EKSTRASI DNA

Oleh:
Nama : Iqbal Auni Rahman
NIM : B1A018105
Rombongan :I
Kelompok :2
Asisten : Bramassetyo Aji

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI
PURWOKERTO
2020
A. Tujuan

Tujuan dari praktikum ekstraksi DNA adalah mengetahui cara mengisolasi

DNA genom pada tanaman.

B. Materi

Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum ekstraksi DNA genom

adalah daun kedelai (Glycine max), Genomic DNA Mini Kit (plant) Geneaid
(GP1, GP2, GP3, W1, Wash & Ellution Buffer), filter coloumn, collection tube,
GD coloumn, microtube, alkohol 70%, dan akuades.
Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ekstraksi DNA genom adalah
mortar, pestle, mikropipet, tip, sentrifugator, freezer, lemari es, sprayer, vortex,
masker, sarung tangan lateks, face shield, dan alat tulis.

C. Prosedur Kerja

Sampel daun dicuci dengan akuades, disemprot dengan alkohol

70%, lalu dikeringkan dengan tissue

Sampel dipindahkan ke mortar lalu digerus

hingga halus

GP1 buffer dirambahkan sebanyak 600

mikrolit

Sampel dipindahkan ke dalam microtube 2 ml, 5 mikrolit

RNAse ditambahkan ke dalam sampel

Vortex dilakukan selama 30 detik

Microtube dimasukkan ke dalam waterbath 65oC

selama 3 menit
 GP2 buffer sebanyak 200 mikrolit kemudian di
vortex selama 30 detik

Sampel disimpan dalam freezer selama

Filter column dimasukkan ke dalam collection tube, lalu
3 menit
larutan sampel dipindahkan ke collection tube

Kedua collection tube yang berisi sampel dimasukkan ke dalam

sentrifugator dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit

Filter column dibuang, supernatan diambil dan dimasukkan

ke dalam microtube 1,5 ml

GP3 buffer ditambahkan sebanyak 1,5 volume sebelumnya,

di vortex selama 5 detik

Sampel dipindakan ke GD coloumn lalu disentrifugasi

dengan kecepatan 15.000 rpm selama 1 menit

Supernatan dibuang, endapan DNA ditambahkan larutan W1

buffer sebanyak 400 mikrolit

Sentrifugasi dilakukan dengan kecepatan 15.000 rpm

selama 1 menit
 Cairan dalam GD coloumn dibuang, wash buffer
ditambahkan sebanyak 600 mikrolit (dibagi 3 ulangan)

Sentrifugasi dilakukan dengan kecepatan 15.000 rpm selama

1 menit dilakukan tiga kali ulangan, endapan dibuang dan
sentrifugasi lagi

Hasil sentrifugasi dipindahkan ke microtube, Elution buffer

dari waterbath ditambahkan ke dalam sampel

Sentrifugasi dilakukan dengan kecepatan 15. 000 rpm selama

1 menit

Sampel dimasukkan ke dalam lemari es dengan suhu 4oC

D. Hasil dan Pembahasan

Langkah pertama yang dilakukan dalam praktikum ekstraksi DNA ini

adalah mencuci sampel daun kedelai (Glycine max) dengan menggunakan akuades
seperti pada Gambar 1.

Gambar 1. Pencucian sampel dengan akuades

Langkah selanjutnya menyemprotkan sampel dengan alkohol 70% agar daun
steril, mengurangi residu dan mempercepat proses pengeringan seperti pada
Gambar 2.

Gambar 2. Penyemprotan sampel dengan alkohol 70%

Selanjutnya mengeringkan sampel dengan tissue seperti pada Gambar 3.

Gambar 3. Sampel daun dikeringkan dengan tissue

Langkah yang dilakukan berikutnya adalah memindahkan dan menggerus sampel
dalam mortar sampai halus seperti pada Gambar 4.

Gambar 4. Sampel dipindahkan ke mortar untuk digerus

Setelah itu sampel yang berada di dalam mortar kemudian diberi buffer GP1
sebanyak 600 mikrolit menggunakan pipet yang yang telah diset 200 mikrolit
untuk memudahkan dalam penggerusan sampel seperti dalam Gambar 5. Menurut
Hamzah et al. (2018), GP1 buffer membantu proses perusakan dan pengahancuran
membran dan dinding sel. Pemecahan sel merupakan tahapan awal dari ekstraksi
DNA yang bertujuan mengeluarkan isi sel.

Gambar 5. Penambahan GP1 buffer 600 mikrolit

Sampel kemudian digerus kembali dan dipindahkan ke dalam microtube 2 ml
seperti pada Gambar 6.

Gambar 6. Pemindahan sampel ke dalam microtube 2 ml

Langkah berikutnya menambahkan RNAse sebanyak 5 mikrolit dengan
menggunakan mikropipet yang telah diset ukuran 10 mikrolit seperti pada Gambar
7. RNAse merupakan enzim pendegradasi RNA, hal ini dilakukan untuk
menghilangkan RNA pada larutan DNA[ CITATION Wid19 \l 1033 ].

Gambar 7. Penambahan 5 mikrolit RNAse ke dalam sampel

Tahapan selanjutnya, sampel dilakukan vortex selama 30 detik dengan vortex
mixer seperti pada Gambar 8. Fungsi nya adalah untuk menghomogenkan larutan
sampel isolasi DNA[ CITATION Eva19 \l 1033 ].

Gambar 8. Vortex pada sampel selama 30 detik

Kemudian memasukkan microtube ke dalam waterbath dengan suhu 65oC selama
tiga menit seperti Gambar 9. Waterbath merupakan alat yang fungsi utamnaya
adalah menciptakan suhu yang konstan, suhu yang sesuai memaksimalkan kerja
enzim RNAse[ CITATION Nur192 \l 1033 ].

Gambar 9. Microtube dimasukkan ke dalam waterbath

Kemudian menambahkan GP2 buffer sebanyak 200 mikrolit untuk menetralkan,
kemudian di vortex kembali selama 30 detik seperti Gambar 10[ CITATION Ham18 \l
1033 ].

Gambar 10. Penambahan GP2 buffer sebanyak 200 mikrolit kemudian di vortex
Tahapan berikutnya, sampel isolasi DNA kemudian masuk ke proses
pendinginan pada freezer selama 3 menit seperti pada Gambar 11. Pendinginan ini
dilakukan agar dapat memudahkan dalam pemecahan dinding sel dan juga dapat
menonaktifkan kerja seluler sehingga berpengaruh pada isolasi DNA serta agar
DNA tidak terdegradasi[ CITATION Mur17 \l 1033 ]

Gambar 11. Pendinginan sampel isolasi di freezer selama 3 menit

Langkah berikutnya memasukkan Filter coloumn ke dalam collection tube seperti
pada Gambar 12.

Gambar 12. Pemasukkan filter column ke dalam collection tube

Kemudian larutan sampel dimasukkan ke dalam collection tube untuk menyaring
cairan dalam sampel dengan filter coloumn seperti pada pada Gambar 13.

Gambar 13. Larutan sampel dimasukkan ke dalam collection tube

Kedua tube yang berisi larutan sampel disentrifugasi kembali dengan kecepatan
1000 rpm selama 5 menit untuk memisahkan antara supernatan dengan molekul
besar lainnya seperti pada Gambar 14.

Gambar 14. Kedua collection tube disentrifugasi 1000 rpm 5 menit

Tahapan berikutnya membuang filter coloumn dibuang seperti terlihat pada
Gambar 15.

Gambar 15. Pembuangan filter column

Menambahkan supernatan sebanyak 500 mikrolit ke dalam microtube 1,5 ml baru
seperti pada gambar 16.

Gambar 16. Penambahan supernatan ke microtube 1,5 ml

Selanjutnya menambahkan GP3 buffer sebanyak 1,5 volume dari supernatan pada
Gambar 17. Fungsi dari penambahan GP3 buffer ini adalah untuk mengikat DNA
ke buffer serta spin coloumn[ CITATION Rau18 \l 1033 ].

Gambar 17. Penambahan GP3 buffer sebanyak 1,5x volume sebelumnya

Sampel di vortex kembali selama lima detik untuk dihomogenkan seperti pada
Gambar 18.

Gambar 18. Dilakukan vortex selama 5 detik

Memasukkan campuran dari supernatan dan GP3 buffer ke dalam GD coloumn
seperti pada Gambar 19.

Gambar 19. Campuran supernatan dan GP 3 buffer dimasukkan ke GD coloumn

Langkah selanjutnya adalah melakukan kembali sentrifugasi dengan kecepatan
15.000 rpm selama 1 menit seperti pada Gambar 20.

Gambar 20. Disentrifugasi 15.000 rpm selama 1 menit

Supernatan yang terbentuk dibuang, kemudian menambahkan W1 buffer endapan
DNA ditambahkan dengan W1 buffer sebanyak 400 mikrolit seperti Gambar 21.
W1 buffer berfungsi untuk mencuci protein atau menghilangkan sisa-sisa protein
yang menempel pada DNA[ CITATION Ham18 \l 1033 ].

Gambar 21. Endapan DNA ditambahkan W1 buffer

Selanjutnya kembali melakukan sentrifugasi engan kecepatan 15.000 rpm selama
1 menit terlihat pada Gambar 23.

Gambar 22. Dilakukan sentrifugasi 15.000 rpm selama 1 menit

Cairan GD coloumn yang sudah melewati proses sentrifugasi kemudian dibuang
dan ditambahkan wash buffer sebanyak 600 mikrolit dengan tiga kali ulangan
seperti pada Gambar 23. Wash buffer ini berfungsi untuk mencuci buffer-buffer
sebelumnya dan garam-garam yang masih menempel pada DNA (Hamzah et al.,
2018).

Gambar 23. Pembuangan cairan GD coloumn, ditambahkan washbuffer 600

mikrolit
Sentrifugasi kembali dilakuan dengan kecepatan 15. 000 rpm selama 1 menit
kemudian hasil sentrifugasi dipindahkan ke dalam microtube seperti pada Gambar
24.

Gambar 24. Dilakukan sentrifugasi 15.000 rpm selama 1 menit

Ellution buffer yang telah disimpa dalam waterbath yang berfungsi melepaskan
DNA dari membran seperti pada Gambar 25[ CITATION And19 \l 1033 ].

Gambar 25. Penambahan elution buffer ke sampel

Hasil isolasi sampel DNA kemudian dimasukkan ke dalam lemari es dengan suhu
4oC seperti pada Gambar 26. setelah itu didapati hasil dari ekstraksi DNA yaitu
DNA murni.

Gambar 26. Penyimpanan sampel isolasi ke lemari es dengan suhu 4oC

Ekstraksi DNA merupakan proses pemisahan DNA dari komponen sel
lainnya seperti protein, karbohidrat, lemak dan zat lainnya. Ekstraksi DNA terdiri
dari tiga tahap utama yakni perusakan dinding sel (lisis), pemisahan DNA dari
komponen lainnya serta pemurnian DNA[ CITATION Ros18 \l 1033 ]. Tahap pertama
dalam ekstraksi DNA adalah proses perusakan atau penghancuran membran dan
dinding sel yang dilakukan menggunakan buffer GP1. Pemecahan sel merupakan
tahapan awal dari ekstraksi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel.
Buffer-buffer yang digunakan pada tahap ini yaitu buffer GP2 yang bertujuan
untuk menetralkan, buffer GP3 untuk mengikat DNA. Kemudian pencucian pada
proses ekstraksi menggunakan buffer W1 untuk mencuci protein, wash buffer
untuk mencuci buffer-buffer sebelumnya dan garam-garam yang masih menempel
pada DNA, dan ellution buffer untuk melepaskan DNA dari membran serta untuk
penyimpanan. Setelah itu didapati hasil dari ekstraksi yaitu, DNA murni [ CITATION
Ham18 \l 1033 ].
 Ekstraksi DNA dapat dilakukan demgan beberapa proses atau cara.
Terdapat bebrapa metode yang bisa dilakukan untuk ekstraksi DNA yaitu metode
konvensional dan metode menggunakan kit. Metode ekstraksi DNA secara
konvensional (tanpa kit) merupakan perpaduan reaksi kimia dari berbagai reagen.
Salah satu contohnya adalah metode Phenol Chloroform Isoamly Alcohol (PClA)
merupakan serangkaian larutan yang terdiri dari larutan phenol, klorofrom, dan
isoarnil-alkohol yang digunakan untuk mengekstrak DNA. Metode tersebut sering
digunakan untuk mengekstrak DNA dari beberapa macam wujud
sampel[ CITATION Onn15 \l 1033 ] . Metode ini memerlukan sejumlah tahapan
penambahan bahan-bahan kimia dan membutuhan waktu pengerjaan yang cukup
lama (± 18 jam). Seiring dengan berkembangnya teknologi, proses ekstraksi DNA
telah mengalami pengembangan dan modifikasi sehingga lebih efisien. Salah satu
bentuk modifikasi proses ekstraksi DNA ialah penggunaan kit ekstraksi komersial
yang telah berisi campuran bahan yang dibutuhkan untuk proses ekstraksi dengan
waktu pengerjaan yang cukup singkat ( ±2 jam)[ CITATION Ros18 \l 1033 ].
Kit yang dapat digunakan selain Genomic DNA Mini Kit (plant) Geneaid
untuk ekstraksi DNA, salah satunya yaitu QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen).
QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) merupakan kit yang digunakan khusus untuk
isolasi DNA bakteri baik dalam kultur murni mapun langsung dari secret makhluk
hidup. Isolasi DNA dengan menggunakan QIAamp DNA Mini Kit dimodifikasi
yang diawali dengan peremajaan kultur bakteri[ CITATION Fit15 \l 1033 ]. Selain itu
isolasi DNA juga dapat dilakukan dengan mengikuti protocol standar dari
PrestoTM Mini gDNA Bacteria Kit, kit ini digunakan untuk isolasi DNA genom
bakteri. Terdapat juga metode yang digunakan untuk isolasi DNA lobster yaitu
dengan menggunakan kit ekstraksi DNA lysis buffer, kit ekstraksi DNA Wizard®
Genomic DNA Purification Kit, dan kit ekstraksi DNA GENEzolTM
Reagent[ CITATION Pam16 \l 1033 ].
 DAFTAR REFERENSI

Fitriya, R. T., Muslimin, I. & Lisdiana, L., 2015. Keefektifan Metode Isolasi DNA
Kit dan CTAB/NaCl yang Dimodifikasi pada Staphylococcus aureus dan
Shigella dysentriae. LenteraBio: Berkala Ilmiah Biologi, 4(1), pp. 87-92.

Hamzah, M. Z., Simbala, H. E. I. & Yudistira, A., 2018. Pengujian Aktivitas

Antibakteri dan Identifikasi Secara Molekuler Menggunakan Gen 16s rRNA
Bakteri Simbion Endofit yang Diisolasi dari Alga Merah. Pharmacon
Jurnal Ilmiah Farmasi, 7(3), pp. 294-301.

Hutami, R., Bisyri, H., Sukarno & Nuraini, H., 2018. Ekstraksi DNA dari Daging
Segar untuk Analisis dengan Metode Loop-Mediated Isothermal
Amplification (LAMP). Jurnal Agroindustri Halal, 4(2), pp.209-216.

Khoiron, N. I., Titisari, D. & Lamidi, 2019. Rancang BAngun Waterbath Dilengkapi
Pemantauan Distribusi Suhu. Journal Teknokes, 12(2), pp. 9-14.

Marwayana, O. N., 2015. Ekstraksi Asam Deoksiribonukleat dari Sampel Jaringan

Otot. Oseana, 40(2), pp. 1-9.

Murtiyaningsih, H., 2017. Isolasi DNA Genom dan Identifikasi Kekerabatan Genetik
Nanas Menggunakan RAPD (Random Amplified Polimorfic DNA). Journal
of Agricultural Science, 15(1), pp. 103-111.

Pambudiono, A., Suarsini, E. & Amin, M., 2016. Isolasi DNA Genom Bakteri
Potensial Pengkelat Logam Berat Kadmium dari Limbah Cair Penepungan
Agar. Jurnal SAINTEK, 1(2), pp. 57-68.

Rau, C. H., Yudistira, A. & Simbala, H. E. I., 2018. Isolasi Identifikasi Secara
Molekuler Menggunakan Gen 16s rRNA dan Uji Aktivitas Antibakteri
Bakteri Simbion Endofit yang Diisolasi dari Alga Halimeda opuntia.
Pharmacon Jurnal Ilmiah Farmasi, 7(2), pp. 52-61.

Sari, W. & Rosmeita, C. N., 2019. Identifikasi Molekuler Cendawan Entomopatogen

Beauveria bassiana dan Metarhizium anisopliae Asal Isolat Cianjur. Jurnal
Program Studi Agroteknologi, 1(1), pp. 1-9.

Shofa, A. F., Hariyanti & Wahyudi, P., 2019. Penggunaan DNA Mitokondria
Sebagai Penanda Sumber Gelatin Sediaan Gummy dengan Teknik
Polymerase Chain Reaction dan Sekuensing DNA. Jurnal Sains Farmasi
dan Klinis, 6(1), pp. 25-31.

Widyasari, E. M., Sriyani, M. E., Daruwati, I., Halimah, K. & Nuraeni, W., 2019.
Karakteristik Fisiko-Kimia Senyawa Bertanda 99m Tc-Kuersetin. Jurnal
Sains dan Teknologi Nuklir Indonesia, 20(1), pp. 9-18.