MAKALAH

MATAKULIAH BIOLOGI MOLEKULER DIAGNOSTIK

“METODE TOUCHDOWN PCR”

DOSEN PENGAMPUH : SYAHRUNI HIDAYATULLAH, S.Si., M.Kes.

DISUSUN OLEH :

1. DEWI LUTFIA DAMAYANTI (B1D122131)

2. SARMILA (B1D122132)
3. MITA TALIA MUNIR (B1D122133)

KELAS C (2022)

PROGRAM STUDI DIV TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK

FAKULTAS TEKNOLOGI KESEHATAN

UNIVERSITAS MEGAREZKY

MAKASSAR

2024
 KATA PENGANTAR

Puji syukur senantiasa terpanjatkan atas kehadirat Tuhan yang Maha Esa atas
segala limpahan nikmat dan karuniaNYA, yang dengannya kami dapat meyelesaikan
makalah ini dengan baik dan tepat waktu. Begitu juga dengan segala kerendahan hati,
kami ucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada ibu Syahruni Hidayatullah,
S.Si., M.Kes. yang telah mengamanahkan dan memberikan kepercayaan kepada kami
untuk menyelesaikan tugas ini dengan baik dan tepat waktu.
Besar harapan kami dengan adanya makalah ini diharapkan dapat membantu
teman-teman sekalian dalam mengetahui dan memahami pemahaman mengenai
Metode PCR Touchdown. Semoga dengan adanya makalah ini dapat menjadi jalan
menuju titik terang dan memberikan manfaat kepada teman-teman sekalian. Penulis
pun tidak menutup mata dan sangat menyadari bahwa didalam penulisan makalah ini
masih banyak kesalahan dan kekurangan, baik dari segi isi ataupun punggunaan
kata.Penulis sangat jauh dari kata sempurna. Dengan itu kritikan dan saran dari para
pembaca amat sangat kami harapkan.

Makassar, 10 Juni 2025

Kelompok 8

II
 DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR .............................................................................................. II

DAFTAR ISI .......................................................................................................... III
BAB I ....................................................................................................................... 4
PENDAHULUAN .................................................................................................... 4
A. Latar Belakang ............................................................................................... 4
B. Rumusan Masalah .......................................................................................... 6
C. Tujuan ............................................................................................................ 7
BAB II ...................................................................................................................... 8
PEMBAHASAN ....................................................................................................... 8
A. Pengertian PCR (Polymerase Chain Reaction) ................................................ 8
B. Sejarah PCR (Polymerase Chain Reaction) ..................................................... 9
C. Prinsip PCR (Polymerase Chain Reaction) ................................................... 10
D. Jenis- jenis Metode PCR (Polymerase Chain Reaction) ................................ 11
E. Metode Touchdown PCR (TD-PCR) ............................................................ 14
F. Perbedaan PCR Konvensional dan PCR Touchdown .................................... 19
G. Kelebihan dan kekurangan Touchdown PCR (TD-PCR)............................... 21
H. Contoh Aplikasi penggunaan Touchdown PCR ............................................ 23
BAB III................................................................................................................... 25
PENUTUP .............................................................................................................. 25
A. Kesimpulan .................................................................................................. 25
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................. 26

III
 BAB I
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Pada Zaman sekarang, perkembangan ilmu pengetahuan serta teknologi
semakin berkembang dengan pesat. Bioteknologi adalah salah satu perkembangan
ilmu pengetahuan dan teknologi yang sering diterapkan adalah bioteknologi.
Pemanfaatan berbagai prinsip ilmiah serta rekayasa terhadap organisme sistem.
Pada proses biologis yang menghasilkan atau meningkatkan potensi organisme
maupun menghasilkan produk dan jasa bagi kepentingan hidup manusia. Secara
umum, bioteknologi dikelompokkan menjadi dua, yaitu bioteknologi tradisional
dan bioteknologi modern. Bioteknologi tradisional merupakan bioteknologi
yangmemanfaatkan mikroba, proses biokimia, dan proses genetik yang terjadi
secaraalami. Bioteknologi tradisional ini terus mengalami perkembangan
hinggaditemukannya struktur DNA yang diikuti dengan penemuan lainnya.
Dengan ditemukannya struktur DNA dan berkembangnya ilmu pengetahuan
tentang DNA,muncullah istilah bioteknologi modern.
PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan teknik laboratorium yang
telah dikembangkan guna memperbanyak segmen DNA tertentu dengan cepat
serta efisien. Sejak penemuannya, PCR (Polymerase Chain Reaction) telah
menjadi alat yang sangat penting dalam berbagai bidang biologi molekuler,
bioteknologi, medis, dan forensik. Untuk memahami pentingnya PCR (Polymerase
Chain Reaction). Sebelum pengembangan PCR (Polymerase Chain Reaction),
memperbanyak segmen DNA tertentu ialah sebuah proses yang sangat rumit dan
memakan waktu. Metode yang ada, seperti kloning gen, memerlukan banyak
langkah dan bahan biologis yang sulit didapatkan dalam jumlah yang cukup. Ada
kebutuhan mendesak akan metode yang lebih cepat dan efisien untuk
memperbanyak DNA untuk analisis lebih lanjut.

4
 PCR (Polymerase Chain Reaction) dikembangkan berdasarkan prinsip
dasar replikasi DNA alami. Dalam sel hidup, enzim DNA polimerase mereplikasi
DNA sebelum pembelahan sel. PCR (Polymerase Chain Reaction) memanfaatkan
enzim ini dalam kondisi in vitro untuk memperbanyak segmen DNA tertentu.
Proses PCR (Polymerase Chain Reaction) melibatkan tiga langkah utama yang
diulang dalam beberapa siklus yaitu : Denaturasi, annealing, dan Extension. Pada
setiap tahapan PCR memerlukan pengaturan suhu serta siklus yang berbeda-beda.
Selain berberguna pada bidang penelitian, PCR (Polymerase Chain Reaction)
juga berguna di bidang klinis untuk kloning DNA, konfirmasi diagnosis, maupun
analisis forensik.
PCR (Polymerase Chain Reaction) ditemukan pada tahun 1983 oleh Kary
Mullis. Kary Mullis merupakan seorang ilmuwan di Cetus Corporation yang
mengembangkan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction). Kutipan dari Kary
Mullis “Dimulai dengan satu molekul materi genetik DNA, PCR dapat
menghasilkan 100 miliar molekul serupa dalam satu sore. Reaksinya mudah
dilakukan. Hal ini memerlukan tidak lebih dari sebuah tabung reaksi, beberapa
reagen sederhana dan sumber panas. Sampel DNA bisa murni, atau bisa juga
merupakan bagian kecil dari campuran bahan biologis yang sangat kompleks.
DNA tersebut mungkin berasal dari spesimen jaringan rumah sakit, dari sehelai
rambut manusia, dari setetes darah kering di tempat kejadian perkara, dari jaringan
otak yang menjadi mumi, atau dari mamut berbulu berusia 40.000 tahun yang
dibekukan di gletser”.
Kary Mullis menyadari bahwa dengan menggunakan siklus berulang dari
tiga langkah tersebut, amplifikasi eksponensial segmen DNA dapat dicapai. Ide ini
revolusioner karena memungkinkan amplifikasi segmen DNA dalam jumlah besar
hanya dalam beberapa jam. Pada akhir 1980an dan awal 1990an, PCR
(Polymerase Chain Reaction) mulai dikomersialisasikan, dengan berbagai
perusahaan bioteknologi menawarkan kit PCR (Polymerase Chain Reaction) dan
mesin thermal cycler yang dirancang khusus untuk melakukan PCR (Polymerase

5
 Chain Reaction). Hal ini memperluas akses ke teknologi PCR (Polymerase Chain
Reaction) dan mempercepat adopsinya di laboratorium penelitian di seluruh dunia.
Keberhasilan proses PCR dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti suhu dan waktu
penempelan oligonukleotida primer. Berdasarkan hal tersebut, penelitian ini
bertujuan untuk mengetahui suhu dan waktu optimal pada primer Aro2-38.
Salah satu metode PCR (Polymerase Chain Reaction) ialah Touchdown
PCR (Polymerase Chain Reaction). TOUCHDOWN PCR telah digunakan secara
luas dalam berbagai penelitian biologi molekuler dan bioteknologi. Misalnya,
dalam identifikasi dan kloning gen, analisis mutasi, dan diagnostik molekuler.
Teknik ini sangat berguna ketika bekerja dengan template DNA yang kompleks
atau dalam situasi di mana primer mungkin memiliki afinitas penempelan yang
rendah. Maka pada makalah ini, akan dibahas mengenai touchdown PCR
(Polymerase Chain Reaction).

B. Rumusan Masalah
Adapun rumusan masalah pada makalah ini ialah :
1. Apa itu PCR (Polymerase Chain Reaction)?
2. Bagaimana sejarah PCR (Polymerase Chain Reaction)?
3. Prinsip PCR (Polymerase Chain Reaction)?
4. Metode PCR (Polymerase Chain Reaction)?
5. Apa itu Touchdown PCR?
6. Apa perbedaan PCR konvensional dan PCR touchdown?
7. Apa Keuntungan Penggunaan Touchdown PCR?
8. Apa saja contoh Aplikasi penggunaan Touchdown PCR?

6
C. Tujuan
Adapun tujuan pada makalah ini:
1. Untuk mengetahui apa itu PCR (Polymerase Chain Reaction)
2. Untuk mengetahui sejarah PCR (Polymerase Chain Reaction)
3. Untuk mengetahui Prinsip PCR (Polymerase Chain Reaction)
4. Untuk mengetahui metode PCR (Polymerase Chain Reaction)
5. Untuk mengetahui apa itu Touchdown PCR
6. Apa perbedaan PCR konvensional dan PCR touchdown?
7. Untuk mengetahui Keuntungan Penggunaan Touchdown PCR
8. Untuk mengetahui contoh Aplikasi penggunaan Touchdown PCR

7
 BAB II
PEMBAHASAN

A. Pengertian PCR (Polymerase Chain Reaction)

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu teknik sintesis dan
amplifikasi DNA secara in vitro. Teknik PCR dapat digunakan untuk
mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah jutaan kali hanya dalam beberapa
jam. Setiap gen mempunyai primer dengan konsentrasi dan suhu annealing yang
berbeda, sehingga perlu dilakukan optimasi konsentrasi primer dan suhu annealing
agar didapatkan komposisi dan kondisi PCR yang sesuai sehingga mendapatkan
hasil PCR yang optimal. (Setyawati & Zubaidah, 2021). Polymerase Chain
Reaction (PCR) adalah teknik laboratorium yang digunakan untuk
mengamplifikasi fragmen DNA tertentu, menghasilkan jutaan hingga miliaran
salinan dari segmen DNA yang diinginkan. PCR sangat penting dalam berbagai
aplikasi biologi molekuler, termasuk diagnosis penyakit, analisis genetik, forensik,
dan penelitian ilmiah. Polymerase chain reaction test (tes PCR) adalah prosedur
dimana pemeriksaan yang dilakukan berguna untuk mendeteksi keberadaan sebuah
material genetik dari suatu bakteri maupun virus. Pemeriksaan PCR adalah
prosedur yang banyak dilakukan untuk membantu menegakkan diagnosis berbagai
penyakit, terutama pada masa COVID 19.
Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan sebuah teknik sintesis
serta amplifikasi DNA secara in vitro yang digunakan untuk menyalin segmen
DNA hingga jutaan kali dalam waktu yang cukup singkat. Pertama kali
dikembangkan pada 1985 oleh Karry Mullis. Metode PCR dapat meningkatkan
jumlah urutan DNA sebanyak ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula. Setiap
urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Pada
setiap n siklus PCR akan diperoleh 2n kali banyaknya DNA target. Adapun kunci
utama pada perkembangan PCR (Polymerase Chain Reaction) ialah menemukan

8
 bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan DNA target dan meminimalkan
amplifikasi urutan non target.

B. Sejarah PCR (Polymerase Chain Reaction)

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah salah satu teknologi
revolusioner dalam biologi molekuler yang memungkinkan amplifikasi segmen
DNA secara eksponensial. Teknologi ini telah mengubah wajah penelitian genetik,
diagnostik medis, forensik, dan berbagai bidang ilmu hayat. Teknik PCR
(Polymerase Chain Reaction) mulai berkembang setelah ditemukannya enzim
DNA polimerase, yang dapat mereplikasi DNA. Teknik ini awalnya
dikembangkan dengan menggunakan fragmen Klenow DNA polimerase I yang
berasal dari Escherichia coli. Fragmen klenow merupakan DNA polimerase yang
telah dihilangkan aktifitas eksonuklease-nya. Enzim ini ternyata memiliki
beberapa kelemahan antara lain tidak tahan panas, laju polimerisasinya sedang,
dan prosesivitasnya rendah. Rendahnya prosesifitas ini menunjukkan rendahnya
kemampuan enzim polimerase tersebut untuk menggabungkan nukleotida dengan
suatu primer secara terus-menerus tanpa mengalami dissosiasi dari komplek
primer DNA template. (Widowati, 2013).
PCR pertama kali dikonsepkan oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan
pada saat itu, Kary Mullis bekerja di Cetus Corporation. Ide dasar Mullis ialah
dengan menggunakan enzim DNA polimerase serta memperbanyak segmen DNA
tertentu melalui siklus berulang denaturasi, penempelan primer (annealing), dan
pemanjangan (extension). Sebelumnya, metode amplifikasi DNA memerlukan
teknik yang rumit dan waktu yang lama, tetapi Mullis menyadari bahwa dengan
siklus termal berulang, amplifikasi DNA dapat dilakukan dengan cepat dan efisien.
Mullis terus menguji idenya, awalnya tanpa siklus termal tetapi kemudian dengan
siklus termal berulang. Pada tahun 1984, Mullis bersama tim uji mutasi genetik di
Cetus mulai mengerjakan eksperimen yang menunjukkan kemampuan PCR untuk

9
 memperkuat DNA genom. Salah satu hambatan awal dalam penerapan PCR
adalah ketidakstabilan enzim DNA polimerase pada suhu tinggi yang diperlukan
untuk denaturasi DNA. Pada tahun 1986, ilmuwan di Cetus Corporation
menemukan penggunaan Taq polymerase, sebuah enzim DNA polimerase yang
diisolasi dari bakteri termofilik Thermus aquaticus. Taq polymerase tetap aktif
pada suhu tinggi, memungkinkan PCR berlangsung dengan lebih efisien dan anda.
Meskipun produk amplifikasi tidak terlihat pada elektroforesis gel
agarosa pada awalnya, Southern blotting mengkonfirmasi peningkatan kuantitas
segmen DNA yang diinginkan. DNA yang diamplifikasi dari PCR berhasil
dikloning dan diurutkan oleh para peneliti, yang kemudian mengajukan
permohonan paten pada PCR dan penerapannya dan mendapatkan persetujuan
paten pada tahun 1987. Sementara itu, tim menggunakan PCR untuk aplikasi lain
dengan merancang primer dan probe baru, yang kemudian menghasilkan DNA
yang diamplifikasi. reaksi lebih spesifik hingga hasilnya terlihat jelas pada
elektroforesis gel agarosa. Pada tahun 1990, PCR mulai dikomersialisasikan
dengan berbagai perusahaan bioteknologi menawarkan kit dan mesin termal sikler
yang dirancang khusus untuk PCR. Ini memperluas akses ke teknologi PCR dan
mempercepat adopsi metode ini di laboratorium penelitian di seluruh dunia.

C. Prinsip PCR (Polymerase Chain Reaction)

Ada beberapa yang diperlukan pada proses PCR adalah templat DNA;
sepasang primer, yaitu suatu oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan
nukleotida yang komplementer dengan urutan nukleotida DNA templat; dNTPs
(Deoxynucleotide triphosphates); buffer PCR; magnesium klorida (MgCl2) dan
enzim polimerase DNA. Pada proses PCR melibatkan beberapa tahap yaitu: (1)
pra-denaturasi DNA templat; (2) denaturasi DNA templat; (3) penempelan primer
pada templat (annealing); (4) pemanjangan primer (extension) dan (5) pemantapan

10
 (post- extension). Tahap (2) sampai dengan (4) merupakan tahapan berulang
(siklus), di mana pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah DNA.
PCR adalah suatu teknik yang melibatkan beberapa tahap yang berulang
(siklus) dan pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah target DNA untai ganda.
Untai ganda DNA templat (unamplified DNA) dipisahkan dengan denaturasi
termal dan kemudian didinginkan hingga mencapai suatu suhu tertentu untuk
memberi waktu pada primer menempel (anneal primers) pada daerah tertentu dari
target DNA. Polimerase DNA digunakan untuk memperpanjang primer (extend
primers) dengan adanya dNTPs (dATP, dCTP, dGTP dan dTTP) dan buffer yang
sesuai. Umumnya keadaan ini dilakukan antara 20 – 40 siklus. (Handoyo &
Rudiretna, 2001). DNA hasil ekstraksi digunakan sebagai template untuk
amplifikasi pada lokus 16S rRNA, control region, dan cytochrome oxidase I
(COI). Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan metode Hotstart standar
dengan parameter sebagai berikut : denaturasi 94oC selama 30 detik, annealing
50oC selama 30 detik, dan extension 72oC selama 30 detik, diulang dalam 38
siklus PCR. Modifikasi terhadap temperatur annealing, volume template DNA,
dan penambahan BSA 1X (bovine serum albumin) dilakukan pada beberapa
sampel yang tidak teramplifikasi menggunakan prosedur standart. (Pertiwi et al.,
2010)

D. Jenis- jenis Metode PCR (Polymerase Chain Reaction)

Setiap jenis PCR memiliki kelebihan dan aplikasi spesifiknya sendiri, yang
memungkinkan peneliti untuk memilih metode yang paling sesuai dengan
kebutuhan mereka. Dari deteksi patogen hingga analisis genetik, PCR dan
berbagai modifikasinya telah menjadi alat penting dalam biologi molekuler dan
bioteknologi.Adapun jenis jenis metode PCR, yaitu:
1. Conventional (Qualitative) PCR.

11
 Conventional PCR atau PCR Konvensional merupakan Metode PCR
dasar yang digunakan untuk mengamplifikasi DNA dengan menggunakan
siklus denaturasi, annealing, dan elongasi. PCR konvensional merupakan
sebuah metode yang paling sederhana dan digunakan sebagai dasar untuk
berbagai modifikasi lainnya.
2. Multiplex PCR.
Multiplex PCR adalah teknik varian dari Polymerase Chain Reaction
(PCR) yang memungkinkan amplifikasi simultan dari beberapa target DNA
dalam satu reaksi. Ini dicapai dengan menggunakan beberapa pasangan primer
yang spesifik untuk masing-masing target DNA yang diinginkan. Multiplex
PCR adalah metode yang sangat efisien dan hemat waktu, terutama berguna
dalam diagnostik klinis, penelitian genetik, dan analisis forensik.
3. Nested PCR.
Nested PCR ini melibatkan dua set primer serta dua putaran
amplifikasi. Putaran pertama menggunakan set primer luar, dan produk dari
putaran pertama digunakan sebagai template untuk putaran kedua dengan set
primer dalam. Teknik ini meningkatkan spesifisitas dan sensitivitas, sangat
berguna untuk mendeteksi target DNA yang sangat sedikit dalam sampel.
4. RT-PCR
RT-PCR digunakan untuk mengamplifikasi DNA dari RNA. Pertama-
tama, RNA diubah menjadi DNA komplementer (cDNA) menggunakan
enzim reverse transcriptase, kemudian cDNA ini diamplifikasi menggunakan
PCR. RT-PCR sangat berguna dalam studi ekspresi gen dan deteksi RNA
virus.
5. qRT-PCR
Real-Time PCR (kuantitatif PCR), memungkinkan pengukuran jumlah
DNA target yang diamplifikasi secara real-time (RT) selama siklus PCR. Pada
Teknik ini menggunakan pewarna fluorescent atau probe untuk mendeteksi

12
 serta mengukur produk DNA selama reaksi berlangsung, memungkinkan
kuantifikasi absolut atau relatif dari DNA target.
6. Quantitative PCR
Quantitative PCR (qPCR), juga dikenal sebagai Real-Time PCR,
adalah teknik laboratorium yang memungkinkan kuantifikasi DNA target
secara real-time selama reaksi PCR berlangsung. Tidak seperti PCR
konvensional yang hanya menunjukkan hasil akhir setelah semua siklus
selesai, qPCR memonitor amplifikasi DNA dalam setiap siklus, memberikan
data kuantitatif yang dapat dianalisis langsung.
7. Hot-start PCR
Hot Start PCR dapat meningkatkan spesifisitas serta mengurangi
pembentukan produk non-spesifik dengan menunda aktivitas polimerase
hingga suhu tinggi tercapai. Ini dicapai dengan menggunakan polimerase yang
diaktifkan secara termal atau dengan menggunakan antibodi atau inhibitor
yang menghalangi aktivitas polimerase hingga tahap denaturasi.
8. Touchdown PCR
Touchdown PCR mengurangi non-spesifik amplifikasi dengan
memulai siklus PCR pada suhu annealing tinggi, kemudian secara bertahap
menurunkan suhu annealing. Teknik ini meningkatkan spesifisitas amplifikasi
dan sering digunakan untuk template DNA dengan kandungan GC tinggi atau
masalah primer-dimer.
9. Assembly PCR.
Assembly PCR atau yang disebut juga Overlap Extension PCR, adalah
teknik yang digunakan untuk menggabungkan beberapa fragmen DNA yang
memiliki overlap (tumpang tindih) pada ujung-ujungnya menjadi satu molekul
DNA kontigu. Teknik ini juga sangat berguna untuk berbagai aplikasi
rekayasa genetika, termasuk pembuatan mutasi spesifik, penggabungan gen,
dan pembangunan klon genetic.

13
 10. Colony PCR.
Colony PCR merupakan sebuah teknik yang digunakan untuk cepat
mengidentifikasi koloni bakteri atau ragi yang mengandung plasmid atau
fragmen DNA. Metode ini juga memungkinkan peneliti untuk memeriksa
keberadaan insert DNA dalam klon yang dipilih langsung dari koloni yang
tumbuh pada media padat tanpa perlu melakukan isolasi plasmid atau DNA
genom terlebih dahulu.
11. Methylation-specific PCR.
Methylation-specific PCR teknik modifikasi dari Polymerase Chain
Reaction (PCR) yang digunakan untuk mendeteksi metilasi DNA pada posisi
CpG di daerah promotor gen. Teknik ini sangat penting dalam studi
epigenetik karena memungkinkan identifikasi perubahan metilasi DNA yang
sering dikaitkan dengan regulasi gen, perkembangan penyakit, dan kanker.
12. LAMP assay.
LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification) adalah teknik
amplifikasi DNA yang sangat efisien dan cepat yang dilakukan pada suhu
konstan. Teknik ini dirancang untuk amplifikasi spesifik urutan DNA target
dengan sensitivitas dan spesifisitas tinggi. LAMP Assay sering digunakan
dalam diagnostik molekuler karena tidak memerlukan perubahan suhu siklik
seperti PCR konvensional, sehingga dapat dilakukan dengan peralatan yang
lebih sederhana.

E. Metode Touchdown PCR (TD-PCR)

Touchdown (TD) PCR merupakan cara yang sederhana dan cepat untuk
mengoptimalkan PCR, meningkatkan spesifisitas, sensitivitas dan hasil, tanpa
memerlukan optimasi yang panjang dan/atau mendesain ulang primer. Touchdown
(TD) PCR menggunakan suhu anil awal di atas suhu leleh yang diproyeksikan
(Tm) primer yang digunakan, kemudian secara bertahap bertransisi ke suhu anil

14
yang lebih rendah dan lebih permisif selama siklus berturut-turut. Setiap
perbedaan Tm antara anil yang benar dan salah akan menghasilkan keuntungan
eksponensial dua kali lipat per siklus.
Touchdown (TD) PCR telah menemukan penerapan yang luas dalam
protokol PCR standar, termasuk PCR yang bergantung pada transkriptase balik,
serta dalam pembuatan perpustakaan cDNA dan skrining polimorfisme nukleotida
tunggal. Touchdown (TD) PCR khususnya berguna untuk templat yang sulit untuk
diperkuat namun juga dapat digunakan secara standar untuk meningkatkan
spesifisitas dan pembentukan produk. ouchdown PCR (TD-PCR) adalah sebuah
teknik modifikasi dari Polymerase Chain Reaction (PCR) yang dirancang untuk
meningkatkan spesifisitas dan efisiensi amplifikasi DNA. Teknik ini
dikembangkan untuk mengatasi tantangan yang sering muncul dalam PCR
konvensional, seperti amplifikasi non-spesifik dan formasi primer-dimer.
Prinsip utama dari TD-PCR adalah penurunan bertahap suhu annealing
selama siklus PCR, yang memungkinkan hanya primer dengan kecocokan yang
tinggi untuk menempel pada template DNA pada siklus awal. Touchdown PCR
mengurangi non-spesifik amplifikasi dengan memulai siklus PCR pada suhu
annealing tinggi, kemudian secara bertahap menurunkan suhu annealing. Teknik
ini meningkatkan spesifisitas amplifikasi dan sering digunakan untuk template
DNA dengan kandungan GC tinggi atau masalah primer-dimer.
Prinsip dasar dari TD-PCR adalah penggunaan program siklus yang
menurunkan suhu annealing secara bertahap. Pada siklus awal, suhu annealing
dimulai beberapa derajat di atas titik leleh (Tm) dari primer. Suhu ini kemudian
dikurangi secara bertahap setiap siklus berikutnya hingga mencapai atau sedikit di
bawah suhu annealing yang dihitung untuk primer tersebut. Yang pertama ialah
pada Suhu Annealing Awal Tinggi: Pada suhu tinggi, hanya pasangan primer-
template yang paling spesifik yang akan terbentuk. dan yang kedua Penurunan
Suhu Annealing Bertahap: Suhu diturunkan secara bertahap untuk memungkinkan
lebih banyak amplifikasi dari target spesifik, sementara mengurangi kemungkinan

15
amplifikasi non-spesifik. Oleh karena itu, metode TD-PCR multipleks yang
diusulkan dapat dikonfirmasi sebagai cara yang efektif untuk optimalisasi reaksi
PCR secara cepat guna meningkatkan spesifisitas dan sensitivitas selama
amplifikasi gen. (Moezi et al, 2019
Prosedurnya memakan waktu antara 90 dan 120 menit, tergantung pada
panjang templat. (Korbie dan Jhon. 2008). TOUCHDOWN PCR diperkenalkan
untuk mengatasi masalah ini dengan menggunakan strategi penurunan suhu secara
bertahap selama siklus-siklus awal PCR. Metode ini dimulai dengan suhu
annealing yang lebih tinggi dari suhu melting primer (Tm), yang memastikan
hanya ikatan yang sangat spesifik yang terbentuk. Kemudian, suhu annealing
diturunkan secara bertahap pada siklus-siklus berikutnya, biasanya dengan
penurunan sebesar 0,5-1°C per siklus, hingga mencapai suhu annealing yang lebih
rendah yang masih dalam rentang optimal. Adapun Metode Touchdown PCR (TD-
PCR) melibatkan beberapa langkah yang mirip dengan PCR konvensional, tetapi
dengan penyesuaian pada fase annealing:
1. Denaturasi: Pada proses denaturasi ini, prosesnya seperti pada PCR biasa,
dimana denaturasi DNA dilakukan pada suhu tinggi yaitu sekitar 94-95°C.
2. Annealing dengan Penurunan Suhu: Suhu annealing dimulai tinggi (biasanya
5-10°C di atas Tm primer) dan diturunkan setiap dua siklus sekitar 1-2°C
sampai mencapai suhu yang diinginkan.
3. Elongasi: Sintesis DNA dilakukan pada suhu optimal untuk enzim polimerase
(biasanya sekitar 72°C).
Komponen utama dalam metode Touchdown PCR sama dengan PCR
konvensional, tetapi ada beberapa variasi yang khas untuk Touchdown PCR.
Berikut adalah komponen-komponen utama yang biasanya digunakan dalam PCR
Touchdown:
1. Primer adalah fragmen pendek DNA yang berfungsi untuk memulai sintesis
DNA oleh DNA polimerase. Dalam Touchdown PCR, primer spesifik target

16
 digunakan dalam reaksi untuk mengamplifikasi fragmen DNA yang
diinginkan
2. Template DNA adalah fragmen DNA yang akan diperbanyak (amplifikasi)
selama siklus PCR. Ini bisa berupa DNA genomik, DNA cDNA, atau fragmen
DNA lainnya yang ingin diperbanyak.
3. DNA polimerase adalah enzim yang bertanggung jawab atas sintesis DNA
baru dengan menambahkan nukleotida ke ujung 3'-OH primer yang sudah ada.
Pada umumnya, DNA polimerase thermostable seperti Taq DNA polimerase
digunakan dalam PCR untuk menahan suhu tinggi yang diperlukan selama
siklus PCR.
4. dNTPs adalah nukleotida yang menjadi bahan bakar untuk sintesis DNA baru
selama PCR
5. Buffer PCR adalah larutan yang menyediakan lingkungan kimia yang optimal
untuk aktivitas DNA polimerase, termasuk pH yang tepat dan konsentrasi ion
yang diperlukan untuk stabilisasi fragmen DNA.
6. Ion magnesium (Mg2+) diperlukan untuk aktivitas optimal DNA polimerase.
Konsentrasi MgCl2 dalam reaksi PCR harus diatur dengan hati-hati untuk
memastikan kinerja yang optimal.
7. Bahan-bahan tambahan seperti bovine serum albumin (BSA) atau dimethyl
sulfoxide (DMSO) mungkin ditambahkan ke dalam reaksi PCR untuk
meningkatkan spesifisitas, efisiensi, atau stabilitas PCR.
Selain komponen-komponen di atas, reaksi Touchdown PCR melibatkan
serangkaian siklus dengan penurunan suhu inkubasi pada setiap siklusnya. Ini
memungkinkan untuk meningkatkan spesifisitas reaksi dengan mengurangi
pembentukan produk primer nonspecific dan primer-dimer.
PCR (Polymerase Chain Reaction) adalah teknik yang digunakan untuk
mengamplifikasi segmen DNA tertentu. Salah satu variasi dari PCR adalah PCR
Touchdown. Teknik PCR Touchdown digunakan untuk meningkatkan spesifisitas

17
dan efisiensi amplifikasi DNA dengan mengurangi kemungkinan terbentuknya
produk non-spesifik. Berikut adalah cara kerja PCR Touchdown secara umum:
1. Denaturasi DNA: Proses ini biasanya dilakukan pada suhu sekitar 94-98°C
selama 20-30 detik untuk memisahkan dua untai DNA.
2. Penurunan Suhu Awal (Annealing): Pada tahap awal, suhu annealing
ditetapkan lebih tinggi dari suhu annealing primer yang diinginkan (sekitar 5-
10°C lebih tinggi). Misalnya, jika suhu annealing primer yang ideal adalah
55°C, tahap ini dimulai dari 65°C.
3. Siklus Touchdown:
Siklus touvhdown PCR terdiri atas:
a) Annealing Suhu Tinggi: Setiap beberapa siklus (misalnya, 2-5 siklus), suhu
annealing diturunkan secara bertahap (misalnya, 1-2°C per siklus).
b) Perpanjangan (Extension): Dilakukan pada suhu sekitar 72°C selama waktu
yang sesuai tergantung panjang produk yang diinginkan
4. Siklus Konstan:
a) Setelah beberapa siklus touchdown, suhu annealing akan mencapai suhu
yang optimal (misalnya, 55°C) dan tetap konstan untuk sisa siklus PCR.
b) Denaturasi, annealing, dan perpanjangan dilanjutkan dengan kondisi suhu
tetap untuk mengamplifikasi DNA secara spesifik.
5. Tahap Akhir
Pada tahap akhir ini terdapat dua fase yaitufase perpanjngan dan fase
penyimpanan.
a) Perpanjangan Akhir: Biasanya dilakukan pada suhu 72°C selama 5-10
menit untuk memastikan semua produk PCR telah diperpanjang
sepenuhnya.
b) Penyimpanan: Produk PCR disimpan pada suhu rendah (biasanya 4°C)
hingga digunakan atau dianalisis lebih lanjut.

18
F. Perbedaan PCR Konvensional dan PCR Touchdown
PCR Touchdown dan PCR konvensional adalah dua varian dari teknik
PCR yang digunakan untuk mengamplifikasi DNA, tetapi mereka memiliki
perbedaan dalam cara pengaturan suhu annealing dan tujuannya. Berikut adalah
perbedaan utama antara PCR Touchdown dan PCR konvensional:
1. Untuk PCR Konvensional
a) Proses: terdapat proses :
1) Denaturasi: Pemisahan dua untai DNA pada suhu tinggi (94-98°C)
selama 20-30 detik.
2) Annealing: Pengikatan primer pada DNA template pada suhu tetap yang
ditentukan berdasarkan titik leleh (Tm) primer, biasanya sekitar 50-
65°C, selama 20-30 detik.
3) Perpanjangan (Extension): Sintesis DNA baru oleh enzim Taq
polymerase pada suhu 72°C selama 1-2 menit.
b) PCR konvensional memiliki siklus :
1) Suhu annealing tetap konstan sepanjang semua siklus PCR.
2) Biasanya terdiri dari 25-35 siklus yang meliputi denaturasi, annealing,
dan perpanjangan.
c) Adapun kelebihan PCR konvensional :
1) Sederhana dan Mudah: Pengaturan suhu yang sederhana dan konstan.
2) Cepat: Karena tidak ada perubahan suhu annealing, prosesnya bisa
lebih cepat.

d) Adapun kekurangan PCR konvensional :

1) Spesifisitas yang Lebih Rendah: Mungkin lebih banyak produk non-
spesifik jika suhu annealing tidak optimal.
2) Efisiensi yang Lebih Rendah: Jika suhu annealing terlalu rendah,
primer non-spesifik dapat mengikat, mengurangi efisiensi amplifikasi.
2. Sedangkan untuk PCR Touchdown

19
a) Pada PCR touchdown terdapat proses yang hamper sama dengan proses
PCR Konvensional, yaitu :
1) Denaturasi: Pemisahan dua untai DNA pada suhu tinggi (94-98°C)
selama 20-30 detik.
2) Annealing: Mulai dari suhu annealing yang lebih tinggi dari suhu
optimal, kemudian secara bertahap diturunkan setiap beberapa siklus.
3) Perpanjangan (Extension): Sintesis DNA baru pada suhu 72°C
selama 1-2 menit.
b) Adapun Siklus PCR touchdown
1) Touchdown Cycles: Suhu annealing awalnya tinggi dan diturunkan
secara bertahap (1-2°C setiap 2-5 siklus) hingga mencapai suhu
annealing optimal.
2) Constant Cycles: Setelah mencapai suhu annealing optimal, suhu
tetap konstan untuk sisa siklus PCR.
c) Adapun kelebihan P CR touchdown
1) Spesifisitas yang Lebih Tinggi: Mengurangi produk non-spesifik
karena pengikatan primer non-spesifik berkurang pada suhu
annealing yang tinggi.
2) Efisiensi yang Lebih Tinggi: Meningkatkan kemungkinan amplifikasi
produk spesifik, terutama jika template DNA memiliki kompleksitas
tinggi.
d) Adapun Kekurangan PCR touchdown:
1) Pengaturan yang Lebih Rumit: Membutuhkan pengaturan suhu yang
berubah-ubah dan lebih kompleks.
2) Waktu yang Lebih Lama: Karena adanya fase penurunan suhu,
proses bisa memakan waktu lebih lama dibandingkan PCR
konvensional

20
G. Kelebihan dan kekurangan Touchdown PCR (TD-PCR)
Touchdown PCR (TD-PCR) merupakan salah satu teknik Polymerase
Chain Reaction (PCR) yang berfungsi untuk meningkatkan spesifisitas dan
efisiensi amplifikasi DNA. Metode Touchdown PCR (TD-PCR) ini sangat
bermanfaat dalam situasi di mana PCR konvensional mungkin tidak memberikan
hasil yang memadai karena adanya amplifikasi non-spesifik atau kesulitan dalam
amplifikasi daerah dengan kandungan GC tinggi. Berikut adalah beberapa
kelebihan dan kekurangan dari penggunaan metode Touchdown PCR.
1. Kelebihan Touchdown PCR (TD-PCR)
a) Touchdown PCR (TD-PCR) mampu meningkatkan spesifisitas amplifikasi
dengan memulai siklus pada suhu annealing yang tinggi, yang mengurangi
kemungkinan ikatan primer yang non-spesifik pada tahap awal. Ini
memastikan bahwa hanya primer dengan kecocokan sempurna yang akan
terikat pada template DNA
b) Penurunan suhu annealing secara bertahap, Touchdown PCR (TD-PCR)
memungkinkan primer untuk mengikat target DNA dengan lebih baik seiring
dengan berjalannya siklus, yang meningkatkan efisiensi amplifikasi produk
DNA yang diinginkan.
c) Touchdown PCR (TD-PCR) juga efektif dalam mengurangi pembentukan
primer-dimer serta produk amplifikasi yang nonspesifik lainnya yang sering
menjadi masalah dalam PCR konvensional
d) Teknik ini sangat berguna untuk mengamplifikasi segmen DNA dengan
kandungan GC tinggi yang sering kali sulit untuk diamplifikasi dengan
metode PCR standar Touchdown PCR (TD-PCR) mampu mengatasi
stabilitas struktur sekunder pada daerah yang kaya akan GC
e) TD-PCR dapat diterapkan dalam berbagai aplikasi, termasuk deteksi
patogen, penelitian genetik, dan analisis forensik. Ini membuatnya menjadi
alat yang serbaguna dalam berbagai bidang biologi molekuler

21
2. Kekurangan Touchdown PCR (TD-PCR)
a) Kebutuhan untuk mengoptimalkan desain primer dan kondisi reaksi.
Penurunan suhu annealing harus dirancang dengan hati-hati untuk setiap
pasangan primer, yang dapat memerlukan waktu dan usaha yang cukup
besar.
b) Tidak semua primer cocok untuk Touchdown PCR (TD-PCR). Primer yang
dirancang harus memiliki properti yang memungkinkan mereka bekerja
dengan baik pada suhu annealing yang lebih tinggi, yang dapat membatasi
pilihan primer yang tersedia
c) Meskipun Touchdown PCR (TD-PCR) tidak memerlukan peralatan yang
jauh lebih canggih dibandingkan PCR konvensional, perlu adanya termal
sikler yang dapat mengatur penurunan suhu secara bertahap. Beberapa
laboratorium mungkin memerlukan pengaturan tambahan atau perangkat
lunak untuk mengelola protokol ini.
d) Protokol Touchdown PCR (TD-PCR) bisa memakan waktu lebih lama
daripada PCR konvensional karena memerlukan beberapa siklus dengan
suhu annealing yang berbeda. Ini bisa memperpanjang total waktu yang
diperlukan untuk menyelesaikan reaksi.
e) Touchdown PCR membutuhkan pengaturan suhu yang cermat untuk setiap
siklus, yang dapat membuatnya lebih rumit dan memakan waktu
dibandingkan dengan metode PCR standar.
f) Metode ini memiliki potensi untuk kontaminasi silang karena proses yang
lebih panjang dan melibatkan banyak langkah, sehingga memerlukan praktik
laboratorium yang cermat untuk mengurangi risiko ini.
g) Keberhasilan Touchdown PCR (TD PCR) sangat tergantung pada
pengaturan suhu yang akurat untuk setiap siklus, dan ketidakstabilan atau
ketidakpresisan dalam mengontrol suhu dapat menghasilkan hasil yang tidak
konsisten.

22
 h) Touchdown PCR (TD PCR) mungkin tidak efektif untuk target dengan
struktur sekunder yang kompleks, karena suhu awal yang tinggi dapat
menghancurkan atau mempengaruhi struktur primer dan target secara tidak
diinginkan.

H. Contoh Aplikasi penggunaan Touchdown PCR

Salah satu contoh penggunaan Touchdown (TD) PCR ialah pada
penelitian yang berjudul “Novel and Sensitive Touchdown Polymerase Chain
Reaction Assays for the Detection of Goat and Sheep Milk Adulteration with Cow
Milk” yang diteliti (Kourkouli et al., 2024), penelitian ini menggunakan konsep
PCR (Polymerase Chain Reaction) dengan jenis metode touch down (TD) PCR.
Dalam penelitian ini, metodologi yang sensitif dan spesifik dikembangkan untuk
mendeteksi target DNA yang berbeda untuk menunjukkan pemalsuan susu domba
atau kambing dengan penambahan susu sapi secara bersamaan dalam satu reaksi.
Karena homologi yang tinggi antara ketiga spesies tersebut, maka
dikembangkanlah protokol touchdown PCR (TD-PCR) yang jauh lebih spesifik
dan sensitif yang bertujuan untuk menghindari kesalahan klasifikasi dan
pembentukan produk non-spesifik. Metode ini juga memiliki potensi untuk
mengatasi masalah dengan suhu anil tinggi yang diperlukan untuk beberapa
kombinasi primer-templat dan sangat berguna untuk templat yang sulit diperkuat,
seperti templat dengan struktur sekunder yang luas atau kandungan %GC yang
tinggi. Kinerja hibridisasi dan keberhasilan metode PCR secara keseluruhan
dievaluasi menggunakan analisis peleburan.
Penggunaan Metode PCR Touchdown juga digunakan (Moezi et al, 2019)
penelitiannya berjudul “Multiplex touchdown PCR assay to enhance specificity
and sensitivity for concurrent detection of four foodborne pathogens in raw milk”.
Pada penelitian ini juga menggunakan Jenis metode touchdown PCR (TD- PCR).
Adapun tujuan pada penelitian ini ialah untuk mengembangkan multiplex

23
touchdown PCR (multiplex TD-PCR) untuk deteksi cepat dan simultan empat
patogen utama bawaan makanan untuk menghindari produksi yang salah dan tidak
diinginkan selama amplifikasi gen.
Touchdown PCR adalah bentuk modifikasi dari PCR standar, yang
meningkatkan spesifisitas dan sensitivitas. Maka dari itu, uji TD-PCR multipleks
dengan langkah pra-pengayaan dikembangkan untuk mendeteksi empat patogen
bawaan makanan yaitu Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes ,
Staphylococcus aureus , dan Salmonella enterica serovar Enteritidis dalam sampel
kultur murni dan susu mentah. Hasil penelitian menunjukkan bahwa protokol ini
dapat menghilangkan atau mengurangi band yang tidak diinginkan secara
signifikan. Sensitivitas deteksi TD-PCR tunggal dan multipleks adalah satu sel per
ml dalam kultur murni. Selain itu, batas deteksi TD-PCR multipleks adalah satu
sel per 25 ml untuk susu mentah yang terkontaminasi secara artifisial. Kami
memperoleh hasil serupa untuk mendeteksi patogen yang disebutkan di atas pada
susu mentah, setelah membandingkan metode TD-PCR multipleks dengan kultur
tradisional, kecuali pada satu atau dua sampel.

24
 BAB III
PENUTUP

A. Kesimpulan
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu teknik sintesis dan
amplifikasi DNA secara in vitro. Teknik PCR dapat digunakan untuk
mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah jutaan kali hanya dalam
beberapa jam. Polymerase Chain Reaction (PCR) memiliki beberapa jenis
metode pemeriksaan, diantaranya : Conventional (Qualitative)PC, Multiplex
PC, Nested PCR, RT-PCR, qRT-PCR, Quantitative PCR, Hot-start PCR
Touchdown PCR, Assembly PCR, Colony PCR, Methylation-specific PCR,
dan LAMP assay. Touchdown (TD) PCR merupakan cara yang sederhana dan
cepat untuk mengoptimalkan PCR, meningkatkan spesifisitas, sensitivitas dan
hasil, tanpa memerlukan optimasi yang panjang dan/atau mendesain ulang
primer. Touchdown PCR adalah bentuk modifikasi dari PCR standar, yang
meningkatkan spesifisitas dan sensitivitas. Metode Touchdown PCR ini sering
juga digunakan pada penilitian penelitian berbasis molekuler. PCR
Touchdown dan PCR konvensional adalah dua varian dari teknik PCR yang
digunakan untuk mengamplifikasi DNA, tetapi mereka memiliki perbedaan
dalam cara pengaturan suhu annealing dan tujuannya.

25
 DAFTAR PUSTAKA

Handoyo, D., & Rudiretna, A. (2001). Prinsip umum dan pelaksanaan Polymerase
Chain Reaction (PCR). Unitas, 9(1), 17–29.

Korbie, H.D., Dan Jhon S.M. 2008. Touchdown PCR for Increased Specifity and
sensitiy in PCR Amplification. Nature Protocols. 3(9)1445-6

Kourkouli, A., Thomaidis, N., Dasenaki, M., & Markou, A. (2024). Novel and
Sensitive Touchdown Polymerase Chain Reaction Assays for the Detection of
Goat and Sheep Milk Adulteration with Cow Milk. Molecules, 29(8).
https://doi.org/10.3390/molecules29081820

Pertiwi, N. P. D., Mahardika, I. G. N. ., & Watiniasaih, N. L. (2010). OPTIMASI

AMPLIFIKASI DNA MENGGUNAKAN METODE PCR ( Polymerase Chain
Reaction ) PADA IKAN KARANG ANGGOTA FAMILI Pseudochromidae (
DOTTYBACK ). Jurnal Biologi, 19(2), 1–5.
https://ojs.unud.ac.id/index.php/BIO/article/view/21254/14017

Setyawati, R., & Zubaidah, S. (2021). Optimasi Konsentrasi Primer dan Suhu
Annealing dalam Mendeteksi Gen Leptin pada Sapi Peranakan Ongole (PO)
Menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR). Indonesian Journal of
Laboratory, 4(1), 36. https://doi.org/10.22146/ijl.v4i1.65550

Widowati, E. W. (2013). Desain Primer Sitokrom B (cyt b) Sebagai Salah Satu

Komponen PCR (Polymerase Chain Reaction) untuk Deteksi DNA Babi.
Laporan Penelitian Individual, 1–64.

26