PEWARNAAN

GRAM

dr. Titiek Sulistyowati, M.Ked.Klin, Sp. MK

BANGKALAN
 PEWARNAAN GRAM PADA SPESIMEN KLINIK
PRINSIP  Panduan laboratorium untuk pemilihan media dan

Pewarnaan suasana kultur

 Panduan terhadap klinisi untuk pemilihan terapi

Gram antibiotik empiris

 Kontrol kualitas spesimen dan prosedur uji
mikrobiologi
 Harus segera dilaporkan pada spesimen dengan nilai
kritis

PEWARNAAN GRAM PADA ISOLAT

 Kemurnian isolat
 Sebagai panduan terhadap proses identifikasi
berdasarkan bentuk, ukuran, morfologi
seluler dan reaksi terhadap pewarnaan Gram
MEKANISME • Gram positif dan negatif menunjukkan
perbedaan komposisi dinding sel dan
arsitekturnya
• Gram positif:
 Lapisan peptidoglikan tebal  menahan
pewarnaan awal (kristal violet/ungu tua)
 >>>  asam teichoic
• Gram negatif:
 Lapisan peptidoglikan tunggal menempel
pada Lipopolisakarida asimetris- membrane
luar 2 lapisan fosfolipid yang diselingi protein
 membran luar rusak oleh alkohol sebagai
dekolorizer
MATERIAL dan 1. Reagen pewarnaan Gram: Crystal
PERALATAN violet, Gram’s iodine, Decolorizer
(alcohol), Safranin

2. Gelas objek, ose, lidi steril, cairan

Salin steril, pipet transfer

3. Bunsen /microcinerator / slide warmer

untuk fiksasi dengan pemanasan atau
methanol / Mikroskop cahaya
SPESIMEN • Spesimen klinik pada swab dengan
media transpor atau kontainer steril
• Kultur darah
• Koloni yang tumbuh pada media padat,
usia koloni < 24 jam dari media yang
tanpa penghambat
• Kultur pada media cair : apabila
morfologi diperlukan
Gram positif
Staphylococcus aureus
Gram negatif
Escherichia coli
Prosedur
• Gunakan gelas objek bersih dengan ujung yang frosted dan beri label
• Persiapkan pembuatan hapusan berdasarkan spesimen, menggunakan tehnik

Persiapan
aseptik :
 Swab dengan media transport : gulung 2 swab dengan pasti pada gelas objek
 Kontainer steril (sputum, aspirat, eksudat) : pilih yang purulen atau pus yang
mengandung darah atau sputum dengan lidi steril atau swab. Spesimen yang
terlalu tebal didilusikan dengan satu tetes salin pada gelas objek untuk
memudahkann persiapan hapusan
 Koloni dari media padat : Teteskan Salin sebanyak 1 tetes pada gelas objek
dan campur dengan sedikit koloni  emulsikan.
 Spesimen cair (mis cairan tubuh) dan kultur pada media cair : Teteskan cairan
pada gelas objek sebanyak 1-2 tetes
 Kultur darah dengan tutup karet : aspirat 2-3 ml dengan tehnik aseptik.
Teteskan sebanyak 1-2 tetes pada gelas objek. Lalu sebarkan sampai
membentuk lapisan tipis.
• Volume spesimen yang cukup harus dibuat sediaan hapusan sehingga dapat
membantu untuk deteksi mikroorganisme
• Hindari hapusan yang tebal : tulisan cetak masih terbaca
Prosedur • Keringkan sediaan di udara pada
permukaan yang rata sebelum difiksasi
Fiksasi • Fiksasi :
Pemanasan
• Lewatkan sediaan yang telah kering 2 sd 3 kali
melewati api
• Jangan terlalu lama untuk pemanasan (mencegah
rusak)
• Slide warmer diatur suhu pada 60˚C (biasa digunakan
untuk menfiksasi beberapa sediaan dalam satu waktu)
• Biarkan sediaan menjadi dingin sebelum pewarnaan

95% methanol bisa untuk fiksasi sediaan direk

dari spesimen klinik (2 menit)
Prosedur Jangan lakukan pewarnaan, pembilasan dan decolorizer langsung pada
hapusan spesimen, tetapi tuangkan pada area ujung sediaan dan biarkan

Pewarnaan
mengalir ke hapusan.
• Genangi hapusan yang sudah terfiksasi dengan kristal violet selama 30
detik.
• Biarkan kristal violet dan bilas dengan air keran yang mengalir.
• Genangi sediaan dengan Gram iodine selama 30 detik.
• Bilas iodine dengan air keran yang mengalir.
• Dekolorisasi dengan membiarkan pereaksi mengalir di atas hapusan
saat sediaan dipegang pada sudut atau posisi miring. Berhenti saat
hapusan menjadi jelas (1-5 detik).
• Sesuaikan waktu dekolorisasi dengan ketebalan sediaan
• Keluarkan kelebihan dekolorizer dengan aliran air keran.
• Genangi dengan safranin dan biarkan selama 30 detik.
• Bilas kelebihan safranin dengan aliran air keran
• Tiriskan sediaan pada udara kering dalam posisi tegak lurus.
Pewarnaan
Gram
Streptococcus
pneumoniae

Neisseria
gonorrhoeae

Clostridium
tetani
Pewarnaan • Sputum: terkontaminasi dengan air liur dan
mengandung flora normal dari orofaring
Gram  Hasil kultur bisa menghasilkan pelaporan

SPUTUM dan pemberian terapi yang salah pada

pasien
 Kultur spesimen respiratori yang salah 
membuang sumber daya laboratorium
• Gunakan untuk evaluasi kualitas sputum
ekspektoran yang diterima rutin pada kultur
bakteriologi.
 Prosedur • Prosedur:
– Periksa minimal 20 lapangan pandang dari
Gram Sputum sputum dengan perbesaran rendah (low power

Interpretasi
field).
– Perkirakan jumlah sel epitel skuamos pada
lapangan pandang yang representatif.
– Catat hasil pewarnaan Gram pada lembar kerja.

• Interpretasi:
– Spesimen sputum ditolak bila jumlah sel epitel ≥
10/LPF  JANGAN dilakukan kultur
– Jangan tolak sputum bila untuk kultur Legionella
atau BTA (basil tahan asam), atau specimen dari
pasien cystic fibrosis.
Kriteria
ditolak
 Kualitas
sputum yang
baik
Pelaporan • Menolak sputum untuk kultur
– Laporkan
• Hasil pewarnaan Gram mengindikasikan
kontaminasi orofaring ; kualitas spesimen tidak
baik sehingga tidak bisa dilakukan kultur. Mohon
untuk pengambilan spesimen ulang jika ada
indikasi klinis.
– Beri catatan pada perawat atau dokter klinisi
bahwa specimen tidak bias dilakukan kultur.
– Catatan tindakan pada lembar kerja :
Termasuk nama atau nomer ID personel
yang dihubungi, tanggal dan waktu,
inisial nama yang menghubungi.
Pewarnaan • BV, bersamaan dengan infeksi Candida
albicans dan Trichomonas vaginalis:
Gram penyebab radang vagina tersering pada
BV wanita usia produktif
• BV: perubahan flora normal pada vagina
Bakterial i.e. lactobacilli  diganti dengan
vaginosis pertumbuhan berlebih oleh bakteri
anaerob dan Gardnerella vaginalis.
Gardnerella melekat pada sel epitel
skuamous yang dominan pada ujung
disebut “clue cells*”  khas BV.
* sel epitel vagina yang dikelilingi oleh bakteri
 Pengambilan
specimen untuk
BV
Bacterial Vaginosis Smear Score Pad
 Gardnerella
vaginalis / Mobiluncus
Lactobacillus spp
Bacteroides spp spp
Skor
Basil Gram positif Basil Gram variabel Bentuk koma
besar kecil Gram variabel

0 >30 0 0
1 5-30 <1 <5
2 1-4 1-4 ≥5
3 <1 5-30  
4 0 >30  

NUGENT SCORE
Gram of Bacterial Vaginosis
Gram stain (1000X enlarged) showing epithelial cell coated with gram variable bacilli (Clue Cell).
Note gram variable bacilli (Gardnerella vaginalis) , gram negative curved bacilli (Mobiluncus sp.) &
regular gram negative bacilli.
 Mobiluncus species contribute to Bacterial
vaginosis. They appear as gram negative (pink)
curved bacilli
 Yeast
Infection

Vaginal Gram Stain of Yeast Infection (1000X)

Note: epithelial cells with yeast cells (purple) and yeast pseudohyphae
(long purple thread-like structure)
PEMERIKSAAN BTA
(TUBERKULOSIS)
 PEMBUATAN
SEDIAAN APUS
DAHAK
Peralatan
• Kaca sediaan yang baru dan
bersih (frosted end slide)
• Bambu/lidi
• Botol berisi pasir +
desinfektan
• Lampu spritus / bunsen
• Wadah pembuangan lidi
bekas
• Desinfektan (lisol 5%,
Alkohol 70%,Hipoklorit 0,5%)
PEWARNAAN
ZN
Prinsip • M. tuberculosis mempunyai lapisan
dinding lipid (Mycolic acid) yang tahan
terhadap asam.
• Proses pemanasan mempermudah
masuknya Carbol Fuchsin ke dalam
dinding sel.
• Dinding sel tetap mengikat zat warna
Carbol Fuchsin walaupun didekolorisasi
dengan asam alkohol.
Peralatan
• Rak pewarnaan
• Pinset / Penjepit kayu
• Air mengalir / botol
semprot air
• Lambu spritus / sulut api
• Rak pengering
• Pengatur waktu
• Reagensia ZN
PEWARNAAN
LAIN
TERIMA
KASIH