Clonación TA
A clonación TA, tamén chamada clonación rápida ou clonación T (TA cloning, T cloning), é unha técnica de subclonación que evita case totalmente o uso de encimas de restrición[1] e é máis doada de realizar e máis rápida que a subclonación tradicional. A técnica baséase na habilidade da adenina (A) e a timina (T) (par de bases complementarias) de diferentes fragmentos de ADN de hibridarse e, en presenza dunha ligase, os fragmentos quedan unidos. Os produtos de PCR producidos son xeralmente amplificados usando a ADN polimerase Taq, que engade preferentemente unha adenina ao extremo 3' do produto. Ditos insertos amplificados por PCR son clonados en vectores linearizados que teñen tramos sobresaíntes colgantes 3' de timina complementarios ás adeninas.[2]
Procedemento
editar
Creación do inserto
editarO inserto créase por medio da PCR usando a polimerase Taq. Esta polimerase carece de actividade de corrección de erros 3' a 5' e, con alta probabilidade, engade un tramo sobresaínte colgante monocatenario 3' de adenina a cada extremo do produto da PCR. É mellor se os cebadores de PCR teñen guaninas no extremo 5' xa que isto maximiza a probabilidade de que a ADN polimerase Taq engada o tramo colgante final de adenosina.[3] Non se deberían usar polimerases termoestables que teñan unha actividade exonuclease extensiva 3´ a 5´, porque non deixan os tramos sobresaíntes colgantes 3' de adenina.[4]
Creación do vector
editarO vector diana, inicialmente circular, é linearizado e cortado cun encima de restrición que deixa extremos romos. Este é o único momento en que se usan encimas de restrición nesta técnica. A este vector fáiselle despois unha cola con didesoxitimidina trifosfato (ddTTP) usando unha transferase terminal. É importante usar ddTTP para asegurarse da adición unicamente dun só residuo T. A creación da cola deixa o vector cun só residuo de timina 3' colgante e non apareado en cada extremo romo.[5] Os fabricantes xeralmente venden "kits" para a clonación TA cunha ampla gama de vectores preparados que xa foron linearizados e etiquetados cunha timina colgante.
Vantaxes e inconvenientes
editarDado que nesta técnica non hai necesidade de utilizar encimas de restrición a non ser para xerar o vector linearizado, o procedemento é moito máis simple e rápido que a subclonación tradicional. Tampouco se precisa engadir sitios de restrición cando se deseñan os cebadores e así poden utilizarse cebadores máis curtos e aforrar tempo e diñeiro. Ademais, en casos en que non hai sitios de restrición viables pode usarse esta técnica como alternativa á clonación tradicional. O maior invconveniente da clonación TA é que a clonación direccional non é posible, así que o xene ten un 50% de posibilidades de ser clonado na dirección inversa.[1]
Notas
editar- ↑ 1,0 1,1 "Improved TA Cloning". Caister Academic Press. Arquivado dende o orixinal o 2011-07-08. Consultado o 2009-10-17.
- ↑ "TA Cloning". www.premierbiosoft.com. Consultado o 2017-02-05.
- ↑ "TA cloning protocol". Durham, New Hampshire, USA: Hubbart Center for Genomic Studies. Arquivado dende o orixinal o 02 de decembro de 2008. Consultado o 2009-10-17.
- ↑ "TA Cloning Kit Manual" (PDF). Invitrogen. 7 de abril de 2004. p. 31. Arquivado dende o orixinal (PDF) o 24 de xuño de 2010. Consultado o 2009-10-17.
- ↑ Holton, T.A.; Graham, M.W (1991-03-11). "A simple and efficient method for direct cloning of PCR products using ddT-tailed vectors". Nucleic Acids Research 19 (5): 1156. PMC 333802. PMID 2020554. doi:10.1093/nar/19.5.1156.