MANAGEMEN PENGELOLAAN SAMPEL

BAKTERI Corynebacterium diphtheriae

Di Instalasi Laboratorium Mikrobiologi

Balai Besar Teknik Kesehatan Lingkungan dan
Pengendalian Penyakit (BBTKLPP) Jakarta

Lenni Simanullang, SKM

 LATAR BELAKANG 2013 - 2017

Indonesia posisi ke-3 hingga ke-2 negara dengan

kasus difteri terbanyak di dunia.

2019 - 2020

Difteri penyakit endemik Paling banyak di Jawa Timur, Jawa Barat, DKI
di berbagai negara di Jakarta, Kalimantan Timur, dan Aceh.
dunia. (Peta persebaran kasus difteri)

(WHO dan Kementerian Kesehatan RI)

Metode diagnostik tepat dan cepat

dapat memberikan penguatan hasil
diagnosis dini kepada penderita.
• Terjadi penurunan kasus.
• Namun kembali meningkat akibat
gangguan program vaskin. Corynebacterium diphtheriae
 DESKRIPSI

• Difteri adalah penyakit akut yang mengancam nyawa dan menular yang disebabkan Corynebacterium
diphtheriae dengan ditandai pembentukan pseudo-membran mukosa dan kulit. Ada hampir 100 spesies
Corynebacteria
• Morfologi : bakteri batang gram positif, tidak bergerak,tidak membentuk spora, bersifat aerob, bentuk
seperti palu (granula metakromatik)
• Diagnosis pasti dari difteri melalui konfirmasi laboratorium dengan mengisolasi Corynebacterium
diphteriae dan tes toksigenitas.
• Jenis spesimen berupa swab tenggorok(Oropharing) / Swab hidung(Nasopharing) .
 DESKRIPSI
Kuman Penyebab Corynebacterium diphtheriae

Sumber penularan Manusia (Penderita/Carrier)

Cara penularan ✓Kontak dengan penderita pada masa inkubasi ✓Kontak

dengan Carrier
✓Melalui pernafasan (droplet infection, muntahan, luka
(difteri kulit)- Mencemari tanah sekitarnya.
Masa Inkubasi 2 – 5 hari

Masa penularan  Dari penderita : 2 – 4 minggu (sejak masa inkubasi)

▪ Dari Carrier bisa sampai 6 bulan
 PENGELOLAAN SAMPEL C.DIPTHERIAE
1.Persiapan alat dan bahan
2.Pengambilan sampel
3.Penyimpanan sampel
4.Pengepakan sampel
5.Pengiriman sampel
6.Pencatatan dan pelaporan sampel
PENDAHULUAN
 Pengelolaan sampel bertujuan mendapatkan spesimen/sampel dengan
kualitas baik dan kuantitas cukup.
 Pengelolaan sampel yang baik akan mencegah spesimen/sampel rusak selama
proses pengiriman dan memberikan hasil pemeriksaan yang akurat.
 Pemeriksaan sampel diperlukan untuk penetapan diganosa.
 Pengelolaan sampel meliputi persiapan alat dan bahan,pengambilan,
penanganan, penyimpanan, pengepakan, pengiriman serta metode
pencatatan dan pelaporan.
1. PERSIAPAN PENGAMBILAN SAMPEL

 Persiapkan tabung berisi media Amies

yang sudah ditempeli label ID pasien
dan diberi selotip.
 Spatula
 APD (masker N95,sarung tangan,hair
cap,septi google,apron)
 alcohol 70%,ice pack,cool box
 2.PENGAMBILAN SWAB TENGGOROK(OROPHARING)

 Penderita duduk ( kalau anak-anak dipangku) atau tidur.

 Pastikan bahwa pharing jelas terlihat
 Penderita diminta membuka mulut dan lidah ditekan dengan spatel lidah.
 Pengambilan → daerah inflamasi
 Masukkan lidi kapas steril. Ambil pada bagian yang diduga yakni
membran berwarna putih, Usap kekiri dan kanan dinding belakang faring
dan tonsil lalu tarik keluar dengan hati-hati, tanpa menyentuh bagian
mulut yang lain. Masukkan lidi kapas ke dalam media transport amies
atau langsung tanam pada media isolasi (Agar darah, Agar CTBA, Agar
Loeffler) dan di buat sediaan
2.PROSEDUR PENGAMBILAN SWAB HIDUNG / NASOPHARING

1. Gunakan APD, siapkan transpor media Amies

2. Penderita duduk ( kalau anak-anak dipangku) atau tidur.

3. Tengadahkan posisi kepala dengan sedikit menekuk

4. Siapkan kapas lidi steril dan masukkan ke dalam lubang hidung sampai ke nasofaring

5. Usapkan dengan memutar swab kapas lidi secara merata sepanjang rongga hidung , Jangan menekan kapas lidi pada lubang
hidung apabila dirasa ada sumbatan

6. Tarik lidi kapas secara perlahan

7.Masukkan lidi kapas ke dalam media transport amies

 3.PENYIMPANAN SEMENTARA

• Spesimen yang telah diambil diusahakan segera

dikirim ke laboratorium untuk menghindari
overgrowth bakteri flora normal
• Selama 24 jam dapat bertahan pada suhu kamar
• Bila > 24 jam, disimpan pada suhu 2 – 4°C
 4.PENGEPAKAN SPESIMEN
Pelabelan
 Stiker anti air (lapisi selotif)
 Idnetitas : nomor/nama/usia/gender/alamat/jenis spesimen/tanggal pengambilan

Pengemasan
• Tutup tabung Amies media dengan parafilm / micropore

• Masing –masing tabung dibungkus tissue kemudian dimasukkan dalam kantung plastik klip
disusun rapi tegak lurus dalam rak tabung (posisi spesimen tidak boleh terbalik)

• Masukkan ice pak pada dasar dan sisi sisi cool box agar suhu tetap dingin (2 – 4 oC)

• Masukkan spesimen ke dalam cool box

• Dilengkapi dengan form pengambilan spesimen

• Tulis alamat lengkap lab tujuan dan nama petugas penanggung jawab dan telp
TABUNG SPESIMEN DIBUNGKUS DENGAN
PARAFILM (AGAR KEDAP AIR)
 5.PENGIRIMAN SPESIMEN/SAMPEL

Pengiriman Spesimen Ke Laboratorium

• Kirim spesimen segera untuk dianalisa.
• Spesimen dalam media transport harus tetap dingin dalam cool box
(Suhu 2 - 4° C)
• Sebaiknya spesimen dibawa petugas sendiri atau bila melalui kargo / jasa
pengiriman pilih yang dapat dipercaya dari segi keselamatan dan
ketepatan waktu.
 WADAH PENGIRIMAN SEKUNDER

1. Wadah pengiriman primer dimasukkan ke dalam pengiriman sekunder

2. Diisi dengan ice pack di sekeliling dan di atas wadah pengiriman primer
LABEL PADA WADAH PENGIRIMAN SEKUNDER
6.PENCATATAN DAN PELAPORAN
SPESIMEN/SAMPEL
SKEMA ALUR PEMERIKSAAN KULTUR
C.DIPTHERIAE

Specimen dari media transport atau langsung

(Apus Tenggorok/Apus Nasofaring/Apus Hidung)

Inokulasi

Cysteine Tellurite Blood Agar (CTBA) CTBA : koloni berwarna hitam

35˚C 24-48 jam

Pewarnaan Gram : Batang Gram Positif
 
Pewarnaan Albert : Batang bergranula; Granula biru kehitaman dan badan bakteri
hijau/hijau kebiruan

Agar darah : Koloni putih, bulat

Koloni tersangka dimurnikan ke media Agar Darah kecil
35˚C 24 jam

Uji Biokimia
35˚C 24 jam

Positif C. diphtheriae Negatif C. diphtheriae

Uji Toksigenitas
PROSEDUR PENGUJIAN

ALAT DAN BAHAN

ALAT :
o BSC II
o Bak pewarna
o Inkubator
o Cawan petri steril
o Ose steril
o APD
BAHAN :
o Pewarnaan Albert’s
o Media selektif : Cystine Tellurite Blood Agar (CTBA)
o Media pemurnian : Blood Agar
o Media uji biokimia , bisa menggunakan :
- Media Konvensional (membuat sendiri media uji biokimia , misal : gula gula, nitrit, urea)
- Media komersil, contoh : API Coryne Test (oxoid), Rapid CB Plus Panel (Remel)
 ALAT DAN BAHAN
Alat Bahan
Sampel usap tenggorok terduga C.diphtheriae,
Gelas ukur volume 1.000 ml, erlenmayer
Hoyle’s tellurite base agar, blood base agar,
volume 1.000 ml, sendok reagen, batang
darah domba steril, kalium telurit 3,5%,
pengaduk, botol penampung, hot plate stirrer, aquadestilata, NaCl fisiologis, pewarna Albert,
autoklaf, cawan petri steril disposable, API Coryne Biochemical Test Strip, mineral oil,
inkubator, biosafety cabinet, ose steril reagen pembacaan hasil ujibiokimia,
disposable, kaca objek, rak pewarnaan, pipet APIWEB™, Qiamp DNA Mini Kit, proteinase K,
steril, mikropipet, PCR Labcycler Basic etanol absolut, PCR Mix (7 µL RNAse free
SensoQuest, vortex, tank elektroforesis, water, 10 µL Hotstar Taq, 1 µL Primer Tox1, 1
microwave, timbangan analitik, UV µL Primer Tox 2), RNAse Free Water,
transluminator (Geldoc). C.diphtheriae ATCC™, gel agaorosa, buffer
TBE 1x, Sybr Shafe DNA gel.
 PROSEDUR PENGUJIAN

1. Pembuatan Media 2. Inokulasi Sampel pada CTBA

Dilarutkan ke
dalam 1L Disterilkan
40 gram base
agar ditimbang
aquadestilata dengan
lalu autoklaf
dipanaskan Sampel: usap
tenggorok

Ditambahkan 10 ml Diinokulasi pada

Ditambahkan 20% CTBA dengan
kalium tellurite 5% tiap
darah domba steril
1L (khusus CTBA) metode streak plate
Agar base:
CTBA : Hoyle’s tellurite blood agar
 HASIL DAN PEMBAHASAN
Deteksi Keberadaan C.diphtheriae

Berdasarkan Pengamatan Koloni

Perbandingan sampel
yang tumbuh dan tidak
tumbuh pada media
CTBA

Pertumbuhan koloni bakteri pada media CTBA; a:

koloni tidak tumbuh, b: koloni tumbuh Koloni berwarna hitam
• TeIV (tellurit) Te0 (tellurium) Endapan hitam
Reduksi
 PROSEDUR PENGUJIAN
4. Uji Biokimia
3. Pengamatan Morfologi
API Coryne Test
Koloni pada CTBA dibuat Koloni bakteri dimasukkanKit
ke dalam botol berisi
olesan tipis di atas gelas ampul lalu dan
Dikeringkan dimohogenkan
fiksasi
objek

Diamati di bawah
Pewarnaan Albert
mikroksop
Campuran1.000x
dituang ke lubang-lubang
pada tray
Diinkubasi selama 24 jam

Dituangkan reagen-reagen pembacaan

hasil
Proses pewarnaan
 HASIL DAN PEMBAHASAN
Deteksi Keberadaan C.diphtheriae

Berdasarkan Pengamatan Sel

Hasil positif didasarkan pada ciri Perbandingan hasil

khas bentuk sel C.diphtheriae: sel pemeriksaan sel yang
batang dengan granula tumbuh pada media
metakromatik CTBA.

Granula Metakromatik

• Merupakan inclusion body, mengandung polifosfat

inorganik sebagai cadangan energi.
• Dapat divisualisasikan secara metakromasia
Granula
metakromatik
 5.HASIL REAKSI UJI BIOKIMIA
Uji Reduksi Nitrat

Uji ESC
Esculin  Esculetin + Fe  Kompleks besi fenolik
Positif : warna merah (coklat)
Negatif : tidak berwarna Positif ESC : perubahan menjadi warna coklat gelap /
hitam gelap
Uji Urease
Uji PYR Negatif : tidak terjadi perubahan warna.
Positif : merah. Negatif : tidak berwarna.
Uji Pyrazinamid (NH2)2CO + 2H2O → CO2 + H2O + 2NH3
Positif : merah atau merah muda. Negatif : kuning
PyrazinamidA + H2O  Asam pirazinoik + NH3
Positif : oranye-merah atau coklat.
Negatif: tidak ada perubahan warna
Hasil uji positif
Uji Katalase
2H2O2 → 2H2O + O2.
Positif : terbentuknya gelembung.
Hasil uji negatif
Negatif : tidak terbentuk gelembung
 5.REAKSI UJI BIOKIMIA

• Glukosa
Fermentasi Karbohidrat • Ribosa
• Xilosa
• Mannitol

• Positif : asam akan dihasilkan dan

menyebabkan perubahan warna pada phenol
red (indikator ph) yang akan menjadi
kuning pada lingkungan asam.
Hasil negatif
Hasil positif
• Negatif : warna tetap merah/oranye.
 HASIL DAN PEMBAHASAN

Contoh hasil pengujian dengan API Web

Deteksi Keberadaan C.diphtheriae
Kode
NO Hasil Identifikasi APIWEBTM
Sampel
Berdasarkan Uji Biokimia
1 M529 C.diphtheriae mitis
2 M536 Listeria grayi
3 M545 C.pseudodiphtheriticum
4 M550 C.striatum/ C.amycolatum
5 M551 C. propinquum
6 M552 C. propinquum
7 M553 C. propinquum
8 M554 C. propinquum
Perbandingan hasil Perbandingan hasil uji 9 M557 C. propinquum
uji biokimia pada 47 beberapa 10 M558 Brevibacterium spp.
sampel. biovarC.diphtheriae 11 M560 C. propinquum
12 M561 Corynebacterium grup F-1
Proporsi mitis 70% lebih banyak (Rosana et al., 2020).
13 M563 C. diphtheriae mitis
14 M570 C. accolens
 PROSEDUR PENGUJIAN
6. Ekstraksi DNA

Qiamp DNA Mini Kit

Pengendapan
Lisis sel protein dan Pencucian 1 Pencucian 2 Elusi DNA
DNA
(Buffer AL) DNA (Buffer AW1) (Bufer AW 2) (Buffer AE)
C.diptheriae
 PROSEDUR PENGUJIAN
8. Visualisasi DNA
7. Pemeriksaan PCR

20 µL mix PCR
Dibuat reagen PCR mix dimasukkan ke
dalam tube PCR

Visualisasi DNA dengan UV

Tabung transluminator(Geldoc)
5 µl sampel DNA
Kontrol: dimasukkan ke
9. Penetapan
dimasukkan pada
Negatif: Nucleutide Free Water dalam mesin
PCR ± 2Kesimpulan Hasil Uji
tabung
Positif: C.diphtheriae ATCC jam.
 PROSEDUR PENGUJIAN
Deteksi Toksigenisitas C.diphtheriae dengan PCR

Gen pengkode toksin Difteri : gen dtx ukuran 1.680 bp

Contoh hasil pengujian toksigenisitas dengan PCR

Hasil identifikasi
Nomor APIWEB™.
No PCR
Sampel
Significant Taxa
1.680 bp
1 M529 C.diphtheriae mitis C.diphtheriae/tox
2 M563 C. diphtheriae mitis C.diphtheriae/tox
3 M677 C.diphheriae mitis C.diphtheriae/tox
a: DNA marker 4 M678 C.diphheriae mitis C.diphtheriae/tox
b: kontrol positif
5 M794 C.diphtheriae gravis C.diphtheriae/tox
c: kontrol negative 20 dari 22 sampel adalah C.diphtheriae toksigenik.
d: positif toksigenik 6 M1885 C.diphtheriae mitis C.diphtheriae/non-tox
TERIMA KASIH