Prosiding 2 nd Seminar dan Konferensi Internasional tentang Masalah Global (ISCoGI) 2016: Eropa dan Asia di Era Globalisasi:

Kerja Sama dan

Tantangan
Universitas Wahid Hasyim, Semarang, Indonesia. 25-26 Nov 2016 Kertas No. A.5

Metode Penentuan Asam Retinoat Menggunakan Kromatografi Cair

Kinerja Tinggi dan Aplikasi pada
Krim Pemutih Malam

Aqnes Budiarti, Nila Vuqohan

Universitas Wahid Hasyim Jurusan Farmasi Fakultas Farmasi Jalan X / 22 Menoreh
Tengah Sampangan Semarang Indonesia 50236
[email protected] ; [email protected]

Abstrak- Asam retinoat secara umum telah digunakan untuk pengelupas kulit dalam perawatan pemutihan wajah. Konsentrasi asam retinoat pada sediaan kosmetik topikal berdasarkan

persyaratan adalah 0,025-0,1% sehingga memerlukan metode yang tervalidasi untuk menentukan kadarnya. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memvalidasi metode penetapan kadar asam

retinoat menggunakan KCKT dan menerapkan metode tervalidasi tersebut pada krim malam pemutih wajah. Penetapan kadar asam retinoat menggunakan KCKT (Jasco PU-2080 plus) yang

dilengkapi detektor ultraviolet (2070 plus) pada panjang gelombang 340,3 nm. Fase diam yang digunakan adalah C18 (12,5 cm x 4 mm) dan fase gerak campuran metanol: air: asam asetat glasial

(90: 10: 0,5, v / v / v), dengan laju alir 1,3 mL / menit. Validasi parameter termasuk presisi, akurasi, linearitas, sensitivitas (LOD dan LOQ) dan selektivitas. Sampel diambil dari klinik kecantikan di

Semarang. Metode analisis yang diusulkan telah memenuhi persyaratan validasi. Uji presisi menghasilkan nilai RSD 0,09% -0,37%, uji akurasi memberikan nilai rekoveri untuk sampel A adalah

99,92% -100,78% dan sampel B adalah 99,44% -101,42%, linieritas yang dihasilkan baik dengan kepercayaan (r) = 0,9996, LOD dan LOQ masing-masing adalah 0,16 µg / mL dan 0,54 µg / mL

dan metode yang memiliki selektivitas yang baik. Kandungan asam retinoat dalam sampel A adalah 0,02% dan sampel B adalah 0,02%. Hasil penelitian menunjukkan bahwa konsentrasi asam

retinoat dalam sampel tidak berlebihan. uji akurasi memberikan nilai rekoveri untuk sampel A adalah 99,92% -100,78% dan sampel B adalah 99,44% -101,42%, linieritas yang dihasilkan baik

dengan koefisien korelasi (r) = 0,9996, LOD dan LOQ masing-masing adalah 0,16 µg / mL dan 0,54 µg / mL dan metode yang memiliki selektivitas yang baik. Kandungan asam retinoat dalam

sampel A adalah 0,02% dan sampel B adalah 0,02%. Hasil penelitian menunjukkan bahwa konsentrasi asam retinoat dalam sampel tidak berlebihan. uji akurasi memberikan nilai rekoveri untuk

sampel A adalah 99,92% -100,78% dan sampel B adalah 99,44% -101,42%, linieritas yang dihasilkan baik dengan koefisien korelasi (r) = 0,9996, LOD dan LOQ masing-masing adalah 0,16 µg /

mL dan 0,54 µg / mL dan metode yang memiliki selektivitas yang baik. Kandungan asam retinoat dalam sampel A adalah 0,02% dan sampel B adalah 0,02%. Hasil penelitian menunjukkan bahwa

konsentrasi asam retinoat dalam sampel tidak berlebihan.

Kata kunci: metode penetapan kadar, asam retinoat, krim malam pemutih wajah, HPLC

Abstrak- Asam retinoat biasanya digunakan untuk pemutihan wajah dalam perawatan pemutihan. Konsentrasi asam retinoat dalam sediaan topikal
adalah 0,025 - 0,1% berdasarkan kebutuhan kosmetika sehingga perlu metode determinasi yang tervalidasi. Penelitian ini bertujuan untuk
memvalidasi metode penentuan asam retinoat menggunakan HPLC dan menerapkan metode validasi pada krim malam pemutih. Penentuan asam
retinoat menggunakan HPLC (Jasco PU-2080 plus) yang dilengkapi dengan detektor ultraviolet (2070 plus) pada panjang gelombang 340,3 nm.
Fase diam menggunakan C18 (12,5 cm x 4 mm) dan fase gerak menggunakan campuran metanol: air: asam asetat glasial (90: 10: 0,5, v / v / v),
diberikan laju alir 1,3 mL / menit . Metode tersebut divalidasi dalam parameter presisi, akurasi, linieritas, sensitivitas (LOD dan LOQ) dan
selektivitas. Sampel yang digunakan diambil dari klinik kecantikan di Semarang. Metode yang diusulkan memenuhi persyaratan validitas. Nilai RSD
untuk uji presisi 0,09% -0,37%, uji akurasi menghasilkan nilai recovery sampel A 99,92% -100,78% dan sampel B

99,44% -101,42%, linieritas baik dengan koefisien korelasi (r) = 0,9996, LOD dan LOQ 0,16 µg / mL dan
0,54 µg / mL, masing-masing dan metode ini memiliki selektivitas yang baik. Asam retinoat pada sampel A 0,02% dan sampel B 0,02%. Hasil penelitian
menunjukkan bahwa konsentrasi asam retinoat pada sampel tidak berlebihan.

Kata kunci: metode penentuan, asam retinoat, krim malam pemutih, HPLC

1. Perkenalan
Asam retinoat umumnya digunakan untuk memutihkan wajah dalam perawatan pemutihan dan digunakan untuk memperbaiki kulit dari
kerusakan kulit akibat sinar matahari. Asam retinoat menyebabkan risiko berbahaya antara lain peradangan kulit dan pengerasan kulit. Potensi sebagai
karsinogen telah dibuktikan pada mencit albino dan mencit berpigmen

ISBN 978-602-8273-57-2 A.5-1

www.iscogi.unwahas.ac.id
terkena UV-A dan UV-B (National Toxicology Program, 2012). Asam retinoat dapat menyebabkan kecacatan pada janin karena
efeknya sebagai zat teratogen (Puspitadewi, 2008).
Penentuan asam retinoat dalam bentuk dosis kosmetik memerlukan metode analisis yang tepat untuk tujuan pengendalian
kualitas. Beberapa metode yang telah dikembangkan untuk menentukan asam retinoat adalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
(KCKT) dengan detektor UV. Asam retinoat memiliki cincin aromatik, ikatan rangkap terkonjugasi dan auksokrom anion-O
sehingga dapat dideteksi dengan detektor UV (Nastiti, 2016).

Metode analisis asam retinoat di pasar krim pemutih telah divalidasi oleh Rahayu (2014) dengan fase gerak yang terdiri
dari metanol: air: asam asetat glasial (85: 15: 0,5, v / v / v), kolom C18 dan panjang gelombang diatur pada 353 nm. Hasilnya
memenuhi persyaratan parameter linieritas, LOD dan LOQ.

Nastiti (2016) melakukan analisis asam retinoat pada krim pemutih menggunakan HPLC. Fase gerak terdiri dari
metanol: air: asam asetat glasial (90: 10: 0,5, v / v / v), kolom fase diam C18, dengan detektor UV diatur pada 353 nm.
Metode tersebut telah divalidasi pada presisi, linieritas, LOD dan LOQ.

Konsentrasi asam retinoat dalam sediaan topikal adalah 0,025 - 0,1% berdasarkan kebutuhan kosmetika, sehingga
diperlukan metode yang sangat sensitif (Draelos dan Thaman, 2006). Namun, ada sedikit laporan mengenai metode penentuan
asam retinoat dalam krim malam pemutih. Penelitian ini bertujuan untuk memvalidasi metode penentuan asam retinoat
menggunakan HPLC dan menerapkan metode validasi pada krim malam pemutih.

2. Metode Penelitian
2.1. Bahan
Standar referensi asam retinoat (Multi Kimia Raya), aquabidestilata (PT. Ikapharmindo), metanol kelas HPLC (Merck),
asam asetat glasial (Merck), sampel krim malam pemutih dari klinik kecantikan A dan B.

2.2. Alat
Satu set HPLC (Jasco PU-2080 plus) yang dilengkapi dengan detektor ultraviolet (2070 plus), kolom C18
12.5cmx4mm, diameter 5μm. Spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu UV-1800), sentrifugator (Hettich EBA 20), vortex mixer
(H-VM-300), penangas ultrasonik (Jeken), filter membran 0,45 μm, pompa penghilang tekanan vakum (Rocker 300), analitik skala
(Pioneer Ohaus PA214), ukuran pipet mikro 5-50 mL dan 1001000 mL (Soccorex).

2.3. Persiapan Stok dan Solusi Kerja

Larutan stok asam retinoat dengan konsentrasi 400 µg / mL dibuat dengan cara dilarutkan
10,0 mg asam retinoat ke dalam labu ukur 25 mL dan diencerkan dengan methanol. Larutan kerja diperoleh dengan pengenceran
yang tepat menghasilkan konsentrasi bahan pada 2, 3, 4, 5 dan 6 µg / mL.

2.4. Kromatografi
Penentuan dilakukan pada fase terbalik pada suhu kamar. Optimasi fasa gerak dilakukan dengan memvariasikan
metanol: air: asam glasial asetat dengan perbandingan (80: 20: 0,5, v / v / v; 85: 15: 0,5 v / v / v dan 90: 10: 0,5, v / v / v). Laju
aliran dioptimalkan pada 1,0; 1,3 dan 1,4 mL / menit. Deteksi UV ditetapkan pada 340,3 nm. Volume injeksi adalah 20 µL.

2.5. Validasi Metode Analisis

Metode HPLC yang dikembangkan divalidasi sesuai dengan pedoman dalam International Conference Harmonization (2005)
dengan menilai beberapa parameter yaitu linearitas, sensitivitas yang dinyatakan dengan limit of detection (LOD) dan limit of
quantification (LOQ), presisi dan akurasi.

ISBN 978-602-8273-57-2 A.5-2

www.iscogi.unwahas.ac.id
2.6. Persiapan
Sampel krim malam ditimbang 1,0 gram kemudian diencerkan dengan 10 ml methanol dan dicampur menggunakan vortex mixer
selama 5 menit. Sentrifugasi dengan kecepatan 600 rpm selama 10 menit kemudian disaring dengan filter membran 0,45 µL. Sampel
diencerkan 5 kali dengan mengambil 1 mL larutan ke dalam labu 5 mL. Larutan disaring menggunakan penyaring membran 0,20 μm
dan 20 μL larutan saring diinjeksikan ke dalam sistem HPLC. Ada enam pengulangan untuk setiap sampel krim malam. Kuantifikasi
asam retinoat dilakukan dengan menggunakan teknik standar eksternal.

3. Hasil dan Pembahasan

3.1. Pengoptimalan Komposisi Fase Seluler
Optimasi dilakukan untuk mendapatkan polaritas tertentu yang meningkatkan selektivitas dan sensitivitas metode analisis.
Asam retinoat mudah larut dalam metanol, pelarut polar yang biasa digunakan dalam kromatografi fase terbalik. Aquabidestilata
digunakan untuk mengatur polaritas fasa gerak. Asam asetat glasial digunakan untuk mengontrol keasaman akibat ionisasi analit,
selain sebagai pengubah kolom silika untuk mencegah dan mengurangi puncak tailing (Munson, 1991). Gambar 1 menunjukkan
bahwa fase gerak yang terdiri dari metanol: air: asam asetat glasial (90: 10: 0,5, v / v / v) menghasilkan waktu retensi 5,36 menit
dan bentuk puncak kromatogram yang baik.

(Sebuah) (b)

(c)

Gambar 1. Pengoptimalan Fase Seluler

(a) metanol: air: asam asetat glasial (80: 20: 0,5, v / v / v) (b) metanol: air:
asam asetat glasial (85: 15: 0,5, v / v / v) (c ) metanol: air: asam asetat
glasial (90: 10: 0,5, v / v / v)

3.2. Kurva Kerja Standar Asam Retinoat

Persamaan regresi linier adalah y = 184462.48x-111.456. Persamaan yang diperoleh digunakan untuk menentukan asam retinoat
dalam sampel.

ISBN 978-602-8273-57-2 A.5-3

www.iscogi.unwahas.ac.id
3.3. Validasi Metode Analisis
3.3.1. Presisi
Uji ketelitian menggunakan larutan asam retinoat pada 3 µg / mL. Direplikasi enam kali. Nilai RSD 0,09% -
0,37%, lebih kecil dari persyaratan, 2%.

3.3.2. Ketepatan
Uji akurasi dilakukan dengan metode penambahan standar. Pengujian dilakukan dengan spiking raw material ke dalam sampel sebesar 80%,
100%, 120%. Nilai pemulihan berada pada kisaran yang diterima 98-102% (Gandjar dan Rohman, 2012). Metode analisis dapat digunakan untuk
menghasilkan data yang mendekati atau mirip dengan konsentrasi yang sesuai.

3.3.3. Linieritas
Regresi linier berdasarkan konsentrasi terhadap absorbansi adalah y = 184462.48x-111.456 dengan faktor korelasi (r) =
0.9996 (gambar 2).

Gambar 2. Regresi Linear Solusi Kerja Asam Retinoat

3.3.4. Kepekaan
Parameter sensitivitas metode analisis diwakili oleh limit of detection (LOD) dan limit of quantification (LOQ). Berdasarkan hasil
perhitungan dengan menggunakan regresi linier nilai LOD sebesar 0,16 µg / mL dan nilai LOQ sebesar 0,54 µg / mL.

3.3.5. Selektivitas
Selektivitas metode analisis ditekankan oleh nilai Resolusi (R). Metode analisis HPLC memiliki selektivitas yang baik
dengan tidak adanya gangguan dari komponen lain.

3.4. Penentuan Asam Retinoat dalam Krim Pemutih Malam

Berdasarkan nilai parameter tersebut dinyatakan bahwa metode yang diusulkan telah memenuhi persyaratan validitas dan
layak digunakan untuk penentuan asam retinoat pada sampel. Asam retinoat pada sampel A 0,02% dan sampel B 0,02%. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa konsentrasi asam retinoat pada sampel tidak berlebihan.

4. Kesimpulan
Dapat disimpulkan bahwa metode analisis menggunakan HPLC pada panjang gelombang 340,3 nm dengan fasa diam
menggunakan C18 dan fasa gerak yang terdiri dari metanol: air: asam asetat glasial (90: 10: 0,5 v / v / v) dan laju alir 1,3 mL /
menit memungkinkan analisis kuantitatif asam retinoat dan metode analisis valid untuk diterapkan pada krim malam pemutih yang
diambil dari klinik kecantikan di Semarang dan konsentrasi asam retinoat pada sampel tidak berlebihan.

ISBN 978-602-8273-57-2 A.5-4

www.iscogi.unwahas.ac.id
Referensi
Draelos, ZD and Thaman, LA, (2006), Formulasi Kosmetik Produk Perawatan Kulit, 30, Taylor &
Francis Group, New York, hlm.27-29
Gandjar, IG, dan Rohman, A., (2012), Analisis Obat Secara Spektrofotometri dan Kromatografi, 1,
Pustaka Pelajar, Yogyakarta, hlm. 71-75
ICH, (2005), Harmonized Tripartite Guideline, Validasi Prosedur Analitis: Teks dan
Metodologi Q2 (RI), Komite Pengarah ICH.
Munson, JW, (1991), Analisis Farmasi: Metode Modern, Ilmu Farmasi dan Obat, 11, Airlangga
University Press, Surabaya, hlm.26-31
Nastiti, AA, (2016), Analisis Asam Retinoat pada Krim Pemutih Wajah Menggunakan KLT dan KCKT,
Skripsi, Universitas Islam Bandung, Bandung
National Toxicology Program., (2012), Studi Fotokarsinogenesis Asam Retinoat dan Retinil
Palmitate, AS: Departemen Kesehatan dan Layanan Kemanusiaan, hlm 63-66
Puspitadewi, R., (2008), Efek Asam Retinoat yang Diberikan Pada Induk Mencit (Mus Musculus)
Umur Bebuntingan 10 Hari Terhadap Hasil Reproduksi dan Kelainan Bawaan Ekternal Janin, Skripsi, Universitas
Airlangga, Surabaya
Rahayu, WS, (2014), Analisis Asam Retinoat Dalam Sediaan Krim Pemutih yang Dijual Bebas di
Wilayah Purwokerto, Jurnal Ilmiah Farmasi, Universitas Muhammadiyah, Purwokerto.

ISBN 978-602-8273-57-2 A.5-5

www.iscogi.unwahas.ac.id