Laboratório de

Microbiologia Geral
e Clínica Aplicada
à Farmácia
 Material Teórico
Introdução à Microbiologia

Responsável pelo Conteúdo:

Prof.ª Me. Camilla de Paula Pereira Uzam

Revisão Textual:
Prof.ª Dr.ª Selma Aparecida Cesarin
 Introdução à Microbiologia

• Introdução da Unidade;
• Anexo I;
• Orientações para Leitura Obrigatória.

OBJETIVOS DE APRENDIZADO
• Desenvolver as habilidades para o manuseio adequado das vidrarias e equipamentos
de Laboratório, além de conhecer as técnicas adequadas de preparo e da manutenção
de culturas;
• Promover o raciocínio crítico e integrar o conhecimento básico de Microbiologia, por meio
da avaliação e da reflexão dos resultados das práticas realizadas;
• Reconhecer as rotinas de Laboratório e as regras de biossegurança;
• Desenvolver novas formas de estudo, o trabalho em grupo, a comunicação oral e escrita.
 Orientações de estudo
Para que o conteúdo desta Disciplina seja bem
aproveitado e haja maior aplicabilidade na sua
formação acadêmica e atuação profissional, siga
algumas recomendações básicas:
Conserve seu
material e local de
estudos sempre
organizados.
Aproveite as
Procure manter indicações
contato com seus de Material
colegas e tutores Complementar.
para trocar ideias!
Determine um Isso amplia a
horário fixo aprendizagem.
para estudar.

Mantenha o foco!
Evite se distrair com
as redes sociais.

Seja original!
Nunca plagie
trabalhos.

Não se esqueça
de se alimentar
Assim: e de se manter
Organize seus estudos de maneira que passem a fazer parte hidratado.
da sua rotina. Por exemplo, você poderá determinar um dia e
horário fixos como seu “momento do estudo”;

Procure se alimentar e se hidratar quando for estudar; lembre-se de que uma

alimentação saudável pode proporcionar melhor aproveitamento do estudo;

No material de cada Unidade, há leituras indicadas e, entre elas, artigos científicos, livros, vídeos
e sites para aprofundar os conhecimentos adquiridos ao longo da Unidade. Além disso, você tam-
bém encontrará sugestões de conteúdo extra no item Material Complementar, que ampliarão sua
interpretação e auxiliarão no pleno entendimento dos temas abordados;

Após o contato com o conteúdo proposto, participe dos debates mediados em fóruns de discus-
são, pois irão auxiliar a verificar o quanto você absorveu de conhecimento, além de propiciar o
contato com seus colegas e tutores, o que se apresenta como rico espaço de troca de ideias e de
aprendizagem.
UNIDADE Introdução à Microbiologia

Introdução da Unidade
A Química Orgânica está presente em nosso dia a dia de forma muito inten-
sa, desde os alimentos que consumimos, combustíveis que utilizamos, roupas que
vestimos, móveis e diversos outros produtos. Nosso organismo funciona graças às
diversas reações orgânicas, que classificamos como bioquímicas, “bio” por serem
reações que ocorrem no organismo vivo.

Para o farmacêutico, em especial, a Química Orgânica é a base para diversas

outras áreas como a Farmacotécnica, a Química Medicinal e a Bioquímica.

Esse material apresenta a sugestão de várias atividades práticas, além de algu-

mas informações sobre Práticas Laboratoriais.

Seja proativo e estude o material, inclusive as leituras complementares, e partici-

pe das práticas propostas, que serão fundamentais para a sua formação.

Segurança no Laboratório
• É obrigatório o uso do EPIs para permanecer nos Laboratórios de Microbiolo-
gia: avental de manga longa, touca, óculos de proteção, luvas e máscara fazem
parte da rotina desse Laboratório;
• Os sapatos devem ser fechados e todas as partes do corpo devem estar pro-
tegidas, portanto, não é permitido bermudas e saias nos Laboratórios. Para
as alunas que, por motivos religiosos, não utilizam calças, providenciar uma
legging para colocar embaixo da saia durante as aulas para proteger as pernas;
• Os cabelos devem estar presos;
• Não é permitido o uso de celular durante as aulas;
• No Laboratório de Microbiologia não é permitido comer, beber, fumar, aplicar
cosméticos ou levar à boca qualquer objeto no Laboratório ou que possa ter
sido contaminado na bancada de trabalho;
• Não colocar as mãos na boca nem coçar os olhos;
• Lavar bem as mãos e os antebraços antes e após os procedimentos;
• Todo e qualquer incidente deverá ser comunicado ao docente responsável e,
no caso e quebra de placa ou tubo de ensaio contendo soluções contaminadas,
deve-se deixar o material no local até a orientação do docente e/ou do técnico;
• No Laboratório de Microbiologia, trabalha-se com microrganismos potencial-
mente patogênicos, devendo-se ter sempre cuidado para evitar uma possível
contaminação (a boca é porta de entrada para muitas infecções);
• Na bancada de trabalho, não deve haver acúmulo de objetos, nela permanecendo
apenas os indispensáveis para o experimento em execução.

8
 Biossegurança
Todas as ações realizadas para prevenir, controlar, diminuir e eliminar riscos à
saúde e meio ambiente, provenientes de atividades como procedimentos labora-
toriais, manuseio de produtos químicos e biológicos e trato com o paciente, entre
outros, são interesse da biossegurança.

Biossegurança: é o conjunto de medidas voltadas para ações de prevenção, minimização

Explor

ou eliminação de riscos inerentes às atividades de pesquisa, produção, ensino, desenvolvi-

mento tecnológico e prestação de serviços, que podem comprometer a saúde do homem,
dos animais e do meio ambiente ou a qualidade dos trabalhos desenvolvidos (BRASIL, 2017).

Adotar as Boas Práticas Laboratoriais garante a execução de procedimentos e

ações adequadas para garantir a biossegurança e, consequentemente, a proteção à
vida. A segurança depende de todos.

Um acidente é um evento não previsto que acontece e pode levar a danos pes-
soais, patrimoniais ou ao meio ambiente, por exemplo, um corte com fragmento
de vidraria, uma queimadura com ácido, uma lesão causada ao tentar reencapar
uma agulha de medicação. Todo acidente, mesmo os leves, devem ser investigados
e ações tomadas para que não ocorram repetições.

Consideramos agentes de risco quaisquer componentes que podem compro-

meter a saúde do homem, animais e meio ambiente, independentemente de sua
origem (químicos, biológicos, físicos e radioativos).

Orientações gerais de segurança

• No Laboratório de Microbiologia, o uso do EPI é imprescindível. Avental, touca,
luva, óculos de proteção e máscara fazem parte da rotina desse Laboratório;
• Todo e qualquer incidente deverá ser comunicado ao docente responsável e no
caso de quebra de placa ou tubo de ensaio contendo soluções contaminadas
deixar o material no local até a orientação do docente e/ou do monitor;
• No Laboratório de Microbiologia, não é permitido comer, beber, fumar,
aplicar cosméticos ou levar à boca qualquer objeto no Laboratório ou que
possa ter sido contaminado na Bancada de Trabalho. Os piercings expostos
devem ser retirados;
• Não utilizar o celular na Bancada de Trabalho e não segurar o telefone ou ma-
nipular qualquer outro objeto externo à área analítica quando estiver com luvas;
• As unhas devem estar cortadas e limpas;
• No Laboratório de Microbiologia, trabalha-se com microrganismos potencial-
mente patogênicos, devendo-se ter sempre cuidado para evitar uma possível
contaminação (a boca é porta de entrada para muitas infecções);

9
9
UNIDADE Introdução à Microbiologia

• Na Bancada de Trabalho, não deve haver acúmulo de objetos, nela permane-

cendo apenas os indispensáveis para o experimento em execução.

Sempre lavar as mãos com água e sabão antes e após a realização de cada pro-
cedimento.

Figura 1 – Técnica de higienização das mãos

Fonte: anvisa.gov.br

10
 É importante observar, ainda:
• É proibido pipetar com a boca;
• Não armazenar alimentos e artigos de uso pessoal no Laboratório: mochilas e bol-
sas devem ser armazenadas nos locais indicados pelo técnico e/ou pelo professor;
• Não utilizar os ventiladores durante os procedimentos;
• Não manter plantas e animais que não são relacionados ao trabalho na área
analítica;
• Descontaminar as superfícies das Bancadas de Trabalho antes e após os pro-
cedimentos e sempre que houver respingos ou derramamentos.

Importante! Importante!

Alguns procedimentos, como a centrifugação, formam aerossóis, nos quais microrga-

nismos podem estar dispersos. Evitar, sempre que possível, essa formação e, em casos
inevitáveis, aguardar cerca de 10 minutos para conduzir o experimento e usar máscara
de filtração adequada.

Descontaminação
Os ambientes e os equipamentos devem ser descontaminados diariamente e
após o uso. As soluções mais utilizadas são o álcool 70% e a solução de hipoclorito,
mas é importante avaliar o contaminante que está sendo manipulado para escolha
do agente de limpeza adequado.

As soluções com agentes contaminantes devem ser inativadas (por autoclavação

ou descontaminação química) antes de descartadas, obedecendo regras de descarte
quando contiverem agentes químicos que não podem ser desprezados no lixo comum.

Os jalecos utilizados durante procedimentos com agentes biológicos devem ser

segregados até a descontaminação (não colocar o avental diretamente na bolsa ou
dentro de armários).

Cabines de segurança biológica

As cabines, estruturas muito parecidas com as capelas de exaustão, são utiliza-
das para a manipulação de produtos biológicos, protegendo o ambiente e o mani-
pulador de aerossóis e borrifos com agentes infectantes, além de proteger também
o produto que está sendo manipulado de contaminação externa.

A grande diferença das cabines de segurança quando comparadas às capelas

de exaustão de gases é a presença de filtros especiais denominados “filtros de alta
eficiência”, ou HEPA.

11
11
UNIDADE Introdução à Microbiologia

As cabines devem ser instaladas longe da área de circulação de pessoas e longe

da porta. Durante sua utilização, manter portas e janelas fechadas para que o fluxo
de ar não interfira na eficiência da cabine.

Observar, também, os seguintes tópicos para a utilização das cabines:

• Higienizar o interior da cabine antes e após cada procedimento;
• Ligar a cabine 20 minutos antes da utilização e manter ligada por mais 20
minutos após o término do trabalho;
• Não armazenar objetos no interior da cabine;
• Não colocar cadernos, lápis, blocos e anotação, borracha, caneta ou quaisquer
outros materiais dentro da cabine.

Periodicamente, a cabine deve ser inspecionada e manutenções preventivas de-

vem ser realizadas para garantir a eficiência da filtração.

Tabela 1 – Comparação do tipo de cabine de segurança

biológica (CSB) quanto às características e indicação de uso
Classes
Velocidade Substâncias Proteção
Tipo Padrão de fluxo do ar de risco
frontal químicas do produto
biológico
0,38 a
Classe I Frontal: atrás e acima através do filtro HEPA Não 2e3 Não
0,5m/s
Classe II 70% do ar recirculado através do filtro HEPA
0,38m/s Não 2e3 Sim
Tipo A 30% de ar exaurido através de filtro HEPA
30% de ar recirculado através de filtro HEPA Sim
Classe II
0,5m/s 70% de ar exaurido através de filtro HEPA e (Níveis baixo/ 2e3 Sim
Tipo B1
tubulação rígida volatilidade)
Classe II Nenhuma ventilação de ar: 100% de ar
0,5m/s Sim 2e3 Sim
Tipo B2 exaurido via filtros HEPA e tubulação rígida
Idêntida às Cabines II A, mas o sistema de
Classe II
0,5m/s ventilação sob pressão negativa para a sala e o Sim 2e3 Sim
Tipo B3
ar é liberado através de tubulação rígida
Classe III Entradas e saídas de ar através de filtros HEPA Sim 3e4 Sim
Fonte: BRASIL, 2005

Classificação dos agentes biológicos

Classificam-se os agentes biológicos de acordo com sua virulência e modo de
transmissão, a estabilidade do agente no meio, a origem do material e sua concen-
tração, o volume e a dose infectante.

Deve-se observar, ainda, se existem medidas profiláticas e de tratamento efica-

zes disponíveis, o tipo de ensaio que será realizado:
• Classe de risco 1: baixo risco individual e coletivo. Fazem parte dessa classe
os microrganismos que, geralmente, não provocam doenças em humanos e
animais como os lactobacillu;

12
 • Classe de risco 2: risco individual moderado e risco coletivo limitado. Nessa
categoria, estão os agentes que podem provocar doenças no homem ou nos
animais, mas seu potencial de propagação coletiva é limitado. Para os micror-
ganismos dessa categoria, existem medidas profiláticas e terapêuticas eficazes.
Fazem parte dessa categoria Escherichia coli, Salmone ssp, Candida albicans,
Vírus da dengue e Rotavirus, entre outros.

Alguns agentes podem se enquadrar na categoria de risco 2 ou 3, como o HIV, de-

pendendo do procedimento que será realizado.

• Classe de risco 3: risco individual alto e risco coletivo moderado. Encontra-

mos nessa classe os agentes que são transmitidos pelas vias respiratórias e são
potencialmente letais. Representam risco para comunidade e ambiente pois
podem ser transmitidos de uma pessoa para outras pessoas. Para os micror-
ganismos dessa categoria, existem medidas profiláticas e terapêuticas eficazes.
Nesse grupo, temos: Bacillus anthracis, Clostridium botulinum, Escherichia
coli enterohemorragica, Vírus influenza H1N1 etc.;
• Classe de risco 4: alto risco individual e coletivo. Nesta classe, consideramos
os agentes patogênicos altamente infecciosos, que se propagam facilmente pela
via respiratória (ou por outro meio desconhecido) e causam doenças graves ao
homem ou animais. Representam risco elevado tanto para os profissionais que
manipulam esses produtos e para a coletividade. Podem levar à morte, pois
não existem medidas profiláticas ou terapêuticas eficazes. São exemplos de
agentes desse grupo: Ebola, Herpes vírus Simiae e Varíola (major).

Ao se conhecer a classe de risco do agente, é possível determinar o nível de

biossegurança que será adotado.

Tabela 2 – Resumo com alguns requisitos exigidos aos níveis de Biossegurança

Barreiras de Contenção

Nível de Biossegurança Barreiras de contenção primárias Barreiras

Procedimentos/ Equipamentos de proteção de conteção
práticas EPI EPC secundárias
Nível de contenção Boas práticas Jaleco Não são necessários Pias para lavagem
adequado para o Luvas das mãos próximas
trabalho com agentes Sinal de risco biológico Touca à saída
biológicos de classe afixado na porta
1 de risco 1, que não
causam doenças Treinamento
em seres humanos
ou animais,
adultos sadios.

13
13
UNIDADE Introdução à Microbiologia

Barreiras de Contenção

Nível de Biossegurança Barreiras de contenção primárias Barreiras

Procedimentos/ Equipamentos de proteção de conteção
práticas EPI EPC secundárias
Nível de contenção Prática de NB-1 mais: · Jaleco Cabines de Parede, teto e piso
adequado para · acesso limitado · Luvas classe I ou II nos em acabamento liso,
o trabalho com · precauções · Toucas procedimentos que impermeável, sem
agentes capazes com materiais · Máscaras gerem aerossóis juntas e reentrâncias
de causar doenças perfurocortantes
2 em seres humanos · manual de Autoclave no prédio
ou animais, porém Biossegurança
sem risco grave aos · exame médico
profissionais, periódico e vacinação
à comunidade
ou ambiente.
Nível de conteção Prática de NB-2 mais: Macacão Cabine de classe NB-2 mais:
adequado para · acesso controlado I ou II · controle
trabalho com agentes · descontaminação de Proteção automatizado de
com potencial de todos os resíduos e EPI respiratória Autoclave dentro do acesso
transmissão aérea, laboratório · intertravamento
3
que causam doenças Protetor de face e de portas
em humano e animais olhos · exaustão por filtro
e representam risco absoluto
se disseminado · pressão negativa
na comunidade. de ar
Nível de contenção NB-3 mais: Macacão de pressão Cabines de classe II NB-3 mais:
adequado para · banho de positiva B 2 ou Classe III · edifício separado
trabalho com agentes escontaminação ou área isolada
potencialmente letais · incineração de resíduos · leitor biométrico
4 aos seres humanos · exaustão através
e animais, em que de dois filtros
não há medidas de absolutos
tratamento ou de · descontaminação
profilaxia eficazes. de efluentes
Fonte: Ministério da Saúde, 2013

O manual de biossegurança, disponibilizado pelo Governo do Estado do Espírito Santo, apre-

Explor

senta informações mais completas sobre o tema. Disponível em: http://bit.ly/375RdmJ

Meio de Cultivo e Preparo de Material

para o Laboratório de Microbiologia
Meios de Cultura
Os microrganismos encontram-se no meio ambiente formando populações
mistas, ou seja, vários tipos de microrganismos fazem parte do mesmo habitat.

14
 Para estudar microrganismos, é necessário obter uma biomassa microbiana na
forma de populações puras, ou seja, isolar o microrganismo do meio, por meio de
técnicas que irão proporcionar seu crescimento.
Quando conseguimos esse crescimento isolado de uma população isolada, te-
mos uma cultura pura ou axênica, populações cultivadas em meios de cultura,
homogêneas (um tipo de microrganismo), sem a presença de outras formas de
vida contaminantes.
Podemos proporcionar esse crescimento em tubos específicos, frascos e Placas
de Petri.
Quando desejamos um crescimento em grande escala, para fins industriais, es-
sas colônias podem ser cultivadas em tanques especiais.
Mas como conseguimos essa separação de populações puras e como deve ser
o meio de cultura?
Atualmente, diversas técnicas e diversos meios de cultura existem para se con-
seguir o isolamento (obtenção de uma cultura pura a partir de uma mista) e cres-
cimento adequados.
Deve-se prever, no meio de cultivo, as substâncias exigidas pelos microrganis-
mos e necessárias para seu crescimento e multiplicação como as proteínas e os
carboidratos e as fontes de nitrogênio, os sais e as vitaminas.
Para conseguir promover o crescimento de uma cultura dentro de um La-
boratório, é importante conhecer e reproduzir as condições do habitat natural
do microrganismo.
Além disso, é fundamental reproduzir as condições ambientais favoráveis, não
somente as nutricionais, proporcionando temperatura, atmosfera de incubação,
pH, pressão osmótica e umidade ajustados às necessidades do microrganismo.
Para se obter o isolamento, realiza-se a semeadura, técnica que consiste na
adição de microrganismos na superfície de um meio de cultura sólido, permitindo,
assim, a formação de diversas colônias (populações isoladas que crescem na su-
perfície do meio de cultura). Das populações, é possível, então, isolar os microrga-
nismos desejados.
Os meios de cultura têm como objetivo obter crescimento bacteriano, isolar mi-
crorganismos para estudo, compreender a morfologia da colônia, pesquisar pa-
togenicidade e mecanismo de resistência, compreender e estudar características
bioquímicas, compreender e estudar o comportamento de microrganismos frente a
diversas substâncias (estudos de fármacos por exemplo), entre outros.

Classificação dos meios de cultura

Quanto à consistência, os meios podem ser líquidos, semissólidos e sólidos:

15
15
UNIDADE Introdução à Microbiologia

• Meios de culturas líquidos: são denominados de meios líquidos ou caldos os

meios nos quais os nutrientes estão em solução aquosa. São utilizados para
crescimento em massa, ou seja, não promovem a formação de colônias e o
crescimento pode ser verificado pela turvação do meio;
• Meios de culturas sólidos: são denominados de meios sólidos ou solidifica-
dos e são obtidos pela adição de um agente gelificante à cultura, geralmente,
o ágar, na concentração de 1,5% a 2%. O cultivo do meio sólido é feito em
Placas de Petri ou tubos, de acordo com o objetivo da cultura. Nesse tipo de
cultura, a formação de colônias ocorre sobre ou dentro do substrato sólido e é
indicado o isolamento de colônias;
• Meios de cultura semissólidos: são denominados de semissólidos os meios
obtidos pela adição de pequena quantidade de agente gelificante, utilizando
o mesmo exemplo do ágar, que seria utilizado na concentração de 0,5% a
0,75%. Essa cultura é, geralmente, comercializada em tubos e, por ser mais
fluida, possibilita a verificação de motilidade do microrganismo.

Os meios podem também ser classificados quanto à função, em meios simples,

seletivos, diferenciais e de manutenção:
• Meios simples: apresentam em sua composição os elementos essenciais que
proporcionam o crescimento dos microrganismos. Útil para microrganismos
que não necessitam de grandes exigências de nutrientes para se desenvolver;
• Meios de enriquecimento: é o meio simples adicionado de substâncias, ou
seja, enriquecido. São exemplos desse meio o ágar chocolate e o ágar sangue,
mas também podem ser adicionados ao meio soro, ovo, leveduras etc.;
• Meios seletivos: são meios que favorecem o crescimento de alguns microrga-
nismos, mas inibem o crescimento de outros. Essa inibição ocorre, geralmente,
pela adição de uma substância inibidora;
• Meios diferenciados: uma variação do meio seletivo, permite o crescimento
de um grupo de microrganismos com características definidas, utilizados para
diferenciar grupos ou espécies;
• Meios de manutenção: utilizados quando queremos manter uma cultura viável.

É possível, ainda, classificar um meio quanto à sua natureza. Nesse caso, temos
os meios animados e inanimados:
• Meios animados: formados por células vivas, por exemplo, tecidos vivos e
ovos embrionados, ou células de animais de Laboratório;
• Meios inanimados: neste meio, não temos células vivas. Podem ser naturais,
quando as substâncias que compõem o meio são obtidas na natureza ou sintéti-
cos, quando contém em sua composição substâncias obtidas em Laboratórios.
Os semissintéticos são obtidos com materiais das duas origens.

16
 Encontramos, ainda, em algumas literaturas, outras classificações, como:
• Meios de transporte: apropriados para garantir que os microrganismos per-
maneçam viáveis até o momento que será possível realizar a cultura;
• Meios de triagem: são meios de cultura úteis para a identificação presuntiva
ou para segregar bactérias em grandes grupos;
• Meios complexos: denominam-se complexos os meios que apresentam em
sua composição componentes essenciais ao crescimento da maior parte de
microrganismos quimio heterotróficos. A composição química exata não é in-
teiramente conhecida. Exemplo: caldo nutriente;
• Meios indicadores (ou diferenciais): são meios de cultura que permitem uma
identificação pela análise de resultado de uma reação bioquímica, podendo ser
seletivo ou não;
• Meios redutores: são meios de cultura utilizados para promover o cresci-
mento de bactérias obrigatoriamente anaeróbias. Em sua composição, en-
contram-se substâncias que reagem com o oxigênio dissolvido, eliminando-o
do meio de cultura;
• Meios quimicamente definidos: são meios que possuem a composição quí-
mica exatamente conhecida.

Para manter um meio de cultura adequado, ele deve ser estéril e a conservação
deve preservar essa condição, ou seja, devemos garantir que a conservação e o ma-
nuseio não propiciem o crescimento de quaisquer outras formas de vida. Para isso,
é necessária uma técnica asséptica, que garante que, ao introduzir um microrga-
nismo no meio estéril (inoculação), não ocorra contaminação externa (ambiental).

Atualmente, é muito comum a aquisição de meios de culturas prontos, chama-

dos de meios comerciais.

Tabela 3 – Meios de cultura e utilizações principais

Meios de cultura para transporte e conservação
Meio carente em nitrogênio que impede o crescimento do microrganismo, porém é nutritivo e
Cary Blair
permite sua sobrevivência até análise. Indicado para transporte de material fecal.
Salina tamponada Meio líquido que mantém a bactéria viável. Indicado para o transporte de fezes.
Assim como o Cary Blair, é um meio carente de nitrogênio, porém nutritivo. Indicado para
Meio Stuart transporte de diversos microrganismo, incluindo patogênicos como Haemophilus spp., Streptococcus
pneumoniae, Salmonella spp., Shigella spp. etc.
Meio simples e barato, muito utilizado em Laboratórios de Microbiologia por sua versatilidade.
É indicado para análises de água, alimentos e leite, cultura preliminar, isolamento para obtenção
Ágar nutriente
de culturas puras, para conservação e manutenção de culturas e para observação de esporulação de
bacilos Gram positivos.

17
17
UNIDADE Introdução à Microbiologia

Meios para crescimento e isolamento

Meio elaborado com sangue de

cavalo, carneiro ou coelho,
suplementos com NAD e cisteína
Ágar chocolate em uma base achocolatada.
Utilizada para microrganismos exigentes
como Haemophilus spp., Neisseria spp.,
Branhamella catarrhalis e Moraxella spp.
Figura 2
Fonte: ENCRYPTED, 2019

Superior a outros meios e rico

em nutrientes, é utilizado para
isolamento de Neisseria gonorrhoeae
Ágar Thayer-Martin
e Neisseria meningitidis.
chocolate
Em sua composição, possui
antibióticos que inibem o crescimento
de outros microrganismos.

Figura 3
Fonte: ENCRYPTED, 2019

Em sua composição, possui componentes

que inibem o crescimento de outros
microrganismos. Em sua composição,
apresenta lactose (indica bactérias que
Ágar SS (salmonella-
produzem fermentação) e tiossulfato
shigella)
de sódio (que identifica bactérias que
produzem ácido sulfídrico).
Utilizado para selecionar e isolar espécies
de Salmonella e Shigella.
Figura 4
Fonte: RESEARCHGATE, 2019
Caldo selenito Inibe o crescimento de coliformes e espécies naturais da flora intestinal.
com novobiocina Utilizado para detectar Salmonella e Shigella em amostras (fezes, alimentos, urina).
Utilizado como meio de enriquecimento para Salmonella spp. Contém sais de bile que inibem o
Caldo tetrationato crescimento de bacilos Gram positivos. É possível adicionar iodo e verde brilhante para inibição de
crescimento de espécies da flora intestinal.
Utilizada para cultivo de microrganismos aeróbios, microaerófilos e anaeróbios, bem como para
Caldo tioglicolato controle de esterilidade de diversos materiais. Apresenta em sua composição o azul de metileno e
com indicador a resazurina, que são indicadores de oxidação de aeróbios. Esse meio contém, também, dextrose
como fonte de carboidrato e promotor de crescimento.
Utilizada para microrganismos anaeróbios, por ter em sua composição componentes
Caldo tioglicolato
redutores como tioglicolato, cisteína e sulfito, que produzem uma anaerobiose adequada para
sem indicador
microrganismos exigentes.

Apresenta violeta genciana (cristal

violeta) em sua composição, que inibe
o crescimento de Gram positivos, mas é
menos seletivo para Gram negativos que
Ágar Mac Conkey
o Ágar SS.
Utilizado para isolar diversos bacilos
Gram negativos como enterobactérias e
microrganismos não fermentadores. Figura 5
Fonte: ENCRYPTED, 2019

18
 Meios para crescimento e isolamento

Meio enriquecido que propicia o

crescimento da maior parte dos
microrganismos. Utilizada para
diferenciar Streptococcus spp. e
Ágar sangue
Stephylococcus spp (hemólise),
isoladamente de microrganismos não
fastidiosos e identificação presuntiva de
Haemophilus spp.
Figura 6
Fonte: ENCRYPTED, 2019

Apresenta deficiência de eletrólitos

Ágar CLED - cystine em sua composição, inibindo o véu
lactose electrolyte de cepas Proteus. Utilizado para isolar
deficiente e quantificar microrganismos Gram
positivos, Gram negativos e leveduras.

Figura 7
Fonte: ENCRYPTED, 2019
Em sua composição, contém nutrientes do cérebro, coração e fontes de nitrogênio, carbono,
Caldo BHI - brain heart
vitaminas e enxofre. Utilizada para cultivo de streptococcos, pneumococos, meningococos,
infusion
enterobactérias, não fermentadores, leveduras e fungos.

Meio à base de ovos integrais, permite

grande crescimento e isolamento
primário de microbactérias.
Löwenstein Jensen
Permite crescimento satisfatório
para o teste da niacina (positivo para
Mycobacterium tuberculosis)

Figura 8
Fonte: ENCRYPTED, 2019
Meio bifásico: Meio constituído de uma fase líquida (Löwenstein Jensen) e uma fase sólida (7H-9), utilizado para
Löwenstein e isolamento de microbactérias isoladas, extraídas de materiais nobres como líquor, líquido pleural,
Middlebrook biópsias, sangue etc.
Apresenta antimicrobianos (cicloheximida e cloranfenicol) em sua composição, que permite o
Ágar Mycosel
isolamento de fungos patogênicos, especialmente dermatófitos.

Utilizado para o cultivo e crescimento de

fungos leveduriformes e filamentosos,
Ágar Sabouraud
como espécies de Candidas.
Dextrose
Permite a caracterização macroscópica
do fungo filamentoso.

Figura 9
Fonte: Wikimedia Commons

19
19
UNIDADE Introdução à Microbiologia

Meios comerciais para provas de identificação

Base de nitrogênio Utilizado para identificar espécies de leveduras, por sua capacidade de assimilar carboidratos. É um
para leveduras – Yeast meio à base de nitrogênio, com discos de carboidratos impregnados, nos quais é possível verificar o
Nitrogen Base crescimento ao redor.

Utilizado para diferenciar espécies de

enterobactérias e não fermentadores,
Ágar Citrato Simmons pela análise da capacidade do
microrganismo de utilizar o citrato de
sódio como fonte de carbono.
Figura 10
Fonte: ENCRYPTED, 2019

Utilizada para identificação dos

Stretococcus e Enterococcus bile-esculina
positivos dos negativos.
Baseia-se na capacidade de alguns
Ágar Bílis-Esculina
microrganismos hidrolisarem a esculina
na presença de bílis (Para identificação
de não fermentadores Gram negativos e
enterobactérias, usar o meio sem bílis).

Figura 11
Fonte: FISHERSCI, 2019

Utilizado para separação de

Streptococcus beta hemolítico do grupo
Ágar Sangue – CAMP B de Lancefield (S. agalactiae) e Listeria
monocytogenes Camp positivo de outros
do mesmo grupo.

Figura 12
Fonte: Wikimedia commons
Utilizada para analisar a capacidade de microrganismos em usar descarboxilases (enzimas que
Caldo base de Moeller reagem com grupos carboxilas) obtendo produtos como cadaverina, putrescina e citrulina. Entre
eles, as enterobactérias, os bacilos Gram negativos não fermentadores e os estafilococos.
Meio utilizado para identificar grupos
de microrganismos que produzem uma
enzima que hidrolisa o DNA presente
no meio de cultura, diferenciando
microrganismos DNase positivos e
negativos, entre eles, Stpahilococcus
Ágar Dnase aureus, Serratia spp. e Proteus spp,
Stenotrophomonas maltophila,
Cryseobacterium meningosepticum
e Moraxella catarrhalis (positivos) e
Staphylococcus coagulase negativa, e
outras enterobactérias e bacilos Gram- Figura 13
negativos não fermentadores (negativos). Fonte: ENCRYPTED, 2019

20
 Meios comerciais para provas de identificação
Algumas espécies de bactérias são capazes de hidrolisar a esculina, formando a esculetina, que
Ágar Esculina reage com o ferro presente no meio tornando o meio marrom escuro ou preto.
Utilizado para diferenciar espécies de enterobactérias e não fermentadores.
Utilizado para diferenciar gêneros de enterobactérias, a partir de sua capacidade de produzir ácido
Ágar Fenilalanina
fenilpirúvico a partir da fenilalanina adicionada ao meio.

Utilizado para diferenciar espécies

de Haemophilus spp., Neisseria
spp., Branhamella catarrhalis e
CTA – Cystine
Corynebacterium spp.
Tryticase Agar
Esse meio fornece condições para estudo
de fermentação de carboidratos de
microrganismos exigentes.
Figura 14
Fonte: ENCRYPTED, 2019
Meio que permite a diferenciação de gêneros de enterobactérias, não fermentadores, Haemophilus
Caldo Triptona e SIM
e anaeróbios, a partir da habilidade do microrganismo de metabolizar o triptofano em indol.
Neste meio, é avaliada a capacidade de o organismo utilizar o malonato de sódio como fonte
Caldo Malonato exclusiva de carbono, o que resulta em alcalinização do meio, utilizado para diferenciar gêneros e
espécies de enterobactérias e não fermentadores.
Neste meio, o nitrato é reduzido a nitrito ou gás nitrogênio e é um meio de diferenciação de
Caldo Nitrato
enterobactérias, não fermentadores, anaeróbios, Haemophilus, Neisseria e Mycobacterium.
Meio base p/ oxidação Este meio avalia a capacidade de o microrganismo utilizar os carboidratos pela via oxidativa ou
e fermentação – OF fermentativa. Utilizado para diferenciar bacilos Gram negativos.

Este meio contém três açucares e

indicares e permite identificar no mesmo
Ágar TSI – triplo meio a via aeróbia e anaeróbia, por meio
açúcar ferro da inoculação em tubo inclinado.
Utilizado para diferenciar bacilos
Gram negativos.

Figura 15
Fonte: ENCRYPTED, 2019
Utilizado para testes de bacilos Gram negativos fermentadores e não fermentadores,
Ágar base ureia
Staphylococcus e Haemophilus, por meio da determinação da capacidade do microrganismo em
(Christensen)
degradar a ureia.
Fonte: Adaptado de ANVISA, 2010

Para saber mais detalhes sobre os meios citados como preparo, controle de qualidade, com-
Explor

posição e procedimento de utilização, e também informações sobre outros produtos para

identificação, acesse o Material completo disponibilizado pela Agência Nacional de Vigilân-
cia Sanitária Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção Relacionada à Assistên-
cia à Saúde – Módulo 5 – Tecnologias em Serviços de Saúde: Descrição dos Meios de Cultura
Empregados nos Exames Microbiológicos. Disponível em: http://bit.ly/2Sm09z7

21
21
UNIDADE Introdução à Microbiologia

De modo geral, os meios comerciais devem ser preparados para utilização, hi-
dratados, inicialmente, com pequena quantidade de água purificada, de modo que
todo meio fique úmido, para, então, adicionar o restante da água.

Para os meios preparados em Laboratório, temos uma fase adicional de pesa-

gem dos componentes sólidos e, na sequência, deve-se seguir o mesmo procedi-
mento de umedecer o pó para somente após adicionar o restante da água.

Para alguns meios pode ser necessário aquecimento para solubilização. Utilizar
sempre vidros apropriados e aquecer com auxílio de bico de Bunsen e tripé ou
chapa de aquecimento.

Os meios preparados em Laboratório devem ser esterilizados antes de serem

utilizados nas culturas.

A esterilização por autoclave é a mais comum e, quando não houver outra des-
crição em procedimento, recomenda-se 15 minutos na temperatura de 121°C.

Nesse método, geralmente, adiciona-se o meio já nos recipientes e na cultura e

se esterilizam juntos a embalagem e o meio, lembrando-se de que, nesse caso, a
esterilização deve ser realizada com o recipiente aberto. É possível esterilizar o meio
separadamente e adicionar depois em um recipiente estéril.

Quando o meio preparado não for compatível com altas temperaturas, a micro-
filtração é o método de escolha para esterilizar o meio.

Utiliza-se o filtro com 0,22 micrômetros de porosidade para esta atividade. Para
este método de esterilização, o filtrado obtido deve ser adicionado em um recipiente
previamente esterilizado.

A eficácia da esterilização pode ser verificada após o processo. Uma amostra de 10%
do lote preparado deve ser analisada, por aquecimento em estufa – 35ºC por 24
horas, não deve aparecer crescimento de colônias ou mudança de cor do meio, ou
ainda, pode-se utilizar cepas de referência ATCC para controle.

Após o preparo do meio e sua devida esterilização, é possível, então ,realizar a

inoculação, ou seja, a adição da amostra no meio de cultura, para que seja possível
verificar o crescimento do microrganismo, que deve, então, ser incubado em local
apropriado, de acordo com a temperatura exigida para o crescimento do microrga-
nismo, geralmente, em estufa ou temperatura ambiente.

A visualização do crescimento, geralmente, é possível a olho nu, por alteração

do meio de cultura. Meios líquidos apresentam turvação ou mudança da coloração,
e nos meios semissólidos ou sólidos, a formação de massas de colônias.

22
 A Farmacopeia Brasileira apresenta as formulações para diversas soluções e meios de cultura
Explor

utilizados em Microbiologia. Disponível em: http://bit.ly/3bgpR0l

Preparo dos Materiais Utilizados

Além dos meios de cultura, vários materiais são utilizados, desde as alças para
realizar a inoculação das amostras no meio, as embalagens para acondicionar a
cultura, os ambientes, os acessórios e outros materiais de Laboratório.

As vidrarias, por exemplo, são fundamentais em um Laboratório de Microbiolo-

gia, e devem estar perfeitamente higienizadas e esterilizadas.

Todo material que será utilizado deve ser esterilizado. Para isso, devem ser bem
embalados em papel Kraft, de modo que não fiquem partes expostas ou que per-
mitam abertura após a esterilização.

Existem fita adesivas apropriadas que, além de fechar a embalagem, possuem

indicador de cor que indica se o material já foi esterilizado.

Ao término do processo de esterilização, o material deve ser armazenado em

local limpo e seco.

Técnicas de Plaqueamento
Plaquear é inocular uma amostra em um meio de cultura, que irá formar colô-
nias originadas de um ou mais microrganismos.

Para plaqueamento, são utilizados quatro procedimentos básicos:

• Plaqueamento em profundidade (pour plate);
• Plaqueamento em superfície (spread plate);
• Plaqueamento em gotas (drop plate);
• Filtração em membrana.

Plaqueamento em profundidade
• Limite de detecção de 10UFC/g para sólidos ou 1UFC/ml para líquidos;
• Aplicada a ensaios de contagem total de aeróbios mesófilos, contagem de clos-
trídios sulfito redutores e contagem de enterobactérias lácticas;
• Desvantagem: necessidade de fusão do meio de cultura antes do uso limita seu
uso a meios e microrganismos que não são sensíveis ao calor.

23
23
UNIDADE Introdução à Microbiologia

Plaqueamento em superfície
• Não há necessidade de fusão do meio, a amostra é inoculada diretamente na
superfície do meio de cultura sólido;
• Não expõe o microrganismo ao meio quente (pela fusão como ocorre no pla-
queamento em profundidade);
• Permite a diferenciação em diversas colônias;
• Desvantagem: o volume que pode ser inoculado é limitado, não mais do que
0,5ml por placa, sendo padrão o uso de 0,1ml por placa;
• Limite de detecção 100 UFC/g para sólidos e 1UFC/ml para líquidos;
• Aplicada para ensaios de contagem total de aeróbios psicrotróficos, contagem
de bolores e leveduras, contagem de S. aureus e contagem de B. cereus.

Plaqueamento em gotas
• Técnica de inoculação em superfície, portanto apresenta as mesmas vantagens
já citadas;
• Nesta técnica, o inóculo não é espalhado e sim depositado no meio de cultura
(gotas de 0,01ml);
• Permite inocular em triplicata diluições diferentes;
• Limite de detecção de 1000 UFC/g para sólidos e 100 UFC/ml para líquidos.

Filtração em membrana
• Limitado a amostras líquidas límpidas;
• Amostra é filtrada em membrana de 0,45 micrômetros;
• Permite inoculação de volume maior de amostra. Os microrganismos ficam
concentrados na membrana na quantidade inoculada;
• Limite de detecção 1UFC por volume inoculado;
• Indicado para amostras com contagem abaixo do limite de detecção pelos
outros métodos;
• Utilizada para ensaios de contagem total de aeróbios mesófilos, contagem de
bolores e leveduras, contagem de bactérias lácticas, contagem de enterococos,
coliformes fecais e e-coli, especialmente em alimentos e bebidas.

Técnicas de inoculação (semeadura)

• Estrias múltiplas: muito utilizadas para Isolamento de microrganismo. Nesta
técnica, espalha-se o material utilizando uma alça de platina ou alça bacterio-
lógica descartável. As estrias são realizadas de modo sucessivo até se esgotar
a amostra da alça;

24
 Figura 16
Fonte: Acervo do conteudista

• Método do “espalhamento”: auxilia na obtenção de um tapete uniforme de

colônias. Neste método, a amostra é espalhada com auxílio de um swab (para
obtenção de tapete uniforme) ou uma alça de Drigalski (quando se deseja obter
colônias isoladas após diluição). A semeadura é realizada em toda a superfície
da Placa de Petri e é importante que toda a superfície da Placa seja semeada.
Recomenda-se que se faça o procedimento de semeadura com o swab em três
direções distintas, com a alça em toda a superfície rodando a Placa;

Figura 17
Fonte: Getty Images

25
25
UNIDADE Introdução à Microbiologia

• Técnica de profundidade ou incoporação: nesta técnica, mistura-se 1ml de

amostra em 20ml de um meio de cultura fundido (resfriado em temperatura
que não favoreça novo endurecimento). A homogeneização deve ser feita em
movimentos circulares;

Figura 18
Fonte: Getty Images
Explor

Como fazer semeios em meio de cultura? Disponível em: https://youtu.be/qIoPo4wSnWk

• Técnica de esgotamento de alça em tubo: feita em meio realizado em tubo,

os microrganismos podem ser inoculados em estrias, na qual se faz a semea-
dura do meio para extremidade do tubo, ou de forma uniforme da base para a
extremidade. Utilizada, geralmente, para crescimento ou observação de carac-
terísticas bioquímicas do microrganismo;
• Técnica de semeadura em picada em tubo: realizada com uma agulha de
semeadura. Neste caso, não é com o meio inclinado; utilizada para observar
funções metabólicas de microrganismos.

Técnicas de Coloração
As colorações auxiliam na observação dos microrganismos e células. Geralmen-
te ao se visualizar sem coloração, as células estão vivas ou em grandes culturas
que podem ser visualizadas a olho nu. Nesses casos, observa-se comportamento
e mobilidade, sendo, muitas vezes, necessário um microscópio de campo escuro.

26
 A utilização de corantes é muito útil para identificações, pois microrganismos
e células são de difícil visualização. As bactérias por exemplo, são quase incolo-
res, dificultando sua observação in natura. Os corantes reagem à estrutura celular
facilitando a visualização de características estruturais. Esta técnica é realizada em
microrganismos, que não estão viáveis, e as lâminas preparadas podem ser trans-
portadas e armazenadas.

Nas colorações simples utilizamos somente um corante, promovendo uma dife-

renciação entre a bactéria e o meio. Para essas colorações, utiliza-se, geralmente, o
azul de metileno (1-2 minutos), o cristal violeta (20-60 segundos) e a carbolfucsina
(15-30 segundos).

As colorações diferenciais contêm mais de um corante, que utilizam as diferenças

químicas estruturais das células. Geralmente, são aplicadas para classificação e diag-
nóstico, distinguindo, por exemplo, diferentes tipos de bactérias e suas estruturas.

A coloração de Gram é a mais famosa das colorações diferenciais, porém, outras

são de grande importância, como a coloração Albert-Laybourn, Ziehl-Neelsen e
Fontana-Triboundeau.

Técnicas de Coloração em Microbiologia

Simples Diferencial

Seleção de Grupos Visualização de

Microbianos estruturas celulares

• Gram • Esporros
• Ziehl-Neelsen • Cápsulas
• Flagelos

Figura 19 – Técnicas de Coloração em Microbiologia

Fonte: Adaptado de DINIZ, 2018

Antes de iniciar uma coloração, é necessário preparar o esfregaço e fixar a

amostra. Um esfregaço é uma aplicação de uma fina camada de amostra biológica
sobre a lâmina de vidro, elaborada para possibilizar a visualização por microscópi-
co, realizada para fins acadêmicos, clínicos ou de pesquisa.

O material biológico deverá ser preparado antes da realização do esfrega-

ço. Pode-se utilizar um caldo ou uma diluição em solução fisiológica, já alguns
materiais, como o sangue, podem ser aplicados in natura e a lâmina deverá estar
limpa e desengordurada.

Após a realização do esfregaço, deve-se aguardar a secagem antes de iniciar o

processo de fixação.

27
27
UNIDADE Introdução à Microbiologia

A etapa da fixação é importante para que o material biológico não seja perdido
durante a coloração, fazendo com o material fique aderwdido à lâmina. Essa etapa
lisa (destrói) as células dos microrganismos, porém, preserva as estruturas na posi-
ção necessária para visualização e identificação.

O processo de fixação por calor é o mais utilizado.

Os vídeos a seguir demonstram duas técnicas de esfregaço:

Explor

Esfregaço de cultura. Disponível em: https://youtu.be/c2BPE7wIK20

Esfregaço sanguíneo. Disponível em: https://youtu.be/wqvrP2gb5XI

Técnica de esfregaço de culturas de microrganismos:

• Do lado oposto da lâmina em que será realizado o esfregaço, desenhe um cír-
culo, do tamanho de moeda pequena;
• Para células provenientes de um meio de cultura sólido:
» Pingar uma gota de solução salina (fisiológica) na lâmina (no centro do círculo
desenhado). Com a alça de cultura, é possível capturar uma gota e adicionar
à lâmina. Não esqueça de flambar a alça caso ela não seja descartável;
• Com a alça, pegue uma pequena porção de cultura, espalhe na lâmina, mistu-
rando com a solução salina, dentro do espaço do círculo delimitado;
• Para células provenientes de um meio de cultura líquido:
» Fazer algumas voltas com a alça cheia com cultura no espaço delimitado na
lâmina (duas pelo menos);
» Aguardar a secagem das lâminas ao ar (não assoprar);
» Fixar o esfregaço seco passando a lâmina três vezes através chama do bico
de Bunsen;
» Armazenar os esfregaços em local adequado até coloração.

Coloração de Gram
É a coloração mais comum em Laboratórios de Microbiologia, sendo, atualmen-
te, importante ferramenta auxiliar de diagnóstico.

Após os processos de coloração, as bactérias irão apresentar coloração roxa ou

rosa, que serão indicativos de sua classe “gram-positivas” ou “gram-negativas”.

Essa característica bacteriana auxilia, por exemplo, na determinação da melhor

forma de tratamento.

As bactérias Gram-positivas se coram de roxo e as Gram-negativas de rosa

A técnica de coloração baseia-se na utilização de corantes, geralmente, o cris-
tal violeta (violeta genciana ou metil-violeta) e tratamento com solução iodetada,

28
que são retidos pelas bactérias gram-positivas, depois de a lâmina receber um tra-
tamento com álcool, que consegue remover parte dessa coloração nas bactérias
gram-negativas.

Para finalizar, utiliza-se a fucsina ou a safranina, que atuam como corante

secundário, fazendo com que as células que foram descoradas apresentem uma
cor diferente da coloração inicial proporcionada pela violeta genciana + iodo (co-
loração diferencial).

De modo bem resumido, podemos dizer que essa diferença de adesão do coran-
te entre as bactérias gram-negativas e gram-positivas ocorre pela diferença entre as
estruturas da parede celular entre esses dois grupos.

A camada mais espessa das positivas evita o descoramento pelo álcool, enquan-
to a parede mais fina das gram-negativas, junto à membrana rica em fosfolipídeos,
são permeáveis ao álcool.

Você pode encontrar pequenas diferenças entre técnicas de coloração, mas que
não irão influenciar no resultado final.

Outer membrane: membrana externa (lipoproteína + lipopolissacarídeos – LPS);

Explor

Lipoproteins: lipoproteínas;
Peptidoglycan: parede celular (peptideoglicano);
Priplasmic space: espaço periplasmático;
Cytoplasmic membrane: membrana plasmática;
Lipoplysaccharides: lipopolissacarídeos – LPS;
Porin: porinas;
Protein: proteínas.

As etapas para realização da coloração de gram são:

1. Preparar o esfregaço;
2. Corar com solução de violeta genciana (cobrir a lâmina com o corante e
aguardar 60 segundos);
3. Lavar com água destilada;
4. Cobrir a lâmina com solução Lugol (solução de iodo) por 60 segundos;
5. Lavar com água destilada;
6. Descorar com álcool a 95%, ou acetona, 10-20 segundos;
7. Lavar água destilada;
8. Corar com solução de fucsina ou safranina por 20 segundos;
9. Lavar com água destilada
10. Aguardar secagem ao ar, por no mínimo 20 minutos e observar ao mi-
croscópio.

29
29
UNIDADE Introdução à Microbiologia

Explor
Etapas da coloração Gram: http://bit.ly/2TFri25

1. Aplicação de cristal violeta (corante púrpura);

2. Aplicada de solução de iodo (mordente);
3. Lavagem com álcool (descoloração);
4. Aplicação de safranina (contracorante).

Gram Positive

Cocci Bacilli
Corynebacterium
Clostridium
Staphylococcus Streptococcus Listeria
catalase + catalase - Bacillus

S. aureus coagulase - -hemolytic

-hemolytic -hemolytic
coagulase + (clear) (green)
Enterococcus
S. epidermidis S. saprophyticus E. faecalis,
Novobiocin Novobiocin S. pyogenes S. agalactiae E. faecium S. pneumoniae Viridans
sensitive resistant Group A, Group B, optochin sensitive S. mutans, S. sanguis
bacitracin bacitracin bile soluble optochin resistant
sensitive resistant capsule not bile soluble
(quellung +) no capsule

Figura 20

Coloração de Ziehl-Neelsen
Esta técnica é aplicada em alguns gêneros de bactérias (Micobacterium e
Nocardia). Esses gêneros são tratados com uma solução de fcsina fenicada, e após
coloração, resistem ao descoramento utilizando uma solução álcool-ácido, e man-
tém a cor vermelha.

Essa resistência ao descoloramento é decorrente da estrutura de membrana des-

sas espécies, que apresentam fortes ligações lipídicas e são altamente lipofílicas,
impedindo a entrada de corantes aquosas, mordentes e diferenciadores.

Mordente: substância química que pode ser adicionada ao processo de coloração e tem
Explor

como objetivo intensifica-la, aumentando a afinidade da coloração pela amostra ou reves-

tindo estruturas e facilitando, assim, a visualização após coloração.
Diferenciador: substâncias que conseguem descorar certas estruturas da bactéria que ha-
viam sido previamente coradas. São utilizadas quando existe a necessidade de uma colora-
ção policromática (mais de uma cor).

30
 Denominamos estas espécies de BAAR – Bacilo-Álcool-Ácido-Resistente

Essa coloração é útil para diagnóstico de tuberculose. Visualizamos os bacilos BAAR como
Explor

bastonetes corados em vermelho em um fundo azul e é feito geralmente com escarro, mas
também pode ser utilizado lavado brônquico e gástrico, swab de laringe, biópsias e outros.
A quantidade de bacilos visualizadas no campo determina se o resultado é negativo ou po-
sitivo para Tuberculose.

As etapas para realização da coloração de Ziehl-Neelsen são:

1. Preparar o esfregaço;
2. Cobrir o esfregaço com solução de fucsina de Ziehl, aguardar 5 a 10 minutos
aquecendo com chama fraca até o desprendimento de vapores (não ferver);
3. Lavar com água corrente;
4. Descorar com solução de álcool-ácido clorídrico 1%;
5. Cobrir o esfregaço com solução de azul de metileno e deixar por 30 segundos;
6. Lavar com água destilada;
7. Aguardar secagem, examinar sob imersão.

Tabela 4 – Outros métodos

Método Descrição
Técnica de impregnação pela prata utilizado para visualização de bactérias
espiraladas como a causadora da leptospirose. Não é uma técnica muito utilizada,
Coloração de Fontana Tribondeau pois é possível utilizar a microscopia em campo escuro a fresco para visualizar
estas espécies, mas quando coradas as espiroquetas coradas são visualizadas em
marrom-escuro ou negras, e o fundo é amarelo-castanho ou marrom claro.
Nesta técnica a solução de Lugol forte coram os corpúsculos metacromáticos
(Babes Ernst), corpúsculos citoplasmáticos presentes em regiões polares.
Coloração de Albert-Laybourn
Esta coloração é utilizada para detectar corinebactérias, sendo aplicado como
diagnóstico auxiliar de difteria.
Apesar da estrutura rígida do esporo, o corante verde malaquita ou carbolfucsina
podem atravessá-lo com aquecimento. Esta mesma proteção da estrutura do
Coloração Para esporos com verde
esporo, evita a descoloração com álcool, deixando os esporos com a aparência
Malaquita (Wirtz-Conklin)
verde. Para esta técnica, utiliza a safranina como contra-corante que cora as
demais estruturas em vermelho permitindo a diferenciação dos esporos.
Fonte: Brasil, 2001

A técnica para esses métodos segue a mesma sequência de preparo da lâmi-

na por esfregaço, adição do corante, adição do descorante e, por fim, adição do
contra-corante, porém na fase de coloração, todas elas passam por aquecimento
da lâmina.

31
31
UNIDADE Introdução à Microbiologia

Anexo I
Prática 1 – Métodos de Desinfecção
Materiais
• Água purificada fervendo;
• Cultura de e-coli em suspensão;
• Tubo de ensaio;
• Banho de água quente;
• Álcool 70%;
• Placa de ágar (preferência Mueller Hinton);
• Alça para cultivo microbiano;
• Bico de Bunsen.

Procedimento
Dividir uma placa com o meio de cultura ágar em quatro quadrantes (identificar
os quadrantes);

I II

III IV

• No primeiro quadrante, semear a cultura de e-coli;

• No segundo quadrante, limpar a alça de cultura utilizada para semear no pri-
meiro quadrante com álcool 70% e semear com o álcool 70%;
• Colocar pequena porção de cultura de e-coli em um tubo de ensaio pequeno e
mergulhar em água fervente por 10 minutos. Após este tempo, semear em III;
• Voltar o tubo de ensaio para a água fervente e manter por mais 10 minutos
(total 20 minutos), retirar do banho e semear em IV;
• Incubar as placas no mínimo por 48 horas e verificar o crescimento.

32
 Resultados
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
________________________________________________________________
_______________________________________________________________
________________________________________________________________

Responda
1 – Diferencie esterilização, desinfecção, antissepsia e assepsia.

_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
________________________________________________________________
_______________________________________________________________
________________________________________________________________

2 – A desinfecção pode ser realizada com auxílio de agentes químicos ou físicos.

Descreva quais são os agentes químicos mais utilizados em Microbiologia:

_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
________________________________________________________________
_______________________________________________________________
________________________________________________________________

3 – Descreva detalhadamente a diferença entre os agentes físicos utilizados para

desinfecção (calor, radiação e filtração):

_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
________________________________________________________________
_______________________________________________________________
________________________________________________________________

Prática 2 – Semeadura de Cultura Bacteriana

Materiais
• Alça de platina ou níquel-cromo;
• Alça de semeadura descartável (opcional);
• Placa de semeadura com meio de cultura ágar;
• Cultura de bactéria crescida;
• Bico de Bunsen.

33
33
UNIDADE Introdução à Microbiologia

Procedimento
• As alças de platina deverão ser flambadas antes e depois da semeadura (manter
a alça no bico de Bunsen a 45° até que fique incandescente);
• Esfriar a alça na parede do tubo ou no meio da placa (desde que ainda não
esteja inoculada);
• Flambar a boca do tubo de ensaio contendo a cultura logo após a retirada da
tampa (retirar a tampa “abraçando” com o dedinho);
• Retirar a amostra com a alça e flambar a boca do tubo novamente, antes de
fechar;
• Semear de acordo com as técnicas (estrias, esgotamento etc.).
• Observar os crescimentos após tempo de incubação.

Resultados
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
________________________________________________________________
_______________________________________________________________
________________________________________________________________

Prática 3 – Coleta e Amostragem

Materiais
• Placa de Petri, com meio de cultura ágar enriquecido;
• Placa com meio de cultura contendo antibiótico (ampicilina);
• Placa com meio de cultura contendo antifúngico (anfotericina);
• Swabs para coleta em ambiente (umidificado em solução fisiológica);
• Alças para semeadura;
• Bico de Bunsen.

Procedimento
• Dividir a turma em grupos de modo que cada grupo colete amostras em locais
diferentes (maçanetas de portas, celulares, teclados de computadores, notas de
dinheiro, sola do sapato, entre os dedos da mão etc.);
• Deixar uma das amostras aberta (ao ar, durante o período da coleta);
• Identificar as placas (com o nome do grupo e o número da amostra);
• Para realizar a semeadura, utilizar os próprios swabs de coleta;

34
 • Incubar as placas a 30°C até a próxima aula;
• Verificar o crescimento das colônias a olho nu.

Resultados
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
________________________________________________________________
_______________________________________________________________
________________________________________________________________

Observação
A critério do professor, essas culturas podem ser utilizadas para fazer a colora-
ção de Gram.

Prática 4 – Coloração de Gram

Materiais
• Solução de violeta genciana;
• Lugol;
• Solução álcool-acetona;
• Solução de fucsina diluída;
• Lâminas para microscopia;
• Placas com culturas bacterianas (pelo menos uma espécie Gram positiva e
uma Gram negativa).

Procedimento
• Identificar as lâminas com as amostras que serão utilizadas;
• Realizar o esfregaço e deixar secar;
• Cobrir o esfregaço com o corante Violeta de genciana e aguardar 1 minuto;
• Escorrer o corante da lâmina (não precisa lavar) e adicionar solução de lu-
gol, também em quantidade suficiente para cobrir o esfregaço e aguardar
mais 1 minuto;
• Escorrer o lugol da lâmina e lavar com água (sem esfregar a lâmina);
• Adicionar sobre a lâmina gota a gota, a solução de álcool-acetona para desco-
rar, por 15 segundos;
• Pingar na lâmina e deixar escorrer sobre o esfregado. Não pingar direto
no esfregado;

35
35
UNIDADE Introdução à Microbiologia

• Adicionar o corante de fucsina sobre o esfregado e aguardar mais 1 minutos;

• Lavar a lâmina com água corrente e secar com papel filtro (não esfregar a lâ-
mina com o papel, somente colocar suavemente o papel ao lado do esfregaço
para que ele absorva o excesso de água;
• Aguardar secar e visualizar o material em microscópio ótico.

Resultados

_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
________________________________________________________________
_______________________________________________________________
________________________________________________________________

Responda
1 – Qual a diferença entre uma bactéria Gram positiva e uma Gram negativa?

_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
________________________________________________________________
_______________________________________________________________
________________________________________________________________

2 – Qual a importância clínica da identificação das bactérias pela técnica de Gram?

_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
________________________________________________________________
_______________________________________________________________
________________________________________________________________

Prática 5 – Identificação de bactérias através de testes

bioquímicos (PADILLA, 2017)
Estas técnicas são utilizadas como método diagnóstico para enterobactérias,
para diferenciar microrganismos da mesma família, porém de gêneros distintos.

36
 Sugere-se a utilização de microrganismos do gênero Enterobacteriaceae
(Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Shigella, Salmonella e Proteus),
porém, a quantidade de testes, bem como a escolha dos microrganismos fica a cri-
tério do professor.

Materiais
• Placa com o meio TSA;
• Placa MacConkey;
• Tubo com meio EPM;
• Tubo com meio MILI;
• Tubo com meio Citrato;
• Culturas pré-determinadas pelo docente e identificadas por números;
• Alças bacteriológicas;
• Bico de Bunsen;
• Reativo de Kovac (dimetilaminobenzaldeído).

Procedimento
Parte 1
• Com a alça bacteriológica, tocar em uma colônia e inoculá-la na placa
MacConkey (estriar para isolar colônias);
• Tocar em uma colônia com a agulha e perfurar o meio MILI (não encostar no
fundo do tubo);
• Flambar a alça e repetir o mesmo procedimento para o meio EPM (por estrias
na superfície do tubo);
• Estriar uma colônia na superfície inclinada do meio contendo CITRATO;
• Incubar por 24 h a 37ºC.

Parte 2
• Realizar as leituras da série bioquímica dos resultados para identificação dos
gêneros.

Agar MacConkey
• Indicador de bactérias fermentadoras de Lactose;
• Lactose positiva: cor vermelha;
• Lactose negativa: incolores.

37
37
UNIDADE Introdução à Microbiologia

Meio EPM
• Os testes de produção de CO2, H2S e urease são verificados na base e teste
para a enzima L-triptofanodesaminase a observação é na superfície do meio;

Teste de CO2
• Observa-se a presença de bolhas resultantes da fermentação da glicose;
• C6H12O6 → Etanol + CO2gás;
• Prova positiva: base amarela com presença de bolhas de ar;
• Prova negativa: base amarela sem bolhas de ar.

Teste de H2S
• H2S Na2SO3 → H2S (reage com Fe dando coloração preta);
• Prova positiva: base preta;
• Prova negativa: base amarela ou inalterada.

Teste de urease
• As bactérias que sintetizam urease convertem a ureia em amônia e gás carbônico;
• Prova positiva: base azul;
• Prova negativa: base amarela ou inalterada.

Teste de Triptofanodesaminase
• Prova positiva: superfície verde escuro;
• Prova negativa: superfície azulada, amarelada ou inalterada.

Meio de Mili (Motilidade, Indol e Lisina decarboxilase)

• Prova positiva (Motilidade): meio turvo;
• Prova negativa (Motilidade): meio límpido ou crescimento só no local
do inoculo;
• Prova positiva (Indol): coloração vermelha;
• Prova negativa (Indol): coloração amarela;
• Prova positiva (L-lisina descarboxilase): coloração roxa.

38
 Agar Citrato de Simmons
• A presença de bactérias que podem utilizar citrato como fonte de carbono mo-
dificam o meio de verde para azul (pH>7.5);
• Prova positiva: coloração azul;
• Prova negativa: coloração do meio inalterada.

Resultados
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
________________________________________________________________
_______________________________________________________________
________________________________________________________________

39
39
UNIDADE Introdução à Microbiologia

Orientações para Leitura Obrigatória

Desinfecção e esterilização. Disponível em: http://bit.ly/2H01vKr
Explor

Segurança do paciente – Manual de Higienização das mãos.

Disponivel em: http://bit.ly/36ZtC7a
Manual de Coleta para exames microbiológicos do Hospital Universitário – Universida-
de Federal de Santa Catarina. Disponível em: http://bit.ly/2S2uWC6
Procedimentos Laboratoriais: da Requisição do Exame à Análise Microbiológica e Laudo
Final. Anvisa. Disponível em: http://bit.ly/2OA6QMO

40
Referências
BRASIL. Governo do Estado do Espírito Santo. Secretaria Estadual de Saúde,
Laboratório Central de Saúde Pública. Manual de Biossegurança. Vitória: Lacen,
2017. Disponível em: <https://saude.es.gov.br/Media/sesa/LACEN/Manuais/
MANUAL%20DE%20BIOSSEGURAN%C3%87A%20LACEN-ES%20REV%20
02.pdf>. Acesso em: nov. 2019.

________. Ministério da Saúde. Comissão Técnica de Biossegurança da FIOCRUZ.

Procedimento para manipulação de microrganismos patogênicos e/ou
recombinates na FIOCRUZ. Rio de Janeiro: FIOCRUZ, 2005. 221p

DINIZ, C. G. Apostila da Universidade Federal de Juiz de Fora – Roteiro de

Aulas Práticas de Bacteriologia, versão 02.2018. Disponível em: <http://www.ufjf.
br/Microbiologia/files/2013/05/ROTEIRO-PARA-AULAS-PR%C3%81TICAS-
bacteriologia-2018-vers%C3%A3o-02-2018.pdf>. Acesso em: nov. 2019.

PADILLA, G. Apostila de Aulas Práticas Microbiologia Básica para Farmácia

– BMM0160 – Diurno. Instituto de Ciências Biomédicas. Departamento de
Microbiologia. São Paulo: Universidade de São Paulo, 2017. Disponível em:
<https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/4101474/mod_resource/content/1/
Apostila-Praticas-BMM0160-DIURNO.pdf>. Acesso em: nov. 2019.

SALVATIERRA, C. M. Microbiolgoia – aspectos morfológicos, bioquímicos e

metodológicos. São Paulo: Érica, 2014.

41
41