Cebador

Un cebador, iniciador ou primer (esta última é a forma inglesa, moi utilizada na literatura noutros idiomas) é unha pequena febra de ácido nucleico (ADN ou ARN) que serve como punto de iniciación da replicación do ADN. Utilízase tanto na síntese natural do ADN como en certas técnicas como a reacción en cadea da polimerase (PCR). Os cebadores ou primers son necesarios para a replicación do ADN porque os encimas que catalizan este proceso, que son ADN polimerases, só poden engadir novos nucleótidos a unha cadea de ácido nucleico xa existente (que é o cebador). O cebador hibrídase cun curto tramo da cadea a copiar, e a polimerase empeza a replicación no extremo 3' do cebador, e fai unha copia complementaria da cadea de ADN que está en fronte.

Forquita de replicación do ADN. O primer de ARN está indicado na parte superior.

Na maioría dos casos de replicación natural do ADN, o primer é unha curta cadea de ARN, que unha vez que a replicación avanza é eliminado e substituído por ADN. O cebador ou primer pode sintetizarse de novo por acción de certas ARN polimerases (pero, como xa se dixo, a ADN polimerase non pode empezar a síntese de cero, precisa un cebador).

Moitas técnicas bioquímicas e de bioloxía molecular de laboratorio nas que intervén a ADN polimerase, como a secuenciación do ADN e a reacción en cadea da polimerase (PCR), requiren primers feitos de ADN. Estes primerrs son xeralmente curtos oligonucleótidos sintetizados, cunha lonxitude de arredor de vinte bases. Unha vez sintetizados son hibridados co ADN diana para que se coloquen en posición e a ADN polimerase poida empezar a copiar o ADN.

Mecanismo in vivo

Artigo principal: Replicación do ADN.

Forquita de replicación coa febra líder ou continua e a febra retardada ou descontinua na que se ven fragmentos de Okazaki con cebadores en vermello.

A febra retardada do ADN en replicación é a que se copia a partir da febra molde da dobre hélice, que se abre formando a forquita de replicación en dirección 5'→3', pero a ADN polimerase III non pode moverse sobre o molde nesa mesma dirección, senón na contraria. Por esta razón, a febra retardada ten que sintetizarse en curtos segmentos chamados fragmentos de Okazaki, conforme a dobre hélice se vai abrindo. Ao longo da febra molde da febra retardada o encima primase constrúe os primers de ADN. As ADN polimerases poden entón utilizar os grupos libres 3'-OH dos primers de ARN para sintetizar ADN en dirección 5'→3'.

As seccións de ARN que fixeron de primers e que forman parte dos fragmentos de Okazaki son despois eliminados pola ADN polimerase I nos procariotas ou pola ADN polimerase δ nos eucariotas (os mecanismos non son os mesmos en procariotas e eucariotas) e engádense os novos desoxirribonucleótidos a partir do primer para encher os ocos entre un primer e o seguinte. Despois serán eliminados os primers, e a ADN ligase une os distintos fragmentos de Okazaki facendo que a febra retardada ou descontinua pase a ser continua.

Eliminación do cebador

Na eliminación do cebador ou primer nos eucariotas, a ADN polimerase δ alonga o fragmento de Okazaki en dirección 5' a 3', e acaba por encontrarse co fragmento de Okazaki previo que está máis adiante, desprazando o extremo 5' do primer, formando unha solapa de ARN monocatenario, que é eliminado por medio dun corte ou clivaxe por nuclease. A clivaxe destas solapas de ARN realízase ou ben por corte de solapas curtas pola endonuclease flap 1 (FEN1), ou por recubrimento de solapas longas pola proteína de unión ao ADN monocatenario chamada proteína de replicación A (RPA) e a clivaxe secuencial pola ADN2 nuclease e FEN1.

Este mecanismo serve como posible explicación de como o VIH pode transformar o seu xenoma en ADN de dobre cadea a partir do híbrido ARN-ADN formado despois da reversotranscrición do seu ARN. Porén, a reversotranscriptase codificada no VIH ten a súa propia actividade de ribonuclease coa que pode degradar o ARN viral durante a síntese do seu ADNc, xunto cunha actividade de ADN polimerase ADN dependente que copia a febra de ADNc con sentido nunha de ADN antisentido para formar un intermediato de ADN de dobre cadea.

Usos dos cebadores sintéticos

A secuenciación de ADN utilízase para determinar a orde dos nucleótidos nunha febra de ADN; o método de terminación da cadea (secuenciación didesoxi ou método de Sanger) utiliza un cebador como marcador de inicio para a reacción en cadea.

Na PCR, os cebadores utilízanse para determinar o fragmento de ADN que vai ser amplificado no proceso da PCR. A lonxitude dos cebadores non é xeralmente maior de 30 (xeralmente 18–24) nucleótidos, e teñen que coincidir coa secuencia do principio e do final do fragmento de ADN que vai ser amplificado.

Os primers non son absolutamente sempre necesarios para a síntese de ADN, e poden ser utilizados polas polimerases virais, como por exemplo, as do virus da gripe, para a síntese de ARN.

Deseño de cebadores para PCR

No deseño de cebadores ou primers hai que ter en conta a temperatura "de fusión" (T_m) do ADN considerado, que é a temperatura á que se separan as dúas cadeas do ADN (ou dun híbrido ADN-ARN) no 50% da dobre hélice (porque rompen as pontes de hidróxeno entre as bases nitroxenadas). Hai que ter en conta tamén a temperatura de aliñamento (annealing) á que ten lugar a hibridación do pequeno cebador coa cadea molde de ADN. Isto débese a que na PCR hai que separar por calor as dobres cadeas e despois hibridar o cebador. Utilízanse dous cebadores, un para cada extremo 3' de cada cadea da dobre hélice de ADN. Os pares de primers deberían ter temperaturas "de fusión" similares, xa que o aliñamento na PCR ocorre para ambos os dous simultaneamente. Un cebador con T_m significativamente máis altas ca a temperatura da reacción de aliñamento pode hibridarse incorrectamente e estenderse nunha localización incorrecta ao longo da secuencia de ADN, mentres que con T_m significativamente máis baixas ca as temperaturas de aleneamento pode non conseguir facer o aliñamento e, por tanto, non estenderse en absoluto.

As secuencias dos cebadores deben ser as que seleccionen unicamente unha rexión do ADN, evitando a posibilidade de incorrectas hibridacións con secuencias similares próximas. Un método utilizado correntemente é a busca por BLAST na cal se ven todas as posibles rexións ás que o cebador se pode unir. Tanto a secuencia de nucleótidos coma a do propio cebador poden ser examinados por BLAST. A ferramenta do NCBI Primer-BLAST integra unha ferramenta para o deseño de cebadores e a busca por BLAST na mesma aplicación, como tamén fai o produto de software comercial ePrime, Beacon Designer. Poden realizarse simulacións por computador de resultados de PCRs teóricas (chamadas PCR electrónicas) para axudar a deseñar os cebadores. Deberían evitarse as repeticións de mononucleótidos, xa que pode producirse a formación de bucles e contribuír a unha incorrecta hibridación. Os cebadores non deberían anelarse doadamente con outros cebadores da mestura (outras copias do mesmo cebador ou cebadores con dirección inversa); este fenómeno pode levar á produción de produtos "dímeros de cebadores", que contaminarían a mestura. Os cebadores deberían tamén non anelarse fortemente a si mesmos, xa que os bucles e forquitas internas orixinadas poderían dificultar o aliñamento ou hibridación co ADN molde.

Cando se deseña un cebador para usalo en clonación TA, pode incrementarse a eficiencia ao engadir colas AG aos extremos 5' e 3'.

O cebador inverso ten que ser o complemento inverso dunha secuencia de ADNc. O complemento inverso pode determinarse facilmente, por exemplo, con calculadoras on line.

Cebadores dexenerados

Artigo principal: Código xenético.

Algunhas veces utilízanse cebadores dexenerados, nos que se aplica a característica de dexeneración na correspondencia entre codóns e aminoácidos no código xenético. Trátase de mesturas de cebadores similares pero non idénticos. Poden ser convenientes se o mesmo xene debe ser amplificado en distintos organismos, xa que tamén os propios xenes probablemente son similares pero non idénticos. O outro uso dos cebadores dexenerados é cando o deseño de cebadores está baseado na secuencia de proteínas. Como varios codóns diferentes poden codificar un mesmo aminoácido (pola dexeneración do código xenético), é a miúdo difícil deducir que codón é o que se usa en cada caso particular. Por tanto, unha secuencia de cebador correspondente ao aminoácido isoleucina podería ser "ATH", onde A significa adenina, T timina, e H pode ser adenina, timina, ou citosina. O uso de cebadores dexenerados pode reducir grandemente a especificidade da amplificación da PCR. O problema pode ser resolto en parte utilizando touchdown PCR.

Os cebadores dexenerados utilízanse moito e son moi útiles no campo da ecoloxía microbiana. Permiten a amplificación de xenes de microorganismos que non se poden cultivar ou a recuperación de xenes de organismos dos que non se dispón de información xenética. Usualmente, os cebadores dexenerados deséñanse aliñando a secuenciación de xenes encontrada en GenBank. As diferenzas entre secuencias contabilízanse usando as dexeneracións da IUPAC para cada base. Os cebadores de PCR son despois sintetizados como unha mestura de cebadores correspondentes a todas as permutacións.

Véxase tamén

Outros artigos

• Síntese de oligonucleótidos

Ligazóns externas

• T_m calculator Arquivado 25 de decembro de 2014 en Wayback Machine.
• Primer3 Arquivado 20 de maio de 2013 en Wayback Machine.
• Primer-BLAST