até
chegar à coluna 3. A coluna 1 deverá conter apenas o caldo, pois será o con-
trole de esterilidade (CE). A coluna 2 conterá apenas a suspensão bacteriana
adicionada ao caldo, pois será o controle do crescimento bacteriano (CC).
Após a pipetagem, colocar a tampa na microplaca e identificá-la (nome do

antimicrobiano, a data de preparo, etc.). Se não for utilizada imediatamente,
deve-se envolver a microplaca com tampa em saco plástico vedando-o com
fita adesiva e armazenar em freezer (- 20°C ou – 70°C) até o momento do uso.
Alguns antimicrobianos, como os carbapenêmicos e associações de β-lactâ-
micos com inibidores de β-lactamases, se degradam mais facilmente e, para
esses antimicrobianos, deve-se preparar as microplacas imediatamente an-
tes do uso, ou armazenar por curto período (no mesmo dia da realização do
teste) em freezer -70°C.
Para proceder ao teste, retirar as placas contendo as diluições seriadas do

antimicrobiano da geladeira e deixar em temperatura ambiente por apro-
ximadamente1h. Enquanto isso, preparar, em solução salina a 0,85% esteri-
lizada, as suspensões bacterianas a serem testadas bem como as cepas-pa-
drão ATCC (“American Type Culture Collection”) de crescimento recente para
controle de qualidade da técnica. Deve-se consultar as tabelas de ponto de
corte do EUCAST/BrCAST para selecionar a cepa-padrão indicada para o mi-
crorganismo que será testado.
A turvação da suspensão bacteriana deve corresponder à do tubo 0,5 da es-

cala McFarland (aproximadamente 1,5 x 108 UFC/mL) e deve ser preparada
conforme descrito para o teste de disco-difusão. Após ajustada a turvação, a
suspensão deverá ser diluída (1:100) adicionando em uma canaleta ou pla-
ca estéril, 2970 μL de CMHCA e 30 μL da suspensão bacteriana, obtendo-se
uma solução com concentração aproximada de 106 UFC/mL.
95
Em seguida, dispensar 50 μL da suspensão diluída, com uma pipeta multica-

nal, em cada linha, da coluna 2 (sem antimicrobiano) até a coluna 12. Sempre
dispensar a cepa padrão ATCC na primeira linha (A), para validação do teste,
e as cepas a serem testadas nas demais linhas. Ao final dessa etapa, as con-
centrações iniciais de antimicrobianos terão sido diluídas 1:2, o que fará com
que se alcance as concentrações finais desejadas. A concentração final de
bactérias será de 5 x 105 UFC/mL.
Colocar a tampa na microplaca e incubar a 35ºC ± 1ºC pelo tempo e atmosfe-

ra de adequados a cada microrganismo, de acordo com as tabelas de ponto
de corte do EUCAST/BrCAST. Para manter a mesma temperatura de incuba-
ção para todas as cepas, não empilhar mais do que quatro placas. Para evitar
evaporação excessiva do caldo deve-se colocar a microplaca dentro de reci-
piente com tampa e colocar algodão ou papel toalha levemente umedecido
para se manter a umidade dentro do recipiente.
Ö Leitura e interpretação dos resultados:
O teste de microdiluição será considerado válido quando não houver cres-

cimento na coluna 1 da microplaca, referente ao controle de esterilidade e
quando houver crescimento na coluna 2 da microplaca, referente ao contro-
le de crescimento. Além disso, as cepas-controle de qualidade devem apre-
sentar resultados dentro do intervalo de valores estabelecido pelo EUCAST/
BrCAST conforme exemplo abaixo. Caso os resultados não cumpram TODOS
os requisitos acima descritos, o teste deve ser desconsiderado e repetido, e,
se necessário, recorrer à análise de possíveis erros.
Quadro 1: Exemplo de pontos de corte de colistina referentes ao controle de qualidade

da microdiluição em caldo frente às cepas padrão E. coli ATCC 25922 e P. aeruginosa ATCC
27853 (EUCAST/BrCAST, 2019).
Antimicrobiano Microrganismo Resultado Aceitável (µg/mL)
Colistina Escherichia coli 0,25 – 2,0
ATCC 25922
Pseudomonas aeruginosa 0,5 – 4,0
ATCC 27853
Na microdiluição, algumas situações são importantes de serem observadas cuidadosamente, tais como as descritas abaixo:
Ö Leitura da CIM para Neisseria spp.: corresponde ao orifício onde não for ob-
servada a formação do botão de crescimento no fundo do orifício;
Ö Leitura da CIM para S. pneumoniae: corresponde ao orifício onde não for

observada a formação do botão de crescimento associado à não produção
de hemólise;
96
Ö Skipped wells (orifícios alternados): há o crescimento bacteriano nos orifí-

cios correspondentes a concentrações de antimicrobiano inferiores à CIM;
porém, em algumas situações, como a presença de bactérias heterorresis-
tentes, ocorre o crescimento da bactéria em orifícios alternados que contêm
concentrações de antimicrobianos superiores à CIM (Figura 5). Ocorre, prin-
cipalmente, quando testadas as polimixinas ou, como comentado, quando
há a presença de heterorresistência. Se ocorrer apenas um orifício saltado,
relatar a CIM mais alta. Se ocorrer mais de um orifício saltado, não relatar e
repetir o teste.
CE CC 0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64
Skipped wells= crescimento em

CIM= 0,5 µg/mL
orifícios alternados/pulados
Figura 5: Representação esquemática de uma microdiluição em caldo apresentando

skipped wells
Para sulfametoxazol/trimetoprima, ler a CIM na menor concentração capaz de inibir

aproximadamente 80% do crescimento quando comparado ao orifício de controle
de crescimento.
4.2.2 Fitas de gradiente de concentração de antimicrobianos

As fitas de gradiente de concentração representam a forma mais prática de se
determinar a CIM em um laboratório de microbiologia clínica, muito embora
não possam ser utilizadas para todos os antimicrobianos e tenham custo ele-
vado. Elas correspondem a fitas de material plástico ou papel impregnados
com um gradiente de concentração de um determinado antimicrobiano.
Tais fitas são aplicadas na superfície dos meios de cultura da mesma forma
como é feito com os discos no teste de disco-difusão. Assim, deve-se seguir
o que foi descrito acima para o teste de disco-difusão, no que diz respeito ao
preparo das suspensões bacterianas e semeadura desse inóculo nas placas
de ágar Mueller-Hinton ou MH-F.
Então, com o auxílio de uma pinça esterilizada, aplicar as fitas contendo os

antimicrobianos na superfície da placa de ágar previamente semeada com
a bactéria em teste. Deve-se atentar para o lado correto de aplicação da fita
na superfície do ágar, sempre com o lado da gravação dos símbolos e escalas
para cima, pois o antimicrobiano se encontra no verso das gravações na fita,
parte que deve ficar em contato com a superfície do ágar. Em placa de 150 x
97
15 mm, até seis fitas poderão ser aplicadas, mantendo a concentração mais
alta na proximidade da borda da placa; quando utilizar fitas contendo ape-
nas um antimicrobiano na extremidade e quando a fita contiver associação
de antimicrobianos como um β-lactâmico com um inibidor de β-lactamase
(ácido clavulânico ou EDTA), aplicar a fita contendo o antimicrobiano asso-
ciado voltada para a borda da placa. Em placa de 90 x 15 mm, até duas fitas
poderão ser aplicadas, sendo que devem ser dispostas em posição inversa.
Incubar a 35ºC ± 1ºC, pelo tempo e atmosfera determinado para cada mi-
crorganismo, segundo o EUCAST/BrCAST e, em seguida, proceder à leitura e
ao registro do valor da CIM. A zona de inibição de crescimento formará uma
elipse, sendo que a CIM será o ponto em que o crescimento bacteriano inter-
ceptará com a fita contendo o antimicrobiano (Figura 6). Se houver diferença
de uma diluição de um lado para outro da fita, considerar a concentração
mais alta; se a diferença for igual ou maior que duas diluições, o teste deve
ser repetido.
Camada de
crescimento
bacteriano
ME Fita de
gradiente
256
192
128
96 Elipse de
64
48 inibição
32
24
16
12
8
6
4
3
2
1.5
1.0
.75
.50
.38
.25 CONCENTRAÇÃO
.19
.125 INIBITÓRIA
.094
.064
.047
.032
.023
.016
Figura 6. Fita de gradiente de concentração utilizada para a determinação de CIM.
98
Ö Leitura do teste
Para a leitura do teste, alguns detalhes devem ser observados, tais como os
descritos abaixo:
• Ignorar hemólise quando testado com Streptococcus spp. Ler no limite do

crescimento.
• Ignorar o véu de Proteus spp. Ler no limite do crescimento.
• S. maltophilia: ignorar a “neblina” na elipse frente ao sulfametoxazol/
trimetoprima.
• Pneumococo frente a β-lactâmicos: ler no limite do crescimento. Conside-
rar se houver presença de colônias no interior da elipse.
• Carbapenêmicos e outros antimicrobianos bactericidas: considerar todas
as colônias. Ler no limite do crescimento.
• Tigeciclina: ler em 80% de inibição.
• Linezolida: ler em 90% de inibição.
• Glicopeptídeos: elipse estreita, ler no final da elipse.
• Elipse assimétrica: ler no maior valor, se a diferença for > 1 diluição, repetir
o teste.
4.2.3 Ágar diluição

Essa é uma metodologia relativamente trabalhosa e não utilizada rotinei-
ramente pelos laboratórios de microbiologia clínica. No entanto, conforme
comentado anteriormente, é o método recomendado pelo EUCAST/BrCAST
para a determinação da resistência à fosfomicina em Enterobacterales, Pseu-
domonas spp. e S. aureus. Na metodologia de ágar diluição, o antimicrobia-
no é incorporado ao ágar Mueller-Hinton; portanto, devem ser preparadas
várias placas contendo diferentes concentrações do antimicrobiano em
cada uma delas. A seguir, o inóculo é aplicado na superfície do ágar por um
aplicador de Steers, capaz de transferir de 24 a 96 inóculos em cada placa,
dependendo do modelo utilizado. Na base do aplicador, são adicionadas
as suspensões bacterianas (uma por orifício) com auxílio de micropipetas.
Após, utilizando-se a parte superior do aplicador, é feita a transferência da
suspensão para a superfície do ágar, conforme demonstrado nas figuras 7,
8 e 9 a seguir. O inóculo pode também ser aplicado na superfície do ágar
utilizando-se micropipetas. As soluções-estoque de antimicrobianos devem
ser preparadas de acordo com o descrito para microdiluição em caldo. Re-
comenda-se utilizar concentrações coerentes com o intervalo de leitura de
cada antimicrobiano, de acordo com as tabelas de pontos de corte do EU-
CAST/BrCAST3.
99
Com o intuito de se evitar a perda da potência dos antimicrobianos, as placas

devem ser preparadas no dia imediatamente anterior ou, no máximo, dois
dias antes de seu uso. Para placas contendo antimicrobianos mais sensíveis
à degradação, como os carbapenêmicos, é recomendado o preparo no dia
de seu uso.
O preparo do ágar Mueller-Hinton deve ser feito de acordo com orientação

do fabricante e antes que o mesmo solidifique, alíquotas de 50-60 mL ou
120-140 mL devem ser colocadas em frascos de vidro estéreis os quais são
mantidos em banho-maria até que o meio de cultura atinja uma tempera-
tura entre 45–50ºC, temperatura ideal para a adição do antimicrobiano. Em
seguida, alíquotas das soluções-estoque dos antimicrobianos são adiciona-
das a cada frasco, sendo que o conteúdo deve ser bem homogeneizado e
volumes iguais a 25-30 mL ou 60-70 mL devem ser vertidos em placas de
Petri descartáveis de 90 mm e 150 mm de diâmetro, respectivamente, pre-
viamente identificadas com a concentração do antimicrobiano. A espessura
do meio de cultura, obtida após solidificação, deve ser de 4 ± 0,5 mm, o que
corresponde, justamente, ao volume adicionado ao de meio de cultura por
placa.
As placas devem ser mantidas sobre uma superfície plana até a completa
solidificação do meio, sendo posteriormente acondicionadas em sacos plás-
ticos, seladas e armazenadas a 4ºC até o momento do uso.
As placas contendo os antimicrobianos devem ser retiradas da refrigeração

e mantidas em temperatura ambiente em torno de 15 min. Após o equilí-
brio térmico, colocar por alguns instantes em estufa a 35±1ºC a fim de que
qualquer umidade visível evapore da superfície do ágar. As placas devem ser
marcadas em sua lateral com um traço marcante, a fim de orientar a aplica-
ção dos inóculos bacterianos (Figura 7).
Preparar a suspensão bacteriana a partir de colônias isoladas em solução sa-

lina a 0,85% até atingir a escala 0,5 de McFarland (como para disco-difusão).
A partir dessa suspensão bacteriana, deve-se fazer uma diluição 1:10 e adi-
cionar alíquotas de 50 µL nas cavidades do aplicador de Steers.
IMPORTANTE: Sempre utilizar um molde em papel correspondente à placa

a ser inoculada com o aplicador de Steers, anotando a numeração dos isola-
dos testados. SEMPRE fazer uma marca na base da placa, indicando o início
dos inóculos (Figura 7).
100
1 2 3 4
5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15 16
17 18 19 20 21 22
23 24 25 26 27 28
29 30 31 32
Figura 7. Molde para placas de ágar diluição
A seguir, deve-se introduzir o aplicador de Steers nos orifícios e “carimbar” as

placas devidamente identificadas e com a superfície seca (Figura 8).
Figura 8. Ágar diluição: Transferência das suspensões bacterianas das cavidades do

aplicador de Steers para a placa de ágar MH.
O teste deve ser feito sempre em duplicata. Primeiramente, inocular uma

placa sem o agente antimicrobiano para verificar a viabilidade do micror-
ganismo. A seguir, começando-se pela concentração mais baixa, inocular as
placas contendo as diferentes concentrações de antimicrobiano. Após a ino-
culação da placa com a maior concentração, uma segunda placa de controle
101
do crescimento deve ser inoculada para verificar possível contaminação ou

transferência significativa de antimicrobiano.
Após a inoculação, as placas devem permanecer em temperatura ambiente

até que a umidade nos pontos de inóculo seja absorvida pelo ágar. A seguir,
as placas devem ser invertidas e incubadas, a 35±1ºC, e atmosfera e tempo
de incubação adequados a cada microrganismo, de acordo com as orienta-
ções das tabelas de ponto de corte do EUCAST/ BrCAST.
Decorrido o período de incubação, as placas devem ser colocadas sobre uma

superfície escura, não refletiva, para a determinação das CIMs. A CIM é defini-
da como sendo a menor concentração do agente antimicrobiano que inibe
completamente o crescimento, descartando-se qualquer colônia única ou
turvação leve na superfície do meio causada pelo inóculo (Figura 9). Deve-se
lembrar de checar primeiro a viabilidade e pureza das cepas na placa sem
antimicrobiano, e se as cepas padrão encontram-se dentro dos limites acei-
táveis, de acordo com o EUCAST/BrCAST.
Sem antimicrobiano 8 µg/mL de Meropenem

Spot de crescimento em 1 (marca inicial assinalada) = S. maltophilia ATCC 13637; 2 = S. maltophilia ATCC SMDP92; 3 = P. aeruginosa ATCC 27853; 4 =
Escherichia coli ATCC 25922; 5 a 13 – cepas do Complexo Burkholderia cepacia. Figura apenas ilustrativa de uma placa sem antimicrobiano e uma placa
com antimicrobiano (8 µg/mL de meropenem).
Figura 9. Ágar diluição.
4.3 Critérios de interpretação de resultados do TSA
Algumas mudanças ocorreram recentemente na definição das categorias sensível,

intermediário e resistente, de acordo com as novas orientações do EUCAST/BrCAST.
Assim, seguindo esses comitês, as definições vigentes são as seguintes:
102
• S – Sensível: um microrganismo é considerado “sensível quando existe uma alta

probabilidade de sucesso terapêutico usando um regime de dosagem padrão do
agente.
• I – Sensível, exposição aumentada: um microrganismo é considerado “sensível, ex-
posição aumentada” quando existe uma alta probabilidade de sucesso terapêuti-
co pela exposição aumentada ao agente antimicrobiano, ajustando o regime de
dosagem ou por sua concentração no local da infecção.
• R – Resistente: um microorganismo é considerado “resistente” quando há uma alta
probabilidade de falha terapêutica, mesmo quando há aumento da exposição ao
antimicrobiano.
Apesar de o termo tradicionalmente descrito como ”Intermediário” apresentar uma

nova interpretação (”Sensível, exposição aumentada”), a abreviatura nos relatos do
TSA continua como ”I” sendo que a diferença entre ”S” e ”I” é a quantidade de anti-
microbiano necessária no local da infecção para que seja alcançada uma resposta
clínica adequada.
4.3.1 Área de Incerteza Técnica (AIT)

A AIT é outro termo de interpretação recentemente proposto pelo EUCAST
para algumas situações nas quais o resultado do TSA (CIM ou diâmetro de
halo) não apresenta uma garantia de reprodutibilidade ou de interpretação
clínica.
A AIT está definida apenas para algumas combinações antimicrobiano/bac-

téria e não deve ser relatada ao clínico, exceto em circunstâncias especiais
e apenas como parte de uma discussão sobre alternativas terapêuticas em
casos difíceis. A seguir, algumas alternativas que podem ser adotadas pelo
laboratório quando as leituras de halos de inibição ou CIM coincidirem com
as AITs:
• Repetir o teste – apenas quando existe razão para suspeitar de erro

técnico.
• Realizar um teste alternativo (CIM, teste para determinar mecanismo
de resistência) – relevante quando o teste alternativo é conclusivo (PCR
para detectar gene vanA ou vanB em enterococos, β-lactamase em H.
influenzae).
• Relatar resultados na faixa AIT como “incerto” – deixar a interpretação em
branco e colocar um comentário no laudo, como, por exemplo: “Para essa
combinação de antimicrobiano-bactéria, o resultado do TSA não permite
descartar incertezas técnicas”.
• Relatar os resultados como “R”. Se houver boas alternativas no resultado
do TSA, essa pode ser a opção mais fácil e segura.
103
4.4 Precauções e cuidados especiais na realização do TSA
Todos os testes de sensibilidade aos antimicrobianos devem ser submetidos rotinei-

ramente a um controle de qualidade de rotina e um controle de qualidade interno
para determinação da CIM e dos halos de inibição (disco-difusão). As cepas ATCC a
serem utilizadas estão descritas nos documentos de controle de qualidade disponí-
veis nos sites do EUCAST/BrCAST.
Existem diversas variáveis que podem afetar o resultado de um teste de sensibilidade

e que devem, portanto, ser rigorosamente controladas pelo laboratório. A seguir, são
descritas as principais:
• Espessura do ágar Mueller-Hinton: a placa de 90 mm deve ter uma espessura de

4 ± 0,5 mm. Espessuras menores ou maiores podem levar a falsos resultados de
sensibilidade ou resistência, respectivamente.
• Qualidade do meio de cultura utilizado: meios contendo altas concentrações de
timina e timidina podem alterar os resultados do teste para sulfametoxazol/trime-
toprima. Utilizar sempre meio Mueller-Hinton de boa procedência.
• Concentrações alteradas de Ca++ e Mg++ no meio de cultura: podem afetar os resul-
tados dos microrganismos frente a aminoglicosídeos e polimixinas.
• Qualidade e armazenamento dos discos: é importante checar sempre se a concen-
tração do antimicrobiano no disco é a recomendada pelo EUCAST/BrCAST. Além
disso, a qualidade do papel de filtro utilizada na confecção do disco também pode
interferir no resultado, visto que, quando de qualidade ruim, pode apresentar bor-
das irregulares, ou serem muito finos, prejudicando a perfeita aderência na super-
fície do ágar. Deve-se respeitar rigorosamente as condições de armazenamento
dos discos, para evitar perda de potência do antimicrobiano.
• pH do meio de cultura: deve estar entre 7,2 e 7,4 para garantir resultados de sen-
sibilidade acurados.
• Armazenamento adequado das cepas-padrão: É importante, por exemplo, testar K.
quasipneumoniae ATCC 700603 (produtora da ESBL SHV-18) frente a β-lactâmicos.
O armazenamento inadequado de cepas pode acarretar em perda de plasmídeos
e, consequente, alteração dos resultados esperados. O ideal é armazenar a -70°C.
• Fitas contendo gradiente de concentração de antimicrobianos, também devem
ser submetidas a controle de qualidade, da mesma maneira que os discos, para
checar se estão dentro dos padrões estabelecidos pelo EUCAST/ BrCAST.
4.5 Pontos críticos

• A correta identificação bacteriana é de fundamental importância para a escolha
do método adequado para a realização dos testes de sensibilidade aos antimi-
crobianos. Em primeiro lugar porque, dependendo do microrganismo, diferentes
104
metodologias são indicadas. Em segundo lugar, porque os microrganismos pos-

suem resistência intrínseca a determinados antimicrobianos, o que torna desne-
cessário testar antimicrobianos aos quais os microrganismos são intrinsecamente
resistentes. Consultar sempre as tabelas de ponto de corte do EUCAST/BrCAST
para definir a melhor metodologia e a tabela de resistência intrínseca para cada
microrganismo.
• Observar sempre, com muita atenção, a concentração do antimicrobiano no disco
que é recomendada pelo EUCAST/BrCAST, que diferem em alguns casos com os
do CLSI.
• MH-F e caldo MH-F são usados para testar Streptococcus spp. (incluindo S. pneumo-
niae), Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Listeria monocytogenes, Cam-
pylobacter jejuni e C. coli, Pasteurella multocida, Corynebacterium spp., Aerococcus
sanguinicola e A. urinae, Kingella kingae e outros microrganismos fastidiosos.
• Ágar diluição é o método referência para testar fosfomicina em relação a bactérias
da ordem Enterobacterales, Pseudomonas spp e Staphylococcus aureus. A CIM para
fosfomicina deve ser determinada na presença de glicose-6-fosfato (25 mg por
litro de ágar MH).
• A CIM de colistina/polimixina B deve ser determinada por microdiluição em caldo.
O controle de qualidade deve ser realizado com cepa sensível (E. coli ATCC 25922
ou P. aeruginosa ATCC 27853) e cepa resistente (E. coli NCTC 13846 – cepa MCR-1
positiva). Para o preparo das soluções de antimicrobiano usar sempre sulfato de
colistina ou sulfato de polimixina B.
• Validar as placas de microdiluição em caldo e ágar diluição realizando o controle
de qualidade com as cepas de referência indicadas nas tabelas de ponto de corte
do EUCAST/BrCAST para diversos microrganismos. Por exemplo, Escherichia coli
ATCC 25922 para membros da ordem Enterobacterales e Stenotrophomonas malto-
philia, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 para Pseudomonas spp. e Acinetobac-
ter spp., Staphylococcus aureus ATCC 25923 para Staphylococcus spp., Streptococcus
pneumoniae ATCC 49619 para S. pneumoniae. Utilizar em todas as placas de micro-
diluição em caldo.
• A CIM de glicopeptídeos é dependente do método e deve ser determinada por
microdiluição em caldo. S. aureus com CIM de 2 mg/L para vancomicina estão no li-
mite da distribuição da CIM para população bacteriana do tipo selvagem (isolados
sensíveis sem mecanismos de resistência) e pode haver diminuição da resposta
clínica. O ponto de corte (resistente) foi diminuído para 2 mg/L para evitar que iso-
lados intermediários (GISA – “Glycopeptide Intermediate Staphylococcus aureus”)
sejam relatados, já que infecções graves por GISA não são tratáveis com doses al-
tas de vancomicina ou teicoplanina.
• Para determinação da CIM de tigeciclina por microdiluição, o meio deve ser fresco,
preparado no dia do uso. Pontos de corte de diâmetro do halo de inibição são va-
lidados apenas para E. coli.
105
• Nitrofurantoína: testar apenas para E. coli isolada de infecção do trato urinário (ITU)
baixa não complicada.
• S. aureus, S. lugdunensis e S. saprophyticus com CIM de oxacilina >2 mg/L são, em
sua maioria, resistentes à meticilina pela presença do gene mecA ou gene mecC.
Ocasionalmente, valores de CIM de oxacilina são altos em S. aureus na ausência
de resistência mediada por gene mec. Essas cepas são conhecidas como BORSA
(“Borderline Oxacillin-Resistant S. aureus”). O EUCAST não recomenda uma tria-
gem sistemática para BORSA. Para estafilococos coagulase negativo, exceto S. sa-
prophyticus e S. lugdunensis, a CIM de oxacilina em cepas resistentes à meticilina é
>0,25 mg/L. S. aureus e S. lugdunensis com valores de CIM para cefoxitina >4 mg/L
e S. saprophyticus com valores de CIM para cefoxitina >8 mg/L são resistentes à
meticilina (oxacilina) principalmente devido à presença do gene mecA ou mecC.
• E. faecium resistente às penicilinas podem ser considerados resistentes a todos os
agentes β-lactâmicos incluindo os carbapenêmicos. Resistência à ampicilina em
E. faecalis é rara e deve ser confirmada com um método de determinação da CIM.
• Enterococos sensíveis à vancomicina apresentam halos de inibição com bordas
bem definidas e não apresentam colônias dentro do halo de inibição (Figura 10).
Suspeitar de resistência quando as bordas forem mal definidas (irregulares ou di-
fusas) ou quando houver crescimento de colônias dentro do halo de inibição, mes-
mo que o diâmetro do halo seja ≥ 12 mm. Os isolados não podem ser relatados
como sensíveis antes de 24h de incubação. Resultados duvidosos devem ser con-
firmados por determinação da CIM e/ou detecção dos genes van por PCR.
a) borda bem definida e diâmetro de halo ≥ 12 mm. Reportar sensível; b-d) bordas esfumaçadas ou colônias dentro do halo de inibição. Realizar teste
confirmatório com PCR ou reportar resistente, mesmo com diâmetro de halo ≥ 12 mm. Fonte: EUCAST/BrCAST3.
Figura 10. Exemplos de halos de inibição em Enterococcus spp. com vancomicina.
• A resistência induzível à clindamicina pode ser detectada pelo antagonismo da

atividade da clindamicina por agente macrolídeo. Se o antagonismo não for de-
tectado, reportar o resultado da clindamicina exatamente como encontrado no
TSA. Se detectado antagonismo, reportar como resistente à clindamicina e con-
siderar a inclusão do comentário: “A clindamicina ainda pode ser utilizada para
tratamento de curta duração ou tratamento de infecções menos graves de pele e
tecidos moles porque é improvável haver desenvolvimento de resistência plena
durante o tratamento”.
106
• O teste de triagem com disco de oxacilina 1 μg para S. pneumoniae e H. influenzae

deve ser utilizado para excluir mecanismos de resistência aos β-lactâmicos. Quan-
do o teste de triagem for negativo (halo de inibição ≥ 20 mm), todos os agentes
β-lactâmicos para os quais estão disponíveis pontos de corte clínicos, poderão ser
relatados como sensíveis sem a realização de testes adicionais. Quando a triagem
for positiva (halo de inibição <20 mm), consultar o fluxograma na tabela de ponto
de corte do EUCAST/ BrCAST para interpretação.
• Isolados não sensíveis à teicoplanina são raros ou ainda não foram reportados. A
identificação e o teste de sensibilidade em isolados não sensíveis devem ser con-
firmados em centro de referência.
• Um ponto crítico importante em relação à padronização estabelecida pelo EU-
CAST/BrCAST é que não existem pontos de corte definidos para todos os antimi-
crobianos, assim como tabelas específicas para todos os microrganismos. Nessa
categoria se incluem os bacilos Gram-negativos não fermentadores da glicose ou-
tros que não Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. e Stenotrophomonas maltophi-
lia, por exemplo. Em todos os casos em que não há pontos de corte estabelecidos,
a sugestão é utilizar os pontos de corte baseados em PK/PD [ver tabela específica
no site do BrCAST (www.brcast.org) ou do EUCAST (www.eucast.org)], sem relação
com espécies. Nesses casos, deve-se utilizar as tabelas de PK/PD que constam no
documento EUCAST/ BrCAST, que são baseadas em resultados da CIM, os quais
devem ser relatados nos resultados. Quando a CIM for maior que o ponto de corte
PK/PD de resistência, desaconselhar o uso do antimicrobiano. Se a CIM for menor
ou igual ao ponto de corte PK/PD de sensibilidade, sugerir o uso do antimicro-
biano, com precaução. Incluir uma nota no laudo informando que o resultado foi
baseado em pontos de corte PK/PD e incluir a dosagem na qual o ponto de corte
foi estabelecido.
• E quando não há pontos de corte PK/PD? Os motivos pelos quais os pontos de
corte de PK-PD não estão disponíveis podem ser em função de não haver dados
para o agente quando ele foi originalmente avaliado ou subsequentemente revi-
sado. A orientação é determinar se a CIM do isolado é consistente com a CIM do
tipo selvagem. Acessar o site de distribuição do EUCAST MIC (https://mic.eucast.
org/Eucast2/) e digitar o nome da espécie ou do agente. Se encontrar uma distri-
buição que corresponda às espécies relevantes (ou de uma espécie relacionada às
espécies em questão) e agente antimicrobiano, poderá decidir se a CIM pertence
ou não ao tipo selvagem. Se a CIM for consistente com o tipo selvagem, é possível
fazer uma comparação com outras espécies para as quais já exista uma categori-
zação clínica do tipo selvagem (ou seja, pontos de corte já foram determinados).
Sugestão no laudo: se a CIM estiver na faixa de tipo selvagem para as espécies ou
espécies relacionadas, sugerir que o agente pode ser usado com cautela. Se a CIM
estiver acima da faixa do tipo selvagem, o agente não deve ser usado. A CIM tam-
bém pode ser relatada, embora isso não seja essencial.
107
4.6 Referências Bibliográficas‑

1. Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI. 2015. Methods for dilution
antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; Approved
standards. Tenth edition. CLSI document M07-A10. Wayne, PA: Clinical and Laboratory
Standards Institute.
2. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2019. Performance standards for

Antimicrobial Susceptibility Testing, 29th edition. Clinical and Laboratory Standards
Institute; Wayne, PA, USA.
3. Brazilian Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, BrCast.2019. Tabelas de

pontos de corte para interpretação de CIMs e diâmetros de halos. Disponível em:
http://brcast.org.br/documentos/.
4. EUCAST. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. 2019.

Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters, v. 7. Disponível
em: http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_
tables/v_9.0_Breakpoint_table.pdf.
5. Bauer AW, Kirby WM, Sherris JC, Turck M. Antibiotic susceptibility testing by a
standardized single disk method. Am J Clin Pathol 1966; 45(4):493-496.
6. Adeolu M, Alnajar S, Naushad S, S Gupta R. Genome-based phylogeny and taxonomy of

the 'Enterobacteriales': proposal for Enterobacterales ord. nov. divided into the families
Enterobacteriaceae, Erwiniaceae fam. nov., Pectobacteriaceae fam. nov., Yersiniaceae
fam. nov., Hafniaceae fam. nov., Morganellaceae fam. nov., and Budviciaceae fam. nov.
Int J Syst Evol Microbiol.2016; 66:5575-99.
108
APÊNDICE CAPÍTULO 4
Preparo de Meios de cultura, soluções e afins

1. Preparo in house do padrão 0,5 da escala de McFarland
• Adicionar 0,5 mL de solução de BaCl2 0,048 mol/L (1,175% p/v BaCl2·2H2O) a 99,5 mL de solução de
H2S04 0,18 mol/L (0,36 N) (1% v/v) e misturar bem.
• Conferir a densidade óptica da suspensão em um espectrofotômetro A absorbância em 625 nm deve
ser na faixa de 0,08 a 0,13.
• Distribuir a suspensão em tubos de mesmo tamanho e espessura que aqueles utilizados para testar o
ajuste do inóculo. Vedar os tubos com papel alumínio.
• Armazenar os padrões vedados no escuro, em temperatura ambiente.
• Agitar os padrões vigorosamente em um agitador (vórtex) imediatamente antes do uso.
• Substituir a escala a cada 6 meses.
• Os padrões adquiridos comercialmente devem ser verificados para assegurar que a absorbância está
dentro dos limites aceitáveis.
2. Preparo do meio MH-F
2.1 Preparo da solução estoque de sangue de cavalo lisado a 50%:
• Diluir assepticamente o sangue de cavalo desfibrinado com uma igual quantidade de água deio-
nizada estéril.
• Congelar o sangue a -20°C overnight e descongelar. Repetir o ciclo até que as células estejam
completamente lisadas (geralmente, 3 ciclos são suficientes, mas, dependendo do caso, podem
ser necessários até 7 ciclos).
• Clarificar o sangue lisado de cavalo a 50% por centrifugação e descartar o pellet. A obtenção de
uma solução clara é fundamental para a leitura do teste. Falha em clarificar a solução pode ser de-
vida à lise inadequada ou centrifugação. A repetição da centrifugação pode melhorar a claridade
da solução. A solução estoque pode ser armazenada a -20°C em alíquotas e descongeladas para
uso. Não congelar novamente a solução não utilizada.
2.2 Preparo da solução estoque de β-NAD:
• Dissolver β-NAD em água deionizada a uma concentração de 20 mg/mL.
• Esterilizar a solução através de uma membrana de filtro 0.2 µm.
• A solução estoque pode ser armazenada a -20°C em alíquotas e descongelada para uso. Não con-
gelar novamente a solução descongelada.
2.3 Preparo do meio MH-F:
• Preparar e autoclavar o ágar Mueller-Hinton, de acordo com as recomendações do fabricante.
Porém, deve-se usar menos 100 mL de água deionizada por litro para permitir a adição de sangue
lisado de cavalo. Resfriar o meio a 42-45°C.
• Adicionar assepticamente 100 mL de sangue lisado de cavalo a 50% e 1 mL de solução estoque de
β-NAD por litro de meio e misturar bem.
• Dispensar o MH-F nas placas de Petri estéreis para obter espessura de 4 ± 0,5 mm (aproximada-
mente 25 mL em placas de 90 mm e 70 mL em placas de 150 mm de diâmetro). Vedar em sacos
plásticos hermeticamente fechados e manter em geladeira entre 4-8°C.
3. Preparo de Caldo Mueller-Hinton cátion-ajustado
• Ajustes de cátions não são necessários quando o meio recebido do fabricante já contém as concen-
trações corretas [de 20 a 25 mg de Ca++/L (50 mg/L para daptomicina) e de 10 a 12,5 mg de Mg++/L] de
cátions divalentes.
• Para ajuste de Mg++: utilizar cloreto de magnésio a 10 mg/mL. Dissolver 8,36 g de MgCl2. 6 H2O em 100
mL de água ultrapura.
• Para ajuste de Ca++: utilizar cloreto de cálcio a 10 mg/mL. Dissolver 3,68 g de CaCl2. 2 H2O em 100 ml
de água ultrapura.
• As soluções de cátions devem ser esterilizadas por filtração em membrana e estocadas a 2-8ºC.
109
• Preparar o caldo Mueller-Hinton conforme orientação do fabricante, autoclavar e refrigerar a 2-8ºC

em um banho de gelo antes da adição dos cátions, caso seja utilizado no mesmo dia. Nota: em meios
comerciais desidratados pode haver concentração de Ca++ ou Mg++. Essa concentração inicial deve ser
levada em consideração quando se calcular a quantidade de Ca++ ou Mg++ a ser adicionada ao meio.
• Adicionar 0,1 mL da solução-estoque refrigerada de Ca++ ou Mg++ por litro de caldo, para cada incre-
mento desejado de 1 mg/L na concentração final do CMHCA.
• Para meios sem concentração de Ca++ ou Mg++, adicionar:
– 2,0 mL da solução 10mg/mL de Ca++  1000 mL de meio
– 1,0 ml da solução 10 mg/ ml de Mg++  1000 mL de meio
4. Preparo do Caldo Mueller-Hinton cátion-ajustado para bactérias fastidiosas:
• Preparar e autoclavar o caldo MH de acordo com as recomendações do fabricante, ou adicionando os
cátions em separado quando utilizar CMH sem ajuste de cátions, porém, com menos 100 mL de água
deionizada por litro para permitir a adição de sangue lisado de cavalo.
• Resfriar o meio a 42-45°C.
• Adicionar assepticamente 100 mL de sangue lisado de cavalo a 50% e 1 mL de solução estoque de
β-NAD por litro de meio e misturar bem.
• Dispensar o CMHCA-F em frascos estéreis com tampa rosca
• Estocar o CMHCA-F a 4-8°C por até 3 meses.
5. Preparo das soluções estoque (mãe) de antimicrobianos:
• Calcular o peso do antibiótico, levando-se em consideração a potência da droga (que consta no rótulo
do frasco do antimicrobiano):
Volume (mL) x Concentração (µg/mL)

Peso (mg) =
Potência (µg/mg)
• Exemplo:
1 (mL) x 10.000 (µg/mL)

Peso (mg) = = 12,88 mg
776 (µg/mg)
• Então: Dissolver 12,88 mg do pó do antimicrobiano no solvente indicado e completar o volume para 1
mL com o diluente. Consultar a Tabela de Solventes e Diluentes para o Preparo de Soluções Estoque
de Agentes Antimicrobianos.
• Exemplos:
Agente Solvente Diluente

Ceftazidima Carbonato de sódio Água
Colistina Água Água
Imipenem Tampão fosfato, pH 7,2. 0,01M Tampão fosfato, pH 7,2. 0,01M
Fosfomicina Água Água
Meropenem Água Água
Polimixina B Água Água
Vancomicina Água Água
5.1. Preparo de solução estoque (mãe) para agentes antimicrobianos com atividade expressa em unida-
des (U):
• Dividir a atividade expressa no rótulo do frasco do antimicrobiano em U/mg por 10 µg/U, para
obter a potência do antimicrobiano.
• Exemplo: Sulfato de Polimixina B = 7760U/mg*
*ATENÇÃO:
a U/mg varia a cada lote do antimicrobiano (SEMPRE consultar o rótulo o antimicrobiano)
Potência (µg/mg) = 7760/10 = 776µg/mg
• Cálculo do peso do antimicrobiano, levando-se em consideração a potência da droga:
110
Volume (mL) x Concentração (µg/mL)

Peso (mg) =
Potência (µg/mg)
• Exemplo: para preparo de 1mL de solução 10mg/mL (10.000µg/mL):
1 (mL) x 10.000 (µg/mL)

Peso (mg) = = 12,88 mg
776 (µg/mg)
• Assim, dissolver 12,88mg de sulfato de polimixina B em 1mL de água ultrapura estéril. Preparar alíquo-
tas desta solução em microtubos identificados, e conservar em freezer -20ºC ou, preferencialmente,
a – 70°C. Antimicrobianos fotossensíveis, tais como, ciprofloxacina e levofloxacina, devem ser envoltos
em papel alumínio antes do congelamento.
111
Capítulo 5:
Outros testes para detecção fenotípica de resistência
bacteriana aos antimicrobianos
Darlan Augusto da Costa Rocha
Jorge Luiz Mello Sampaio
5.1 Testes para a detecção de ESBL
As β-lactamases são enzimas capazes de hidrolisar o anel β-lactâmico presente em al-

guns compostos químicos (antimicrobianos β-lactâmicos); são amplamente estuda-
das, principalmente por possuírem uma relação direta com o uso racional de antimi-
crobianos. Essas enzimas são bioquimicamente classificadas em dois grandes grupos,
de acordo com a maneira que hidrolisam o substrato: serino β-lactamases, as quais
possuem um resíduo de serina no sítio ativo da enzima e as metalo β-lactamases, que
possuem uma ou duas moléculas de íons de zinco em seu sítio-ativo, facilitando a
reação hidrolítica1. Também são classificadas de acordo com a homologia de aminoá-
cidos do sítio-ativo e peso molecular, além da funcionalidade de cada enzima frente
a determinado substrato (antimicrobianos β-lactâmicos) ou bloqueador enzimático
(exemplo: ácido clavulânico, avibactam e EDTA – Etilenodiamino tetra-acético). São
4 grupos moleculares (A, B, C e D) e 17 subgrupos funcionais (1, 1e, 2a, 2b, 2be, 2br,
2ber, 2c, 2ce, 2d, 2de, 2df, 2e, 2f, 3a, 3b e NI – Não incluídos)2–4.
A síntese de novos β-lactâmicos nos anos 70-80 foi realizada pela adição de diferen-
tes radicais ao anel β-lactâmico para que pudessem apresentar uma menor afinidade
com as enzimas β-lactamases até então caracterizadas, de forma a apresentar uma
maior resistência à ação dessas enzimas. A pressão seletiva causada pela utilização
clínica, e eventualmente, indiscriminada desses compostos, provavelmente sele-
cionou mutantes com novas enzimas a cada novo β-lactâmico clinicamente dispo-
nibilizado, incluindo as oxiimino-cefalosporinas, amplamente utilizadas para o tra-
tamento de bactérias Gram-negativas em infecções graves nos anos 80. A primeira
enzima com capacidade de hidrolisar as oxiimino-cefalosporinas foi SHV-2, isolada
na Alemanha em Klebsiella ozaenae e as enzimas com tal capacidade foram denomi-
nadas Extended-spectrum β-lactamases (β-lactamases de espectro estendido – ESBL).
113
No Brasil, a primeira publicação relatando a resistência à cefepima em isolados resis-

tentes a ceftazidima, apesar da observação na prática clínica desde 1985 de isolados
com resistência a cefalosporinas de terceira geração, foi apenas em 19945.
No entanto, somente em 1997 foi publicado o primeiro estudo com confirmação de

72 isolados de K. pneumoniae produtoras de ESBL6. O primeiro trabalho molecular
para caracterização de ESBL no Brasil foi apenas nos anos 2000, evidenciando que
as ESBLs mais frequentes eram do tipo CTX-M7. Um recente trabalho de revisão da
resistência em Enterobacterales no Brasil demonstra que a maioria das ESBL no cená-
rio nacional são enzimas dos tipos CTX-M, SHV, TEM, com destaque para a CTX-M-2
que foi a enzima mais frequentemente detectada8. Desde o início dos anos 80, as
ESBLs foram descritas em vários países, com expansão de clones que produziam es-
sas β-lactamases, bem como por transferência de plasmídeos. Enterobacterales pro-
dutoras de ESBL primariamente eram isoladas, em sua grande maioria, em pacientes
hospitalizados. Contudo, após os anos 2000 se tornou frequente o isolamento desses
microrganismos a partir de pacientes da comunidade9,10.
As ESBL são enzimas capazes de hidrolisar praticamente todas as penicilinas, bem

como as oxiimino-cefalosporinas: cefalosporinas de segunda, terceira e quarta gera-
ção (exemplo: cefuroxima, cefotaxima, ceftriaxona, ceftazidima, cefepima), além de
monobactâmicos (ex: aztreonam). Contudo, não hidrolisam carbapenêmicos e ce-
famicinas (cefoxitina e cefotetan) e são bloqueadas por inibidores de β-lactamases,
como ácido clavulânico, sulbactam, tazobactam e avibactam. A maioria das ESBLs são
classificadas na categoria molecular A e funcional 2be1,3,9,11,12.
A detecção laboratorial de Enterobacterales produtoras de ESBLs é feita por métodos

de triagem seguidos por métodos confirmatórios que possuem critérios de interpre-
tação relativamente diferentes a depender da espécie do microrganismo isolado, de
acordo com as diretrizes recomendadas pelo EUCAST/BrCAST13. Os métodos de tria-
gem podem ser realizados utilizando ceftazidima E ceftriaxona/cefotaxima, ou ainda
cefpodoxima isoladamente por disco-difusão, microdiluição em caldo, diluição em
ágar ou, ainda, por sistemas automatizados. O teste se baseia na detecção de isolados
não sensíveis à dose padrão para esses antimicrobianos. Deve-se ressaltar a impor-
tância da utilização de diferentes cefalosporinas de terceira geração para aumentar a
sensibilidade do método em Enterobacterales, uma vez que há diferença substancial
na Concentração Inibitória Mínima (CIM) para cada isolado, a depender do tipo de en-
zima produzida14–18. Já, para Enterobacterales do grupo CESP/MYSPACE (Enterobacter
spp., Serratia spp., Citrobacter freundii, Morganella morganii, Providencia spp., Hafnia
alvei) o recomendado é a utilização da cefepima, uma vez que a desrepressão da ex-
pressão de β-lactamases do tipo AmpC cromossômicas pode ocorrer nessas espécies,
um mecanismo comum de resistência a cefalosporinas de terceira geração13.
114
O método de triagem para ESBL por disco-difusão e microdiluição em caldo deve ser
interpretado de acordo com os critérios recomendados pelo EUCAST/BrCAST, com os
seguintes pontos de corte: CIM >1mg/L para qualquer um dos antimicrobianos (cef-
tazidima, ceftriaxona/cefotaxima, ou cefpodoxima) e halos de inibição menores que
21 mm para cefotaxima (discos com potência de 5 mg) e cefpodoxima (discos com
potência de 10 mg); halos menores que 23 mm para ceftriaxona (discos com potência
de 30mg) e halos menores que 22 mm para ceftazidima (discos com potência de 10
mg)13.
Equipamentos automatizados também podem ser utilizados para a detecção de ESBL

e se baseiam no bloqueio enzimático por ácido clavulânico em combinação com ce-
falosporinas de terceira e quarta geração (cefepima, cefotaxima e ceftazidima), jun-
tamente com um algoritmo que interpreta a CIM para os antimicrobianos puros. De
modo geral, a redução do sinal do crescimento detectado no teste combinado em re-
lação ao sinal detectado no teste com antimicrobiano puro, é indicativo de produção
de ESBL. Além disso, o próprio software consegue interpretar o valor das CIMs para
os diversos β-lactâmicos testados em cada painel e sugerir o provável fenótipo em
relação à resistência bacteriana (exemplo: penicinilase, ESBL, AmpCs, entre outros).
A sensibilidade dos principais métodos automatizados varia de 83,5% a 98,8%, e a
especificidade de 52,2% a 78% quando todas as Enterobacterales são consideradas
no cálculo17,19–21.
Uma vez realizada a triagem de isolados resistentes, são executados métodos confir-
matórios. A microdiluição em caldo para confirmação de ESBL é realizada utilizando
ceftazidima, ceftriaxona e cefepima em diluições seriadas (razão 2) e os mesmos an-
timicrobianos acrescidos de uma concentração fixa de ácido clavulânico de 4mg/L
em todas as diluições. O teste é positivo se houver uma diferença de pelo menos 8
vezes (três diluições) entre a CIM do antimicrobiano puro e do teste realizado com o
acréscimo de ácido clavulânico22.
O teste de combinação de discos é realizado utilizando discos de ceftazidima e ce-

fotaxima (discos com potência de 10 mg e 5 mg respectivamente)23 que são dis-
postos em placa contendo ágar Mueller-Hinton com um inóculo bacteriano padrão
equivalente à escala 0,5 de McFarland. Além desses discos, são adicionados discos
dos mesmos antimicrobianos acrescidos de 10 mg de ácido clavulânico. O teste é
considerado positivo se houver um aumento no halo de inibição maior ou igual a 5
mm, comparando-se o disco com ácido clavulânico com o disco contendo apenas a
cefalosporina24,25.
O método de Jarlier26 ou de disco aproximação, que se baseia no sinergismo entre

os discos contendo cefalosporinas de terceira e quarta geração que são dispostos
próximos ao disco contendo amoxicilina-ácido clavulânico, também pode ser utiliza-
115
do para confirmação de ESBL. Em uma placa contendo ágar Mueller-Hinton com um

inóculo bacteriano padrão equivalente à escala 0,5 de McFarland são dispostos os
discos de cefotaxima, ceftazidima e cefepima (discos com potência de 30 mg) a uma
distância de 15 a 30 mm centro a centro em relação ao disco de amoxicilina-ácido
clavulânico (20-10 mg). O teste é positivo quando a zona de inibição é aumentada em
direção ao disco de amoxicilina-ácido clavulânico27.
Existem no mercado fitas de gradiente de concentração de antimicrobiano específi-

cas para a detecção de ESBL. Elas são uma combinação de cefalosporinas de terceira
geração de um lado, e o mesmo antimicrobiano de outro com adição do ácido cla-
vulânico. A interpretação do teste deve ser realizada de acordo com o recomendado
pelo fabricante. Da mesma forma que é interpretada a microdiluição em caldo, uma
redução de 8 vezes (3 diluições) na CIM do antimicrobiano combinado com ácido
clavulânico em relação ao puro, indica a produção de ESBL. Também é indicativo de
produção de ESBL o aparecimento de uma zona de inibição no meio da fita (zona
fantasma) ou qualquer deformidade nas elipses. É importante ressaltar que esse teste
é apenas para confirmar a produção de ESBL e não é recomendado para determinar
a CIM13.
5.1.1 Métodos alternativos

a) Método tridimensional
Um método alternativo para a detecção de ESBL é o método tridimensional,

no qual o microrganismo estudado é semeado na superfície do ágar Muel-
ler-Hinton com turbidez equivalente à escala 0,5 de McFarland, fendas cir-
culares são produzidas no ágar e um inóculo mais denso (109 a 1010 UFC/
mL) é dispensado até o completo preenchimento da fenda. Os discos são
dispensados a uma distância de 3 mm das fendas preenchidas com o inó-
culo bacteriano. Posteriormente, é realizada uma análise por inspeção nas
margens da zona de inibição com a fenda contendo o inóculo. A hidrólise
do antimicrobiano pela ESBL ocorre de acordo com a difusão pela fenda e
a distorção/descontinuidade da zona de inibição e crescimento de colônias
isoladas indica presença de ESBL com sensibilidade de 93%28.
b) Métodos colorimétricos
A detecção de ESBL também pode ser feita de maneira rápida (menos de

2 horas) utilizando testes colorimétricos (ESBL NDP), que são baseados na
hidrólise do anel β-lactâmico com redução do pH e alteração da cor do meio
de vermelho para amarelo, efeito possibilitado pela adição do indicador de
pH vermelho de fenol. O primeiro teste foi descrito em 2012 e usa cefotaxima
como cefalosporina indicadora. A sensibilidade do método é de 92,6%, en-
116
quanto a especificidade é de 100%29. Outro método colorimétrico é baseado

na utilização de uma cefalosporina cromogênica HMRZ-86 (βLacta Test) que
detecta Enterobacterales resistentes às cefalosporinas de terceira geração. O
teste apresenta uma sensibilidade e especificidade de 96% e 100%, respecti-
vamente, quando as espécies testadas são K. pneumoniae e E. coli e o tempo
para execução é de apenas 15 minutos30.
c) Meios cromogênicos
Meios de cultura, de modo geral, também podem ser suplementados com

cefalosporinas de terceira geração, a exemplo de cefotaxima e ceftazidima
para o isolamento de microrganismos produtores de ESBL. Nesse contexto,
se destacam os meios cromogênicos por permitirem a identificação presun-
tiva de microrganismos diferenciando as colônias pela coloração, reduzindo
substancialmente o tempo para o isolamento de bactérias produtoras de
ESBL, especialmente em rotinas de cultura de vigilância. Há disponibilidade
no mercado de algumas marcas de meios cromogênicos para essa finalidade
e que apresentam sensibilidade que varia de 74,6% a 94,9% e especificidade
entre 94,9% a 96,8%, a depender do fabricante31,32.
5.2 Testes para a detecção de AmpC
As enzimas β-lactamases do tipo AmpC hidrolisam penicilinas, cefalosporinas até ter-

ceira geração (não hidrolisam cefalosporinas de quarta geração, a exemplo de cefepi-
ma) e hidrolisam cefamicinas (com exceção da enzima ACC-1, uma AmpC mediada
por plasmídeo que não hidrolisa cefoxitina) e não são ou são fracamente inibidas
pelos bloqueadores de β-lactamases clássicos, a exemplo de ácido clavulânico33,34. As
Enterobacterales do grupo CESP/MYSPACE (Enterobacter spp., Serratia spp., Citrobacter
freundii, Morganella morganii, Providencia spp., Hafnia alvei) possuem genes cromos-
sômicos que codificam para AmpCs e são induzíveis. Nessas bactérias, a desrepressão
dos genes ou hiperprodução podem conferir altos níveis de resistência. Já K. pneumo-
niae, Salmonella spp. e P. mirabilis podem adquirir genes plasmidiais que carreiam o
gene ampC, o que confere as mesmas características observadas em mutantes que
possuem genes cromossômicos que estão desreprimidos e levam à hiperprodução
dessas enzimas. Os níveis de resistência dependem da expressão ou outros meca-
nismos de resistência (expressão de bombas de efluxo ou perda de permeabilidade).
Escherichia coli e Shigella spp. podem produzir AmpCs de maneira natural, ou seja,
codificadas por cromossomos; contudo, neste caso, a enzima é produzida em um ní-
vel mínimo porque os genes promotores de AmpC são considerados “fracos”. Nessas
espécies, também pode haver a produção de AmpC por mutação nos promotores de
ampC ou aquisição de plasmídeos, consequentemente produzindo níveis mais altos
117
de resistência. É importante ressaltar que a produção de AmpC plasmidial associada

a efluxo e/ou perda de permeabilidade pode levar a resistência a carbapenêmicos34,35.
Os primeiros isolados produtores de AmpC codificadas por plasmídeos foram nos

anos 80 e têm sido detectadas globalmente, provavelmente por disseminação clonal
ou transferência horizontal. As enzimas do tipo AmpC são categorizadas na classe C
pela classificação molecular das β-lactamases2,3,36. Dentre as enzimas do tipo AmpC,
várias linhagens são provenientes de AmpCs cromossômicas, por exemplo, MIR e
ACT de Enterobacter spp.; CMY, LAT e FCE de Citrobacter spp.; DHA, ACC e FOX de
Morganella morganii, Hafnia alveii e Aeromonas spp. respectivamente. Dessas, as mais
frequentemente detectadas são as do tipo CMY-2 e DHA34.
Os métodos de detecção de AmpCs se baseiam na resistência às cefalosporinas de

terceira geração (ceftazidima ou cefotaxima) e uma cefamicina (cefoxitina), bem
como testes de sinergismo com cloxacilina e bloqueio enzimático com ácido fenil-
-borônico. É importante ressaltar que a utilização da cefoxitina pode ser prejudicada
em microrganismos que apresentam deficiência de porinas e que, consequentemen-
te, apresentam resistência a esse antimicrobiano34,37.
Os métodos de triagem de AmpCs por disco-difusão e microdiluição em caldo devem

ser interpretados de acordo com os critérios recomendados pelo EUCAST/BrCAST,
com os seguintes pontos de corte: CIM maior que 8 mg/L e <19 mm de zona de ini-
bição no teste por disco-difusão para cefoxitina (disco com potência de 30 mg), CIM
maior que 2 mg/L ou zona de inibição <17 mm para cefotaxima (disco com potência
de 5 mg) e CIM maior que 4 mg/L ou zona de inibição <19 mm para ceftazidima (disco
com potência de 10 mg). Embora menos específico, para laboratórios que não testam
cefoxitina, uma das alternativas é testar cefepima (disco com potência de 30 mg) jun-
tamente com cefotaxima (disco com potência de 5 mg) e/ou ceftazidima (disco com
potência de 10 mg) e amoxicilina-ácido clavulânico (disco com potência de 20-10
mg). A sensibilidade à cefalosporina de quarta geração, a resistência às de terceira
geração e a não resposta ao bloqueador de ácido clavulânico pode auxiliar na identi-
ficação de isolados produtores de AmpC13.
Uma alternativa para triagem de isolados produtores de AmpC também pode ser
executado utilizando um disco de cefoxitina (disco com potência de 30mg) puro que
é disposto em uma placa contendo ágar Mueller-Hinton com um inóculo bacteriano
padrão equivalente à escala 0,5 de McFarland. Além do disco contendo apenas o an-
timicrobiano, deve ser adicionado outro disco do mesmo antimicrobiano acrescido
de 200mg de cloxacilina. O teste é considerado positivo se houver um aumento no
halo de inibição de, pelo menos, 4 mm comparando-se os halos do disco com e sem
cloxacilina. Esse teste apresenta sensibilidade de 95% e especificidade de 95%38.
118
Alternativamente, podem ser utilizados os antimicrobianos cefoxitina e ceftazidima

puros e acrescidos de 400mg de ácido fenil-borônico, um bloqueador enzimático de
serino β-lactamases. Um disco de cefoxitina (disco com potência de 30 mg) e um dis-
co de ceftazidima (disco com potência de 10 mg) puro são dispostos em uma placa
contendo ágar Mueller Hinton com um inóculo bacteriano padrão equivalente à es-
cala 0,5 de McFarland. Nessa placa são adicionados outros discos dos mesmos antimi-
crobianos acrescidos de 400 mg de ácido fenilborônico. O teste será considerado po-
sitivo quando a diferença entre as zonas de inibição para os discos puro e acrescido
do bloqueador apresentar valor maior ou igual a 5mm para os dois antimicrobianos35.
5.3 Testes para detecção de carbapenemases
Os carbapenêmicos são até hoje a classe de antimicrobianos mais utilizada no trata-

mento das infecções graves causadas por bacilos Gram-negativos em ambiente hos-
pitalar, e, por esse motivo, a disseminação de carbapenemases é, dentro do problema
da resistência bacteriana, talvez o tópico mais importante. A produção de carbape-
nemases é o mecanismo de resistência aos carbapenêmicos mais frequente e mais
eficiente em Enterobacterales em todo o mundo39. Carbapenemases são β-lactamases
capazes de hidrolisar carbapenêmicos, sendo que algumas têm a capacidade de hi-
drolisar todas as classes de β-lactâmicos atualmente disponíveis. Excetuando as car-
bapenemases da classe B de Ambler4, que possuem uma ou mais moléculas de zinco
em seu sítio ativo, as carbapenemases das classes A, C e D possuem um resíduo de
serina em seu sítio catalítico.
As carbapenemases são um grupo amplo e diverso de enzimas, sendo as de maior

importância clínica na classe A as variantes de KPC – Klebsiella pneumoniae carbape-
nemase; na classe B as variantes de NDM – New Delhi metallo-β-lactamase, na classe
C a CMY-10 e na classe D as variantes de OXA. Essas enzimas usualmente apresentam
seus determinantes genéticos localizados em transposons e plasmídeos, o que fa-
cilita a sua disseminação40. As carbapenemases diferem amplamente quanto à sua
efetividade na hidrólise de carbapenêmicos; portanto, sua detecção no laboratório
de rotina de microbiologia por métodos fenotípicos representa um desafio. Além da
grande variação dos coeficientes de hidrólise, há variabilidade da expressão em di-
ferentes microrganismos e contextos genéticos41,42 e, consequentemente, o fenótipo
de resistência pode ser de resistência a todos os carbapenêmicos e cefalosporinas,
observado frequentemente nas cepas produtoras de KPC, ou resistência a carbape-
nêmicos e sensibilidade às cefalosporinas observada em cepas produtoras de varian-
tes de OXA-48.
Apesar da grande importância epidemiológica, a detecção de carbapenemases não

é necessária para a categorização de um isolado como sensível dose padrão (S), sen-
119
sível aumentando exposição (I) ou resistente (R) segundo as normas do EUCAST/

BrCAST, bastando a interpretação do diâmetro do halo de inibição e Concentração
Inibitória Mínima (CIM), segundo os critérios interpretativos vigentes.
A detecção de carbapenemases, além da importância epidemiológica para imple-

mentação de precauções de contato, é importante para orientar a prescrição de
antimicrobianos enquanto o resultado do antibiograma não está disponível. Com a
aprovação para uso clínico de antimicrobianos associados aos novos inibidores de
β-lactamases como ceftazidima-avibactam, é importante reconhecer a classe da car-
bapenemase produzida pelo isolado bacteriano, uma vez que essa combinação é ati-
va contra a maioria dos isolados produtores de KPC, OXA-48, mas não é ativo contra
isolados produtores de metalo-β-lactamases.
Há diversos métodos para detecção de carbapenemases descritos na literatura, que

serão detalhados nesse capítulo. Os métodos moleculares são considerados o padrão
ouro para detecção de genes de carbapenemases conhecidos; porém, a detecção do
gene codificador da carbapenemase não garante a sua expressão. Por outro lado, os
testes fenotípicos têm menor custo e permitem a identificação presuntiva dos grupos
de carbapenemases. Todos os laboratórios clínicos no Brasil devem seguir as normas
do EUCAST/BrCAST para detecção de mecanismos de resistência, incluindo a detec-
ção de carbapenemases; entretanto, no documento, há vários testes recomendados
e o laboratório deve avaliar e implementar aqueles com melhor relação custo-efetivi-
dade e que melhor se adaptem à sua rotina e epidemiologia. O documento intitulado
“Orientações do EUCAST para a detecção de mecanismos de resistência e resistências
específicas de importância clínica e/ou epidemiológica” descreve os métodos a se-
rem utilizados nos laboratórios clínicos no Brasil e está disponível em http://brcast.
org.br/documentos/ 13.
5.3.1 Triagem da produção e caracterização de carbapenemases em

Enterobacterales pelo método de disco-difusão
Segundo o EUCAST/BrCAST, os dois carbapenêmicos que podem ser utili-
zados para triagem de isolados produtores de carbapenemases são o erta-
penem e o meropenem. O ertapenem tem a vantagem de o ponto de corte
clínico para a categoria resistente no método de disco-difusão (< 25 mm)
ser o mesmo utilizado para triagem, ou seja, a resistência a este composto é
considerada uma triagem positiva para a produção de carbapenemases (Ta-
bela 1); entretanto, o ertapenem tem baixa especificidade em Enterobacter
spp. e Klebsiella aerogenes, pela ocorrência significativa de isolados desses
gênero e espécie produtores de ESBL e simultaneamente com alterações de
porinas43. O meropenem é o substrato que apresenta a melhor combinação
de especificidade e sensibilidade, com 100% de sensibilidade43,44. O uso do
disco de ceftazidima-avibactam como parte da triagem de Enterobacterales
120
produtoras de carbapenemases pode ser útil, pois cepas que expressam va-
riantes de KPC sensíveis ao meropenem têm capacidade de hidrolisar me-
ropenem abolida ou reduzida e usualmente apresentam níveis elevados de
resistência à ceftazidima-avibactam45.
Tabela 1. Pontos de corte clínicos e para triagem de Enterobacterales produtoras de

carbapenemases (de acordo com a metodologia do EUCAST)23.
Diâmetro do halo de inibição
CIM (mg/L)
(mm) com discos de 10 µg
Carbapenêmico
Valor de corte Valor de corte
Valor de corte S/I Valor de corte S/I
para triagem para triagem
Meropenema ≤2 >0,12 ≥22 <28b
Ertapenemc ≤0,5 >0,12 ≥25 <25
a
Melhor equilíbrio entre sensibilidade e especificidade
b
Isolados com 25-27 mm só necessitam ser investigados para produção de carbapenemases se forem resistentes à piperacilina-tazobactam e/ou temocilina
(temocilina contribui mais para especificidade). A confirmação de carbapenemases é sempre necessária se o diâmetro do halo para meropenem for < 25
mm.
c
Elevada sensibilidade, mas baixa especificidade. Pode ser usado como um agente de triagem alternativo, mas isolados com ESBL e AmpC podem apre-
sentar resistência mesmo sem ter carbapenemase.
Retirado do documento do BrCAST Orientações do EUCAST para a detecção de mecanismos de resistência e resistências específicas de importância
clínica e/ou epidemiológica.
5.3.2 Identificação fenotípica de carbapenemases por disco-difusão com

inibidores adicionados aos discos de sensibilidade
Ö Discos combinados
O teste fundamenta-se no método de disco-difusão, mas com a adição de

uma ou mais soluções inibidoras a discos de carbapenêmicos. O diâmetro do
halo de inibição obtido com e sem inibidores é aferido e havendo aumento
de 5mm ou mais, comparado ao disco sem inibidores, o teste é considerado
positivo. Os ácidos aminofenilborônico (AAFB) e fenilborônico (AFB) inibem
carbapenemases de classe A, sendo as principais enzimas desta classe as va-
riantes de KPC. A combinação com melhor desempenho para detecção de
KPCs é meropenem com AFB, pois apresenta 100% sensibilidade e 97,6% de
especificidade (46). A cloxacilina é um inibidor de AmpCs, utilizado para di-
ferenciar essas enzimas das KPCs, pois as AmpCs podem conferir resistência
aos carbapenêmicos quando há perda de porina associada. As KPCs não são
inibidas pela cloxacilina. As enzimas da classe B de Ambler, são inibidas por
quelantes de metais, a exemplo de EDTA, ácido 2-mercaptopropiônico, ácido
mercaptoacético e ácido dipicolínico (DPA). Esses compostos são capazes de
quelar o zinco presente no sítio catalítico das metalo-β-lactamases47. O gru-
po de enzimas mais importante dessa classe é o das NDMs. Apesar de não
haver um estudo na literatura indexada comparando a eficiência desses ini-
bidores na inativação das diferentes variantes de NDM, o estudo de Giske e
colaboradores evidenciou que o DPA tem maior especificidade que o EDTA;
121
portanto se for utilizado o EDTA é recomendável que seja feita a confirmação

por método molecular48.
A Tabela 2 detalha a quantidade de inibidor por disco de meropenem de 10

µg e modo de preparo das soluções. Por exemplo, para o preparo de 1 mL de
solução de ácido dipicolínico, deve-se pesar 100 mg do ácido e dissolver em
1 mL de dimetilsulfóxido. Um volume de 10 µL deve ser adicionado a cada
disco em até 15 minutos após a aplicação dos discos de meropenem sobre
a superfície do ágar Mueller-Hinton. No caso de combinação de inibidores,
como DPA e AFB, adicionar 10 µL de cada solução. A Tabela 3 detalha o perfil
obtido com os principais grupos de carbapenemases. Em caso de ausência
de aumento do halo após a adição dos inibidores e resistência à temocilina,
o perfil é compatível com OXA-48-like, sendo recomendável a confirmação
por PCR. Até o momento não há relato de caso autóctone de OXA-48 no
Brasil, sendo OXA-370 a variante descrita e detectada no Brasil até a data de
preparo desse texto49–51.
Tabela 2. Soluções de inibidores a serem aplicadas aos discos de meropenem23

Inibidor Quantidade de inibidor por disco Solução de inibidor
DPA 1000 µg 100 mg/mL em DMSO
AFB 400 µg 40 mg/mL em água e DMSO 1/1
AAFB 600 µg 60 mg/mL em água
CLOX 750 µg 75 mg/mL em água
EDTA 730 µg 0,1 M em água; pH 7,4
Nota: O volume de cada solução a ser aplicado ao disco é de 10 µL.
Abreviaturas: DPA = ácido dipicolínico, DMSO = dimetilsulfóxido, AFB = ácido fenilborônico, AAFB = ácido aminofenilborônico, CLOX = cloxacilina, EDTA
= ácido etilenodiamino tetra-acético.
122
Tabela 3. Testes fenotípicos para diferenciação de carbapenemases em Enterobacterales

com diâmetro do halo de inibição < 28 mm ou CIM < 0,125 mg/L para meropenem,
segundo o EUCAST/BrCAST23
Sinergismo observado com aumento ≥ 5 mm do
halo de inibição com disco de meropenem (10 µg) CIM de temocilina
Grupo de
>32 mg/L ou diâmetro do
β-lactamase DPA/EDTA
ADP/EDTA AAFB/AFB CLOX halo de inibição <11 mm
AAFB/AFB
MBL + - - - Variávela
KPC - + - - Variávela
MBL + KPCb Variável Variável + - Variávela
OXA-48-like - - - - Sim
AmpC + perda de porina - + - + Variávela
ESBL + perda de porina - - - - Não
Modificado do arquivo original disponível em:www.brcast.org.br

Abreviaturas: MBL = metalo-β-lactamase, KPC = Carbapenemase de Klebsiella pneumoniae, DPA = ácido dipicolínico, EDTA = ácido etilenodiamino tetra-
-acético, AAFB = ácido aminofenilborônico, AFB = ácido fenilborônico, CLOX = cloxacilina.
O teste é considerado positivo se houver aumento do diâmetro do halo de ≥ 5mm quando comparado ao halo obtido com o disco sem inibidor.
a
O resultado do teste de sensibilidade à temocilina só deve ser considerado se caso for observado nenhum sinergismo com DPA/EDTA, AAFB/AFB, CLX
e ADP+AAFB/AFB, a fim de diferenciar entre ESBL + perda de porinas e enzimas OXA-48-like. Quando outras enzimas estão presentes, a sensibilidade é
variável e não fornece qualquer indicação adicional da β-lactamase presente.
b
Há um relato que suporta o uso de comprimidos comerciais contendo dois inibidores (DPA ou EDTA mais AAFB ou AFB)48, mas ainda faltam estudos
multicêntricos ou múltiplos estudos de um único centro. No Brasil, um número crescente de publicações tem relatado a ocorrência de co-produção de NDM
e KPC em Enterobacterales.
Ö Método de inativação de carbapenêmico (CIM) e variantes eCIM, mCIM,
blood-mCIM, rCIM e sCIM
O teste foi originalmente descrito por van der Zwaluw e colaboradores52 e

baseia-se no método de disco-difusão utilizando a cepa de referência Esche-
richia coli ATCC 25922 (NCTC 12241, CIP 76.24, DSM 1103, CCUG 17620, CECT
434), sensível aos carbapenêmicos, e disco de meropenem previamente
incubado por duas horas em suspensão do isolado a ser testado quanto à
produção de carbapenemases. O inóculo bacteriano obtido de ágar Mueller-
-Hinton ou ágar sangue, equivalente a uma alça cheia de 10 µL é suspenso
em 400 µL de água, um disco de meropenem de 10 µg é adicionado a essa
suspensão e a seguir o tubo é incubado a 35°C. Após duas horas, o disco é
removido e aplicado sobre a superfície de ágar Mueller-Hinton inoculado
com suspensão de E. coli ATCC 25922 com turbidez equivalente ao padrão
0,5 da escala de McFarland. Após seis horas de incubação, a ausência de halo
de inibição ao redor do disco, incubado na suspensão bacteriana, indica pro-
dução de carbapenemase. O teste, tal como descrito inicialmente, apresen-
ta sensibilidade de 50 a 90% para OXA-48-like53–55, tendo sido proposto por
Pierce e colaboradores o mCIM55. O teste mCIM difere do método original
pelo fato de que a suspensão bacteriana é preparada em caldo TSB, após
a adição do disco de meropenem é realizada incubação por 4 horas, e há
critérios de diâmetro de halo de inibição definidos. Diâmetros de 6 a 15 são
123
considerados positivos para carbapenemase, 16 a 18 mm são considerados

indeterminados e aqueles ≥ 19 mm são considerados negativos. Quando há
colônias dentro do halo de inibição, são considerados positivos diâmetros ≤
18 mm e indeterminados aqueles ≥ 19 mm. Na publicação original, o mCIM
apresentou a mesma especificidade de 100% observada no teste original
CIM. A sensibilidade do mCIM – 93% – foi superior àquela de 82% observada
para o CIM55.
Considerando que a caracterização precoce de produtores de metalo-β-lac-

tamases é uma ferramenta importante para guiar o uso de ceftazidima-avi-
bactam, foi proposto o eCIM56. Esta modificação do método CIM utiliza EDTA
para bloquear a degradação do meropenem por metalo-β-lactamases e se-
gundo os autores tem 100% de especificidade e sensibilidade. No método
eCIM, dois tubos contendo 2 mL de caldo TSB, um deles contendo EDTA 5
mM, são inoculados com massa equivalente a uma alça de 1 µL.
Após 4 horas de incubação, os dois discos incubados nas suspensões são

transferidos para a superfície do ágar Mueller-Hinton inoculado com a sus-
pensão de E. coli ATCC 25922 com turbidez equivalente ao padrão 0,5 da es-
cala de McFarland. Após 6 horas de incubação, os halos de inibição obtidos
com os discos tratados são aferidos e comparados. Aumento ≥ 5 mm no halo
obtido com o disco incubado na presença de EDTA 5 mM, comparado com
o diâmetro do halo obtido com o disco tratado sem EDTA indica presença
de carbapenemases. Diferenças ≤ 4 mm indicam negatividade para a detec-
ção de metalo-β-lactamase. A principal limitação do teste é que nas cepas
co-produtoras de KPC e NDM o teste se apresenta negativo levando a um
diagnóstico incorreto. A sensibilidade e especificidade de 100% são, portan-
to, decorrentes da amostragem sem co-produtores de NDM e KPC ou serina
e metalo-β-lactase. O teste tem valor, portanto nos casos positivos para me-
talo-β-lactamases, mas em caso de negatividade do bloqueio com EDTA não
é possível afastar a possibilidade de que haja co-produção de KPC e NDM.
Como o tempo de leitura do método CIM e suas variantes eram de 8 a 10

horas, Muntean e colaboradores propuseram o rCIM57. O teste rCIM consiste
em utilizar o sobrenadante da suspensão bacteriana incubada com disco de
meropenem para avaliar seu efeito inibitório sobre o crescimento da cepa E.
coli ATCC 25922, sensível a baixos níveis de meropenem. Em caso de degra-
dação do meropenem, a adição do sobrenadante à cultura de E. coli ATCC
25922 não interfere no crescimento medido por nefelometria. Em caso de
negatividade para carbapenemase, o sobrenadante adicionado ao caldo de
cultura de E. coli ATCC 25922 impedirá o crescimento bacteriano, por conter
meropenem intacto. Duas alças de 10 µL cheias de crescimento bacteriano
124
recente são homogeneizadas em 1 mL de água estéril, e dois discos de me-

ropenem.
O tubo contendo a suspensão e os discos é homogeneizado no vórtex por

1 min e incubado a 37°C por 30 min. Ao final da incubação, o tubo é nova-
mente homogeneizado com vórtex por 1 min e, a seguir, centrifugado por
5 min a 10.000 rpm. Um volume de 500 µL do sobrenadante é transferido
para suspensão de E. coli ATCC 25922 com turbidez equivalente a McFarland
1,0 em caldo TSB. O tubo do isolado suspeito e controles negativo e positivo
são incubados a 37°C for 2 h com leitura em nefelômetro a cada 30 min. A
leitura basal é subtraída da leitura após 90 min de incubação. Diferenças com
valores >1,0 são indicativas de produção de carbapenemases, enquanto di-
ferenças <0,5 indicam negatividade do teste. Testes com diferença entre 0,5
e 1,0 aos 90 min de incubação devem ser incubadas por mais 30 min. Caso o
valor da diferença persista nessa faixa, deve ser utilizado um outro método,
imunológico por molecular.
Visando simplificar a execução do teste, Jing e colaboradores propuseram o

sCIM58. A modificação consiste em aplicar a massa bacteriana diretamente
sobre disco de 10 µg de imipenem e, a seguir, aplicar o disco (com a face
contendo o inóculo voltada para baixo) sobre a superfície do ágar Mueller-
-Hinton previamente inoculado com suspensão de E. coli ATCC 25922 com
turbidez equivalente ao padrão 0,5 da escala de McFarland (Enterobacte-
rales) ou diluição 1/10 da mesma escala (P. aeruginosa e Acinetobacter spp.).
Após incubação a 35°C por 16–18 h, isolados produtores de carbapenema-
ses apresentam diâmetro de halo de inibição de 6–20 mm ou colônias den-
tro do halo de 21 ou 22 mm. Diâmetros de halo ≥26 mm são considerados
negativos e diâmetros de 23 a 25 são considerados indeterminados. Para En-
terobacterales, a concordância com os resultados de PCR foi de 99,5% e para
Acinetobacter e P. aeruginosa 100%. A principal limitação do teste é o tempo
de leitura de 16 a 18 horas.
Mais recentemente, foi proposta a realização do teste mCIM diretamente de

hemoculturas positivas, sendo a modificação designada blood-mCIM59. Qua-
tro gotas do caldo de uma hemocultura positiva são inoculadas em 2mL de
caldo TSB contendo 1 disco de 10 µg de meropenem e a seguir a suspensão é
homogeneizada por vórtex rapidamente e incubada a 35˚C em ar ambiente
por 4 horas. O disco de meropenem é removido e aplicado sobre a superfí-
cie do ágar Mueller-Hinton previamente inoculado com suspensão de E. coli
ATCC 25922 com turbidez equivalente ao padrão 0,5 da escala de McFarland.
Após incubação em ar ambiente 35˚C por 18 a 24 h, os resultados são inter-
125
pretados como descrito originalmente para mCIM por Pierce colaboradores.

A principal limitação do teste é o tempo de leitura de 16 a 18 horas.
5.3.3 Métodos acidimétricos para detecção de carbapenemases

O uso de indicadores de pH (vermelho de fenol) para detecção de hidróli-
se de β-lactâmicos foi originalmente descrito por Rubin e Smith em 197360,
que demonstraram que a hidrólise do anel β-lactâmico levava à acidificação
do meio; entretanto, o método só ganhou notoriedade com a descrição das
modificações propostas por Nordmann e colaboradores61 e Pires e colabora-
dores62, que propuserem o uso do método para detecção de carbapenema-
ses. Enquanto a primeira modificação propunha o uso do vermelho de fenol
como indicador de pH, a segunda propôs o uso do azul de bromotimol para
a mesma finalidade utilizando o imipenem injetável como substrato.
Os dois métodos estão disponíveis comercialmente no Brasil. Ambos indica-

dores de pH apresentam a coloração amarela quando em pH ácido. Subse-
quentemente Nordmann e colaboradores descreveram uma modificação do
teste original com uso de inibidores, permitindo a caracterização do tipo de
carbapenemase, utilizando o tazobactam como inibidor de carbapenema-
ses da classe A de Ambler (principal grupo KPC) e EDTA como inibidor de car-
bapenemases da classe B de Ambler (principal grupo NDM)63. O teste, inicial-
mente descrito com 100% de especificidade e sensibilidade pelos autores do
método Carba-NP, mostrou menor sensibilidade – 80% – para amostragens
contendo maior número de carbapenemases fracas, a exemplo de OXA-4864.
Em estudo realizado com isolados do Brasil, incluindo produtores de OXA-
370, a sensibilidade e especificidade do Carba-NP foram de 62,7% e 97,5%54.
Dois outros estudos realizados no Brasil evidenciaram que o método pode
ser utilizado em concentrados bacterianos obtidos a partir de hemoculturas
positivas com excelente sensibilidade para KPC65,66. Uma segunda modifica-
ção, designada CarbAcineto NP foi proposta por Dortet e colaboradores67.
A modificação substitui o tampão de lise do método original por solução de

NaCl 5M e o aumento do inóculo (o dobro do incialmente proposto no teste
original). O inóculo bacteriano equivalente a uma alça de 10 µL é transferida
para cada um de dois microtubos contendo 200 µL de NaCl 5M. Após ho-
mogeneização em vórtex e incubação a 35°C por 20 minutos, a suspensão é
dividida em dois tubos com 100 µL e a solução contendo vermelho de fenol
e imipenem (6 mg/mL) é adicionada ao tubo teste e a mesma solução sem
imipenem é adicionada ao tubo controle e a seguir os dois tubos são incuba-
dos a 37°C por um máximo de 2 horas. A sensibilidade do teste é de 94,7% e
a especificidade 100%67.
126
Recentemente, uma nova modificação do Carba-NP, designada “CPO com-

plete”, foi proposta por Thomson e colaboradores68. O CPO complete não uti-
liza o passo de lise bacterina prévia à adição da solução de vermelho de fenol
com imipenem. Uma das soluções, a solução A, contém 12 mg imipenem/
cilastatina injetável, 10 mg timerosal, 5 mg de glicose e 4 mg de polimixina
em 1 mL de caldo Mueller-Hinton, 30 μL sulfato de zinco 0,3 N e 140 μL de
solução de vermelho de fenol. O pH foi ajustado para 7,0. A um volume de
solução A de 30 μL é adicionada o inóculo bacteriano equivalente a alça de
1 μL. O teste é incubado por até 90 min a 37°C, sendo que uma coloração
amarela indica positividade.
Para caracterização do tipo de carbapenemase são utilizados 30 μL de uma

solução denominada solução B, que contém, além de 30 μL da solução A, 2
μL solução de AFB (20 mg/mL em partes iguais de DMSO e água) e 840 μL so-
lução de vermelho de fenol. O pH final da solução é 7,5. A solução C contém
30 μL de solução A, 2 μL de solução de ácido dipicolínico (235 mg em 10 mL
de tampão Tris-EDTA 100x concentrado) e 1.400 μL de solução de vermelho
de fenol. O pH final da solução é pH 6,8. As soluções B e C são inoculadas da
mesma forma que a solução A. A coloração amarela nos dois tubos após a in-
cubação indica co-produção de carbapenemases de classes A e B. Coloração
amarela apenas no tubo B indica carbapenemase de classes B (metalo-β-lac-
tamase), enquanto esta coloração apenas no tubo C indica carbapenemase
de classe A. Segundo os autores, o teste tem 100% de sensibilidade e 98,5%
de especificidade para detecção de carbapenemases, sendo que 99,0% dos
isolados contendo um único tipo de carbapenemase foram classificados cor-
retamente quanto ao tipo de carbapenemase.
Ö β-CARBA test é um kit comercial com substrato cromogênico e permite a de-

tecção de carbapenemaes em Enterobacterales e Acinetobacter spp. A vanta-
gem é o tempo de reação de 30 min e a limitação é a perda da sensibilidade
para carbapenemases que não sejam do tipo KPC. Para NDM a sensibilidade
é de 85,3% e para OXA-48-like a sensibilidade é de 80,5%. Tem uma sensibili-
dade muito boa – 90,3% – para enzimas do tipo OXA em Acinetobacter spp69.
Ö O teste Carbapenembac se constitui de fitas impregnadas com solução de

carbapenêmicos associada a um agente revelador. À fita, é aplicado 150 µL
de uma suspensão bacteriana densa com auxílio de uma micropipeta. A fita
é, então, incubada por 60 minutos. Após, é aplicada uma solução de iodo
especial e, caso a bactéria seja produtora de carbapenemases, a cor roxa
previamente existente irá sumindo, surgindo uma coloração amarela, entre
15 e 90 min. Essa metodologia foi avaliada por alguns autores, encontrando
100% de sensibilidade e especificidade variando de 96,5% a 100%70,71.
127
5.3.4 Detecção da hidrólise de carbapenêmicos por espectrometria de massas

Os espectrômetros de massas atualmente registrados no Brasil – BrukerDal-
tonics e bioMérieux permitem a detecção de carbapenemases avaliando o
espectro de relação massa/carga após exposição do ertapenem ou merope-
nem à suspensão bacteriana. O teste é lido após 2 horas de incubação e apre-
senta excelentes sensibilidade e especificidade desde que para detecção de
OXA-48-like seja adicionado NH4HCO3 ao tampão de reação72. Como a ação
de uma β-lactamase consta de uma etapa inicial de hidrólise e posterior-
mente descarboxilação, o produto da degradação dos carbapenêmicos tem
menor massa que o produto intacto. Pode-se observar, portanto, a ausência
ou redução do pico correspondente ao carbapenêmico intacto e apareci-
mento de pico correspondente ao composto hidrolisado e descarboxilado. A
dificuldade na realização do teste é a necessidade de calibração do equipa-
mento para uma faixa de massa distinta daquela utilizada para identificação
bacteriana e interpretação visual dos espectros obtidos. Essa subjetividade é
eliminada com o uso do teste MBT STAR-BL73, disponível apenas para o equi-
pamento da BrukerDaltonics.
5.3.5 Testes imunocromatográficos para detecção de carbapenemases

Os testes imunocromatográficos têm sido amplamente utilizados para diag-
nóstico rápido em medicina laboratorial. O princípio do teste consiste na
captura do antígeno eventualmente presente na amostra com anticorpos
específicos ligados a nanopartículas de ouro coloidal ligadas a uma mem-
brana de nitrocelulose74. Estão disponíveis comercialmente vários produtos,
a exemplo de Resist-5 O.O.K.N.V. (detecta OXA-48, OXA-163, KPC, NDM e VIM)
e Resist-4 O.K.N.V. (detecta OXA-48, KPC, NDM e VIM) ambos do fabricante
Coris-Bioconcept. O teste pode ser utilizado em culturas puras75, mas tam-
bém em hemoculturas positivas com 100% de sensibilidade e especificidade
com prolongamento do tempo de leitura (76). Pode, também, ser utilizado
em amostras de swab retal, que tenham sido previamente cultivadas em
meio líquido77,78. O tempo total de ensaio é de até 16 minutos, mas resulta-
dos positivos já podem ser observados em 1 minuto após a adição da sus-
pensão bacteriana ao dispositivo.
Mais recentemente foi lançado no mercado o produto NG-Test Carba 5, ca-

paz de detectar os grupos de carbapenemases KPC, OXA-48-like, VIM, IMP e
NDM79–81. Da mesma forma que os produtos da Coris, pode ser utilizado para
detecção de carbapenemases em hemoculturas positivas82.
As vantagens dos testes imunocromatográficos são a rapidez, com obten-

ção de resultados em menos de 30 minutos, a simplicidade da execução do
128
ensaio, a disponibilidade de kits comerciais; entretanto apresentam elevado

custo.
5.3.6 Detecção de carbapenemases em sistemas de automação

Ö Recentemente foi lançado no mercado o teste CPO do sistema Phoenix (Bec-
ton-Dickinson), capaz de detectar e diferenciar carbapenemases. O teste de-
tecta e identifica carbapenemases de classes A, B e D de Ambler e utiliza
meropenem, doripenem, temocilina e cloxacilina isoladamente e em combi-
nação com diferentes inibidores de carbapenemases. O estudo mais recen-
te sobre o desempenho do teste foi realizado com desenho retrospectivo e
prospectivo, indicando 92,4% de acurácia na detecção de isolados produto-
res de carbapemanases, 97,8% de sensibilidade e 87,1% de sensibilidade na
sessão de análises retrospectiva83. Quanto à classificação, o teste foi capaz
de alocar as carbapenemases nas classes A, B, e D em 81,3% dos casos, com
acurácia de 94,6%. Quando avaliou amostras de forma prospectiva, o estudo
evidenciou acurácia de 77,8%, 100% de sensibilidade e 67,8% de especifici-
dade em 135 isolados suspeitos de produção de carbapenemase e 98,8% de
acurácia e sensibilidade em isolados não suspeitos de produção de carbape-
nemases83. A grande vantagem do teste é a eliminação de etapas manuais
para detecção de carbapenemases.
5.4 Testes alternativos para a detecção de resistência às polimixinas
Ao longo da década de 90, o uso das polimixinas era consideravelmente restrito

e limitava-se ao tratamento de infecções causadas por P. aeruginosa e A. bauman-
nii resistentes aos carbapenêmicos. Após 2010, com a disseminação de cepas de
Enterobacterales produtoras de KPC na maioria dos países dos diferentes continentes,
e concomitante indisponibilidade de novos antimicrobianos para uso clínico, houve
uma retomada do uso das polimixinas e consequentemente um aumento progressi-
vo nas taxas de resistência às polimixinas. O principal gênero que expressa resistência
adquirida às polimixinas é Klebsiella spp. e o mecanismo mais frequente é a modifi-
cação do alvo das polimixinas, o LPS. A interrupção do gene mgr é o mecanismo que
mais frequentemente leva à resistência às polimixinas84. Mais recentemente foram
descritos os genes mcr – mobile colistin resistance – que codificam uma transferase
capaz de modificar as moléculas de LPS adicionando a elas a fosfoetanolamina85,86.
Atualmente, o único método recomendado pelo EUCAST/BrCAST para a avaliação

da sensibilidade às polimixinas é a microdiluição em caldo não automatizada (www.
brcast.org.br). Há na literatura, entretanto, descrição de métodos alternativos para
a detecção da resistência a esses compostos, tais como eluição do disco87, teste da
gota (http://antimicrobianos.com.ar/ATB/wp-content/uploads/2019/06/Protocolo-
129
COLISTIN-DROP-TEST.pdf ), disco combinado88, MALDIxin89, triagem com ágar con-

tendo polimixina90.
O teste da eluição do disco consiste em eluir discos de colistina em caldo Mueller-

Hinton cátion-ajustado (CMHCA) e realizar diluições ½ de modo a obter soluções de
colistina nas concentrações a serem testadas, sem necessidade de aquisição do sal do
antimicrobiano, pesagem em balança analítica e esterilização de solução de antimi-
crobiano por filtração. É, portanto, o método mais próximo do método padrão ouro,
diferindo apenas quanto ao preparo inicial da solução mais concentrada de colisti-
na. O método de eluição para colistina foi publicado por Simner e colaboradores87.
Recentemente o método foi avaliado com isolados do Brasil e evidenciou taxas de
erros graves e muito graves de 12 a 20% e 4,6 a 11,6%91, o que torna o método não
aceitável para uso em diagnóstico.
O teste da gota também foi desenvolvido pelo Instituto Dr. Carlos Malbrán (http://an-
timicrobianos.com.ar/ATB/wp-content/uploads/2019/06/Protocolo-COLISTIN-DROP-
TEST.pdf ). Consiste em adicionar uma gota de solução de colistina a 16 mg/L. Para
preparar a solução é necessário adicionar 8 discos de 10 µg de colistina a 5 mL de
CMHCA e deixar em repouso por 1 h. Uma gota (10 µL) é adicionada à placa de ágar
Mueller-Hinton inoculada com suspensão bacteriana com turbidez equivalente ao
padrão 0,5 da escala de McFarland. A placa é incubada a 35°C por 16 a 18 horas e a
seguir observada quanto à presença de halo de inibição.
A presença de halo de inibição com qualquer diâmetro indica sensibilidade. Segundo

os autores o teste apresenta concordância categórica de 97,8 a 98,2% e taxa de erros
muito graves de 2,1%, acima do valor aceitável pelo Food and Drug Administration
(1,5%). Nordmann e colaboradores descreveram o RapidPolymyxin NP test, que con-
siste em avaliar a fermentação da glicose na presença de colistina ou polimixina B. Os
isolados resistentes são capazes de metabolizar a glicose da presença de polimixina,
alterando o pH do meio e resultando na mudança de cor do vermelho de fenol para
amarelo. É um teste rápido e tem ótimo desempenho em isolados com CIM ≥ 8 mg/L
ou ≤ 1 mg/L; entretanto apresenta resultados falsamente positivos para isolados com
CIMs de 2 ou 4 mg/L92. O teste pode ser aplicado a concentrados bacterianos obtidos
de hemoculturas positivas93. O desempenho do teste depende da epidemiologia lo-
cal e, portanto, cada laboratório deve avaliá-lo antes da implementação em rotina.
Por exemplo, na grande São Paulo, cerca de 25% das cepas de K. pneumoniae resisten-
tes aos carbapenêmicos têm CIM de 2 mg/L, o que torna o teste de pouca utilidade
face à taxa de falsos positivos94. Por outro lado, Dalmolin e colaboradores observaram
sensibilidade e especificidade de 98% para o teste em isolados do sul do Brasil95. Os
valores observados nos dois trabalhos para especificidade e sensibilidade têm como
limitação o número limitado de isolados com valores de CIM próximos ao valor de
corte de 2 mg/L.
130
Um método alternativo que permite a detecção de cepas produtoras de MCR-1 é a

adição de EDTA ao disco de colistina. Um aumento ≥ 3 mm no diâmetro do halo de
inibição após adição de 10 µL de EDTA 0,1M é considerado um teste positivo para
MCR88. Os autores referem sensibilidade de 96,7% e especificidade de 89,6% para de-
tecção de MCR-1, mas há necessidade de estudos multicêntricos para que seja avalia-
da a robustez do método em diferentes laboratórios, considerando a pequena dife-
rença de halo (3 mm) para a positividade do teste.

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Capítulo 6:
Testes genotípicos para a detecção de mecanismos de
resistência e avaliação da similaridade genética
Ana Paula D’ Alincourt Carvalho Assef
Ivson Cassiano de Oliveira Santos
Melise Chaves Silveira
6.1 Detecção de marcadores genéticos de resistência
O método mais utilizado para a detecção molecular da resistência adquirida é a am-

plificação do DNA alvo através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR, Polymerase
Chain Reaction). Essa metodologia é muito útil para a detecção de genes adquiridos,
como genes codificadores de ESBLs, carbapenemases, resistência plasmidial às po-
limixinas (genes mcr), resistência à oxacilina (mecA) e à vancomicina (vanA e vanB),
além de outros genes de importância epidemiológica em bactérias Gram-negativas
e Gram-positivas.
No entanto, é importante ressaltar que a presença de genes de resistência adquiridos

não significa necessariamente que estes genes estão sendo expressos. Em algumas
situações, é possível detectar a presença destes genes em amostras sensíveis ao an-
timicrobiano. Portanto, seus resultados devem ser correlacionados com testes feno-
típicos in vitro.
Por outro lado, para a avaliação da resistência aos antimicrobianos associada a mu-
tações em genes cromossômicos, como a hiperexpressão de bombas de efluxo, a re-
sistência às polimixinas associada a mutações em mgrB, phoPQ, pmrAB, é necessário
realizar a amplificação e o sequenciamento do gene envolvido e/ou avaliar a expres-
são deste gene.
6.1.1 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

A técnica de PCR se baseia na replicação do DNA que é o processo no qual
a enzima DNA polimerase sintetiza uma nova cópia de DNA a partir de uma
fita molde. É uma metodologia rápida e muito sensível, onde a região de in-
teresse no genoma (ex.: gene de resistência) é copiada milhares ou milhões
141
de vezes, sendo possível detectar quantidades muito pequenas de DNA alvo

na amostra1,2,3.
Na PCR, para que o DNA alvo seja amplificado e visualizado, é necessário

uma série de ciclos com variações de temperatura. Geralmente, cada ciclo
consiste de três etapas com diferentes temperaturas: na primeira etapa,
ocorre a desnaturação do DNA em temperaturas muito altas (> 90oC); na se-
gunda etapa, ocorre o anelamento dos iniciadores necessários para a síntese
da nova fita de DNA, geralmente em temperaturas médias (37-60oC) e; na
terceira etapa, ocorre a extensão da cadeia nucleotídica pela ação da enzi-
ma DNA polimerase a 72oC. Esses ciclos são realizados em um equipamento
chamado termociclador1,2.
Antes de começar a reação de amplificação, é necessária a obtenção do DNA

molde, o qual deverá ser extraído do isolado bacteriano que queremos in-
vestigar. O ideal é que o DNA esteja livre de impurezas (proteínas, lipídeos,
RNA, etc.). Contudo, em algumas situações é possível fazer a reação de PCR a
partir da colônia bacteriana diretamente1.
Ö Extração do DNA
A extração de DNA é um procedimento amplamente utilizado para a realiza-

ção de análises moleculares. Existe uma série de metodologias de extração,
que se baseiam na lise celular mecânica ou química.
A extração por lise mecânica provoca o rompimento do envoltório celular,

incluindo a membrana externa, a parede celular e a membrana celular, ex-
pondo o DNA da bactéria. Nesse tipo de extração, se obtém um lisado bac-
teriano contendo o DNA e restos celulares. Apesar de o produto final não ser
um DNA totalmente livre de impurezas, esta é a extração mais utilizada para
PCR, devido à sua simplicidade de execução e eficiência. São exemplos de
técnicas para extração de DNA por lise mecânica: fervura, sonicação (ultras-
som), agitação com microesferas de vidro, maceração e nitrogênio líquido1,2.
Por outro lado, na extração por lise celular química, se obtém um DNA mais
purificado. Essa extração envolve várias etapas, quais sejam: remoção de
lipídeos de membrana para desorganizar a bicamada lipídica (no caso das
bactérias Gram-negativas) e solubilização das proteínas (detergentes e sur-
factantes); ação enzimática (lisozimas, proteases, RNAses) e precipitação do
DNA com álcool (etanol ou isopropanol). Também é possível utilizar alguns
agentes caotrópicos, como isotiocianato de guanidina, iodeto de sódio, clo-
reto de lítio (função: desnaturar proteínas, reduzir atividade enzimática, dis-
142
solver cápsulas e envelopes de células ricas em lipídios). Existem vários kits

comerciais para a extração do DNA bacteriano através de lise química, os
quais permitem a obtenção de DNA purificado1,2.
Ö Reagentes necessários para a reação de PCR
Após ter extraído o DNA, é possível realizar a PCR. A síntese das novas cópias
do DNA durante a PCR ocorre pela ação de uma enzima DNA polimerase
especial, que é estável em temperaturas muito elevadas. Assim, essa enzima
não se desnatura durante as diferentes etapas da PCR. Esta enzima é chama-
da de Taq DNA polimerase e recebe este nome pois foi isolada pela primeira
vez a partir de uma bactéria termófila (Thermus aquaticus).
A Taq DNA polimerase só é capaz de começar a adicionar nucleotídeos a um

grupo 3’-OH preexistente; por isso é necessário colocar na reação de am-
plificação um par de iniciadores (primers), que são oligonucleotídeos com-
plementares às extremidades da região do DNA que será amplificada. Um
iniciador se liga numa fita de DNA molde no sentido 5’-3’ (denominado sen-
so ou foward) e o outro iniciador se liga na outra fita no sentido 3’-5’ (deno-
minado antisenso ou reverse). Esses iniciadores irão se ligar às fitas de DNA
molde e permitirão que a TaqDNA polimerase comece a sintetizar as novas
fitas de DNA.
Além da Taq DNA polimerase e dos iniciadores, também são necessários (i)
os nucleotídeos que serão utilizados para sintetizar um novo fragmento de
DNA (dNTPs ou deoxinucleotídeostrifosfatados); (ii) cloreto de magnésio
(MgCl2), que é um cofator da enzima; (iii) tampão para manter as condições
da reação estáveis para atividade da enzima; (iv) o DNA-molde; e (v) água
estéril para completar o volume final.
Ö PCR
Após o preparo da reação, esta será levada ao termociclador onde ocorrerão

os ciclos de variação de temperatura e a amplificação do DNA. A cada ciclo,
a quantidade de DNA alvo duplica, uma vez que os fragmentos gerados ser-
vem como molde para a etapa posterior.
Etapa de Desnaturação
Nessa etapa, a dupla fita de DNA molde é separada em fitas simples (desna-
turada) através do aumento da temperatura próximo a 95ºC. A temperatura
vai depender da quantidade de citosina e guanina (C e G) presentes no frag-
143
mento de DNA alvo (quanto mais C e G, mais alta deverá ser a temperatu-
ra). Normalmente, 10 a 60 segundos são necessários para desnaturação da
maioria dos DNA molde1,2.
Etapa de Anelamento
O par de iniciadores (primers) é responsável pelo início da síntese de DNA,

pois indica o local onde a Taq DNA polimerase irá atuar. Essas pequenas se-
quências flanqueadoras se anelam à extremidade 5’ da região-alvo em cada
fita simples do DNA molde, as quais foram separadas na etapa de desnatu-
ração. Durante o anelamento, que dura aproximadamente 30 segundos, a
temperatura encontra-se entre 37ºC e 60ºC. Quanto mais alta a temperatu-
ra, mais específico é o anelamento, e isso pode servir para eliminar bandas
inespecíficas que possam aparecer no resultado final do processo da PCR.
Entretanto, a temperatura de anelamento deve ser escolhida de acordo com
conteúdo G+C dos iniciadores utilizados. O fragmento de DNA amplificado
tem comprimento equivalente ao número de bases nucleotídicas presentes
no intervalo entre os dois iniciadores1,2.
Etapa de Extensão
A extensão é catalisada pela enzima Taq DNA polimerase, sendo a etapa

mais longa da reação. Como a temperatura ótima na qual essa enzima apre-
senta atividade é 72ºC, esta será mantida durante toda a etapa de extensão.
A síntese do DNA (polimerização) irá ocorrer no sentido 5’-3’, pois o iniciador
está ligado à região 5’ do fragmento a ser sintetizado. A enzima sempre vai
continuar a sequência a partir da extremidade 3’ do iniciador, sintetizando
uma sequência complementar à sequência molde e gerando um fragmento
de fita dupla de DNA, chamado de amplicon1,2.
Essas etapas de desnaturação, anelamento e extensão são repetidas de 20

a 35 vezes, fazendo com que o DNA molde inicial seja amplificado e ao final
dos ciclos serão obtidos milhares ou milhões de cópias da região-alvo do
DNA que foi anelado com os iniciadores (Figura 1).
144
Separação das fitas de DNA e Sintese

(B) anelamento dos indicadores de DNA
Separação das fitas Sintese
de DNA e anelamento de DNA
dos indicadores
Separação das fitas Sintese
de DNA e anelamento de DNA
dos indicadores
etc.
Oligonucleotídeos
indicadores de DNA
Região do DNA
cromossomal de
fita dupla a ser
amplicado
PRIMEIRO CICLO SEGUNDO CICLO TERCEIRO CICLO

(produzindo duas moléculas (produzindo quatro moléculas (produzindo oito moléculas
de DNA de fita dupla) de DNA de fita dupla) de DNA de fita dupla)
Fonte: Alberts et al. 2010, Biologia Molecular da Célula, 5ª ed3
Figura 1. Amplificação de DNA pela técnica de PCR.
Ö Visualização
Após a reação, esses produtos amplificados serão submetidos a uma eletro-

forese em gel de agarose ou poliacrilamida. Na eletroforese, os fragmentos
de DNA são inseridos em uma matriz de gel e submetidos a um campo elétri-
co. Devido à carga negativa do DNA, este migra em direção ao polo positivo
e os fragmentos de DNA são separados de acordo com seu peso molecular
(quantidade de nucleotídeos). Os fragmentos de menor peso molecular mi-
gram mais rápido. Os fragmentos de mesmo peso molecular formam uma
banda no gel, que será posteriormente marcada com substâncias que per-
mitam sua visualização1,2.
O método mais comum e mais usado para a detecção de DNA em géis de

agarose é o uso do corante fluorescente brometo de etídeo. Esse composto
se intercala na mólecula de DNA através de forças de van der Waals. O bro-
meto de etídeo pode detectar bandas contendo até 10 hg de DNA. Para fo-
tografar o gel, é necessária luz UV transmitida ou emitida, usando aparelhos
chamados transiluminadores, que são acoplados a uma câmera fotográfica e
a um computador com software específico1,2.
Apesar de o brometo de etídeo ser o marcador de DNA mais utilizado, exis-

tem alternativas menos tóxicas e mais seguras, visto que esse composto é
intercalante de qualquer molécula de DNA, incluindo o humano. São exem-
plos de outros marcadores de DNA: SYBR Safe, Gel Red e Syber Gold. Esses
corantes emitem fluorescência 100 vezes maior em relação ao brometo de
145
etídeo, devido à alta afinidade com o DNA, portanto, quantidades ainda me-
nores de DNA podem ser detectadas (< 20 pg). No entanto, esses corantes
alternativos são mais caros.
O tamanho dos amplicons gerados será estimado em comparação às ban-

das obtidas com o marcador de peso molecular e da amostra utilizada como
controle positivo.
Ö Variações de PCR
A partir da PCR convencional surgiram outras variantes da técnica que são

bastante utilizadas na detecção de genes de resistência: PCR-Multiplex; RT-
-PCR; PCR em tempo real, dentre outras.
PCR-Multiplex
A PCR-Multiplex é uma reação na qual são adicionados dois ou mais pares de

iniciadores em uma mesma reação. Logo, pode ser feita a detecção de mais
de um gene no DNA a ser estudado com somente uma reação. É importan-
te citar que, nessa técnica, as temperaturas de anelamento dos iniciadores
devem ser bem próximas umas das outras para que ocorra a amplificação
das regiões-alvo corretamente. Além disso, os amplicons devem ter tama-
nhos diferentes para que sejam diferenciados na corrida eletroforética. Essa
técnica é muito utilizada para detecção de mais de um gene de resistência,
como por exemplo a detecção de diferentes genes de carbapenemases em
uma mesma reação. Uma de suas vantagens inclui o fato de se gastar menos
material e tempo.
RT-PCR
A RT-PCR (“Reverse Transcriptase-PCR”) é utilizada para detectar qualitativa-

mente níveis de expressão de RNA. O RNA alvo é convertido em DNA com-
plementar (cDNA) através da ação da enzima transcriptase reversa e o cDNA
é amplificado pela PCR tradicional. Essa técnica é muito utilizada para verifi-
car a expressão de genes, como, por exemplo, para a avaliação da expressão
de bombas de efluxo ou de porinas4.
PCR em tempo real
A técnica de PCR em tempo real (“Real-time PCR”) é um método semiquan-ti-

tativo (q-PCR) muito sensível e rápido. Nessa metodologia, não é necessário
submeter os amplicons gerados a uma corrida eletroforética. Sua detecção
146
ocorre simultaneamente à amplificação. O fragmento de DNA gerado é iden-

tificado por emissão de fluorescência, que é medida a cada ciclo e cuja inten-
sidade é correspondente à quantidade de DNA amplificado. Existem duas
estratégias para emitir fluorescência: a adição de um corante como o SYBR
Green à reação, que se liga ao DNA de dupla fita de maneira inespecífica, ou
a adição de sondas específicas para o DNA alvo marcadas com fluoróforos
repórteres. Para a detecção da fluorescência emitida, é necessário um equi-
pamento que contenha um termociclador acoplado a um sistema ótico para
a excitação e captura da emissão da fluorescência, além de um computador
para aquisição de resultados e análise final da reação4.
As vantagens da q-PCR incluem a detecção de pequenas quantidades de

DNA na amostra, a quantificação de sequências de DNA alvo em diferentes
matrizes, maior rapidez na obtenção do resultado, além de diminuir o risco
de contaminação cruzada por não ser necessária nenhuma outra manipula-
ção da amostra após a amplificação4.
Atualmente existem protocolos e kits comerciais de PCR em tempo real para

identificar alguns patógenos e genes de resistência de importância médica.
É possível realizar um PCR multiplex usando a plataforma de PCR em tempo
real, permitindo a detecção de mais de um gene na mesma reação de forma
rápida e específica. Para esse tipo de reação, usam-se iniciadores e sondas
específicas para cada gene de interesse e as sondas são marcadas com fluo-
róforos diferentes4.
Análise da curva de dissociação através de PCR em tempo real
A técnica de análise de curva de dissociação (HRM, High Resolution Melting

Analysis) é um método de análise pós-PCR em tempo real que permite iden-
tificar variações na sequência de nucleotídeos do DNA amplificado através
da análise da temperatura de dissociação ou temperatura de melting (Tm).
A Tm é a temperatura na qual 50% do DNA está na forma de fita simples e a
outra metade em fita dupla. Essa temperatura se modifica de acordo com o
conteúdo G+C do fragmento de DNA amplificado5.
Para a detecção das variações de Tm, utiliza-se intercalantes de DNA fluores-

centes (por exemplo, EvaGreen, Syber Green) que se ligam especificamente
a DNAs de fita dupla. Assim, após a reação de qPCR, há um alto nível de fluo-
rescência no tubo de reação devido a presença de milhões de cópias de DNA
em fita dupla. Submetem-se então estes amplicons gerados na PCR a um
aumento gradual de temperatura e à medida que estes amplicons são aque-
cidos, as fitas de DNA vão se separando e a fluorescência vai diminuindo. O
147
equipamento de PCR em tempo real registra a intensidade de fluorescência

e plota um gráfico conhecido como curva de dissociação, mostrando o nível
de fluorescência versus a temperatura5.
Essa técnica é bastante sensível, podendo detectar desvios de Tm derivados

da modificação de um único nucleotídeo (SNP, “Single Nucleotide Polymor-
phism”). Assim, é possível utilizar essa metodologia para detectar mutações
em genes de resistência, identificar variantes alélicas ou ainda detectar mais
de um gene simultaneamente (qPCR multiplex). Neste tipo de qPCR multi-
plex com análise HRM, não são utilizadas sondas específicas para cada gene,
mas os iniciadores de cada gene devem ser desenhados de forma que te-
nham temperaturas de dissociação (Tm) diferentes, pelo menos em 2oC, para
evitar a sobreposição de picos e permitir a detecção de cada um dos genes
investigados5.
6.1.2 Sequenciamento de DNA: Método de Sanger

O sequenciamento de DNA pode ser uma ferramenta para avaliar a presença
de mutações em genes cromossômicos que estejam relacionados à resistên-
cia aos antimicrobianos, identificar variantes alélicas de genes adquiridos e
identificar o contexto genético em que os genes adquiridos estão inseridos,
como plasmídeos, integrons ou transposon6,7.
Dentre as metodologias de sequenciamento disponíveis atualmente, o mé-

todo proposto por Frederic Sanger e colaboradores, em 1977, é o que gera
resultados com maior facilidade de interpretação, tem custo relativamente
baixo e é bastante utilizado para sequenciar fragmentos pequenos de DNA6,7.
O sequenciamento de Sanger é conhecido como método de terminação

de cadeia ou método dos dideoxinucleotídeos. Essa metodologia mimetiza
uma reação de PCR, onde são colocados o DNA molde (geralmente ampli-
cons obtidos a partir de uma reação de PCR), a TaqDNA polimerase, os ini-
ciadores específicos para a região de interesse e os nucleotídeos. Contudo,
além dos deoxinucleotídeos trifosfatados usuais (dNTPs), são adicionados
dideoxinucleotídeos (ddNTPs) à reação. Esses ddNTPs não possuem o radical
hidroxila (OH) ligada ao carbono 3’ da pentose (Figura 2). Assim, quando um
desses nucleotídeos é inserido na nova fita, a síntese do DNA é interrompida,
pois a TaqDNA polimerase não consegue inserir um novo nucleotídeo6,7.
148
OCH2 O Base OCH2 O Base
H H H H H H H H
H H
Figura 2. Moléculas de dideoxinucleotídeos (ddNTPs) e deoxinucleotídeos (dNTPs).
Atualmente, se utiliza uma detecção automatizada da sequência de nucleo-

tídeos obtida, onde cada ddNTP é marcado com um fluoróforo distinto e a
sequência de nucleotídeos marcados é identificada num sequenciador auto-
mático. A separação dos fragmentos é realizada por eletroforese capilar7. Os
fragmentos de DNA marcados com os fluoróforos migram ordenadamente
de acordo com seu tamanho no interior dos capilares. São excitados por um
feixe de laser e emitem colorações distintas que permitem a identificação
das quatro bases nitrogenadas. A informação é transmitida para um compu-
tador e, ao final da corrida, obtemos um eletroferograma correspondente à
sequência de bases dos fragmentos de interesse6,7 (Figura 3).
110 120 130 140 150 160 170 180 190 200
A C C T G AT C C T G A G C C G G A A C C C G A G G T G G T G C C T G A A C C G C T G A A A GA G G C G C C G G T G G T G AT C C ATA A A C C G G A A C C G A A G C C G A A G C C TA A A C C C A A A C C G A A A C C C
Figura 3. Exemplo de eletroferograma de sequenciamento de fragmento de DNA

bacteriano.
A análise da sequência de nucleotídeos gerada pode ser realizada através de

um alinhamento da sequência com um DNA de referência. Assim, é possível
observar as identidades e diferenças nas sequências nucleotídicas, podendo
determinar a variante alélica ou observar a presença de mutações, inserções
ou deleções em um determinado gene que podem estar associadas ao de-
senvolvimento de resistência aos antimicrobianos6,7.
Existem algumas ferramentas disponíveis na internet para a realização deste

alinhamento, como por exemplo, o BLAST (“Basic Local Alingment Sequence
Tool”) na plataforma do NCBI (“National Center for Biotechnology Informa-
tion”) (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) e o CLUSTAL W (https://www.
genome.jp/tools-bin/clustalw).
149
6.2 Métodos para avaliação da epidemiologia molecular de bactérias

multirresistentes
A avaliação da diversidade genética entre os isolados bacterianos multirresistentes

aos antimicrobianos é fundamental para a caracterização de surtos de infecção, ava-
liação de possíveis fontes de transmissão e aquisição desses patógenos, além da ob-
servação da prevalência de grupos clonais em determinados locais, visando o moni-
toramento da emergência e disseminação de bactérias multirresistentes9,10,11,12.
Os métodos de tipagem molecular são os mais recomendados para estudos epide-

miológicos, pois são menos sujeitos a variações que os métodos fenotípicos e apre-
sentam maior poder discriminatório, maior reprodutibilidade e, em alguns casos,
permitem o estabelecimento de bancos de dados. Existem quatro gerações de mé-
todos de tipagem molecular. Um dos primeiros métodos utilizados foi a análise do
perfil plasmidial, depois vieram os métodos envolvendo o uso de enzimas de res-
trição (RFLP, “Restriction Fragment Length Polymorphism”) e de sondas genéticas
(Ribotipagem). Outra metodologia amplamente utilizada para tipagem molecular
é a técnica de macrorrestrição de DNA seguida de eletroforese em campo pulsado
(PFGE, “Pulsed-Field Gel Electrophoresis”). Métodos baseados em amplificação por
PCR de genes housekeeping seguida de sequenciamento desses genes (por exem-
plo: MLST, “Multilocus Sequence Typing”) também são utilizados como técnicas de
tipagem molecular. Atualmente, é possível avaliar a diversidade genética através de
abordagens baseadas no sequenciamento do genoma total7.
6.2.3 Metodologias baseadas em padrões de bandas: macrorrestrição de DNA

seguida de PFGE
Os métodos de tipagem de isolados bacterianos baseados no perfil de ban-
das geralmente envolvem a fragmentação de DNA cromossômico pela diges-
tão com enzimas de restrição. Estas enzimas reconhecem precisamente uma
região específica no DNA e clivam em uma sequência definida. A utilização
de enzimas de restrição de ação rara no DNA gera um número relativamente
pequeno de fragmentos de alto peso molecular, cerca de 10Kbp–1Mbp (ma-
crorrestrição), os quais necessitam de um sistema de eletroforese pulsada
(PFGE) para serem separados e gerar um padrão de bandas distinto. Devido
ao seu alto poder discriminatório e boa reprodutibilidade, a macrorrestrição
de DNA seguida de PFGE é o método baseado em padrões de bandas mais
utilizado para tipagem molecular de bactérias.
Ö Extração de DNA cromossômico
Para essa metodologia, é necessário que o DNA cromossômico bacteriano

esteja livre de impurezas e intacto, ou seja, sem que ocorram quebras ines-
150
pecíficas. Para isso, as células bacterianas são aprisionadas em blocos de

agarose aonde ocorrerá a lise celular, digestão da parede celular e de pro-
teínas, restando apenas o DNA íntegro que será submetido à digestão pela
enzima de restrição.
Ö Corrida eletroforética
Em uma eletroforese convencional, os fragmentos de DNA com alto peso

molecular (superior a 20 Kbp) migram com a mesma mobilidade, por isso ne-
nhuma separação dessas bandas pode ser observada. Como os fragmentos
gerados por enzimas de ação rara no cromossomo superam esse peso mo-
lecular, é necessário fazer uma eletroforese com alternância de orientação
do campo elétrico para que as moléculas consigam migrar adequadamen-
te pela agarose. Essas alternâncias de orientação do campo elétrico causam
alterações na estrutura dos fragmentos, que, por sua vez, se alongam e se
contraem alternadamente. O tempo para que ocorram essas modificações
estruturais varia de acordo com o peso molecular, para tanto, a duração do
pulso elétrico em determinada orientação e o tempo da corrida eletroforé-
tica devem ser padronizados para cada espécie, de acordo com o tamanho
dos fragmentos de DNA esperados.
Para realizar essa eletroforese, o equipamento mais utilizado é o “CHEF DRIII”

(Biorad), que possui uma cuba de eletroforese com eletrodos dispostos he-
xagonalmente permitindo a alternância da direção do campo elétrico com
gradiente de voltagem constante no gel.
Ö Análise dos dados
Após corrida eletroforética, os fragmentos de DNA são marcados com inter-

calantes de DNA, como brometo de etídio e é feita a observação dos perfis
eletroforéticos, através de uma inspeção visual e uma análise automatizada.
A análise automatizada permite relacionar os perfis de fragmentação através
de um dendograma.
Para a avaliação de surtos, Tenover e colaboradores (1995)13 estabeleceram

alguns critérios de interpretação dos perfis de bandas gerados no PFGE: iso-
lados pertencentes a um mesmo surto ou epidemia apresentam perfis de
fragmentação do DNA cromossômico indistinguíveis; um isolado bacteria-
no é considerado intimamente relacionado a outro, provavelmente fazendo
parte do surto, quando ocorre apenas um evento genético (mutação, dele-
ção, inserção e rearranjos) que gera de uma a três bandas de diferença no
perfil de fragmentação; microrganismos são considerados possivelmente
151
relacionados, quando os isolados se diferenciam por quatro bandas (que re-

presentam dois eventos genéticos independentes). Isolados com diferenças
de mais de cinco bandas (sugestivo de mais de três eventos genéticos) são
ditos como não relacionados e não pertencentes ao mesmo surto. Essa e
outras definições, no entanto, devem ser apenas um dos componentes de
uma avaliação epidemiológica, onde uma análise acurada deve incluir todos
os dados clínicos disponíveis13.
6.2.4 Técnicas baseadas em sequenciamento de genes: MLST

As técnicas de sequenciamento de genes housekeeping podem ser utilizadas
para estudos de diversidade genética das bactérias. Essas técnicas possuem
a vantagem de serem baseadas em dados não ambíguos, ou seja, sequên-
cias únicas de DNA, sendo mais fácil a interpretação quando comparadas
com os métodos que envolvem padrões de bandas. Além disso, são bastante
reprodutíveis, independentemente dos equipamentos e kits comerciais de
amplificação e sequenciamento utilizados. Os dados gerados pelas técnicas
de sequenciamento de genes housekeeping podem ser depositados em ban-
cos de dados, e assim, serem comparados com resultados obtidos em dife-
rentes laboratórios em todo o mundo14.
MLST é uma técnica que se baseia na amplificação e sequenciamento de ge-

nes conservados entre os isolados de uma mesma espécie, onde as muta-
ções pontuais (SNPs) são acumuladas de maneira mais lenta. Dessa forma,
essa metodologia é adequada para estudos filogenéticos, para investigações
epidemiológicas de longos períodos e de isolados não relacionadas geogra-
ficamente, enquanto que a macrorrestrição de DNA seguida de PFGE é mais
utilizada para investigações de surtos locais14.
Existem esquemas de MLST descritos para diversas bactérias Gram-negati-

vas e Gram-positivas, e o número de genes incluídos é variável de acordo
com a espécie. Por exemplo, nas espécies Klebsiella pneumoniae, Pseudomo-
nas aeruginosa e Acinetobacter baumannii são sete genes incluídos no esque-
ma. Assim, nessa metodologia, um fragmento interno de aproximadamente
450-500 bp de cada um dos genes é sequenciado e a sequência encontrada
é comparada com as depositadas no banco de dados. Para cada sequência
diferente de cada gene, é dado um número de alelo. Assim, a combinação
dos números de alelos de cada gene gera o ST (“Sequence Type”), que pode
ser comparado com os STs já descritos em bancos de dados. Os bancos de
dados que contêm o maior número de espécies e isolados são os curados
pelo Instituto Pasteur – Paris, França (www.pasteur.fr/mlst) e o banco Pub-
MLST, disponível no site http://pubmlst.org/.
152
Através dessa metodologia, e com a ajuda dos bancos de dados, já foi pos-
sível identificar alguns clones multirresistentes circulantes mundialmente. O
clone ST131 de E. coli tem sido associado a disseminação da ESBL CTX-M-15
em diferentes partes do mundo8. A disseminação da carbapenemase KPC
em isolados de K. pneumoniae também tem sido associada a um comple-
xo clonal, o CC258, que já foi descrito nas Américas, na Europa e na Ásia,
e alguns dos STs pertencentes a esse complexo clonal (ST437 e ST11) têm
sido considerados os mais prevalentes circulando no Brasil carreando o gene
blaKPC. Um complexo clonal é formado por STs filogeneticamente bem próxi-
mos, com diferenças em apenas um ou dois genes analisados no MLST (de-
pendendo da espécie). Em A. baumanni, os complexos clonais CC109 e CC92,
inicialmente encontrados na Europa, denominados de clone epidêmico glo-
bal (GC) 1 e 2 respectivamente, têm sido observados em diferentes partes
do mundo. O mesmo também tem sido observado para MRSA, a maioria dos
clones epidêmicos pertence a oito principais complexos clonais CC1, CC5,
CC8, CC22, CC30, CC45, CC59 and CC8010.
6.2.5 Técnicas baseadas em Sequenciamento de Nova Geração

O sequenciamento de Sanger foi uma das primeiras metodologias propostas
para o sequenciamento de DNA e tem sido extensivamente utilizada para
determinação de alelos de genes. Isso significa que apenas uma pequena
fração do genótipo de um indivíduo, usualmente aqueles genes que foram
selecionados, é avaliada. Com o intuito de superar essa problemática, as no-
vas metodologias de sequenciamento em massa de DNA têm sido utilizadas
para diferenciação dos isolados. Todas as metodologias de sequenciamento
do genoma total que surgiram após o método de Sanger são chamadas de
Sequenciamento de Nova Geração (NGS, “New Generation Sequencing”)15.
A primeira geração de sequenciadores era composta pela automatização do

sequenciamento de Sanger, com a plataforma ABI 3700, o primeiro sequen-
ciador utilizando eletroforese capilar. Na segunda geração de sequenciado-
res destacam-se as plataformas 454 da Roche, IonTorrent da Life Techonolo-
gies e MiSeq/HiSeq da Illumina, baseadas nas metodologias de pirosequen-
ciamento, alteração de pH e sequenciamento em ponte, respectivamente,
sendo que o mais utilizado atualmente é o Miseq da Illumina.
A tecnologia 454 que, conforme mencionado, utiliza a metodologia de piro-

sequenciamento, se difere do método de Sanger pelo fato de que se baseia
na detecção da liberação de pirofosfato quando ocorre a incorporação de
nucleotídeos, ao invés da terminação da cadeia com dideoxinucleotídeos. O
DNA total é fragmentado e, em seguida, sequências adaptadoras são ligadas
nas extremidades. O DNA então é amplificado em beads microscópicas, atra-
153
vés de PCR em emulsão. Nessa tecnologia, a síntese de DNA é mediada pelas

enzimas (ATP sulfurilase e luciferase) e os substratos (adenosina 5’ fosfosul-
fato e luciferina). Durante a adição de um nucleotídeo, o grupo pirofosfato é
liberado e gera a produção de luz detectável15.
O IonTorrent é um pHmetro de DNA. Através de chips semicondutores, o

equipamento é capaz de detectar a alteração mínima de pH pela liberação
de íons de hidrogênio (H+) toda vez que a DNA polimerase insere um nucleo-
tídeo e o sinal químico é transformado em digital. Esta técnica elimina o uso
de nucleotídeos marcados e lasers. O DNA total é fragmentado, ligado a uma
bead e inseridas nos poços do chip, todos os reagentes para polimerização
da cadeia de DNA são adicionados à reação e a liberação de H+ é captada
sempre que um nucleotídeo diferente é inserido. Para isso, é adicionado um
nucleotídeo por vez, A, T, C ou G. Se o nucleotídeo não for adicionado, não
ocorre alteração de pH e ele é retirado da reação, que logo em seguida insere
o próximo nucleotídeo15.
Os equipamentos MiSeq e HiSeq baseiam-se no sequenciamento através de

PCR em ponte. Inicialmente, o DNA total é fragmentado e, a esse DNA, são
ligados adaptadores (um diferente em cada uma das extremidades, 5’ e 3’),
que permitem a fixação dos fragmentos de DNA à placa de sequenciamen-
to, onde se encontram adaptadores complementares fixados. Após o anela-
mento, uma estrutura em ponte é formada. Os nucleotídeos marcados com
fluoróforos distintos são inseridos pela DNA polimerase e a leitura do sinal
da fluorescência é captada. Após o término do primeiro ciclo, essa estrutura
em ponte é desfeita. Subsequentemente, 35 ciclos são repetidos, o que gera
aproximadamente mil cópias de cada fragmento, formando um cluster. A lei-
tura da sequência de bases é realizada através da análise sequencial das ima-
gens capturadas em cada ciclo. A plataforma MiSeq gera até 7 gigabases de
dados em cada corrida, o que a torna mais adequada ao estudo de genomas
bacterianos. Já a plataforma HiSeq é mais robusta, possibilitando a geração
de 300 gigabases de dados, para cada corrida e tem sido utilizada para o
sequenciamento de genomas maiores e mais complexos, como o genoma
humano15.
A terceira geração de sequenciadores é composta pela metodologia de mo-

lécula única em tempo real, do inglês “Single-Molecule Real-Time” (SMRT),
desenvolvida pela Pacific BioSciences (PacBio), podendo ser chamada de se-
quenciamento SMRT ou sequenciamento PacBio. A reação ocorre em uma
célula contendo cerca de 150.000 poços, que são chamados de “Zero-Mode
Wave guides” (ZMWs). O DNA alvo é fragmentado e ligado a adaptadores
que transformam as fitas em moldes circulares, para que então ocorra o se-
154
quenciamento. Para o sequenciamento, são utilizados a DNA polimerase e

os nucleotídeos marcados fluorescentemente. A fluorescência é detectada
por um laser na parte inferior de cada ZMWs, sendo a leitura mostrada em
tempo real15.
A quarta geração de sequenciadores é composta pelo Nanopore da Oxford

(sequenciamento por nanoporos). Este sequenciador tem a vantagem de ser
portátil, o que permite sua utilização em qualquer lugar ou ambiente, pesa
cerca de 100 gramas e tem entrada USB para computador. Essa metodolo-
gia baseia-se na leitura de uma molécula de DNA conforme esta atravessa o
nanoporo. O DNA é colocado em uma membrana que possui os nanoporos.
É aplicada uma diferença de potencial entre os dois lados da membrana ge-
rando uma corrente iônica que passa pelos poros e é medida por sensores
do aparelho. A cada base nucleotídica que passa pelo poro é detectada uma
alteração na amperagem, que é característica de cada base, permitindo o
sequenciamento. Teoricamente, através dessa metodologia, é possível iden-
tificar todas as bases de uma molécula inteira.
O sequenciamento total do genoma (STG) bacteriano tem se tornado uma

chave poderosa para investigações epidemiológicas, pois permite acessar
várias informações de forma rápida e eficiente. Todas as metodologias for-
necem milhares de informações sobre o microrganismo em questão. Através
desses dados, é possível procurar por mecanismos de resistência cromossô-
micos ou carreados em elementos genéticos móveis; comparar as platafor-
mas genéticas responsáveis por essa disseminação; detectar genes de viru-
lência e; determinar a similaridade genética entre dois isolados16.
Entretanto, essas metodologias fornecem vários fragmentos de DNA (reads)

que necessitam ser unidos em uma sequência maior, porém os genomas
bacterianos possuem grande quantidade de sequências repetidas (como
elementos genéticos móveis), o que dificulta a montagem pela sobrepo-
sição destas regiões. Assim, muitas vezes, a união dos fragmentos obtidos
acaba gerando mais de uma sequência final (chamados de contigs). Após
gerar os contigs, é necessário encontrar os genes dentro do genoma através
da etapa de anotação gênica. Essa etapa inclui também a determinação da
função desses genes. Os resultados de cada etapa precisam passar por um
processo de curadoria, para validar os resultados obtidos. Para cada etapa
existe uma ferramenta computacional específica, que em sua maioria são
disponíveis para utilização no sistema operacional Linux7,8,15.
155

1. Lorenz TC. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and
Optimization Strategies. J Vis Exp. 2012; (63): 3998.
2. Polymerase Chain Reaction (PCR). National Center for Biotechnology Information, NCBI.
Disponível em (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techpcr/)
3. Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Biologia Molecular da Célula.

Traduzido por Ana Letícia Vaz. 5 ed. Artmed. 2010.
4. Kralik P, Ricchi MA. Basic Guide to Real Time PCR in Microbial Diagnostics: Definitions,
Parameters, and Everything. Front Microbiol. 2017; 8:108.
5. Pettersson E, Lundeberg J, Ahmadian A. Generations of sequencing technologies.

Genomics. 2009; 93(2):105-11.
6. Didelot X, Bowden R, Wilson D, Peto TE, Crook D. Transforming clinical microbiology

with bacterial genome sequencing. Nat Rev Genet. 2012;13(9):601-12.
7. Swerdlow H, Wu SL, Harke H, Dovichi NJ. Capillary gel electrophoresis for DNA
sequencing. Laser-induced fluorescence detection with the sheath flow cuvette. J
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8. Banerjee R, Johnson Jr. A New Clone Sweeps Clean: The Enigmatic Emergence of
Escherichia coli ST131. Antimicrob Agents Chemother. 2014; 58(9):4997-5004.
9. Boswihi S, Udo E. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: an update on the

epidemiology, treatment options and infection control. Curr Med Res Pract. 2018: 8:18-
24.
10. Li W, Raoult D, Fournier P. Bacterial strain typing in the genomic era. FEMS Microbiol
Rev. 2009; 33: 892–916.
11. Thomson N, Weill FX, Holt KE. Genomic insights into the emergence and spread of
antimicrobial-resistant bacterial pathogens. Science. 2018; 360(6390):733-738.
12. Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV. How to select and interpret molecular strain typing
methods for epidemiological studies of bacterial infections: a review for healthcare
epidemiologists. Molecular Typing Working Group of the Society for Healthcare
Epidemiology of America. Infect Control Hosp Epidemiol. 1997;18(6):426-39.
13. Maiden MC, BygravesJ, Feil E, Morelli G, Urwin R, Zhang Q, Zhou J, Zurth K, Caugant Da,
Feavers I, Achtman M, Spratt B. Multilocus sequence typing: a portable approach to the
identification of clones within populations of pathogenic microorganisms. Proc Natl
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14. Shendure J, Ji H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 2008; 26(10):1135-

45.
156
Vídeos Ilustrativos
Com o objetivo de facilitar a compreensão das principais técnicas laboratoriais des-

critas neste módulo, estão apresentados a seguir vídeos ilustrativos, correspondentes
a cada capítulo.
• Capítulo 4:
Disco difusão
Autoria: EUCAST
Descrição: Apresenta-se aqui a metodologia de disco difusão (Kirby-Bauer), para a

realização do teste de susceptibilidade aos antimicrobianos. Os vídeos incluem deta-
lhes sobre a preparação do inóculo, a inoculação das placas, a aplicação dos discos e
a incubação das placas. Além disso, orienta como fazer a leitura das zonas de inibição
e a interpretação dos resultados.
Link para acesso: https://www.youtube.com/watch?v=GXlpwj5f11k&list=PLQU_

kWRWBld694u9cLr4asinonWSzr9Rf&index=6
Microdiluição em Caldo
Autoria: Prof. Dr. Marcelo Pillonetto – Laboratório Central do Estado do Paraná (LACEN/
PR) e Pontifícia Universidade Católica do Paraná (PUCPR)
Descrição: Apresenta-se aqui a metodologia de preparo, inoculação e leitura de pla-

cas de microdiluição em caldo, conforme as orientações do EUCAST/BrCAST, para de-
terminar a susceptibilidade à Polimixina B. O ouvinte deve estar atento para o fato
157
de que, embora baseado em recomendações padronizadas, pode haver variações na

metodologia como o uso de vidrarias, pipetas, volumes e descartáveis alternativos
aos aqui apresentados.
Link para acesso: https://youtu.be/QwHk6VM1leo
• Capítulo 5:
Teste fenotípico colorimétrico de detecção de carbapenemases: CarbaNP
Autoria: Dra. Ana Paula D’ Alincourt Carvalho Assef e Dr. Cláudio Marcos Rocha de
Souza – Instituto Oswaldo Cruz
Descrição: Apresenta-se o passo a passo para a execução do teste colorimétrico

CarbaNP que é um teste fenotípico rápido para detecção da produção de carbapene-
mases em Enterobactérias e Pseudomonas e baseia-se na visualização da hidrólise do
imipenem pela carbapenemase através da alteração do pH e consequente mudança
da cor do indicador de pH vermelho de fenol. Para este teste, é necessária uma lise
celular prévia.
Link para acesso: https://youtu.be/t_sQslieNuU
Teste fenotípico colorimétrico de detecção de carbapenemases: BlueCarba
Descrição: Apresenta-se o passo a passo para a execução do teste colorimétrico

BlueCarba que é um teste fenotípico rápido para a detecção da produção de carbape-
nemases em Enterobactérias e Pseudomonas. Este teste é um derivado do teste Carba
NP e baseia-se na visualização da hidrólise do imipenem pela carbapenemase através
da alteração do pH e consequente mudança da cor do indicador de pH azul de bro-
motimol. Diferente do CarbaNP, o Blue carba não necessita de lise bacteriana prévia.
Link para acesso: https://youtu.be/g0NNxy4lbjg
Teste fenotípico colorimétrico de detecção da resistência às polimixinas: Rapid

polymyxin NP test
158
Descrição: Apresenta-se o passo a passo para a execução do teste colorimétrico Rapid

polymyxin NP test que é um teste fenotípico de detecção rápida da resistência às
polimixinas em Enterobactérias. Este teste baseia-se detecção do crescimento bac-
teriano na presença de colistina através da observação da metabolização da glicose,
com alteração do pH e consequente mudança de cor do indicador de pH vermelho
de fenol.
Link para acesso: https://youtu.be/T5Bjl82Gk2o
mCIM, eCIM e sCIM
Autoria: Prof. Dra. Andreza Francisco Martins e Otávio von Ameln Lovison –
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Descrição: Neste vídeo estão apresentados os procedimentos para a realização das

técnicas MCIM, ECIM e SCIM utilizadas para a pesquisa de carbapenemases. Detalham-
se todas as etapas de desenvolvimento metodológico e interpretação dos resultados.
O ouvinte deve estar atento para o fato de que, embora baseado em recomendações
padronizadas, pode haver variações na metodologia como o uso de vidrarias, pipetas
e descartáveis alternativos aos aqui apresentados.
Link para acesso: https://youtu.be/-dvNmLepHFc
Detecção de carbapenemases através da utilização de inibidores enzimáticos
Autoria: Prof. Dra. Andreza Francisco Martins e Otávio von Ameln Lovison –
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Descrição: Neste vídeo estão apresentados os procedimentos para a realização da

pesquisa de carbapenemases utilizando inibidores/potenciadores enzimáticos: ácido
fenilborônico, EDTA e cloxacilina. Detalham-se todas as etapas de desenvolvimento
metodológico e interpretação dos resultados. Indica-se bibliografia complementar
para consulta, especialmente no preparo dos insumos. O ouvinte deve estar atento
para o fato de que, embora baseado em recomendações padronizadas, pode haver
variações na metodologia como o uso de vidrarias, pipetas e descartáveis alternati-
vos aos aqui apresentados.
Link para acesso: https://youtu.be/SY7dPNQICNk
159
• Capítulo 6:
PCR multiplex convencional para a detecção de genes de carbapenemases
Descrição: Apresenta-se o passo a passo para a execução da técnica de PCR multi-

plex convencional para a detecção de três genes de carbapenemases (blaKPC, blaNDM
e blaOXA-48), desde a extração do DNA até a visualização dos produtos amplificados.
Este teste pode ser usado para a detecção de genes de carbapenemases assim como
outros genes de resistência de interesse epidemiológico, e baseia-se na amplificação
in vitro de fragmentos específicos de DNA.
Link para acesso: https://youtu.be/WQw-u-7aR_k
PCR em tempo real (qPCR)
Autoria: Prof. Dr. Marcelo Pillonetto – Laboratório Central do Estado do Paraná (LACEN/
PR) e Pontifícia Universidade Católica do Paraná (PUCPR)
Descrição: Metodologia aplicada para a pesquisa genotípica de genes de resistência

por técnicas moleculares. Foi utilizado, a título de exemplo, a pesquisa dos genes de
carbapenemases, que codificam as enzimas KPC, NDM e o gene de resistência móvel
à colistina, mcr-1. O ouvinte deve estar atento para o fato de que, embora baseado
em um protocolo oficial (CDC), pode haver variações na metodologia como volume
de reagentes e equipamentos, uso de vidrarias, pipetas e descartáveis alternativos
aos aqui apresentados.
Link para acesso: https://youtu.be/B-cEFNwax1A
160
Agência Nacional de Vigilância Sanitária - Anvisa
SIA Trecho 5 - Área especial 57 - Lote 200
CEP: 71205-050
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Telefone: 61 3462 6000
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MICROBIOLOGIA CLÍNICA PARA O

CONTROLE DE INFECÇÃO RELACIONADA À

Agência Nacional de Vigilância Sanitária | Anvisa

MICROBIOLOGIA CLÍNICA PARA

Elaboração, distribuição e informações:

Brasil. Agência Nacional de Vigilância Sanitária

1. Infecção Relacionada à Assistência à Saúde – Controle. 2. Infecção em Serviços de Saúde. 3. Microbiolo-

Capítulo 2: Bases moleculares da resistência bacteriana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

Capítulo 3: Microrganismos multirresistentes de importância clínica e suas

Capítulo 4: Teste de sensibilidade aos antimicrobianos (TSA). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

4.2 Métodos quantitativos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93

APÊNDICE CAPÍTULO 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109

Capítulo 5: Outros testes para detecção fenotípica de resistência bacteriana aos

Capítulo 6: Testes genotípicos para a detecção de mecanismos de resistência e

Capítulo 7: Vídeos Ilustrativos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157

importância médica; Módulo 8 – Detecção e identificação de fungos de importância médica e

De acordo com Charles Darwin, a premissa básica da evolução é a adaptação, o que,

A ocorrência e emergência de bacilos Gram-negativos multirresistentes tem se reve-

No Brasil, de acordo com dados do Boletim de Segurança do Paciente e Qualidade

É imprescindível ressaltar que não apenas a ampla utilização de antimicrobianos em

Realmente, é necessário que se tenha uma visão holística da problemática da resis-

Entendendo a importância fundamental desse olhar global sobre a questão da re-

Nesse sentido, foi proposto pela Secretaria de Vigilância em Saúde a criação do

As bactérias apresentam mecanismos de resistência complexos, que envolvem a di-

Diante do cenário apresentado, nunca o laboratório de Microbiologia Clínica foi tão

É importante, por exemplo, que os laboratórios tenham ferramentas que permitam o

e a Secretaria de Vigilância em Saúde (SVS), foi criado o sistema Gerenciador de

Em relação às técnicas de determinação da sensibilidade das bactérias aos antimi-

Ö Em 1991, foi desenvolvido o primeiro método comercial (Teste Epsilométri-

mecanismos de resistência específicos, e, para isso, testes adicionais são necessários.

A exemplo da descoberta dos antimicrobianos, a Biologia Molecular foi outro avanço

A Reação em Cadeia da Polimerase (“Polymerase Chain Reaction” – PCR) pode ser

As ferramentas de Biologia Molecular também podem ser utilizadas para compreen-

processo, escolhendo e executando de forma adequada as metodologias atualmente

Diante do exposto, fica claro que a resistência bacteriana aos antimicrobianos é um

1.1 Referências bibliográficas

3. Holmes, AH; Moore, LSP; Sundsfjord, A; Steinbakk, M et al. Understanding the

6. Perez F, Bonomo RA. Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae: global action required.

7. Brasil, Anvisa. Boletim de Segurança do Paciente e Qualidade em Serviços de Saúde

8. World Health Organization. Global Antimicrobial Resistance Surveillance System:

11. Brasil, Ministério da Saúde. Plano de Ação Nacional de Prevenção e Controle da

15. Tamma PD & Simner PJ. Phenotypic Detection of Carbapenemase-Producing

16. Bilozor A, Balode A, Chakhunashvili G, Chumachenko T, Egorova S, et al. Application

Entende-se por resistência bacteriana a capacidade de um microrganismo de se de-

As bactérias podem apresentar resistência intrínseca ou adquirida aos antimicrobia-

Resistência adquirida ocorre quando uma bactéria previamente sensível a deter-

2.1 Mecanismos de resistência aos antimicrobianos

A resistência aos antimicrobianos pode ocorrer por diferentes mecanismos, tais

2.1.1 Alteração da permeabilidade celular ao antimicrobiano

A membrana externa das bactérias Gram-negativas é a primeira linha de de-

A entrada de muitos antimicrobianos, como por exemplo os β-lactâmicos, na

Um exemplo é o desenvolvimento de resistência ao imipenem em Pseudo-

Algumas vezes, as alterações na expressão de determinadas porinas podem

No entanto, a associação da diminuição da permeabilidade com outros me-

2.1.2 Remoção do antimicrobiano por bombas de efluxo

Os sistemas de efluxo são formados por transportadores proteicos que fun-

Existem cinco grandes famílias de sistemas de efluxo classificadas de acordo

Enquanto alguns sistemas de efluxo são específicos para um determinado

A maioria dos sistemas de efluxo é codificada por genes cromossômicos, po-