REPUBLIC ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

Ministère de L Enseignement supérieure et de la Recherche

Scientifique
Centre Universitaire Belhadj BOUCHAIB Ain Témouchent

Institue des Sciences et Technologie

Département de La Science de la Nature et de la Vie

thème de l exposée: Le Biofilm bactérien

Membre du groupe :
 Bellaribi abdel-illah responsable du module:
 Ben bachir asma Dr Lachachi
 Amraoui amira
 Benoussad mouloud

Année universitaire :2016/2017

 Plan de travail:
 Introduction
 Définition du biofilm
 Quelques exemples de biofilm
 Le biofilm un mode de vie avantageux
 La formation du biofilm ( éxemple de Pseudomonas aeruginosa)
 Pourquoi les bactéries forment-elles des biofilms?
 Les biofilms dans le secteur médical
 Les facteur qui favorisent la formation de biofilm
 Résistance des biofilms aux antibiotiques
 Les trois mécanismes de résistance du biofilm aux antibiotiques
 Détection de la formation du biofilm
 1. Méthode de plaque de culture de tissus (TCP)
 2 -La méthode de tube TM
 Conclusion
 Introduction

Les surfaces sont d’importants habitats microbiens car les

nutriments y sont absorbés.

Très souvent les micro-organismes se développent sur des surfaces,

incluses dans des Biofilms, qui sont des assemblages de cellules
bactériennes fixées sur des surfaces et incluses dans des
polysaccharides adhésifs excrétés par les cellules elles-mêmes.
 Introduction

Les communications entre cellules sont critiques dans le

développement et le maintien d’un biofilm. L’attachement d’une
cellule à une surface constitue un signal pour l’expression de « gènes
spécifiques des biofilms »

Ces gènes codent des protéines qui synthétisent des molécules de

communication intercellulaires et amorcent la formation des
polysaccharides.
 Introduction
Définition du biofilm:
communauté de microorganismes (bactéries, champignons, etc.) agrégés
en microcolonies adhérant sur une surface inerte ou biologique caractérisée
par la sécrétion d'une matrice adhésive et protectrice d’exopolymères (Sci
Ameri, 1978).

Forme de vie existant depuis au moins 3,3 Million d’années, cette forme a
une Longue évolution ainsi qu’une très grande adaptation et une très grande
résistance.

A l’état naturel les biofilms sont des communautés bactériennes au sein des
quelles on peut trouver de nombreuses espèces différentes (Ghigo, 2001).

On attribue la découverte des biofilms à l’inventeur du microscope, Antoni

Van Leeuwenhoek (1632-1723), qui observa vers 1683 avec cet appareil des
communautés de micro-organismes à la surface des dents (Donlan, 2002).
 Introduction
Le biofilm est le mode de vie normal des bactéries:

Deux modes de vie des organismes unicellulaires :

 Flottaison libre planctonique « en milieu liquide »

 Biofilm « en millieu solide » :

 Serait le mode de vie naturel de la plupart des microorganismes,

notamment en milieu hostile
 Colonies sur boîtes de Pétri
 Sa structure et sa physiologie donne aux bactéries ce que
l’organisation tissulaire apporte aux cellules des êtres supérieurs.
 Quelques exemples de biofilm

Les biofilms peuvent coloniser tous les environnements (naturels, artificiels, tissus

vivants ).
•Biofilms naturels: multi-espèces

Dans la Plaque dentaire on peut trouver 500 espèces différentes dans

la cavité buccale humaine.

Écosystèmes naturels : eucaryotes unicellulaires, algues, protozoaires,

amibes (biofilm d’eau chaude à Yellowstone, les canalisations, les rideaux
de douches)
 Quelques exemples de biofilm

• Biofilms artificiels
Multitudes de surfaces colonisées :
- Toutes surfaces submergées, environnements aqueux
- Tous types de matériaux :
 inorganiques : verre, minéraux, métaux.
 organiques : synthétiques et biologiques. Médical
Cathéter
Pacemakers
Environnement Industriel
 Le biofilm : un mode de vie avantageux

Matrice
Vie multicellulaire
extracellulaire

Protection vis-à-vis des

•Communication intercellulaire conditions
•Coopération métabolique environnementales (UV,
•Favorisation des transferts toxicité
horizontaux. métabolique, pH,
déshydratation
Mise en échec du système
et salinité, tolérance aux
immunitaire.
antibiotiques pour une
concentration donnée)
•Persistance.
Sous forme planctonique, les bactéries :
•peuvent être éliminées par les mécanismes
de défense
naturels (anticorps, phagocytes…)
•restent sensibles aux antibiotiques.

* Antibiotique
Anticorps
Cellules planctoniques

Cellules en biofilm
Enzymes phagocytaires
Si les conditions sont réunies, les bactéries
peuvent adhérer etre elles avant d’être
éliminées par les systèmes de l’hôte
Elles forment un biofilm notamment sur une
surface inerte Cette communauté, sessile, est
résistante aux anticorps, aux phagocytes et
aux antibiotiques.

* Antibiotiques

Anticorp

Cellules planctoniques
Cellules en biofilm
Enzymes phagocytaires
Le biofilm étant reconnu comme un corps
étranger, la réponse immunitaire est activée Les
anticorps reconnaissent certains épitopes des
bactéries et des molécules sécrétées (TPS,
lectines, Cup, …)
Les phagocytes sont attirés La phagocytose est
inopérante sur le biofilm mais les enzymes
phagocytaires sont libérées localement.

* Antibiotiques

Anticorp

Cellules planctoniques

Cellules en biofilm

Enzymes phagocytaires
La réponse immunitaire est inefficace Les enzymes
phagocytaires vont endommager les tissus autour du
biofilm et entraîner une réponse inflammatoire chronique
à Cycle d’autodestruction des tissus

Des bactéries planctoniques vont essaimer du biofilm

Cette libération peut être la cause d’une dissémination
de l’infection et d’une infection aiguë dans un tissu
voisin.

* Antibiotique

Anticorp
Cellules planctoniques

Cellules en biofilm

Enzymes phagocytaires
 La formation du biofilm :
La formation du biofilm(Exemple de Pseudomonas
aeruginosa)
(Exemple de Pseudomonas aeruginosa)

Attachement Attachement stade de 2ème stade de Dispersion

initial définitif maturation maturation Production de molécules
Adhérence Adhérence Agrégation Croissance et oxydantes ou azotantes et
maturation du de Bactériophages
transitoire et forte et en
biofilm Altération interne et de
Réversible Irréversible microcolonies surface des microcolonies
Pili Type IVa EPS EPS (conditions anaérobiques )
Flagelle Fimbriae Fimbriae
Structures adhésives Pili Type IVb Lectines
(cellule/surface) Lectines
EPS Adhésines
Rhamnolipides Flagelle
(cellule/cellule)
 Pourquoi les bactéries forment-elles des biofilms?

 Les bactéries forment des biofilms car ce mode de croissance

améliore indiscutablement la survie et la croissance des organismes.

 Au moins quatre raison sont à la base de la formation des biofilms:

1- Les biofilms constituent une sorte de défense, car ils résistent

au forces physiques capables d’emporter les cellules non fixées.
A la phagocytose des cellules par les défenses immunitaires.
Et ils empêchent la pénétration des antibiotiques.
 Pourquoi les bactéries forment-elles des biofilms?

2- permet aux cellules de rester dans une niche favorable, car

les biofilms fixent les cellules bactériennes à un endroit où les
nutriments sont souvent plus abondants.

3- permet aux cellules bactériennes de vivre en étroite

association les unes avec les autres, comme le cas de
P.aeruginosa, cela facilite les communication intercellulaire, et
les possibilités d’échanges génétiques sont augmentées.

4- constitue le processus typique de croissance des cellules

dans la nature, où les concentrations en nutriments sont loin
d’être celles des milieux de culture.
 Les biofilms dans le secteur médical

Les biofilms sont responsables d’un large éventail d’infections chez

l’Homme. Plus de 80% des infections bactériennes chroniques sont
associées à la présence de biofilms (Hall-Stoodley et al., 2004).

Ces derniers peuvent se former à la surface ou à l’intérieur des

dispositifs médicaux implantés dans l’organisme (lentilles de
contact, cathéter veineux central, sonde endotrachéale, dispositifs
intra-utérins, valves cardiaques artificielles, pacemakers, cathéters de
dialyse péritonéale, sondes de tympanostomie, sondes urinaires,
prothèses vocales…) ,

82% des infections nosocomiales sont dues à la présence

d’implants médicaux contaminés (Archibald et Gaynes, 1997).
 les principales infections liées à la présence de biofilms (Lewis, 2008):
 Caries dentaires
 Gingivites
 Péritonite
 Mucoviscidose
 Otite moyenne (notamment chez l’enfant)
 Ostéomyélites
 Prostatites

• Sources de ces infections:

 Sutures
 Lentilles de contact
 Sonde urinaire
 Cathéter veineux central
 Sonde endotrachéale
 Sonde de gastrotomie
 Valve cardiaque artificielle
 Prothèse orthopédique
 Broches (ostéomyélite)
  Les facteur qui favorisent la formation de biofilm

La formation de biofilms dépend de plusieurs facteurs :

- nombre de cellules présentes,
- vitesse du flux du liquide dans lequel se trouve le dispositif,
- propriétés physico-chimiques de la surface (Donlan, 2001).
- Les cathéters veineux centraux sont les implants médicaux les plus à
risque par rapport au développement d’une infection nosocomiale
(Klevins, 2005).

 Ceci pose de graves problèmes de santé publique puisque les

traitements systémiques de routine des patients atteints d’infections de
ce type se révèlent le plus souvent inefficaces, souvent difficiles à traiter
du fait de leurs propriétés d’antibiorésistance (Figure 1) (Donlan, 2008).
Figure 1. Biofilms et infections nosocomiales : pourquoi le traitement médical est
souvent inefficace ? (Utili, 2007)
 Résistance des biofilms aux antibiotiques
L’éradication d’un biofilm bactérien pose de gros problème clinique, car
l’antibiothérapie active habituellement sur les bactéries à l’état planctonique se
révèle bien souvent moins efficace sur des structures organisées en biofilm
(Broom et al., 2000 ; Stewart et Costerton ,2001).
Au sein d’un biofilm , les bactéries peuvent être jusqu’à 1000 fois plus
résistantes que sous une forme planctonique (Donlan,2001 ). Certaines
concentrations faibles en antibiotiques stimulent la production
d’exopolysaccharides de la matrice et contribuent à accroître son épaisseur
(Donlan,; Conley et al ., 2003; Clutterbuck et al., 2007).
l’importance de la production de biofilm dans le développement d’infections
et de maladies qui confère la résistance à des antibiotiques , par comparaison
quantitative de la sensibilité aux antibiotiques de S.epidermidis par éxemple
sous la forme sessile et planctonique . Les résultats ont montré que les bactéries
productrices de biofilm étaient résistantes aux antibiotiques qui inhibent la
synthèse de la paroi cellulaire mais étaient sensibles aux inhibiteurs de la
synthèse d’ARN et des protéines , tandis que les cellules planctoniques ont été
sensibles pour les deux à la fois.
Figure 2. Les trois mécanismes de résistance du biofilm aux
antibiotiques (Ghigo ,2005)
 Les trois mécanismes de résistance du biofilm aux antibiotiques
Les mécanismes de résistance habituels, basé sur des modifications enzymatiques, des
mutations ou des pompes membranaires d’efflux, ne semblent pas entrer en jeu dans les
résistances observées dans les biofilms bactériens ( Math et O’Toole,2001).
Les mécanismes conférant cette résistance bactérienne accrue aux antibiotiques sont
maintenant mieux connus (Patel, 2005) .Trois hypothèses principales sont avancées afin
d’expliciter les mécanismes de résistance des bioflms aux antibiotiques (Figure 9).
La première repose sur une notion de barrière physique qui expliquerait la pénétration
lente et incomplète de certains antibiotiques (Stewart et Costerton, 2001).
Plusieurs causes expliquent cet effet :
1-L’encombrement stérique : Ceci est vrai uniquement pour les molécules de grande
taille (par exemple les lysozymes et autres peptides antimicrobiens) ; cependant cet effet est
faible et n’est pas la raison majeure à la baisse de sensibilité du biofilm.
2-L’effet ionique : Les EPS portent des charges négatives, ces polyanions peuvent
piéger les antimicrobiens chargés positivement ; cependant les EPS ne sont pas présent en
quantité importante au départ il ya donc d’autre facteurs qui entrent en jeu; La dégradation
enzymatique des agents antimicrobiens, par exemple les antibiotiques de la familles des
pénicillines pénètrent difficilement dans les biofilms constitués de staphylocoques, car ces
bactéries fabriquent une enzyme, nommée béta-lactamase qui dégrade l’antibiotique plus
rapidement que celui-ci ne diffuse dans le biofilm l’antibiotique n’atteint jamais les couches
les plus profondes (Anderson et O’Toole, 2008).
 La seconde hypothèse est liée à l’environnement spécifique du
biofilm dont les zones les plus profondes riches en résidus acides et
pauvres en oxygène et en nutriment correspondant à des gradients de
taux de croissance et d’activité physiologique , il semble qu’on générale il
existe une corrélation entre la diminution du taux de croissance dans les
biofilms et l’augmentation de la résistance ( Xu et al, 2000).

La pénicilline agit la ou une bactérie se divise en deux cellules filles

lorsque chacune construit une paroi protectrice .Or au coeur d’un biofilm
des bactéries sont parfois en dormance : elles sont vivantes mais ne se
divisent pas, et par conséquent sont insensibles à la pénicilline (stewart
et Costertan , 2001).

D’autre part, certains groupes de gènes sont activés par de basses

concentrations en oxygène, et sont à l’origine de modifications
phénotypiques permettant une résistance accrue aux agents
antimicrobiens. Des concentrations réduites en oxygène engendrent des
modifications phénotypiques à l’origine d’une diminution de sensibilité
aux agents antimicrobiens (Drenkard, 2003).
 Enfin la dernière hypothèse s’appuie sur les modifications phénotypiques
observées dans certains biofilms et dont les microorganismes constituant
pourrait présenter des formes plus résistantes (Donlan,2008 ).

Ces trois hypothèses reposent sur la nature communautaire et

multicellulaire du biofilm. La plupart des spectres antibiotiques ont été étudiés
sur des formes planctoniques et doivent maintenant être étudiés sur des
modèles de biofilms plus complexes, ainsi de nouvelles concentrations
minimales d’inhibition ainsi que de nouvelles associations médicamenteuses
doivent être envisagées ( Costerton , 2004 ).

.
 Détection de la formation du biofilm

1. Méthode de plaque de culture de tissus (TCP):

Le Protocole d’essai TCP décrit par Christensen et al,(1985) est le plus
largement utilisé et a été considéré comme la norme d’essai pour la détection de
la formation de biofilm, dans les différentes études il doit avoir une séléction de
souches bacteriennes par éxemple staphylococcus épidermidis afin de
déterminer leur capacité a former le slim bactérien avec la modification de la
durée d’incubation qui est généralement de 24H, et l’ajout de 2% de sacharose
dans le milieu de croissance .
Dans la méthode standard TCP on prend en compte les isola des souche qui
sont positif pour leur phénotype de production de biofilm le milieu de
croissance BHIB avec l’addition de 2% de sacharose le nombre d’isolat formant
le biofilm augmente.
La Production de biofilm par la méthode de tissu en plaque TCP se fait a
partir des isolats testés pour la formation de biofilm.
 La détermination quantitative de la formation de biofilm dans les
microplaques à 96 puits doit etre réalisée selon les recommandations de
Christensen et al., (1985). Les bactéries doivent être cultivées en milieu
BHIB et incubées 24h à 37°C.
Chaque culture jeune est ajustée pour l’obtention de 108 UFC/mL
et diluée au 1/100éme dans le même milieu (BHIB). Chaque puits de la
plaque contient 150 μL du milieu BHIB supplémenté de 2% de
saccharose ensuite rempli avec 20 μL de cette dilution. Les microplaques
sont recouvertes, scellées stérilement et incubées pendant 24h à 37°C.
Après incubation, les puits des microplaques sont vidés, rincées 3
fois avec 200μL d'eau distillée, séchées en position inversée et colorées
avec 200μL de cristal violet à 0,5%. Après 30min d’incubation, l’excès du
cristal violet est éliminé par 5 lavages successifs avec 200 μL d’eau
distillée stérile. Le colorant incorporé par les cellules ayant adhéré ou
ayant formé un biofilm est solubilisé avec 200 μL d'éthanol à 95%.
Figure3 Dépistage de la production de biofilm par la méthode de
tissu en plaque (TCP) Elevé, modéré et non producteurs de slime
sont différenciés par la coloration au cristal violet dans les 96 puits
de la plaque.
2 -La méthode de tube TM

Un bouillon coeur cervelle (BHIB 2℅ saccharose) avec un volume de

(10ml) doit etre inoculé avec une quantité de micro organismes prélevés
par anse incubé à 37°C pendant 24 heures .Au lendemain de la culture,
les tubes doivent etre lavés avec du TPS (pH 7, 2) et séchés. La couche de
biofilm adhérente dans chaque tube est colorée avec du Crystal violet
(0.1 %).Les tubes sont ensuite lavés avec de l’eau distillée stérile et séchés
toute la nuit à température ambiante. La formation de biofilm est
considérée comme positive lorsqu’un film visible borde le mur et le fond
du tube, les expériences sont généralement réalisées en triples.
3 -Dépistge de la production de biofilm par la méthode en tube (TM)

A C C B A

Figure 4.Dépistge de la production de biofilm par la méthode en

tube (TM) .
A :Elevé, B :Modéré,C :Non producteur de biofilm
Corrélation entre les deux méthodes

La méthode TM a montré une bonne corrélation avec la

méthode TCP pour une formation élevée de biofilm.Les
résultats détaillés pour toutes les souches.
 Conclusion
Les études sur les biofilms ont montré que les microorganismes
capable de le former , sont la cause la plus commune des infections
nosocomiales chez les patients avec cathéters .Cela pose de graves
problèmes de santé publique puisque les traitements systémiques de
routine des patients atteints d’infections de ce type se révèlent le plus
souvent inefficaces .
Le meilleur moyen d’empêcher la formation de biofilm sur des
implants en milieu hospitalier repose sur le respect de quelques principes
fondamentaux .La formation de biofilm sur cathéter est liée à la durée de
présence de cet implant dans l’organisme, plus l’implant est là depuis
longtemps, et plus il y a un risque de formation de biofilms. La pose de
l’implant doit se faire dans des conditions d’hygiène strictes, afin d’éviter au
maximum toute contamination bactérienne. Il y a encore un vaste champ
de recherche à ce sujet, par exemple ce qui rend S epidermidis un bon
colonisateur de la peau et des muqueuses de l’homme, comment
l’interaction bactérie/hôte peut être expliquée, et comment les
microorganismes saprophytes peuvent devenir pathogènes.
 Par les dommages qu’ils causent dans les milieux médical et
industriel, les biofilms ont un impact économique important. Il est
nécessaire de développer des moyens de lutte efficaces et pérennes
contre la formation de biofilms. De manière croissante ces dix
dernières années, les recherches concernant les moyens de lutte contre
les biofilms se multiplient

L’avenir appartient sans doute aussi aux avancées de la biologie

moléculaire et de la biologie cellulaire. C’est ainsi que des recherches
actuelles s’orientent vers le développement de messagers susceptibles
de s’opposer à la formation du biofilm bactérien, tels que des anticorps
bloquant l’adhésine des staphylooques qui Médie sa fixation à la
fibronectine. Enfin, l’analyse structurale de la signalisation inter-
bactérienne (quorum-sensing) qui semble nécessaire à la maturation
du biofilm donnera peut être de nouveaux moyens dans la lutte
antimicrobienne.
 Référence bibliographique
1- Ghigo J.M. (2001). Nature 412 :442-445.
2- https://www.scientificamerican.com
3-. Archibald L.K, Gaynes R.P. (1997). Hospital acquired infections in the United
States: The importance of interhospital comparisons. Nosocomial Inf. 11: 245-
255.
4-Lewis K. (2008). Multidrug tolerance of biofilms and persister cells. Curr. Top.
Microbiol. Immunol. 322: 107- 131.
5-Hall-Stoodley L, Costerton J.W, Stoodley P. (2004). Bacterial biofilms: from the
natural environment to infectious diseases. Nat. Rev. Microbiol. 2(2): 95-108.
6-Donlan R.M, Murga R, Bell M, Toscano C.M, Carr J.H, Novicki T.J, et al.
(2001).Protocol for detection of biofilms on needleless connectors attached to
central venous catheters. J Clin Microbiol .39:750–3.
7-Utili R, Durante-Mangoni E, Tripodi M.F. (2007). Infection of intravascular
prostheses: how to treat other than surgery. Int. J. Antimicrob. Agents 30 S: S42-
S50.
8- Donlan R.M. (2001). Biofilms and device-associated infections. Emerg. Infect.
Dis. 7: 277-281.
9-Klevins R.M, Tokars J.I, Andrus M. (2005).Nephrol. News Issues 19: 37- 38, 43.
10-JW Costerton Science 284, 1999, 1318-1322.
12-Patel R. (2005). Biofilms and antimicrobial resistance. Clin. Orthop. Relat. Res. 41-47.7
13-Stewart P.S, Costerton J.W. (2001). "Antibiotic resistance of bacteria in biofilms."
Lancet 358 (9276): 135-8.
14-Xu K.D , McFeters G.A , Stewart P.S. (2000).Biofilm resustance to antimicrobial agents
Microbial . 146,547-549.
15-Stewart P.S, Costerton J.W. (2001). "Antibiotic resistance of bacteria in biofilms."
Lancet 358 (9276): 135-8.
16-Drenkard E. (2003).Antimicrobial resistance of Pseudomons aeruginosa
biofilms.Microbs and infection 5 : 1213-1219.
17-Costerton J.W, Lewandowski Z, Caldwell D.E, Korber D.R, Lappin-Scott H.M. (1995).
Microbial biofilms. Annu. Rev. Microbiol. 49, 711-745.
18- Christensen G.D, Simpson W.A, Bisno A.L, Beachey E.H. (1982).Adherence of
slimeproducing strains of Staphylococcus epidermidis to smooth surfaces. Infect
Immun.37:318-26.
19-Christensen G.D., Simpson W.A., Younger J.J., Baddour L.M., Barrett F.F., Melton
D.M., Beachey E.H. (1985). Adherence of coagulase-negative staphylococci to
plastic tissue culture plates: a quantitative model for the adherence of
staphylococci to medical devices. Journal of Clinical Microbiology. 22:996-1006.
20-JW Costerton Science 284, 1999, 1318-1322.
21- https://www.youtube.com/watch?v=FfY19rpnbew
22-Ghigo J.M. (2005). Les mécanismes de résistance du biofilm aux antibiotiques. La
recherche N°389.49 .
23-Mah T.F, O’Toole G.A. (2001).Mechanisms of biofilm resistance to
antimicrobial agentsTrends in microbiology 9 :34-39.