2015PA066061

Etude du signal AMP cyclique déclenché par la
chimiokine CX3CL1 en aval de son récepteur CX3CR1

Virginia Felouzis
To cite this version:

Virginia Felouzis. Etude du signal AMP cyclique déclenché par la chimiokine CX3CL1 en aval
de son récepteur CX3CR1. Biologie cellulaire. Université Pierre et Marie Curie - Paris VI,
2015. Français. ¡ NNT : 2015PA066061 ¿.
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*
THESE DE DOCTORAT DE
L’UNIVERSITE PIERRE et MARIE CURIE
École doctorale Complexité du Vivant (ED515)
Spécialité Biologie Moléculaire et Cellulaire
Présentée par
Mlle VIRGINIA FELOUZIS

Pour obtenir le grade de
Docteur de l’université PARIS VI
Sujet de thèse :
Etude du signal AMP cyclique déclenché par la

chimiokine CX3CL1 en aval de son récepteur
CX3CR1
Soutenue publiquement
le 31 mars 2015
Devant le jury composé de :
Pr. Pierre VINCENT Président

Dr. Karl BALABANIAN Examinateur
Dr. Klaus SEUWEN Examinateur
Dr. Gilles GUILLON Rapporteur
Dr Clotilde RANDRIAMAMPITA Rapporteur
Dr. DETERRE Philippe Directeur de thèse
1
2
3
4
Table des Matières
Avant Propos 13
Introduction Bibliographique 17
I. LES RECEPTEURS COUPLES AUX PROTEINES G 21
A] GENERALITES 22
A.1 – STRUCTURES DES RCPG 23
A.2 – CLASSIFICATION DES RCPG 24
A.2.1 – La famille A : « Rhodopsin like » 25
A.2.2 – La famille B: « Secretin like » 27
A.2.3 – La famille C : « Metabotrope-glutamate/pheromone» 28
A.2.4 – Autres familles : D / E / F 28
B] TRANSDUCTION DU SIGNAL PAR LES PROTEINES G 29
B.1 – RCPG, L’HISTOIRE D’UNE CASCADE DE NOBEL 29
B.2 – LES DIFFERENTES PROTEINES G 30
B.3 – LE COUPLAGE DES PROTEINES G AUX RECEPTEURS 31
B.4 – ACTIVATION DES PROTEINES G 33
B.5 – LES EFFECTEURS DES PROTEINES G 33
B.5.1 – Les effecteurs activés par la sous-unité Gα 35
B.5.2 – Les effecteurs activés par le complexe βγ 38
C] REGULATION DE L’ACTIVITE DES RCPG 39
C.1– ELIMINATION DU LIGAND 39
C.2 – REGULATION PAR LES RGS (REGULATOR OF G PROTEIN SIGNALLING) 39
C.3 – DESENSIBILISATION 40
C.3.1 – Désensibilisation homologue 41
C.3.2 – Désensibilisation hétérologue 41
C.4 – INTERNALISATION DES RCPG DEPENDANTE DES Β-ARRESTINES 42
C.4.1 – Internalisation constitutive des RCPG 42
C.4.2 – Internalisation dépendante du ligand 42
D] TRANSDUCTION DU SIGNAL NON-CONVENTIONNELLE 43
D.1– TRANSDUCTION DU SIGNAL DEPENDANT DES PROTEINES G PAR DES RCPG INTERNALISES 43
D.2– TRANSDUCTION DU SIGNAL INDEPENDANT DES PROTEINES G 46
D.2.1 – Activation des différentes voies MAPK 46
D.2.2 –Autres voies de signalisation 47
5
II. LE SYSTEME CHIMIOKINE/ RECEPTEUR DE CHIMIOKINE 49
A] LES CHIMIOKINES 49
A.1 – CLASSIFICATION STRUCTURALE ET FONCTIONNELLE 50
A.1.1 – Les CXC-chimiokines 52
A.1.2 – Les CC-chimiokines 52
A.1.3 – Les CX3C-chimiokines 54
A.1.4 – Les C-chimiokines 54
A.2 – STRUCTURE DES CHIMIOKINES 54
A.2.1 – Séquence primaire 54
A.2.2 – Structure tridimensionnelle 55
A.2.3 – Sructure quaternaire 55
A.2.4 – Fixation aux glycosaminoglycanes 57
B] LES RECEPTEURS AUX CHIMIOKINES (OU RCK) 58
B.1 – CLASSIFICATION DES RCK 58
B.2 – STRUCTURE DES RCK 59
B.3 –DIMERISATION ET OLIGOMERISATION DES RCK 60
B.4 –EXPRESSION DES RCK 61
B.4.1 – Profil d’expression des RCK 62
B.4.2 – Régulation de l’expression des RCK 62
C] INTERACTION CHIMIOKINE-RECEPTEUR 63
C.1 – REDONDANCE DES INTERACTIONS LIGANDS/RECEPTEURS 63
C.2– UN MODELE D’INTERACTION EN DEUX ETAPES 64
C.3– TRANSDUCTION DU SIGNAL 64
C.3.1 – Voies protéine G dépendantes 64
C.3.2 – Voies protéine G indépendantes 66
C.3.3 –Régulation de l’activité 67
D] ROLES PHYSIOLOGIQUES DES CHIMIOKINES ET DES RCK 68
D.1 – CHIMIOTACTISME ET MIGRATION CELLULAIRE 69
D.1.1. – Transmigration endothéliale 69
D.1.2 – Migration interstitielle 70
D.2 – HEMATOPOÏESE 70
D.3 – ANGIOGENESE 71
D.4 – INITIATION DE LA REPONSE IMMUNITAIRE… 71
D.3.1 – …innée 72
D.3.2 – …adaptative 72
E] PHYSIOPATHOLOGIE DES CHIMIOKINES ET DE LEURS RECEPTEURS 73
E.1 – CHIMIOKINES ET MALADIES INFLAMMATOIRES 73
E.2 – CHIMIOKINES ET INFECTIONS VIRALES 75
E.3 – CHIMIOKINES ET CANCERS 75
E.3.1 – Rôle des chimiokines sur la croissance et/ou la survie tumorale 76
E.3.2 – Rôle des chimiokines sur l’angiogenèse tumorale 77
E.3.3 – Rôle des chimiokines dans la dissémination tumorale 78
6
III. LA CHIMIOKINE CX3CL1 ET SON RECEPTEUR LE CX3CR1 82
A] LA CHIMIOKINE CX3CL1, UNE CHIMIOKINE UN PEU PARTICULIERE… 82

A.1 – STRUCTURE 82
A.2 – RELATION STRUCTURE – FONCTIONS 83
A.2.1 – Domaine chimiokine 83
A.2.2 – Tronc mucine 84
A.2.3 – Domaine transmembranaire 84
A.2.4 – Domaine intracellulaire 84
A.3 – EXPRESSION DU CX3CL1 85
A.3.1 – Sites de production 85
A.3.2 – Régulation de l’expression 85
B] CX3CR1 87
B.1 – STRUCTURE 87
B.2 – POLYMORPHISME GENETIQUE DU CX3CR1 88
B.3 – EXPRESSION DU CX3CR1 89
B.3.1 – Les monocytes 89
B.3.2 – Les lymphocytes 91
B.3.3 – Les autres cellules CX3CR1+ 92
B.3.4 – Régulation de l’expression du CX3CR1 92
B.4– TRANSDUCTION DU SIGNAL EN AVAL DU CX3CR1 93
B.4.1 – Signal Calcique 93
B.4.2 – La voie AMP cyclique 94
B.4.3 – Interaction entre les voies de transduction calcique et AMPc 95
B.4.4 – Voie des MAP-Kinases 95
C] FONCTIONS ASSOCIEES AUX COUPLES CX3CR1/CX3CL1 96
C.1– CHIMIOTACTISME 97
C.2- ADHESION CELLULAIRE … 97
C.2.1 – … induite par la forme soluble 99
C.2.2 – … induite par la forme membranaire 99
C.2.3 – Corrélations fonctionnelles du polymorphisme génétique du CX3CR1 100
D] PHYSIOLOGIE DU COUPLE CX3CR1/CX3CL1 101
D.1- PROLIFERATION, DIFFERENTIATION ET SURVIE DES CELLULES 101
D.2- OSTEOCLASTOGENESE 101
D.3- REPONSES INFLAMMATOIRE ET IMMUNITAIRE 103
D.4- ROLE PHYSIOLOGIQUE DANS LE SYSTEME NERVEUX CENTRAL 104
CX3CL1, « SIGNAL OFF » DE L’ACTIVATION MICROGLIALE 104
E] PHYSIOPATHOLOGIE DU COUPLE CX3CR1/CX3CL1 105
E.1- INFLAMMATION 105
E.2- PATHOLOGIE CARDIO-VASCULAIRE SUR FOND D’INFLAMMATION 106
E.3- PATHOLOGIES CEREBRALES 108
E.3.1 – Douleur 108
7
E.3.2 –Maladies neurodégénératives 109
E.4- CX3CL1 ET CANCER 110
E.5- CX3CL1 ET VIH 112
IV. AMP CYCLIQUE & IMMUNITE : AMI OU ENNEMI ? 115
A] ANATOMIE DU SYSTEME AMPC 115

A.1- EFFECTEURS ET VOIES DE SIGNALISATION 115
A.1.1 – Les Phosphodiestérases (PDE) 116
A.1.2 – Effecteurs de l’AMPc 118
A.2- COMPARTIMENTATION DU SIGNAL CAMP… 121
A.2.1 – Importance des AKAP 122
A.2.2 – Implication des PDE 123
B] AMPC ET FONCTIONS IMMUNITAIRES 124
B.1 - AMPC, ADHESION ET MIGRATION DES CELLULES DU SYSTEME IMMUNITAIRE. 124
B.2 - AMPC ET FONCTIONS IMMUNES ASSOCIEES AU MONOCYTE/MACROPHAGE 125
B.3 – AMPC ET FONCTIONS LYMPHOCYTAIRES 126
B.3.1 – Lymphocytes T 126
B.3.2 - Signal AMPc, Lymphocyte et VIH 126
Exemple de l’implication de l’AMPc dans la physiopathologie 126
B.3.3 – Lymphocytes B 128
C] OUTILS TECHNOLOGIQUES PERMETTANT L’ETUDE DU SIGNAL AMPC 128
C.1 – TECHNIQUE DE DOSAGE DE L’AMPC INTRACELLULAIRE 129
C.2 – TECHNIQUES RESOLUTIVES UTILISANT LE FRET OU LA LUMINESCENCE 130
C.2.1 - Techniques basées sur la PKA ou ses cibles 130
C.2.2 – Techniques résolutives basées sur les cibles de l’AMPc 132
C.2.3 – Sondes basées sur EPAC 132
V. OBJECTIF DE LA THESE 136
Article 133
Résultats Complémentaires 139
I. CARACTERISATION DE LA VOIE DE SIGNALISATION AMPC EN

AVAL DU CX3CR1 (COMPLEMENTS) 187
A] ETUDE DE L’IMPLICATION DE DIFFERENTS PARTENAIRES DE LA VOIE AMPC DANS LA REPONSE

INHIBITRICE INDUITE PAR LES CHIMIOKINES 187
8
B] RECRUTEMENT DIFFERENTIEL DES Β-ARRESTINES EN FONCTION DE L’ACTIVATION DU
RECEPTEUR PAR LA FORME SOLUBLE OU LA FORME MEMBRANAIRE DU CX3CL1 195
II. IMPLICATION DE L’AMPC DANS LES FONCTIONS ASSOCIEES AU

COUPLE CX3CL1/CX3CR1 198
A] CHIMIOTACTISME ET AMPC 199

B] EFFET DE L’AUGMENTATION D’AMPC INTRACELLULAIRE SUR LA FONCTION ADHESIVE DU
COUPLE CX3CR1/CX3CL1 200
C] AMPC ET SURVIE 201
Annexes – Fiches Techniques 167

Références Bibliographiques 181
9
10
Liste des figures et tableaux
Figures :
I-1 : Principe de transduction en aval des RCPG
I-2 : Représentation schématique 3D et 2D de la structure générale des RCPG
I-3 : Classification des RCPG
I-4 : Les RCPG, une histoire de NOBEL
I-5 : Cycle d’activation/désactivation des protéines G
I-6 : Diversité des voies de signalisation en aval d’un RCPG
I-7 : Structure de l’Adenylate Cyclase
I-8 : Modèle « classique » de l’internalisation β-arrestine dépendante des RCPG
I-9 : Résultats principaux issus de différentes études sur la transduction du signal AMPc par des
récepteurs internalisés.
II-1 : Implication du système chimiokinergique dans différentes processus physiologiques et

physiopathologiques.
II-2 : Structure protéique des 4 sous familles des chimiokines humaines
II-3 : Structure 3D des chimiokines
II-4 : Interaction des chimiokines avec les GAG et leurs récepteurs.
II-5 : Expression des chimiokines et de leurs récepteurs au sein des différents organes
II-6 : Interaction en deux étapes des chimiokines avec leur récepteur
II-7: Complexité des voies de signalisation induite suite à l’activation d’un RCK
II-8 : Rôle des chimiokines au cours de différents processus physiologiques
III-1 : Structures schématiques des deux formes physiologiques du CX3CL1

III-2 : Représentation schématique des variants génétiques du CX3CR1
III-3 : Représentation schématique des deux principales sous-populations de monocytes chez l'humain et
la souris
III-4 : Représentation des principales voies de signalisation connues induites en aval du CX3CR1
III-5 : Coordination de l’action de la chimiokine soluble et membranaire lors du processus de recrutement
leucocytaire
III-6 : Trois configurations d’adhérence cellulaire induite par le système intégrine et ou le couple
CX3CR1/CX3CL1 sur des cellules endothéliales
III-7 : Principaux rôles physiologiques de l’axe CX3CL1/CX3CR1
III-8 : Boucle paracrine
III-9 : Implication de l’axe CX3CL1/CX3CR1dans différentes pathologies
11
III-10 : Représentation schématique de la configuration rétinienne chez un individu sain et un patient
atteint de DMLA
IV-1 : Représentation schématique de la Protéine Kinase A

IV-2 : Représentation schématique de la structure et de l’activation des protéines EPAC
IV-3 : Modèle structural et mode de fonctionnement des canaux régulés par les nucléotides cycliques
IV-4 : Localisation sub-cellulaire de quelques complexes AKAP-effecteurs au sein d’une cellule
IV-5 : Principe du FRET
IV-6 : Outils dynamiques de la mesure de l’AMPc cellulaire
Tableau :
I.1 : Diversité et fonctions des différentes sous-unités des protéines G

1.2 : Diversité et régulation des AC
II.1 : Classification des chimiokines et de leurs récepteurs

II.2 : Homo et Hétéro-dimères de RCK
II.3 : Exemples d’études précliniques « Cancer et Chimiokine »
III.1 : Expression du CX3CL1 selon le tissu et le type de cellule

III.2 : impact du polymorphisme de CX3CR1 dans différentes pathologies
IV.1 : Classification des PDE

IV.2 : Classification des outils permettant l’étude de l’AMPc intracellulaire
12
Liste des abréviations
A G
aa -- > acides aminés
AC Adenylate Cyclase GAG  GlycosAminoGlycane
AMPc  Adénosine MonoPhosphate cyclique GAP  GTPase Activating Protein
AP-2  Adaptator Protein complex 2 GDP / GTP  Guanosine Di- / TriPhosphate
AKAP A- Kinase Anchoring Protein GEF  Guanine nucleotide Exchange Factor
AKAR  A-Kinase Activity Reporter GIRK  G protein-coupled Inwardly-Rectifying K+
ATP  Adénosine TriPhosphate current
GMPc  Guanine Mono-Phosphate cyclique
B GRK  G-protein coupled Receptor Kinase
BRET  Bioluminescence Resonance Energy Transfer
H
C HCN  Hyperpolarization-activated Cyclic
CaMK CalModuline- Kinase Nucleotide-gated
CFP Cyan Fluorescent Protein HEK  Human Embryonic Kidney
CML  Cellules Musculaires Lisses HUVEC  Human Umbilical Vein
CNG Cyclic Nucleotid Gated channel Endothelial Cell
CPA Cellules Présentatrices de l’Antigène
CREB  C-AMP Response Element-Binding protein I
CTX  ToXine Cholérique ICL  IntraCellular Loop – Boucle IntraCellulaire
IFN  InterFeroN
D IκB 
DAG Di Acyl Glycerol IL  InterLeukine
DC  Dentritic Cell - Cellules Dentritiques IP3  Inositol 1’-4’-5’ triphosphate
DMLA  Dégénérescence Maculaire Liée à l’Age
DRY motif (E/DRY)  Aspartate / Arginine / Tyrosine J
JaK Janus Kinase
E JNK c-Jun N-Terminal Kinase
ECL  ExtraCellular Loop – Boucle ExtraCellulaire
EPAC  Exchange Protein directly Activated by cAMP L
ELR-motif  Glutamate / Leucine / Arginine LDL  Low Density Lipoprotein
ERK  Extracellular signal Regulated Kinase LPA  LysoPhosphatidic Acid
LPS  LipoPolySaccharide
F
FRET  Fluorescence Resonance Energy Transfer M
MAPK Mitogen Activating Protein Kinase
MEK MAP Kinase / Erk Kinase Kinase
13 MRP Multidrug Resistant Protein
FSH/ FSHR Follicle-Stimulating Hormone–
Hormone Folliculo Stimulante/ FSH Receptor
FSK  ForSKoline
N S
NK Natural Killer Src Proto-oncogene tyrosine-protein kinase
NFAT  Nuclear Factor of Activated T-cells STAT  Signal Transducers and Activators of
NF-κB  Nuclear Factor-κB Transcription
P T
PDE  PhosphoDiEsterase TCR T-Cell Receptor
PI3K  PhosphoInositide 3 Kinase TSH/ TSHR Thydroïd Stimulating Hormone /
PIP2 PhosphatIdylinositol diphosphate TSH Receptor
PI  PhosphoInositol TNF  Tumor Necrosis Factor
PKA / PKB / PKC  Protéine Kinase A / B / C TGF  Tumor Growth Factor
PKI  Protéine Kinase Inhibitor
PLC / PLA2 PhosphoLipase C / PhosphoLipase A2 V
VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
R VIH Virus d’Immunodéficience Humaine
RCPG  Récepteurs Couplés aux Protéines G
RCK  Récepteur aux ChimioKines Y
RGS  Regulator of G protein Signalling YFP Yelow Fluorescent Protein
RIA  RadioImmunoAssay
ROS  Reactive Oxygen Species
14
AVANT PROPOS
15
16
Avant propos
De nombreuses fonctions vitales aussi diverses que le développement embryonnaire, la

plasticité cérébrale ou le fonctionnement du système immunitaire, dépendent de processus de migration
et de recrutement cellulaire. Ces fonctions sont assurées, entre autres, par la famille des chimiokines ou
cytokines chimiotactiques. On en connaît aujourd’hui plus d’une cinquantaine. Il s’agit de petites
protéines sécrétées d’une centaine d’acides aminés, de poids moléculaire compris entre 8 et 14 kDa. De
manière générale, elles interviennent dans le routage des cellules immunes et prennent à ce titre une
part décisive dans la mise en place et la régulation de la réponse immune. Cependant, les chimiokines
interviennent également dans d’autres processus biologiques comme l’angiogenèse, la prolifération
cellulaire, l’apoptose ou encore la dégranulation des leucocytes. De ce fait, elles sont également
impliquées dans de nombreuses pathologies dont l’athérosclérose, l’arthrite rhumatoïde ou encore dans
certains cancers.
Toutes les chimiokines activent leurs cellules cibles via des Récepteurs Couplés aux Protéines G
(RCPG), c'est-à-dire des protéines composées de 7 hélices α transmembranaires.
Le couple CX3CL1/CX3CR1 sur lequel porte ce travail de thèse se distingue des autres couples
chimiokines/récepteurs par plusieurs aspects. L’une de ses particularités réside dans le fait que le
CX3CL1 (ou fractalkine) est une chimiokine qui existe sous deux formes protéiques fonctionnelles : une
forme soluble chimio-attractante comme toutes les chimiokines et une forme membranaire qui confère à
ce couple des propriétés d’adhérence, contribuant notamment à l’arrêt de leucocytes circulants sur la
paroi endothéliale et leur migration vers le foyer inflammatoire. Une autre des particularités de ce couple
est l’existence de deux variants naturels du CX3CR1, annotés VT et IM, en fonction de la nature des
acides aminées en position 246 et 280 (V246I/T280M). Le variant IM est associé à une progression plus
rapide vers le SIDA en cas de contamination, à un moindre risque vis-à-vis des maladies cardio-
vasculaires, à une susceptibilité moindre à certain astrocytome et à une augmentation du risque de
dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA).
Une meilleure connaissance de la signalisation en aval des récepteurs aux chimiokines et des
éventuelles différences de signaux selon la forme activatrice du ligand ou selon le variant du récepteur,
permettrait de progresser dans la définition de moyens d’intervention pharmacologiques afin de lutter
contre les multiples pathologies dans lesquelles ce couple chimiokine/récepteur et, plus généralement,
dans lesquelles les chimiokines et leurs récepteurs sont impliqués.
17
18
INTRODUCTION
19
20
Introduction – les chimiokines & leurs récepteurs
I. Les récepteurs couplés aux protéines G
La capacité des organismes multicellulaires, qu’ils soient animaux ou végétaux, à réagir

aux signaux provenant de leur environnement est déterminante pour leur survie et leur
développement. Cette nécessité d’adaptation, essentielle au maintien de l’équilibre de
l’organisme, apparaît dès l’échelle cellulaire à travers un processus de communication finement
« orchestré » avec le milieu environnant. La communication cellulaire peut être définie comme
l'ensemble des mécanismes permettant à une cellule de recevoir, d’intégrer et de répondre aux
signaux émis par son environnement. Cet ensemble de mécanismes (réception, transduction
des messages et génération d’une réponse cellulaire appropriée) nécessite la présence de
protéines membranaires capables de capter, décoder et relayer les différents stimuli du milieu
extracellulaire en signaux intracellulaires. Ce processus implique l’activation coordonnée de
différents effecteurs tels que des enzymes, des canaux ioniques ou des facteurs de
transcription. Ces réactions moléculaires en cascade constitue le processus de transduction du
signal, à l’origine du déclenchement d’une réponse biologique de la cellule cible (migration,
sécrétion, mitose, expression génique, ...).
Les récepteurs membranaires représentent donc l’interface entre un stimulus extracellulaire

et sa perpétuation dans le cytosol. Ces récepteurs appartiennent à plusieurs classes de
protéines, que l’on peut différencier selon leur mode d’action et leur structure moléculaire. On
distingue notamment les récepteurs de type canaux ioniques (récepteurs ionotropiques) et les
récepteurs associés à une activité enzymatique (récepteurs métabotropiques). Les récepteurs
métabotropiques sont eux-mêmes subdivisés en deux grandes classes de récepteurs selon le
type d’enzyme associée, les récepteurs associés à une activité tyrosine kinase et les récepteurs
couplés aux protéines G (RCPG).
Dans ce chapitre, nous nous intéresserons spécifiquement aux RCPG, aussi appelés
récepteurs à sept domaines transmembranaires.
21
A] Généralités
Les RCPG sont certainement parmi les plus anciens transducteurs de signaux. En effet,
ils sont présents chez les plantes, les levures, les champignons, ainsi que les protozoaires et les
métazoaires diploblastiques. Ils interviennent dans tous les grands systèmes de communication
intercellulaire. Par comparaison les récepteurs à tyrosine kinase n’apparaissent qu’avec les
métazoaires triploblastiques. Chez l’homme, il existe plus de 1000 RCPG différents, dont plus
de la moitié, sont des récepteurs olfactifs (Bockaert and Pin 1999) (Fredriksson and Schioth
2005). 3% du génome humain est consacré à cette famille de protéine. Cela fait de la famille
des RCPG, une des plus grandes classes de protéines du génome humain.
Les ligands des RCPG sont d’une très grande diversité chimique. Ils incluent des
photons, des ions (Ca2+), des stimuli sensoriels (molécules olfactives, gustatives et
phéromones), des petites molécules endogènes (acides aminés, amines, nucléotides, lipides et
peptides endogènes), des composés exogènes (cannabinoïdes, peptides d'amphibiens:
ranatensine ou bombésine), des composés impliqués dans les réactions du système
immunitaire (chimiokines, anaphylatoxines C3a et C5a du complément, peptides N formylés
chimiotactiques) et des protéines (hormones glycoprotéiques, protéases) (Vassilatis, Hohmann
et al. 2003).
Le signal apporté par le stimulus extracellulaire est transmis à l’intérieur de la cellule par
l’intermédiaire du récepteur qui la plus part du temps active une protéine hétérotrimérique, liant
les nucléotides guanyliques di- ou triphosphate (GDP/GTP), aussi appelée protéine G, d’où
l’appellation récepteurs couplés aux protéines G. Ces protéines transmettent le signal provenant
du récepteur à différents effecteurs intracellulaires permettant l’amplification du signal et la
genèse d’une réponse cellulaire appropriée (Figure I-1).
Les premiers RCPG ont été décrits comme des récepteurs capables de moduler l’activité
d’une enzyme membranaire, l’adénylyl cyclase (AC), via l’activation des protéines G (Rodbell
1992). Mais au fil du temps, il est apparu que les RCPG régulent d’autres effecteurs tels que des
canaux ioniques ou encore des kinases. De plus, il est maintenant clair que les RCPG
interagissent de façon directe ou indirecte avec un nombre important de protéines régulatrices
ou des protéines d’échafaudage créant ainsi une plateforme fonctionnelle de signalisation
qualifiée de «réceptosome » (Bockaert, Roussignol et al. 2004). Enfin les RCPG ne sont plus
considérés comme des entités monomériques depuis la mise en évidence de dimères (homo-
ou hétérodimères) de RCPG, même si l’existence de ces dimères semble transitoire (Mizoue,
22
Bazan et al. 1999; Garton, Gough et al. 2001; Prinster, Hague et al. 2005; Kasai and Kusumi
2014).
Aussi, au vu de la multitude de signaux qu’ils transmettent et, de ce fait, du grand

nombre de processus physiologiques qu’ils contrôlent (modulations cardio-vasculaires,
neurotransmission, régulations hormonales, réponses immunitaire et inflammatoire, douleur,…)
la compréhension du mode de fonctionnement et de régulation des RCPG est capitale, plus
particulièrement dans le domaine pharmaceutique. A l’heure actuelle on estime que plus de 60%
des médicaments utilisés ont pour cible un protagoniste de la voie de transduction via les RCPG
(Bockaert and Pin 1999; Fong, Alam et al. 2002).
Figure I-1 : Principe de la transduction du signal en aval des Récepteurs Couplés aux Protéines G.
Les RCPG sont capables de reconnaître des ligands extrêmement variés (photons, ions, molécules odorantes,
peptides, lipides, protéines...). La liaison de molécules messages sur la face extracellulaire du récepteur permet
l’activation au niveau intracellulaire de protéines G. Les protéines G, une fois activées, agissent à leur tour sur
différents effecteurs responsables d’effets intracellulaires importants parmi lesquels la prolifération ou encore la survie
cellulaire.
A.1 – Structures des RCPG
Jusqu’en Octobre 2007, la rhodopsine bovine était le seul récepteur de la famille des
RCPG dont la structure cristallographique était résolue. De ce fait elle a longtemps été utilisée
comme modèle des RCPG.
23
A l’heure actuelle, plus d’une dizaine de structures cristallographiques de RCPG ont été
obtenues (Ozaki, Shibasaki et al. 2000; Cullere, Shaw et al. 2005), dont celle des récepteurs β1
et β2-adrénergique, du récepteur A2 de l’adénosine (Warne, Serrano-Vega et al. 2008)
(Jaakola, Griffith et al. 2008) ou encore celle du CXCR1 (Geissmann, Jung et al. 2003). La
comparaison des séquences de ces RCPG révèle une topologie membranaire commune à tous
les membres de cette superfamille : sept segments hydrophobes transmembranaires organisés
en hélice α, particulièrement bien conservés et composés chacun d’environ 25 à 35 acides
aminés (aa) organisés en un tonnelet tridimensionnel (Figure I-2). Ces segments
transmembranaires sont reliés entre eux par trois boucles cytoplasmiques (ICL) et trois boucles
extracellulaires (ECL). Les extrémités N-terminale et C-terminale se situent respectivement du
côté extracellulaire et intracellulaire. L’extrémité N-terminale constitue la région le plus variable,
pouvant être constituée de 7 aa comme dans le cas du récepteur A2 de l’adénosine comme de
5900 aa dans le cas du VLGR (Very Large G-protein coupled Receptor). Ces variations de taille
importantes dans la longueur des extrémités N-terminale et des boucles constituent un des
critères permettant de caractériser les différentes familles de RCPG.
A.2 – Classification des RCPG
De nombreux systèmes de classification des RCPG ont été proposés. Ils répartissent les
récepteurs en sous-groupes ou familles en se basant sur des critères variés tels que le mode de
liaison du ligand, la structure, la phylogénie ou encore la composition en aa (Kumari, Pant et al.
2009).
La classification la plus répandue est celle établie par Kolakowski en 1994, qui identifie
six classes, basée sur la recherche de similarité entre RCPG connus de vertébrés ou
d’invertébrés (Kolakowski 1994). Cette classification servira de base par la suite à la création de
la base de données des RCPG, appelée GPCRdb (pour G-Protein Coupled Receptors
database). Une autre classification, proposée par Joël Bockaert et Jean-Philippe Pin, répertorie
les RCPG en cinq classes sur la base de critères structuraux et selon le mode de liaison du
ligand (Bockaert and Pin 1999). Parallèlement, deux études proposent des classifications
phylogénétiques des RCPG (Joost and Methner 2002; Fredriksson and Schioth 2005).
Dans ce chapitre nous ne détaillerons que la classification de Kolakowski, du fait de son

utilisation prédominante. Celle-ci attribue une lettre à chaque famille de RCPG : A pour
Rhodopsin-like, B pour Secretin-like, C pour Metabotrope-glutamate/phéromone, D pour fungal
pheromone, E pour AMP cyclique et enfin F pour Frizzled/smoothened.
24
Figure I-2 : Représentation schématique 3D et 2D de la structure générale des

récepteurs couplés aux protéines
Les 7 segments transmembranaires antiparallèles hydrophobes (1-7), qui caractérisent les RCPG, sont reliés par 3
boucles intracellulaires (ICL1-3) et 3 boucles extracellulaires (ECL1-3). L’extrémité N-terminale est extracellulaire
alors que l’extrémité C-terminale est intracellulaire.
A.2.1 – La famille A : « Rhodopsin like »
La famille A est la mieux caractérisée et aussi celle qui comporte le plus grand nombre
de récepteurs avec plus de 80% des RCPG dont la rhodopsine et le récepteur β2-adrénergique.
Cette classe de récepteurs lie des hormones, des polypeptides, des amines biogènes, des
photons ou encore des substances apparentées aux lipides. La moitié des récepteurs de cette
famille sont décrits comme des récepteurs sensoriels impliqués dans la reconnaissance de
stimuli olfactifs, gustatifs ou lumineux. Cette classe est divisée en trois sous-groupes suivant la
taille et l’emplacement du site de liaison du ligand (Figure I-3) :
25
- la sous classe A1 comprend des récepteurs dont les ligands sont de petites molécules
comme le rétinal et pour lesquels le site de liaison est constitué par une cavité formée par les
segments transmembranaires au sein du tonnelet central du RCPG
- la sous-classe A2 comprend des récepteurs dont le site de liaison implique l’extrémité

N-terminale, les boucles extracellulaires et la partie supérieure des domaines extracellulaires.
Les récepteurs de chimiokines font partie de cette sous-famille
- la sous-classe A3 comprend des récepteurs d’hormones glycoprotéiques

(Thyréostimuline-TSH, Hormone folliculo-stimulante-FSH ou Hormone lutéinisant-LH). Elle est
caractérisée par un grand domaine N-terminal qui sert de site de liaison du ligand.
Ce groupe est caractérisé par 3 grandes signatures :
- un motif E/DRY (glutamate /aspartate-arginine-tyrosine) à l’extrémité cytoplasmique

du domaine transmembranaire 3 (TM3).
- deux cystéines qui forment un pont disulfure sur les deux premières boucles ECL1 et
ECL2, permettant le maintien de la structure tertiaire de la molécule
- et le motif NPXXY (asparagine-proline-X-X-tyrosine) dans le domaine
transmembranaire 7 (TM7) qui induit une torsion de l’hélice et qui semble être
importante pour l’activation des récepteurs (He, Browning et al. 2001)
On note également la présence d’un aa di-acide (aspartate ou glutamate) très conservé

dans le TM2 dont le rôle serait la reconnaissance du ligand et le couplage à la protéine G
(Ceresa and Limbird 1994). L’extrémité C-terminale possède un site de palmitoylation. Ce site
de modification post-traductionnelle représente un ancrage lipidique dans la membrane,
pouvant, ainsi créer une quatrième boucle intracellulaire (ICL4).
Parmi ces séquences consensus, le motif E/DRY a fait l’objet d’une multitude d’études,
notamment sur son implication dans l’activation des RCPG de la classe A (Rovati, Capra et al.
2007). Il a ainsi été montré que toute mutation dans ce motif affecte le couplage aux protéines G
(Murphy 1994; Fourmy, Escrieut et al. 2002).
26
Figure I-3 : Classification des RCPG. Représentation schématique de la structure

générale de certaines familles de RCPG et des interactions ligand (en rose).-récepteur
A.2.2 – La famille B: « Secretin like »
La classe B des RCPG ne présente qu’une faible homologie (12%) de séquence avec la
classe A.
Cette famille de RCPG se lie avec des peptides relativement grands tels que des
hormones et des neuropeptides. Cette famille regroupe des récepteurs structurellement proches
du récepteur à la sécrétine. On y retrouve notamment le récepteur du glucagon, du GIP (Gastric
Inhibitory Polypeptide), du GLP-1R et GLP2-R (Glucagon Like Peptide-1/2), le récepteur de la
PTH (Hormone ParaThyroïdienne), le récepteur à la calcitonin, le récepteur à la GHRH (Growth
Hormone Releasing Hormone), les récepteurs au VIP (Vasoactive Intestinal Polypeptide) et du
PACAP (Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide). Le site de liaison du ligand se
situe au niveau de l’extrémité N-terminale du récepteur comme pour les récepteurs de la famille
A3, bien qu’il n’existe pas d’identité de séquences entre les deux familles (Figure I-3).
27
A.2.3 – La famille C : « Metabotrope-glutamate/pheromone»
La famille C des RCPG regroupe les récepteurs métabotropiques du glutamate, les

récepteurs au calcium, les récepteurs GABA-B, les récepteurs du goût, les RAIG (Retinoic Acid
Inducible orphan GPCR) et les récepteurs aux phéromones.
Ces RCPG ont la particularité de présenter une extrémité N-terminale particulièrement

longue d'environ 500 aa. Le repliement de l’extrémité N-terminale donne lieu à la formation de
deux lobes qui constituent le site de liaison de l'agoniste. Il existe, pour cette classe de RCPG,
de nombreux ligands allostériques capables de moduler l’activité des récepteurs en se liant à
différent site du ligand, dit site orthostérique. Une autre particularité de la classe C réside dans
la taille de la troisième boucle intracellulaire qui est très courte et très conservée (Pin, Galvez et
al. 2003) (Figure I-3). Du point de vue de l’activation des récepteurs de la famille C, la
dimérisation entre deux récepteurs identiques (homodimérisation) ou entre deux récepteurs
différents (hétérodimérisation) est un élément crucial. Ceci a été particulièrement étudié dans le
cas du récepteur au GABA (Pin, Galvez et al. 2003). Une seule molécule de l’agoniste suffit à
activer le dimère de récepteur.
A.2.4 – Autres familles : D / E / F
La famille D est constituée de récepteurs de phéromones principalement exprimés chez

les insectes (Nakagawa, Sakurai et al. 2005). Elle inclut également des récepteurs de
phéromones de levures, tels que les récepteurs des facteurs α et a (STE2 et STE3) (Josefsson
1999).
La famille E est formée par les quatre récepteurs à l’AMPc (cAR 1–4) et d’autres
récepteurs « cAMP receptor-like » caractérisés chez Dictyostelium discoideum. Ces récepteurs
sont exprimés lors des étapes précoces du développement de cette amibe où ils participent au
système de signal chimiotactique. Plus tard dans le développement, ils interviennent dans la
différenciation cellulaire et dans le contrôle du cycle cellulaire (Prabhu and Eichinger 2006). A ce
jour, aucun homologue n’a été trouvé chez les vertébrés, ce qui en fait une famille de RCPG
minoritaire, mais unique.
La famille F de récepteurs rassemble des récepteurs homologues aux protéines

«frizzled» et « smoothened ». Les récepteurs de type « frizzled » jouent un rôle important dans
le développement embryonnaire et plus particulièrement dans le contrôle de la prolifération et la
28
polarité cellulaire, en se liant avec Wnt et en activant le signal Hedgehog. Ils sont également
impliqués dans les processus de différenciation cellulaire et d’apoptose (Wang, Liu et al. 2006).
Chez les mammifères, dix récepteurs “frizzled” et un récepteur « smoothened » ont été
identifiés. Leurs boucles intracellulaires sont parmi les plus courtes des RCPG et la longueur de
la partie C-terminale varie d’une vingtaine à plus de 200 aa chez l’Homme. Ces récepteurs
présentent une homologie de séquence faible mais significative avec la famille B (Malbon 2004).
B] Transduction du signal par les protéines G
Hormis des éléments structuraux communs, l’autre caractéristique à tous les RCPG tient
du fait qu’ils déclenchent une cascade de signalisation par le biais des protéines G
hétérotrimériques avec lesquelles ils interagissent. Le récepteur activé par la liaison de son
ligand subit des changements conformationnels qui par extension favorisent son interaction
avec la protéine G, ce qui catalysera l’activation de cette dernière. La protéine G ainsi activée
peut alors induire la transmission du signal intracellulaire.
Parallèlement à cette transduction du signal protéine G dépendante ; d’autres signaux en

aval des RCPG semblent totalement indépendant de l’activation de la protéine G (Heuss and
Gerber 2000). Par ailleurs, et contrairement au modèle proposé au moment de leur découverte,
un RCPG donné n’active pas une seule voie de signalisation spécifique. En effet, un même
RCPG peut activer plusieurs voies de signalisation en parallèle. La nature et l’importance de ces
voies transductionnelles activées varient d’un type cellulaire à l’autre. La signalisation des
RCPG apparaît donc comme riche et variée, d’où une difficulté à établir des modèles généraux,
tous les mécanismes de cette transduction n’étant pas encore connus.
B.1 – RCPG, l’histoire d’une cascade de Nobel
C’est dans les années 70’ que les premiers acteurs de la cascade de signalisation en
aval des RCPG sont découverts. L’adénosine-3’-5’-monophosphate cyclique (AMPc) et l’enzyme
responsable de sa synthèse l’adénylate cyclase (AC) sont les premiers partenaires à être mis en
lumière. Cette découverte vaudra à Earl W Sutherland le prix Nobel de médecine en 1971
(Robison and Sutherland 1971). Parallèlement à ces travaux, Edwin G. Krebs découvre la
protéine kinase activée par l’AMPc décrivant ainsi un niveau plus en aval dans la cascade de
signalisation. Cette protéine, aujourd’hui connue sous le nom de Protéine Kinase A (PKA), est le
premier effecteur de la voie de signalisation AMPc dépendante (Walsh, Perkins et al. 1968).
C’est le second Nobel de médecine (1992) en rapport avec la signalisation AMPc. Il faut
attendre la fin des années 70’ et la démonstration d’Alfred G. Gilman et de M. Rodbell sur
29
l’existence d’une protéine intermédiaire faisant le lien entre le récepteur et l’AC, pour qu’un
troisième acteur de la voie soit évoqué (Rodbell, Krans et al. 1971). En 1980, la protéine Gs est
purifiée et sa structure hétérotrimérique est décrite (Northup, Sternweis et al. 1980). Cette
dernière pièce du puzzle permet à Rodbell et Gilman de décrocher, en 1994, le troisième Nobel
de Physiologie et Médecine attribué à cette thématique. Ces différents biochimistes ont été les
pionniers de la recherche moderne sur la transduction du signal. Dans les années 80’ les autres
protéines G ont été découvertes et leur rôle d’hydrolyse du GTP (Guanosine TriPhosphate) mis
en évidence, connectant ainsi les récepteurs à l’AC. Récemment, en 2012, les travaux des
américains Robert Lefkowitz et Brian Kobilka portant sur l’étude structurale et fonctionnelle du
complexe ligand-RCPG-protéine G ont été récompensés par le Nobel de chimie 2012
(Figure I-4).
Figure I-4 : Les RCPG, une histoire de Nobel
B.2 – Les différentes protéines G
Les protéines G sont des protéines hétérotrimériques composées de sous-unités α, β et

γ. Lorsque la protéine G est activée par le récepteur, elle se dissocie en deux parties
indépendantes, la sous-unité α et le complexe βγ qui interagissent par la suite avec des
30
protéines effectrices intracellulaires différentes, dont elles vont moduler la fonction afin
d’engendrer une réponse cellulaire adaptée (Robishaw and Berlot 2004). L’existence de
nombreuses sous-unités α, β et γ différentes a été rapportée. Le clonage par homologie a
permis l’identification de 35 gènes codant les différentes sous-unités des protéines G (16 codent
les α, 5 les β et 14 les γ) (Milligan and Kostenis 2006).
Les sous-unités α, malgré une grande diversité, présentent toutes une activité
d’hydrolyse du GTP. Elles se subdivisent en quatre sous-groupes qui différent autant par leur
expression tissulaire que par leur action sur leurs effecteurs : αs (4 sous-types, stimulatrice de
l’AC), αi/o (6 sous-types, inhibitrice de l’AC), α q/11 (5 sous-types, activant la PLC) et αi2/i3 (2 sous
types jouant un rôle dans la régulation du cytosquelette) (Tableau 1.1). Cinq sous-unités β et
douze sous-unités γ sont décrites à ce jour. Les sous-unités β sont assez similaires entre elles
d’un point de vue structural alors que les sous-unités γ présentent une variation plus importante.
Un degré de diversité supplémentaire provient de l’assemblage croisé de ces trois sous-

unités α, β, γ entraînant ainsi une multitude de combinaisons possibles. Cette grande diversité
de structure et d’assemblage contribue probablement à l’exceptionnelle variété des réponses
biologiques associées aux RCPG.
B.3 – Le couplage des protéines G aux récepteurs
Les premières données conduisant à déterminer quelle protéine G est couplée à un

RCPG donné, ont été obtenues au moyen d’expériences utilisant des toxines. Il a ainsi été
rapporté que la protéine Gαs est sensible à la toxine cholérique (CTX) qui la bloque dans un état
actif suite à l’ADP-ribosylation d’un résidu arginine du site liant le nucléotide guanlylique (Gill
and Meren 1978). Parallèlement la protéine Gαi est inhibée par la toxine pertussique (PTX) qui,
par ADP-ribosylation d’un résidu cystéine proche du site de liaison du récepteur, la bloque dans
un état inactif (Bokoch and Gilman 1984) (Tableau I.I).
Actuellement, nous disposons de diverses techniques pour déterminer la spécificité de

couplage des protéines G aux récepteurs, telles que la co-immunoprécipitation, la mutagénèse
dirigée, le BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer) ou encore l’utilisation de
modèles cellulaires ou animaux «knockout» pour certaines protéines ou sous-unités. Leurs
utilisations font ressortir l’idée qu’un RCPG est capable d’interagir avec plusieurs types de
protéine G (Hermans 2003). Un exemple de cette sélectivité multiple a été montré par le groupe
de Hillhouse en 2001, avec le récepteur de la CRH (Corticotrophin Releasing Hormon) capable
31
de se coupler à 5 protéines G différentes : Gs, Gq/11, Go, et avec une efficacité réduite Gi1/2 et Gz
(Grammatopoulos, Randeva et al. 2001).
Famille
Sous Type Effecteur Distribution Toxine
GαS αS (S),(L),(XL)  AC, Src tyrosine Kinase Ubiquitaire CTX

αolf  AC Neurones olfactifs, CTX
tractus digestif et
urogénital
2+
Gαi/o α o1/2  AC,  canaux Ca , Neurones,astrocytes, PTX
+
 canaux K cœur
2+
α i1/2/3  AC,  canaux Ca , Ubiquitaire PTX
+
 canaux K , Src tyrosine
kinase, MAPK
2+
αz  AC,  canaux Ca , Plaquettes, Neurones ?
+
 canaux K , Rap1GAP
α t1-2 cGMP- Cônes, batônnets, PTX
Phosphodiesterase bourgeons du goût
α gust ? bourgeons du goût, PTX
chemorécepteurs des
voies aériennes
Gαq/11 α q/11 PLCβ1/3 Ubiquitaire YM-254890
α 14/ 15/ 16 PLCβ1/3 Cellules ?

hématopoïétiques
Gα12/13 α 12/13 Ubiquitaire ?
β1 à 5 PLCβ, PLA2,GIRK β1γ1 :cônes

γ1 à 12  canaux Ca2+, β3γ8:batonnets
AC type I β5: neurones
AC type II,IV,VII β5(L) : rétine
PI3Kinase,Src Kinase autres βγ : ubiquitaires
GRK,JNK
Tableau 1.1 : Diversité et fonctions des différentes sous-unités des protéines G.

Seuls les principaux effecteurs sont indiqués. Certaines sous-unités peuvent être ADP ribosylées par la toxine
Pertussique (PTX) ou cholérique (CTX). (D’après Milligan et Kostenis, 2006).
AC (Adenylate Cyclase), GRK (kinase des RCPG), GIRK (canaux potassiques de la rectification entrante), PI3-
kinase (phosphoinositide 3-kinase), PLA2 (Phospholipase A2), PLC (Phospholipase C) Ras-GEF (protéine
d’échange GDP/GTP de la petite protéine G Ras), RhoGEF (protéine facteur d’échange GTP/GDP de la protéine
Rho).
Cependant, tous les RCPG ne sont apparemment pas capables d’activer plus d’une
classe de protéines G. En effet, on estime que seulement 11% des RCPG peuvent activer
plusieurs types de protéines G avec une efficacité différente, les autres RCPG seraient
spécifiques d’une seule classe de protéine G avec 43% couplés à Gi/o, 33% couplés à Gq/11 et
25% préférentiellement couplés à Gs (Wong 2003).
32
B.4 – Activation des protéines G
Bien que leurs effecteurs différent et donc induisent des cascades de signalisation
distinctes, les protéines G présentent un mécanisme commun d’activation et de désactivation
(Figure I-5) :
En absence de ligand et à l’état basal, le récepteur oscille entre une conformation

inactive, majoritaire (notée R) et une conformation active mais non lié au ligand (notée R*). C’est
sous la seconde conformation R* que le récepteur lie la protéine G hétérotrimérique, où la sous
unité α est liée au GDP. Lors de la fixation du ligand (L) au récepteur, cet équilibre R-R* est
déplacé en faveur de la conformation active du récepteur (L-R**). Dans cette conformation
active, le récepteur se lie à la protéine G et induit son changement conformationnel. Le
récepteur activé agit comme catalyseur de l'ouverture du site GTPase de la sous unité α, ce qui
aboutit à une réaction d’échange du GDP par du GTP. Ainsi selon la nomenclature établie pour
les « petites G-protéines» de la superfamille Ras, le récepteur est une protéine de type GEF
(Guanine Exchange Factor). Le processus moléculaire de l’échange se fait en deux étapes
quasi simultanées, d’une part la libération du GDP lié à l’état basal à la sous-unité α, suivie de la
liaison soit d’une nouvelle molécule de GDP ou de GTP. La liaison du GTP à la sous-unité α,
entraîne un réarrangement structural du trio L-R-G et aboutit à la dissociation du complexe en
trois : αGTP, βγ et le récepteur ligandé. La sous unité αGTP et le complexe βγ ainsi dissociés du
récepteur interagissent alors avec leurs effecteurs intracellulaires. Comme mentionné
précédemment, la sous-unité α possède une activité GTPasique intrinsèque qui restaure la
forme αGDP et permet sa réassociation avec le complexe βγ et donc avec le récepteur.
B.5 – Les effecteurs des protéines G
Le changement de conformation de la sous unité α induit par sa liaison avec le GTP lui
confère une meilleure affinité pour ses effecteurs. Il en résulte une modulation de leur activité
(activation ou inhibition) qui permet la propagation du signal initié par la liaison de l’agoniste sur
son récepteur.
Les premières études sur l’activation d’effecteurs ont laissé penser que seule la
sous-unité α était capable d’activer des effecteurs intracellulaires.
33
Figure I-5 : Cycle d’activation/désactivation des protéines G

A l’état basal, la protéine G est hétérotrimérique et peut-être précouplée à un RCPG non-ligandé se trouvant dans un
état de repos (1). La liaison d’un agoniste (ovale rose) à ce RCPG va induire des changements conformationnels au
niveau de la protéine, permettant l’échange du GDP par un GTP, réaction catalysée par le récepteur. Cela conduit à
l’activation de la protéine G hétérotrimérique (2) La sous unité α liée au GTP se dissocie du complexe βγ et vont
agirent sur leurs effecteurs respectifs (3). L’hydrolyse du GTP favorise le retour à l’état basal de la protéine G.
Figure I-6 : Diversité des voies de signalisation en aval d’un RCPG

Une multitude de voies de signalisation sont activées en aval des RCPG. Ces voies de signalisation résultent de
l’action de la sous unité α comme du complexe βγ sur leurs effecteurs intracellulaires respectifs comme l’adénylate
cyclase (AC), les RhoGEF, la voie des MAPK, GIRK,…
34
Maintenant, il est reconnu que le dimère βγ est capable d’activer des effecteurs intracellulaires
spécifiques (MAPK–Mitogen Activated Protein Kinase, PLC-PhosphoLipase C, GRK-G protein-
coupled Receptor Kinase,…) (Figure I-6).
B.5.1 – Les effecteurs activés par la sous-unité Gα
L’adénylate-cyclase (AC)
L’AC est une enzyme membranaire qui synthétise l’AMPc à partir de l’ATP (Adénosine
TriPhosphate). La réaction nécessite du magnésium (Mg2+) et provoque la libération de
pyrophosphate (PPi). L’AMPc joue le rôle de messager secondaire en devenant à son tour un
activateur allostérique de plusieurs effecteurs intracellulaires, dont le plus connu est la PKA.
Cependant l’AMPc est capable de lier d’autres effecteurs tel que le facteur d’échange Epac
(Exchange Protein directly Activated by cAMP) et les canaux HCN (Hyperpolarization activated
Cyclic Nucleotide gated channel) ou CNG (Cyclic Nucleotide Gated channel). Le détail des voies
de signalisation impliquant ces effecteurs sera abordé au cours du 4ème chapitre sur l’AMPc et
ses effecteurs.
Actuellement chez les mammifères, on compte 9 isoformes membranaires d’AC (1 à 9)

résultant de gènes différents (Krupinski, Coussen et al. 1989) et une forme soluble (AC10), qui
est exprimée essentiellement dans les testicules (Hanoune and Defer 2001). Les isoformes
membranaires sont des glycoprotéines dont le poids moléculaire est compris entre 120 et
140 kDa. Toutes partagent une structure secondaire commune contenant (Figure I-7) :
- une extrémité N-terminale intracellulaire
- deux domaines transmembranaires similaires (M1 et M2) constitués chacun de six
segments transmembranaires organisés en hélice α et séparés par
- une boucle cytoplasmique C1
- une extrémité C-terminale cytoplasmique appelée C2
Les régions C1 et C2 se subdivisent en deux parties distinctes C1a-C1b et C2a-C2b :

C1a et C1b portent les domaines de liaison à l’ATP pour former le cœur catalytique de l’AC,
tandis que C2a et C2b forment les sites régulateurs (Sprang, Chen et al. 2007; Willoughby and
Cooper 2007). Les propriétés de régulation communes aux 9 formes membranaires de l’AC
décrites jusqu’à présent mettent en évidence une activité basale de l’AC qui est stimulée par la
sous unité α de la protéine Gs et inhibée par celle de la Gi. Les sous-unités αi et αs régulent
différemment ces états. Par sa liaison avec le domaine C2, αsGTP favorise l’hétérodimérisation
entre C2a et C1a (Figure I-7.B), tandis que αiGTP se lie à C1a et empêche la formation du
complexe C1a-C2a (Figure I-7.A) (Sunahara, Tesmer et al. 1997).
35
La forskoline (FSK- diterpène dérivé de la plante Coleus forskolii) est un activateur connu
de la plupart des isoformes membranaires de l’AC. Elle se fixe sur les sites C1a et C2a et joue
le rôle de « glue moléculaire » en maintenant C1a et C2a sous forme hétérodimérique
(Dessauer, Scully et al. 1997; Willoughby and Cooper 2007).
Certaines isoformes de l’AC sont modulées par le dimère βγ. Par exemple βγ est capable
de stimuler les AC2, 4 et 7 mais est aussi un puissant inhibiteur des AC1 et 8 (Sunahara and
Taussig 2002). De plus, les ACs possèdent des sites de phosphorylation pour la Protéine
Kinase C (PKC), la PKA et la Calmoduline-Kinase II (CaMKII). Les différents niveaux de
régulations possibles sont répertoriés dans le tableau 1.2
A B
Figure I-7: Structure de l’Adénylate Cyclase

L’AC est une protéine ancrée dans la membrane cellulaire par douze domaines transmembranaires répartis en 2
régions M1 et M2. Le cœur catalytique de l’AC est formé par le rapprochement des domaines cytoplasmiques C1 et
C2. L’ATP se fixe au niveau des sites de liaisons localisés sur le domaine C1 (domaine catalytique) où il sera
hydrolysé en AMPc + pyrophosphate (PPi). Le domaine C2 est le domaine régulateur où se trouve le site de liaison
des sous unité α de la protéine G ainsi que des sites de liaison de la forskoline (FSK) ou encore du magnésium. La
sous unité de type αi inhibe l’AC en empêchant que le cœur catalytique soit formé. A l’inverse la sous unité de type αs
stimule la formation de ce cœur catalytique en favorisant le rapprochement des domaines C1 et C2.
La phospholipase C (PLC)
L’activation de la PLC par les sous-unités de la classe Gαq aboutit, à partir du

phosphatidylinositol 4,5-biphosphate (PIP2) membranaire, à la synthèse du diacylglycérol (DAG)
qui reste au contact de la membrane lipidique et d’inositol 1,4, 5 triphosphate (IP3) qui diffusent
dans le cytoplasme. L’IP3 agit sur les canaux calciques présents sur le réticulum endoplasmique
afin de provoquer la libération de calcium contenu dans ce réservoir.
36
AC Localité tissulaire Régulation par

isoforme
protéine G calcium protéines FSK
kinases
Gαs Gαi Gβγ
AC I Cerveau (neurones)     CaM  PKC 

Glandes surrénales
 CaMK IV
(medulla)
AC II Cerveau, muscles,  Ø  Ø  PKC 
poumons, cœur
AC III Cerveau, épithélium   Ø  CaM  PKC 
olfactif, pancréas,
 CaMK II
tissu adipeux brun,
utérus, cœur,
poumons
AC IV Cerveau, cœur, rein,  Ø   PKC 
foie, poumons,
utérus, tissu adipeux
brun
AC V Cœur, cerveau, rein,    [<1µM]  PKC 
foie, poumons,
 PKA
utérus, tissu adipeux
brun
AC VI ubiquitaire    [<1µM]  PKA 

 PKC
AC VII ubiquitaire     PKC 
AC VIII Cerveau, poumons,   Ø  CaM 

utérus, testicules,
cœur
AC IX Cerveau,    calcineurine 
AC X Testicules Aucun effet de la

protéine G
Tableau 1.2 : Diversité et régulation des AC

CaM  calmodulin
  stimulation CaMK  Calmoduline kinase
  inhibition PKA / PKC  protéine kinase A / C
Ø  aucun effet FSK  Forskolin
L'élévation du calcium intracytoplasmique entraîne l'activation d'un certain nombre de

processus dépendants du calcium et notamment d’une protéine prenant en charge le calcium, la
calmoduline. Le complexe calcium-calmoduline peut activer d’autres enzymes telles que la
37
phosphodiestérase (PDE - enzyme de dégradation de l’AMPc en 5’-AMP), la phospholipase A2.

Le DAG est un activateur de la PKC. Celle-ci catalyse, en présence de calcium, la
phosphorylation d'un grand nombre de substrats intervenant dans la différenciation cellulaire, la
mitose, l'exocytose, et d’autres processus cellulaires.
Autres effecteurs des sous-unités α
D’autres types de phospholipases telles que les phospholipases D et A2 peuvent

également être activées par des sous-unités Gα. La GMP cyclase est également un effecteur
des protéines G. De plus, certains canaux ioniques, notamment à conductance potassique ou
calcique, voient leur activité modulée par certaines sous-unités de la classe αi.
B.5.2 – Les effecteurs activés par le complexe βγ
Jusqu’à la fin des années 90, le complexe βγ était considéré comme ne servant qu’à
capter la sous-unité α liée au GDP pour la remettre dans un nouveau cycle d’activation.
Cependant l’intérêt pour βγ s’est amplifié suite à la mise en évidence de son rôle d’activateur
direct des canaux potassiques de la rectification entrante (GIRK) (Yamada, Inanobe et al. 1998).
L’ouverture de ces canaux permet une hyperpolarisation du neurone sur lequel ils se trouvent et
joue donc un rôle très important dans la modulation de la propagation des signaux au sein du
système nerveux. De plus, le complexe βγ diminue l’ouverture des canaux calciques voltage-
dépendants de type N, responsables de la libération de neurotransmetteurs au niveau d’une
synapse entre deux neurones via une interaction directe avec le canal (Dascal 2001).
Le complexe βγ peut aussi activer la phospholipase A2, certaines phospholipases β,

certaines AC, mais aussi la phosphoInositol 3 Kinase (PI3K) et les MAPK par des mécanismes
faisant intervenir la protéine Src (Proto oncogene tyrosine protein kinase) (Clapham and Neer
1997; Luttrell, Della Rocca et al. 1997). De manière intéressante, l’activité de GRK2 et GRK3
(G protein Receptor Kinase) est augmentée par βγ, ce qui suggère un rôle de rétrocontrôle
négatif de ce complexe en favorisant la désensibilisation du récepteur (cf. chapitre I -§ C.3)
(Clapham and Neer 1997).
Les effecteurs activés peuvent varier selon les sous-unités β et γ considérées. Ainsi, la
phosducine interagit préférentiellement avec le complexe β1γ1, alors que la sous-unité β5
semble plus spécifique de la stimulation de la PLC que des MAPK. De même, β3, β4, β5
diffèrent de β1 et β2 par leurs interactions avec des fragments de l’AC2 et GIRK1 dans des
expériences de double hybride (Hildebrandt 1997).
38
Ainsi les protéines G peuvent activer de nombreux effecteurs intracellulaires qui eux-
mêmes activent d’autres protéines. Par conséquent, ces protéines sont à l’origine de
nombreuses voies de transduction ce qui explique, en partie, l’implication des RCPG dans de
nombreux processus physiologiques ou physiopathologiques.
C] Régulation de l’activité des RCPG

L’activité des RCPG repose sur un équilibre entre les mécanismes d'activation de la
cascade de réactions qu'ils déclenchent et ceux qui aboutissent à leur inactivation et gouvernent
l’arrêt de la réponse, permettant ainsi une meilleure adaptation de la cellule à un environnement
en perpétuel changement
C.1– Elimination du ligand
Le signal intracellulaire peut être limité par l’arrêt de la présence du ligand dans le milieu
extracellulaire. Deux mécanismes conduisent à la suppression du ligand du milieu
extracellulaire. Soit il est éliminé par recapture via des transporteurs spécifiques, comme c’est le
cas de nombreux neurotransmetteurs (sérotonine, noradrénaline,…) au niveau des synapses
cérébrales, soit il est dégradé par des enzymes protéolytiques contenues dans le milieu
extracellulaire, comme cela peut être le cas des chimiokines tel que le CCL2.
C.2 – Régulation par les RGS (Regulator of G protein Signalling)
Bien que les protéines G soient capables d’hydrolyser, elles-mêmes, le GTP qu’elles
portent, le processus est extrêmement lent et n’est pas représentatif de la vitesse à laquelle le
signal des RCPG est arrêté in vivo. Par exemple, le temps de demi vie de l’hydrolyse du GTP
est de 15s pour la sous-unité α purifiée tandis que la désactivation des signaux visuels associés
est de 0,2s (Bockaert, Claeysen et al. 2002).
Dans le milieu des années 1990, une famille de protéines, les RGS, a été identifiée pour
sa capacité à réguler le signal des RCPG. Les RGS ont été identifiés pour la première fois chez
Saccharomyces cerevisiae pour leur rôle dans l’inhibition des protéines G. Ces protéines sont
des GAP (GTPase-Accelerating Protein). Les RGS ne possèdent pas d’activité GTPasique à
proprement parler mais elles modulent le signal des RCPG en accélérant le taux d’hydrolyse du
GTP par la sous unité α réduisant ainsi la durée et l’amplitude du signal des RCPG dépendant
des protéines G. La protéine G retourne alors dans son état inactif, liée au GDP. Puisqu’elles
39
facilitent la réassociation de la sous unité α avec le complexe βγ, on considère que les RGS
inhibent également la signalisation induite par le dimère βγ.
La famille des RGS comprend plus de 30 membres, dont les tailles varient de 17 à
160 kDa et qui peuvent être soit membranaires soit cytosoliques. La signature des protéines de
cette famille consiste en un domaine RGS de 120 résidus par lequel elle lie la sous-unité α et qui
est responsable de la fonction GAP. On distingue deux classes de RGS : les petites protéines
RGS (160 à 217 aa) qui ne possèdent que le domaine RGS encadré par de courtes extrémités
N- et C-terminales et les grandes protéines RGS (372 à 1387 aa) qui contiennent des motifs
additionnels permettant des liens entre les protéines G hétérotrimériques et d’autres voies de
signalisation. Globalement leur rôle est de permettre la réassociation de l’hétérotrimère en fin de
cycle (Chasse and Dohlman 2003; McCudden, Hains et al. 2005).
C.3 – Désensibilisation
La désensibilisation est un processus de régulation crucial pour la cellule. Il consiste à

contrôler finement la durée de la stimulation cellulaire induite par un RCPG donné, empêchant
une stimulation excessive.
On distingue deux types de désensibilisation : la désensibilisation homologue et la

désensibilisation hétérologue. La désensibilisation homologue désigne une perte de réponse
d’un RCPG à la suite de sa stimulation par son ligand, alors que dans le cas de la
désensibilisation hétérologue, la perte de réponse du RCPG, fait suite à une stimulation d’une
autre famille de récepteurs co-exprimés à la surface de la cellule. Cette désensibilisation est
possible notamment par l’intermédiaire des kinases intracellulaires activées à la suite des
seconds messagers.
L’événement le plus précoce, au cours de la désensibilisation, homologue comme

hétérologue, correspond à une phosphorylation des résidus thréonine et sérine situés au niveau
de la région C-terminale du récepteur. Cette phosphorylation démarre quelques secondes après
l’activation du récepteur (Bouvier, Hausdorff et al. 1988). Les familles de protéines à l’origine de
cette phosphorylation différent en fonction du type de désensibilisation. Néanmoins, leur effet
est comparable : elles sont à l’origine d’une inhibition du couplage du récepteur avec les
protéines G.
40
C.3.1 – Désensibilisation homologue
Dans le cas de la désensibilisation homologue, la phosphorylation se fait par des kinases

spécifiques de la famille des RCPG, les GRK. La famille des GRK est composée de sept
membres qui présentent de fortes similitudes de séquence et qui appartiennent à la famille des
sérines/thréonines kinases. Elles possèdent toutes un domaine catalytique central et une
extrémité N-terminale importante pour la reconnaissance des RCPG. L’extrémité C-terminale est
impliquée dans des interactions protéine-protéine et dans l’adressage des kinases vers la
membrane et les récepteurs.
Fonctionnellement les GRK présentent trois caractéristiques (Pitcher, Hall et al. 1998) :
- Elles phosphorylent préférentiellement les récepteurs en conformation active et lié à

l’agoniste plutôt que les récepteurs inactifs ou liés à un antagoniste.
- L’interaction avec les récepteurs augmente leur activité.
- Leur adressage à la membrane est finement régulé par une multitude de mécanismes
dont certains impliquent le complexe βγ.
Les GRK phosphorylent le récepteur au niveau de l’extrémité C-terminale (Lefkowitz,

Pitcher et al. 1998). La phosphorylation du récepteur par une GRK permet la liaison d’une
β-arrestine au récepteur. L’arrivée de la β-arrestine au niveau du récepteur masque les
séquences d’interaction avec les sous-unités α, ce qui a pour conséquence d’inhiber
stériquement l’interaction entre le récepteur et la protéine G et contribue à un arrêt du signal.
C.3.2 – Désensibilisation hétérologue
Ce phénomène est lié au fait que les kinases dépendantes des seconds messagers
phosphorylent non seulement les récepteurs activés par leurs ligands mais aussi d’autres
familles de récepteurs inactifs.
La phosphorylation du récepteur dans le cadre d’une désensibilisation hétérologue est

assurée par les protéines kinases activées par les seconds messagers : PKA et PKC. Elles
catalysent le transfert d’un groupe phosphate issu d’une molécule d’ATP vers une sérine ou
thréonine contenue à l’intérieur d’une séquence consensus d’une protéine donnée, ici le
récepteur. Ces kinases PKA et PKC sont activées en réponse à l’augmentation intracellulaire de
seconds messagers induits par un RCPG, tels que l’AMPc, le calcium ou le DAG et participent à
la phosphorylation de protéines cibles en aval de la voie de signalisation du RCPG considéré.
41
D’un point de vue moléculaire, le processus est équivalent à celui déclenché par les GRK
puisque ce sont les groupements phosphates qui favorisent le découplage du récepteur de la
protéine G par un encombrement stérique, ainsi que le recrutement des β-arrestines conduisant
ainsi à l’internalisation du récepteur afin d’interrompre le signal. Ce mécanisme serait
prédominant dans le cas des faibles concentrations en agonistes (Ferguson 2001).
C.4 – Internalisation des RCPG dépendante des β-arrestines
C.4.1 – Internalisation constitutive des RCPG
A l’état inactif, les RCPG subissent une internalisation, dont le taux est relativement bas
par rapport à une internalisation induite par le ligand. En plus de contribuer à l’homéostasie
cellulaire, l’internalisation constitutive des RCPG pourrait servir à maintenir une réserve interne
de récepteurs pour remplacer ceux qui sont désensibilisés après une exposition aux ligands.
C.4.2 – Internalisation dépendante du ligand
Après l’étape de désensibilisation par les GRK, la liaison des β-arrestines au récepteur
permet le découplage de la protéine G et engage le récepteur dans le processus d’endocytose
(Figure I-8). Les RCPG sont en général internalisés par une voie classique passant par la
formation de puits recouverts de clathrine autour du récepteur. Si le plus souvent cette
endocytose participe au recyclage des récepteurs phosphorylés et donc à la re-sensibilisation
du système, elle peut également marquer la première étape de la dégradation des récepteurs
(Figure I-8). Dans les deux cas de figure, les β-arrestines 1 et 2 vont jouer un rôle primordial. En
se fixant préférentiellement à un RCPG phosphorylé (Rasmussen, Novak et al. 2004), elles
établissent un pont moléculaire entre le récepteur à internaliser et les protéines clés de la
machinerie d’endocytose. En effet, les β-arrestines vont recruter un ensemble de partenaires,
dont l’adaptateur AP-2 et la clathrine et participer à la formation d’une vésicule recouverte de
clathrine, au sein de laquelle se retrouve le récepteur à internaliser. Cette vésicule s’invagine
vers l’intérieur de la cellule. Une petite GTPase, la dynamine, va ensuite assurer la scission des
membranes pour créer une vésicule d’endocytose contenant les récepteurs toujours attachés à
la membrane. Cette vésicule nouvellement formée rejoindra, grâce au cytosquelette de la
cellule, le réseau vésiculaire où son contenu sera trié (Figure I-8) (Volovyk, Wolf et al. 2006;
Wolfe and Trejo 2007).
42
Figure I-8 : Modèle « classique » de l’internalisation β-arrestine dépendante des RCPG

Après l’activation de la protéine G suite à la liaison du ligand sur le RCPG, les GRK phosphorylent l’extrémité
C-terminale du récepteur. Les β-arrestines sont recrutées et viennent se lier aux domaines intracellulaires
phosphorylés, recrutant à leur tour les différents composants de la machinerie d’endocytose, comme la protéine AP-2
et la clathrine. Les récepteurs internalisés sont soit recyclés à la membrane après élimination du ligand soit dégradés
dans les lysosomes.
D] Transduction du signal non-conventionnelle

Dès la fin des années 1990, certains résultats suggéraient que des RCPG étaient
capables de signaliser sans recourir aux protéines G ou encore que ces récepteurs continuaient
à signaler tout en étant dans les vésicules d’endocytose (Calebiro, Nikolaev et al. 2009; Lohse
and Calebiro 2013).
D.1– Transduction du signal dépendant des protéines G par des

RCPG internalisés
Le schéma d’internalisation actuel des RCPG suppose le fait que le signal dépendant
des protéines G est transmis exclusivement depuis la membrane plasmique alors que le signal
dépendant des β -arrestines est plutôt transmis au niveau des compartiments endosomaux.
43
En 2009, trois études, réalisées au sein de trois groupes différents, présentent de solides
preuves de l’existence d’un signal AMPc persistant qui émane de RCPG internalisés.
La première étude du groupe de Martin Lohse (Calebiro, Nikolaev et al. 2009) utilise un
modèle transgénique de souris exprimant de manière ubiquitaire une sonde mesurant l’AMPc, la
sonde EPAC, afin d’étudier le signal AMPc persistant dans des cellules de tyroïde fraîchement
isolées. Ils observent que suite à une stimulation du récepteur TSHR par son ligand naturel, le
récepteur et son ligand sont rapidement internalisés via un mécanisme principalement
dépendant de la β-arrestine 2 et migrent jusqu’à des vésicules périnucléaires. Cependant,
malgré l’internalisation du récepteur, les niveaux d’AMPc intracellulaires restent très élevés. Les
résultats de cette étude, incluant des effets d’inhibiteurs d’endocytose et des techniques de
fractionnement cellulaire, montrent que les protéines G et l’AC sont présentes au niveau des
membranes des vésicules d’endoctyose contenant les récepteurs internalisés et que ces
complexes internalisés continuent de transduire un signal dépendant des protéines G. A la
différence du signal membranaire qui est rapidement réversible, le signal provenant des
récepteurs internalisés continue en l’absence de stimulation TSH. Ce signal AMPc persistant
induit par le récepteur TSH internalisé, serait crucial pour assurer la fonction sécrétoire de la
tyroïde (Calebiro, Nikolaev et al. 2009) (Figure I-9.A).
Rapidement après la première étude sur le récepteur de la TSH, Ferrandon et collègues

(Ferrandon, Feinstein et al. 2009) publient une étude similaire sur le récepteur de l’hormone
parathyroïdienne (PTH). Le récepteur PTHR possède deux ligands naturels, l’hormone
endocrine PTH, et la PTHrP (ParaThyroid Hormone-related Protein), un facteur autocrine. Ces
deux peptides déclenchent un signal de durée différente (Figure I-9.B). Les résultats de cette
étude montrent que la stimulation par PTH induit une internalisation rapide du récepteur dans
les endosomes précoces, en association avec l’AC. Les complexes PTH-PTHR internalisés ne
sont pas associés avec une désensibilisation de la voie AMPc mais plutôt avec un signal AMPc
persistant. A l’inverse, le PTHrP présente un profil de signalisation membranaire et rapidement
réversible (Ferrandon, Feinstein et al. 2009).
La troisième étude montre que le récepteur de la sphingosine-1-phosphate (S1P1),

couplé à Gi/Gq, émet un signal persistant dépendant de la protéine Gi, une fois le récepteur
internalisé. Une stimulation du récepteur par son ligand, le S1P1, combiné à une molécule
immunomodulatrice, FT720 induit un signal d’inhibition de l’AMPc permanent passant par la voie
Gi, et ceux après l’internalisation du récepteur. A l’inverse le signal calcique dépendant de la
protéine Gq reste lui restreint à la membrane plasmique (Mullershausen, Zecri et al. 2009)
44
Figure I-9 : Résultats principaux issus de différentes études sur la transduction du signal AMPc
par des récepteurs internalisés.
A- Cinétique de la réponse AMPc, observée par FRET, en aval du récepteur de l’hormone TSH en fonction du temps
de présence du ligand dans le milieu extracellulaire. Les auteurs constate deux type de réponse une réponse
réversible (courbe noire et grise) et une réponse permanente (courbe rouge). La réponse permanente semble émaner
d’un groupe de récepteur internalisés mais encore lié à la protéine G et qui continuent de stimuler l’adénylate cyclase
de type 3. D’après Calebiro, Nikolaev et al. 2009.
B- Cinétique de la réponse AMPc, observée par FRET, en aval du récepteur de l’hormone PTH en fonction du ligand :
PTH ou PTHrP. La cinétique de la réponse AMPc est différente en fonction de ce paramètre, en effet alors que le
récepteur activé par la PTH induit une réponse rapide mais réversible (courbe rouge) contrairement au PTHrP qui
induit une réponse permanente (courbe noire). D’après Ferrandon, Feinstein et al. 2009.
C- Modèle proposé pour expliquer les deux types de réponse, réversible et permanente, en aval du récepteur de la
TSH. A l’aide de nanoparticules se liant spécifiquement au récepteur non lié à la β-arrestine (Nb 80) ou à la protéine
G (Nb 37). De cette manière, les auteurs confirment qu’en plus d’un couplage récepteur-protéine G à la membrane,
responsable d’une première vague de réponse AMPc (a), il y a un « re-couplage » du récepteur avec la protéine G au
niveau des endosomes (c), après l’étape d’internalisation du récepteur par le mécanisme β-arrestine dépendant (b).
Ce re-couplage est à l’origine d’une seconde vague de réponse, certainement la réponse persistante décrite dans
l’article précédent. D’après Lohse and Calebiro 2013.
Très récemment, l’étude de ces signaux via des récepteurs internalisés a été accélérée
par le développement de nouveaux outils de mesure comme par exemple les « nanobodies » ou
anticorps à domaine unique permettant de cibler le récepteur internalisé couplé à la protéine G
(Lohse and Calebiro 2013). De ce fait, le nombre de récepteur capable de signaler après leur
45
internalisation n’a cessé d’augmenter, c’est le cas notamment du récepteur β2-adrenergique

(Irannejad, Tomshine et al. 2013), le récepteur GLP-1R (Glucagon like peptide-1 Receptor)
(Urano, Jones et al. 2012) ou encore celui de la vasopresssine (Hewavitharana and
Wedegaertner 2012).
Ces données posent une multitude d’autres questions : comment l’existence de ces
complexes de récepteurs internalisés avec leurs protéines G est conciliable avec leur
internalisation dépendante des β-arrestines ? D’autre part, comment expliquer cette dernière
étude qui est venue contredire les autres observations ? Ainsi, ces découvertes nécessitent des
travaux complémentaires pour déterminer l’existence in vivo de ces complexes de RCPG
internalisés associés aux protéines G ainsi que leurs rôles physiologiques.
D.2– Transduction du signal indépendant des protéines G
Outre leurs rôles classiques connus, de plus en plus d’études portent sur la signalisation
des RCPG indépendante de l’activation de la protéine G. Ces voies sont très difficiles à mettre
en évidence dans la mesure où il existe une large variété de récepteurs exprimés dans un
même tissu. Il résulte de cette co-expression une réponse cellulaire extrêmement complexe, ce
qui rend très difficile l’étude de la voie de signalisation liée à un seul récepteur. Ces voies de
signalisation sont donc étudiées en exprimant indépendamment chaque récepteur dans un
système d’expression hétérologue, approche largement critiquée puisque le récepteur est sorti
de son contexte naturel. En effet, on peut facilement imaginer que la réponse est dépendante du
tissu et du taux d’expression des protéines impliquées dans la signalisation, et de la
stœchiométrie des différents partenaires ce qu’il est impossible de reproduire en système
d’expression hétérologue. Néanmoins, cette approche, même si elle est contestée reste la
meilleure pour mettre en évidence de telles voies de signalisation.
D.2.1 – Activation des différentes voies MAPK
Les MAPK sont des sérines/thréonines kinases qui regroupent les ERK1/2, c-jun NH2-
terminal kinases (JNK) et p38/MAPK. La cascade de phosphorylation Ras/Raf/ERK-
kinases/ERK1/2 conduit à la régulation de la prolifération, la différenciation, la survie ou
l’apoptose cellulaire, que ces kinases modulent en activant par phosphorylation des facteurs de
transcription. L’activation de cette voie en aval d’un RCPG diffère selon le récepteur et le type
de cellule. Cette voie de signalisation peut être induite par 4 mécanismes distincts (Figure I-10) :
- Mécanisme déclenché par les protéines kinases A et C (Gutkind 1998)
- Mécanisme déclenché par les β-arrestines (Luttrell, Della Rocca et al. 1997)
46
- Mécanisme de transactivation des récepteurs à tyrosine kinases (Lowes, Ip et al. 2002;

Piiper and Zeuzem 2004)
- Mécanisme déclenché par interaction directe avec le récepteur (Guillet-Deniau, Burnol
et al. 1997)
D.2.2 –Autres voies de signalisation
On trouve dans la littérature de plus en plus d’études qui montrent que les boucles
intracellulaires et le domaine C-terminal des RCPG présentent des motifs structuraux
caractéristiques des interactions protéine/protéine, qui prévoient des liaisons avec d’autres
protéines que les partenaires classiques des RCPG (G-protéines, GRK et β-arrestines). Ces
protéines qui se lient directement aux RCPG semblent participer à l’assemblage et à la cohésion
d’un véritable échafaudage protéique fonctionnel autour du récepteur (Brzostowski and Kimmel
2001; Milligan and White 2001)
L’engouement observé depuis une vingtaine d’années pour l’étude des RCPG va sans
doute se poursuivre pour mettre en évidence toutes ces voies de signalisation nouvellement
découvertes. D’un point de vue médical en effet, les principales études se sont portées sur la
recherche de nouveaux ligands du récepteur impliqué dans la pathologie, mais sans doute est-il
plausible de vouloir trouver des molécules interagissant à une autre étape de la voie de
signalisation, encore faut-il que cette voie soit connue.
47
Figure I-10 : Activation de la voie MAPK par les différents acteurs de la signalisation
cellulaire. La cascade MAPK/MAPKK peut être activées par différents partenaires cellulaires, dont les Récepteurs
de type Tyrosine Kinase (RTK), les PKA et PKC faisant suite à l’activation préalable de RCPG. Une activation directe
de la voie par le récepteur est également possible mais non représentée sur ce schéma simplifié.
48
II. Le Système Chimiokine/ Récepteur de chimiokine
Durant la dernière décade, les mécanismes qui régissent le trafic des leucocytes, en
conditions physiologique ou pathologique, ont été mieux compris. Contrairement à l’idée
ancienne d’une migration au hasard des leucocytes vers les tissus, il a été démontré que la
migration des leucocytes était un processus étroitement régulé mettant en jeu des interactions
récepteurs-ligands (Springer 1995). De nombreuse molécules sont décrites comme
responsables de cette attraction cellulaire coordonnée, parmi lesquelles la molécule du
complément C5a, le leukotriène B4 ou encore le peptide bactérien formyl-méthionyl-leucyl-
phénylalanine (fMLP). Cependant grâce à une expression spécifique à des sous-populations
cellulaires, les chimiokines et leurs récepteurs sont les molécules chimio-attractantes qui
contribuent largement à ce phénomène de recrutement et migration des leucocytes, aussi bien
dans des conditions physiologiques que pathologiques (Rossi and Zlotnik 2000). Leur
implication dans le système immunitaire ne se cantonne cependant pas à la migration cellulaire
dans des conditions pathologiques inflammatoires. Les chimiokines interviennent aussi dans la
régulation physiologique du trafic leucocytaire dans les organes et vaisseaux lymphoïdes ainsi
que dans la maturation, la différenciation et l’activation de différentes sous-populations de
cellules de l’immunité (Moser and Willimann 2004; Ebert, Schaerli et al. 2005; Lapidot, Dar et al.
2005; Schaerli and Moser 2005). Plus récemment, il a été démontré que les chimiokines jouent
un rôle déterminant dans des phénomènes non-immuns comme le développement
embryologique et la neuromodulation au sein du système nerveux central (Rostene, Guyon et al.
2011), l’angiogenèse, le trafic et le « homing » des cellules souches mésenchymateuses ou
encore la croissance et la migration tumorale (Rollins 1997; Luster 1998; Rossi and Zlotnik
2000; Strieter, Burdick et al. 2005) (Figure II-1).
A] Les Chimiokines
En 1987, le groupe de Yoshimura identifie un facteur soluble sécrété par des monocytes
activés et présentant des propriétés chimio-attractantes vis-à-vis des neutrophiles. Ce facteur
est nommé interleukine 8 (IL-8) selon la nomenclature en usage à l’époque, interleukine
désignant une cytokine secrétée par et agissant sur les leucocytes. Il faudra attendre les années
90’ et le troisième Symposium international dédié à ces cytokines chimio-attractantes, pour que
le terme de chimiokine soit officiellement adopté.
49
Figure II-1 : Représentation schématique de l’implication du système chimiokinergique

dans différents processus physiologiques et physiopathologiques.
A.1 – Classification structurale et fonctionnelle
Les chimiokines sont des protéines de faibles poids moléculaire constituées de 60 à

80 aa. Une cinquantaine de chimiokines ont été identifiées à ce jour. Cette famille de protéines
est caractérisée par une homologie de séquence en aa variant de 20% à 80%, ainsi qu’un motif
commun incluant deux ou quatre cystéines conservées. Les chimiokines sont ainsi répertoriées
structuralement selon le nombre d’acides aminés qui séparent les deux premières cystéines
situées en N-terminal et constituent quatre grandes familles : C-, CC-, CXC- et CX3C- (Figure II-
2).
Les chimiokines peuvent également être classées selon leur expression qui peut être
constitutive ou inductible (Tableau 2.1). En effet certaines chimiokines, considérées comme
« homéostatiques », sont produites constitutivement par des tissus lymphoïdes ou non
lymphoïdes (peau, muqueuse, …). Elles ont un rôle de régulation de la production et de la
distribution des leucocytes, aussi sont-elles essentiellement impliquées dans la veille
immunitaire.
50
Figure II-2 : Représentation schématique de la structure protéique des 4 sous familles

des chimiokines humaines. A gauche : représentation de la structure de chaque sous-famille de chimiokines.
A droite : représentation de la redondance caractéristique de la relation des chimiokines avec leurs récepteurs
symbolisés par les rectangles.
La majorité des chimiokines sont qualifiées d’inflammatoires car leur production n’est
observée que dans un contexte d’inflammation ou d’infection. Ces chimiokines peuvent être
secrétées soit directement par le tissu inflammé lui-même (endothélium vasculaire, épithélium)
ou par des leucocytes infiltrants (macrophages, lymphocytes T, …). Ces chimiokines sont
synthétisées au sein des cellules après stimulation par des cytokines pro-inflammatoires (IL-1a,
TNF-α, IFN-α, …) (Brown, Gerritsen et al. 1994; Graves and Jiang 1995) ou après contact avec
un agent pathogène (virus, LPS = lypopolysaccharide, un composant majeur de la membrane
bactérienne) (Baggiolini, Dewald et al. 1997; Mahalingam and Karupiah 1999). Le rôle de ces
chimiokines est d’induire la migration des leucocytes (monocytes, neutrophiles et autres cellules
51
effectrices) depuis le sang vers le site de l’inflammation et d’activer les cellules immunitaires afin
d’enclencher une réponse immunitaire.
Cette distinction constitutive/inductible n’est toutefois pas absolue, certaines chimiokines

comme CX3CL1 ou CCL20, appartiennent aux deux catégories (Tableau 2.1).
A.1.1 – Les CXC-chimiokines
Initialement appelée α-chimiokines, les membres de cette première sous-famille de

chimiokines se distinguent par le fait que les deux premières cystéines sont séparées par un
seul aa d’où leur nom CXC- (Figure II-2). Actuellement, environ 14 CXC-chimiokines ont été
identifiées chez l’Homme, parmi lesquelles l’Interleukine-8 appelée CXCL8 dans la
nomenclature systématique. Les gènes humains codant ces protéines sont localisés sur le
chromosome 14 dans la région q12-21, à l’exception du gène CXCL12 qui est localisé sur le
chromosome 10. Ce groupe CXC- peut être subdivisé en deux sous-catégories selon la
présence ou non d’un motif tripeptidique N-terminal : ELR (Glutamate-Leucine-Arginine), qui
confère aux chimiokines, qui le portent, des propriétés angiogéniques. Ainsi leur implication est
souvent rapportée au cours de la formation de nouveaux vaisseaux sanguins, lors du
développement embryonnaire, des processus de cicatrisation mais aussi au cours des
développements tumoraux ou inflammation chroniques (Strieter, Polverini et al. 1995; Strieter,
Polverini et al. 1995; Rossi and Zlotnik 2000). La présence de ce motif confère à la chimiokine
une activité chimiotactique spécifique pour les neutrophiles, alors que son absence oriente cette
activité vers les lymphocytes et les monocytes. Les chimiokines ELR- sont décrites, exception
faite pour le CXCL12, comme des angiostatiques, inhibant l’effet angiogéniques du groupe
ELR+.
A.1.2 – Les CC-chimiokines
Les membres de la sous-famille des CC-chimiokines, la plus importante en termes de

nombre (27 actuellement recensés) se distinguent par le fait que les deux cystéines
N-terminales sont adjacentes. Dans la majorité des cas, les gènes humains codant ces
protéines sont localisés sur la région q11.2-12 du chromosome 17. Il existe toutefois des
exceptions à cette règle puisque le gène codant CCL19 est localisé sur le chromosome 9 et
celui codant CCL20 se situe au niveau du chromosome 2.
52
Chimiokines Récepteurs
Famille Dénomination Dénomination Dénomination Expression

commune officielle officielle leucocytaire
IL-8 CXCL8
CXC- CCP-2 CXCL6 CXCR1 NeutroΨ
NAP-2 CXCL7
ENA-78 CXCL5
Gro-α CXCL1 CXCR2 NeutroΨ
Gro-β CXCL2
Gro-γ CXCL3
IP-10 CXCL10
Mig CXCL9 CXCR3 LTeff /NK
I-TAC CXCL11 CXCR7 Tumeurs
SDF-1α/β CXCL12 CXCR4 Mono / LB
SCA-1 CXCL13 CXCR5 LB
- CXCL16 CXCR6 DC/ LTact
BRAK CXCL14 ? Mono / LB / NK
MCP-1 CCL2
CC- MCP-4 CCL13 CCR2 Mono / LT / NK/ eosinoΨ
MCP-3 CCL7
MCP-2 CCL8
MIP-1β CCL4 Mono/Macro/ NK/ LTeff /
MIP-1α CCL3 CCR5 DC
RANTES CCL5
MIP-3 CCL23 CCR11
Mono
HCC-1 CCL14
HCC-2 CCL15 CCR1
HCC-4 CCL16 LTeff /NK
Eotaxin-1 CCL11
Eotaxin-2 CCL24 CCR3
Eotaxin-3 CCL28 eosinoΨ/ Baso Ψ/ DCimm/
TARC CCL17 NK
MCD CCL22 CCR4
MIP-3α CCL20 CCR6 DC / LTeff
MIP-3β CCL19 DCimm/ LTeff / LB
SLC CCL21 CCR7
I-309 CCL1 CCR8 DC/ Macro/ LT
TECK CCL25 CCR9 Mono/ LT/ DCimm
CTACK CCL27 CCR10 LB
DC-CKI CCL18 ? LTeff
DC
C- MCD XCL1 CXR1 LB/ LT/NK/ NeutroΨ

MIP-3α XCL2
CX3C- Fractalkine CX3CL1 CX3CR1 LT/NK/ NeutroΨ
Tableau 2.1 : Classification des chimiokines et de leurs récepteurs.

La majorité des chimiokines sont dites « inflammatoires » (rouge) c'est-à-dire inductibles
dans des conditions inflammatoires. D’autres sont homéostatiques, exprimées de manière
constitutives (noir). Cette distinction inductible/constitutive n’est toutefois pas absolue,
certaines chimiokines appartiennent aux deux catégories (vert).
Abréviations : NeutroΨ neutrophile / LTeff  Lymphocyte T effecteur /NK  Natural Killer /
Mono monocyte / LB Lymphocyte B / DC cellule dendritique mature/ DCimmcellule
dendritique immature/ LTact Lymphocyte T activé / LT Lymphocyte T / eosinoΨ eosinophile/
Baso Ψ basophile/Macromacrophage.
53
Les CC-chimiokines sont associées à des inflammations chroniques caractérisées par

l’infiltration de monocytes, lymphocytes, éosinophiles, mastocytes et basophiles. Ces
chimiokines induisent également une migration des Natural Killer (NK) et des cellules
dendritiques (DC).
A.1.3 – Les CX3C-chimiokines
Ce troisième groupe de chimiokine, ne comporte à ce jour qu’un seul membre : le

CX3CL1 dont les deux cystéines sont séparées par trois résidus. Le CX3CL1 également appelé
fractalkine, est une chimiokine qui se distingue des autres chimiokines par sa structure
particulière puisqu’elle possède un domaine hydrophile extracellulaire de 77 aa et un domaine
hydrophobe de 18 aa qui lui permet un ancrage à la membrane, faisant d’elle la seconde
chimiokine membranaire connue, avec le CXCL16. Sous sa forme membranaire, le CX3CL1 agit
comme une molécule d’adhésion à part entière, responsable d’une forte adhérence leucocytaire,
indépendante des intégrines. Le domaine extracellulaire peut être clivé donnant naissance à une
chimiokine soluble chimio-attractante envers les monocytes, les lymphocytes T et le
neutrophiles. Le chapitre III sera consacré à la description de CX3CL1 et son récepteur le
CX3CR1, couple chimiokine/récepteur utilisé comme modèle au cours de mon travail de thèse.
A.1.4 – Les C-chimiokines
Encore appelées Lymphotactines (Ltn), les C-chimiokines ne possèdent que deux

cystéines conservées et donc ne comportent qu’un seul pont disulfure. Le groupe n’est composé
que de deux membres, XCL1 (Ltn-α) et XCL2 (Ltn-β). Leurs séquences sont très proches et ne
différent que par la nature des résidus 7 et 8 de l’extremité N-terminale. Leurs gènes sont
localisés sur le chromosome 1, région q23. Elles sont produites par les lymphocytes T8 activés
du thymus et du sang périphérique. Ces deux chimiokines présentent une activité chimiotactique
pour les lymphocytes via un unique récepteur le XCR1, hautement exprimé dans la rate, le
thymus et l’intestin.
A.2 – Structure des chimiokines
A.2.1 – Séquence primaire
Bien que présentant une structure commune, les chimiokines ne se caractérisent pas par
une homologie de séquence (20-80% de variation), ni par une homologie protéiques (20-30% de
variation) entre les membres des quatre sous-familles. Toutefois au sein d’une même sous-
54
famille, cette variation s’amoindrie, ainsi les membres de la sous-famille CC- présentent une
homologie protéique de 70% et ceux de la sous-famille CXC- montent jusqu’à 90% d’homologie
protéique. Les chimiokines sont caractérisées par la présence d’un motif structural N-terminal
commun, incluant deux ou 4 cystéines conservées. Ces cystéines, comme nous venons de la
décrire sont à l’origine de la classification des chimiokines en quatre sous-familles (§ A.1). Elles
sont engagées dans la formation de deux ponts disulfures, sauf pour les lymphotactines
(XC-chimiokines) qui n’en possèdent qu’un.
A.2.2 – Structure tridimensionnelle
Les structures tridimensionnelles de plusieurs chimiokines ont été résolues par

cristallographie aux rayons X et/ou par résonance magnétique nucléaire (RMN) et montrent un
repliement caractéristique. Cette topologie conformationnelle se caractérise par (Figure II-3A) :
 Une région N-terminale flexible, structurellement désordonnée qui précède la
première cystéine.
 Un domaine très stable avec les deux premières cystéines engagées dans les ponts
disulfures
 Une région en boucle appelée « N-loop »
 Un feuillet constitué de trois brins antiparallèles β reliés entre eux par les boucles
30s, 40s et 50s. En plus de ce rôle de connecteur des feuillets β, la boucle 30s et 50s
contiennent les deux dernières cystéines engagées dans les ponts disulfures.
L’ensemble forme un motif en clé grecque
 Un domaine C-terminal organisé en une hélice α et qui suit la dernière cystéine.
La stabilité de cette structure est assurée à la fois par les ponts disulfures mais
également par des liaisons hydrophobes entre les résidus du domaine C-terminale et des
résidus du feuillet β.
La portion N-terminale et la « N-loop » sont les deux sites majeurs d’interaction des
chimiokines avec leurs récepteurs (Clark-Lewis, Kim et al. 1995; Clore and Gronenborn 1995;
Baggiolini and Loetscher 2000).
A.2.3 – Structure quaternaire
C’est sous la forme de monomère que la plupart des chimiokines ont une activité
biologique in vitro (Paolini, Willard et al. 1994). Cependant, les chimiokines ont la capacité de
s’oligomériser à forte concentration.
55
Figure II-3 : Représentation schématique de la structure tridimensionnelle des

chimiokines
A- Structure 3D générale d’une chimiokine
B- Structure tertiaire et quaternaire de certaines chimiokines
La topologie générale monomérique est conservée entre les différentes sous-familles.

Cependant, les structures de chimiokines résolues jusqu’ici, montrent que les dimères des
différentes sous-familles adoptent des structures quaternaires très différentes (Figure II-3B). Les
différences de dimérisation observées pour chaque sous-famille sont attribuées à des
différences isoélectriques.
Les CXC-chimiokines ayant plus de résidus hydrophobes dans le premier feuillet β que
les CC-chimiokines, dimérisent en utilisant ce premier feuillet comme interface inter-monomère,
diminuant ainsi l’exposition des résidus apolaires à un environnement aqueux.
La question du caractère physiologique et du rôle éventuel de l’oligomérisation des

chimiokines a fait l’objet de nombreux travaux. Il a ainsi été montré que les chimiokines
conservent leur activité biologique qu’elle soit sous forme d’un dimère covalent ou d’un
monomère (Rajarathnam, Sykes et al. 1994; Leong, Lowman et al. 1997). Il semble également
que la dimérisation ne soit pas nécessaire à la fixation de la chimiokine à son récepteur et que
plus globalement l’activité in vitro de la plupart des chimiokines ne nécessite pas cette
dimérisation. Par contre, à forte concentration, CCL5 formerait des dimères qui seraient
nécessaire pour son activité in vivo (Johnson, Kosco-Vilbois et al. 2004). De même, un variant
monomérique de CCL2 conserve ses propriétés in vitro mais perd son pouvoir de recrutement
cellulaire et acquiert des propriétés anti-inflammatoire in vivo (Handel, Johnson et al. 2008). Ces
observations indiquent que la dimérisation de certaines chimiokines peut être déterminante pour
leurs fonctions. A l’inverse, la dimérisation peut être associée à la perte des propriétés des
monomères, comme c’est le cas pour CXCL12, qui serait cardio-protecteur uniquement sous
56
forme monomérique (Veldkamp, Seibert et al. 2006). Notons que certaines chimiokines, comme
CCL1 ou CCL7 s’avèrent être incapables de former des dimères. La question du rôle fonctionnel
de la dimérisation dépend donc de la chimiokine envisagée.
A.2.4 – Fixation aux glycosaminoglycanes
Bien que les chimiokines soient solubles, leur diffusion dans le tissu interstitiel est limitée
par des interactions complexes avec les macromolécules de la matrice extracellulaire ainsi
qu’avec les glycosaminoglycanes (GAG) de la surface des cellules (Figure II-4).
Les GAG sont des polysaccharides constitués d’une répétition de disaccharides variant
tant en composition qu’en nombre et présentent à ce titre une très large diversité parmi les
macromolécules biologiques. On les trouve sous forme soluble, comme c’est le cas pour
l’héparine ou lié à la membrane sous la forme de protéoglycanes, dont l’exemple le plus
répandue est l’héparane sulfate. Leur densité en groupements sulfate et carboxylate leur donne
une charge globalement négative qui suggère une interaction électrostatique avec des protéines
basiques. Les GAG peuvent donc interagir avec des centaines de protéines dont les chimiokines
(Witt and Lander 1994).
L’interaction des chimiokines avec les GAG présents à la surface des cellules
endothéliales permet la présentation des chimiokines aux cellules circulantes du sang, ce qui
induit une adhésion leucocytaire solide. De plus il semble que la liaison aux GAG soit
nécessaire au maintien du gradient de concentration des chimiokines à partir du site
inflammatoire, ce qui permet la migration dirigée des cellules (Rot 1992). Toutefois plusieurs
hypothèses, non exclusives, sont envisagées quant au rôle fonctionnel de cette liaison
chimiokine-GAG :
 Un rôle protecteur des chimiokines contre leur dégradation (Kuschert, Coulin et al.
1999)
 Cela confère une orientation ou une conformation favorisant la liaison
chimiokine / récepteur (Ali, Palmer et al. 2000)
 Il s’agit d’un élément combinatoire supplémentaire pour la spécificité des
chimiokines : un récepteur serait ainsi spécifique d’une chimiokine donnée, liée à un
GAG particulier (Witt and Lander 1994; Kuschert, Coulin et al. 1999; Vives, Crublet et
al. 2004)
 Les GAG pourraient enfin favoriser l’oligomérisation des chimiokines.
57
Figure II-4 : Interaction des chimiokines avec les glycosaminoglycanes (GAG) et leurs
récepteurs.
Les chimiokines sont présentées à la surface des cellules endothéliales grâce à leur interaction avec les
GAG via leurs extrémités C-terminale. L’interaction avec le récepteur mobilise de nombreuses régions de
la chimiokine, dont l‘extrémité N-terminale.
B] Les Récepteurs aux Chimiokines (ou RCK)

B.1 – Classification des RCK
Les chimiokines exercent leur activité biologique en se liant à des récepteurs

membranaires dont la particularité est de posséder sept domaines transmembranaires et d’être
des RCPG. Une vingtaine de ces récepteurs ont été identifiés et répertoriés selon la même
nomenclature que celle retenue pour leur ligand. Ainsi, les récepteurs aux chimiokine (RCK)
sont répartis en quatre sous-familles dont la nomenclature fait écho à celle des quatre sous-
familles de chimiokine : CCR (11 membres), CXCR (7 membres), XCR1 et le CX3CR1. A part
quelques exceptions, un RCK ne peut lier que des chimiokines appartenant à la même famille.
Pour exemple, le groupe des récepteurs appelé CXCR se lie et est activé par les CXC-
58
chimiokines, alors que les récepteurs CCR ne lient que des chimiokines de type CC-chimiokines
(Tableau 2.1).
B.2 – Structure des RCK

Les vingt RCK connus appartiennent à la famille A2 des RCPG. Les analyses de
séquence de ces récepteurs mettent en évidence un haut degré d’homologie au niveau des
régions transmembranaires mais de grandes variations au niveau des domaines
extramembranaires. Les parties les plus variables sont les régions N- et C-terminales, qui
participent l’une à la liaison du ligand et l’autre à l’activation des partenaires intracellulaires
(protéine G, β-arrestines,…).
A l’inverse des chimiokines, seule la structure tridimensionnelle du CXCR4 et du CXCR1

ont été décrites et publiées (Wu, Chien et al. 2010), ce qui est principalement dû aux difficultés
rencontrées lors de la cristallisation d’une protéine membranaire. Par extrapolation des
structures tridimensionnelles des RCPG connues et en particulier du cristal du CXCR4, nous
pouvons inférer que les RCK possèdent les caractéristiques communes suivantes :
 Une séquence primaire de longueur comprise entre 320 et 380 aa
 Une petite séquence N-terminale d’environ 40 aa
 Une extrémité C-terminale intracellulaire comprenant dans sa séquence plusieurs
résidus sérine et thréonine qui sont hautement phosphorylables et impliquées dans la
signalisation et la désensibilisation du récepteur
 Un motif DRY spécifique à cette famille de RCPG
 Une boucle ICL3 basique, très courte (12-14 aa) par rapport aux autres RCPG où
cette boucle est constituée de 50 à 75 aa. Cette boucle est impliquée dans la
sélectivité pour la protéine G
 La présence de deux ponts disulfure extracellulaires permettant le maintien de la
structure tertiaire
Les RCK possèdent aussi des sites de maturation post-traductionnelle. On trouve

principalement au niveau du domaine N-terminal, des sites de sulfatation sur les résidus
thréonine et tyrosine ainsi que des sites N- et O-glycosylation. Ces modifications améliorent
l’affinité des récepteurs pour le ligand (Bannert, Craig et al. 2001; Veldkamp, Seibert et al.
2006). Le domaine C-terminal des RCK, comme celui de tous les RCPG de famille I, contient
des sites de palmitylation. Ces sites semblent impliqués dans le trafic intracellulaire et
l’expression des récepteurs en surface (Blanpain, Wittamer et al. 2001; Percherancier,
Planchenault et al. 2001).
59
B.3 –Dimérisation et Oligomérisation des RCK
Sur la vingtaine de RCK actuellement connus, environ un tiers sont décrits comme
pouvant former des homo et / ou hétérodimères entre eux (Tableau 2.2). Qu’ils soient
constitutifs ou conséquent à une activation par le ligand reste encore un point controversé.
Considérerons ici l’exemple du CXCR4 dont l’existence d’un dimère a été confirmée par
plusieurs techniques. Vila-Coro et al. montrent que suite à l’immunoprécipitation de CXCR4,
seules les cellules
ayant été stimulées avec du SDF présentent des bandes immunoréactives à 80kDa, le poids
moléculaire approximatif d’un dimère de CXCR4 (Vila-Coro, Rodriguez-Frade et al. 1999). Dans
une autre étude menée en FRET cette fois, Toth et al. constatent un transfert d’énergie basal
entre CXCR4-CFP et CXCR4-YFP et une augmentation de signal après stimulation par le SDF;
ils en concluent que la dimérisation de CXCR4 préexiste à la stimulation mais est renforcée voir
augmenter par le ligand (Toth, Ren et al. 2004). Par contre, plusieurs travaux démontrent que la
dimérisation de CXCR4 est constitutive (Percherancier, Berchiche et al. 2005) (Wang, He et al.
2006). On est donc en présence de tous les cas de figures possibles : inductible, constitutif ou
inductible et consécutif à la fois. La même controverse existe pour le CCR5 (Hernanz-Falcon,
Rodriguez-Frade et al. 2004; Rodriguez-Frade, del Real et al. 2004; Lemay, Marullo et al. 2005).
En plus d’une homodimérisation, le CXCR4 peut s’hétérodimériser avec plusieurs autres

RCK. Par exemple dans les lymphocytes T, le CXCR4 s’hétérodimèrise avec CCR5.
Contrairement aux récepteurs individuels, couplés uniquement à une G i, l’hétérodimère
CXCR4/CCR5 peut se coupler à Gq et /ou G11, ce qui conduit à augmenter l’activation des
cellules T (Molon, Gri et al. 2005; Contento, Molon et al. 2008). CXCR4 peut également former
un hétérodimère avec CXCR7, un récepteur qui a la particularité de lier le même ligand, SDF-1.
Cet hétérodimère constitutif a été révélé en FRET et en co-immunoprécipitation et
potentialiserait la réponse calcique de CXCR4 (Sierro, Biben et al. 2007).
En dehors de toute controverse sur l’origine des homo- et hétéro- dimères de RCK, il
reste à savoir si leur formation est transitoire comme cela a été montré pour nombreux RCPG
de classe A (Prinster, Hague et al. 2005; Kasai and Kusumi 2014) ou si elle est permanente
comme pour les RCPG de classe C et comme le laisse penser les données de cristallisation de
CXCR4 (Wu, Chien et al. 2010)
60
Dimère Méthode d’étude Références

CCR2 – CCR2 BRET, Co-IP El-Asmar et al. 2005
(Homo-dimère) Percherancier et al, 2005
CCR2 – CCR5 BRET, Co-IP, radioliaison El-Asmar et al. 2005

(Hétéro-dimère)
CCR2 – CXCR4 BRET, radioliaison Percherancier et al. 2005

(Hétéro-dimère) Sohy et al. 2007
CXCR4 – CXCR4 BRET, FRET Babcock et al. 2003;

(Homo-dimère) Percherancier et al.2005
CCR5 – CCR5 BRET, FRET, Co-IP El-Asmar et al. 2005

(Homo-dimère) Hernanz-Falcon et al.2004 Issafras
et al. 2002
CXCR1 – CXCR1 BRET, FRET, Co-IP Wilson et al. 2005

(Homo-dimère)
CXCR1 – CXCR2 BRET, FRET, Co-IP Wilson et al. 2005

(Hétéro-dimère)
CXCR2 - CXCR2 BRET, FRET, Co-IP Trettel et al. 2003

(Homo-dimère) Wilson et al. 2005
CXCR7 -CXCR7 BRET Kalatskaya et al. 2009

(Homo-dimère)
CXCR4 - CXCR7 FRET Sierro et al. 2007

(Hétéro-dimère)
CXCR4 - CCR5 BRET Contento et al. 2008

(Hétéro-dimère)
CX3CR1 – CX3CR1 BRET Darbandi-Tehrani et al. 2010

(Homo-dimère)
Tableau 2.2 : Homo- et Hétéro- dimères de RCK connus
B.4 –Expression des RCK
L’obtention d’anticorps spécifiques aux différents RCK a permis d’étudier finement

l’expression de ces récepteurs à la surface des leucocytes et de comparer leur expression dans
les situations physiologiques et pathologiques
61
B.4.1 – Profil d’expression des RCK
Les RCK sont exprimés à la surface d’une multitude de type cellulaire (Figure II-5) dont
les cellules épithéliales et endothéliales (Bernardini, Ribatti et al. 2003), les cellules musculaires
lisses (CML) (Reape and Groot 1999) ou encore au sein du système nerveux : sur les neurones
et les cellules microgliales (Rollins 1997). Leur présence à la surface de ces types cellulaires,
non circulants, les prédispose à des fonctions dépassant leur statut de simple partenaire
chimio-attractant. Toutefois, les RCK sont principalement exprimés sur les leucocytes.
Chaque classe de leucocyte présente un profil différentiel d’expression de RCK, par leur
combinaison et leur niveau d’expression. Alors que certains récepteurs sont exprimés sur
plusieurs classes de leucocytes, d’autres sont plus spécifiques : par exemple le CCR5 pour les
monocytes, le CCR3 à la surface des éosinophiles ou encore le CXCR1 et le CXCR2
exclusivement exprimés à la surface des neutrophiles. Les lymphocytes expriment eux la quasi-
totalité du répertoire RCK (Loetscher, Moser et al. 2000). Néanmoins le profil d’expression dans
cette population est variable en fonction de l’état de maturation et d’activation. Par exemple, les
cellules dendritiques immatures expriment le CCR1, CCR2 et CCR5 alors que les formes
matures expriment le CCR4 et CCR7, ces derniers permettant la migration dans les organes
lymphoïdes secondaires (Sallusto and Lanzavecchia 2000) (Tableau 2.1). Les RCK constituent
des marqueurs des différentes classes de T (Th1/Th2/Th17/Th23…).
B.4.2 – Régulation de l’expression des RCK
L’expression des RCK est stimulée par certaines cytokines, comme par exemple
l’Interleukine-2 qui stimule l’expression de CCR1, CCR2, CCR5, CXCR4 et CX3CR1 à la
surface des Lymphocytes T (Loetscher, Seitz et al. 1996) tandis que le TGF-β (Transforming
Growth Factor β) modifie le profil d’expression des RCK présents à la surface des cellules
dendritiques (DC) (Sato, Kawasaki et al. 2000).
62
Figure II-5 : Expression des chimiokines et de leurs récepteurs au sein des différents
organes
L’expression des RCK est également régulée par les cytokines pro-inflammatoires
comme l’IFN-γ qui augmente l’expression de CXCR3 sur les lymphocytes T activés et de CCR1
et CCR3 sur les neutrophiles mais qui diminue l’expression de CCR1, CCR3, CCR5, CCR6 et
CXCR4 sur les cellules dendritiques matures.
En conclusion, l’expression des RCK sur les leucocytes dépend du type cellulaire, du
stade de différenciation et de l’état d’activation de la cellule. Le système chimiokinergique est
donc finement régulé et adapté en fonction des différentes populations cellulaires, de leur
localisation et de leur état d’inactivation.
C] Interaction Chimiokine-Récepteur
L’affinité des chimiokines pour leur récepteur est de l’ordre du nanomolaire. Elle varie en
fonction de plusieurs paramètres dont le couple récepteur-chimiokine étudié (Kohout, Nicholas
et al. 2004), le type cellulaire (Locati, Riboldi et al. 2001) ou encore la présence de GAG (Appay,
Brown et al. 1999).
C.1 – Redondance des interactions ligands/récepteurs

La redondance tient du fait qu’une chimiokine peut être le ligand de plusieurs récepteurs,
à des degrés d’affinité variable et que plusieurs récepteurs peuvent partager le même ligand
(Tableau 2.1). Cette redondance importante a pour conséquence directe de stabiliser
l’ensemble du système chimiokinergique, tout en compliquant l’étude de ces interactions
multiples. Elle entretient aussi la robustesse et l’adaptabilité de la réponse inflammatoire et
immune qui obéit ainsi à un réseau protéique et non à un élément unique. Nous pouvons
63
cependant remarquer que certains systèmes de chimiokines dérogent à la cette règle, à l’instar
du couple CX3CL1/CX3CR1.
C.2– Un modèle d’interaction en deux étapes

Les études de relations structure-activité suggèrent un modèle d’interaction
chimiokine/récepteur en deux étapes, qui a été étudié dans les cas du couple CCR5/CCL5
(Nikolaev and Lohse 2006) et CXCR4/CXCL12 (Clark-Lewis, Kim et al. 1995). Au cours d’une
première étape, la chimiokine reconnait, via son extrémité N-terminale, l’extrémité N-terminale
du récepteur (Figure II-6). Les boucles extracellulaires du récepteur, contenant des résidus
chargés, vont ensuite interagir à leur tour avec la partie N-terminale de la chimiokine. Cette
étape conduit au changement conformationnel du récepteur correspondant à son activation et
au déclenchement d’une signalisation. Ainsi selon ce modèle, la chimiokine interagit avec son
récepteur via deux sites, tous deux relativement courts (quelques aa seulement) mais
relativement proches dans l’espace. Toujours conformément à ce modèle, c’est la séquence de
l’extrémité N-terminale du RCK qui détermine la spécificité de liaison de ses ligands.
C.3– Transduction du signal

La fixation d’une chimiokine à son récepteur provoque une cascade d’événements
intracellulaires aboutissant à différents effets biologiques.
La majorité des voies de signalisation en aval des RCK font intervenir les protéines G.
Néanmoins, il existe une grande diversité des signaux intracellulaires qui ne semblent pas se
limiter aux seules voies de signalisation G dépendantes. Plusieurs de ces voies pouvant
s’activer parallèlement (Figure II-7). Ainsi la complexité du réseau extracellulaire des
chimiokines et de leurs récepteurs, semble être doublée d’une complexité intracellulaire liée à la
combinatoire des signaux intracellulaires.
C.3.1 – Voies protéine G dépendantes
Il est admis de façon générale que les RCK sont couplés à une protéine G
hétérotrimérique de la famille Gi/o, sensible à la PTX (Thelen 2001). Selon ce couplage, il est
classique d’observer une inhibition de l’AC, aboutissant à une réduction du niveau d’AMPc
intracellulaire responsable de l’activation entre autre de la PKA (Murphy, Baggiolini et al. 2000;
Bajetto, Barbero et al. 2001).
Parallèlement à cette voie de signalisation AMPc, la majorité des chimiokines activent la

voie de la PLC. Cette voie de signalisation peut passer soit par la protéine Gαi soit par le
64
complexe βγ (Neptune and Bourne 1997). Les PKA et PKC catalysent la phosphorylation de
nombreuses protéines cibles dont les MAPK. Les principaux membres des MAPK sont les
kinases ERK1/2 (Extracellular signal-Regulated Kinases), JNK (c-Jun N-terminal Kinase) et la
protéine p38, décrites comme d’importants régulateurs du chimiotactisme (Klemke, Cai et al.
1997). Cependant, les MAPK peuvent être activées par une voie alterne, impliquant Ras et Raf
(Knall, Young et al. 1996).
Enfin, le dimère βγ semble jouer un rôle important dans la signalisation des RCK, grâce à
l’activation de la voie de la PI3K et de son effecteur la protéine Kinase B (PKB) (Ganju, Brubaker
et al. 1998). Cette voie semble être impliquée dans le processus inflammatoire (Ward, Sotsios et
al. 2003) et la limitation de la septicémie (Martin, Souza et al. 2010). Il a également été rapporté
que le recrutement leucocytaire est affecté en absence de PI3K, suggérant son rôle clé dans la
signalisation des RCK et des fonctions cellulaires qui en découlent (Hirsch, Katanaev et al.
2000; Hannigan, Zhan et al. 2002).
Figure II-6 : Interaction en deux étapes des chimiokines avec leur récepteur.
La phase de rapprochement des chimiokines de leurs récepteurs est dirigée par des forces
électrostatiques entre la charge négative des boucles extracellulaires du récepteur et la surface
positivement chargée de la chimiokine. La première phase d’interaction implique les extrémités
N-terminales des deux partenaires Cette première interaction, induit un changement conformationnel du
récepteur permettant une interaction de la chimiokine, toujours par son extrémité N-terminale, avec les
boucles extracellulaires du récepteur.
65
En outre, les signaux induits par l’activation de la protéine G conduisent à une

polymérisation de l’actine, à une régulation positive des molécules d’adhérence et à d’une
multitude d’autres composants cellulaires permettant la migration cellulaire. De plus, d’autres
fonctions leucocytaires, comme la dégranulation ou la prolifération, sont activées par les
cascades de signalisation induites par les RCK (Rowland-Jones, Pinheiro et al. 2001).
Par ailleurs, il a été décrit un couplage différentielle des RCK avec non pas une G i/o mais
avec des G14 ou G15 de la famille des Gq comme c’est le cas du CXCR3 ou encore du CXCR4
(Shi, Partida-Sanchez et al. 2007; Kumar, Kremer et al. 2011).
Figure II-7: Complexité des voies de signalisation induite suite à l’activation d’un RCK
(adaptée à partir O’Hayre et al. 2008)
C.3.2 – Voies protéine G indépendantes
D’autres voies de signalisation insensibles à la PTX et indépendantes des protéines Gi,

ont été mises en évidence en aval des RCK (Arai and Charo 1996). Ces voies impliquent
JAK/STAT (Janus Kinase / Signal Transducers and Activators of Transcription) (Rodriguez-
66
Frade, Mellado et al. 2001), ERK (Kumar, Tripathi et al. 2012) ou font intervenir les β-arrestines
(Kraft, Olbrich et al. 2001; Fong, Premont et al. 2002; Sun, Cheng et al. 2002). Ces résultats
restent cependant très controversés (Ahr, Denizot et al. 2005; Moriguchi, Hissong et al. 2005)
C.3.3 –Régulation de l’activité
Désensibilisation
L’arrêt du signal en aval des RCK suit la même logique que celle décrite pour l’ensemble
des RCPG au cours du chapitre I et que je rappel brièvement ici : l’activation du RCK par un
agoniste induit non seulement le déclenchement de voies de signalisation mais aussi une
régulation de l’activité du récepteur. Cette régulation dite « négative » permet un contrôle de la
durée d’activation de manière à éviter les effets néfastes d’une stimulation prolongée du
récepteur. Il s’agit du premier maillon de la chaîne de verrouillage de la transduction du signal.
Le récepteur désensibilisé, bien qu’encore à la surface, est incapable de générer une
signalisation car il a perdu sa capacité à lier une protéine G. La phosphorylation du récepteur et
la fixation de la β-arrestine au niveau de la partie C-terminale sont à l’origine de cette perte de
liaison Récepteur- Protéine G. Des mécanismes de désensibilisation croisée entre RCK ont été
rapportés (Richardson, Pridgen et al. 1998). La phosphorylation peut être induite par trois
protéines kinases différentes :
- PKA ou PKC, activées par les seconds messagers (AMPc, calcium et DAG).
- les GRK.
Concrètement, cette phosphorylation se traduit par le recrutement à la membrane

plasmique d’une protéine cytosolique, la β-arrestine, qui empêche la laision de la protéine G sur
le récepteur et initie la seconde phase d’arrêt du signal : l’internalisation.
Internalisation
Une fois à la membrane, la β-arrestine devient alors un partenaire essentiel de la

machinerie d’endocytose en permettant la formation des puits recouverts de clathrine,
indispensables à l’internalisation du récepteur.
Néanmoins des études suggèrent que le trafic et la signalisation de certains RCK sont
régulés par une voie indépendante de la clathrine (Rose, Foley et al. 2004). Cette voie
impliquerait des radeaux lipidiques ou plus globalement des structures riches en cholestérol
appelées cavéoles, c’est le cas du récepteurs CXCR4. L’équilibre entre les voies
67
d’internalisation par la clathrine ou par les cavéoles dépend du type cellulaire étudié
(Venkatesan, Rose et al. 2003) vs (Signoret, Hewlett et al. 2005).
En outre, un ligand peut avoir une meilleure efficacité d’internalisation d’un récepteur
activé qu’un autre ligand du même récepteur. Ainsi, par exemple, CXCL8 est plus efficace que
CXCL6 pour induire l’internalisation de CXCR2 in vitro alors que l’affinité de liaison est
comparable (Feniger-Barish, Belkin et al. 2000). De la même manière, CCL22 est supérieur à
CCL17 dans sa capacité d’internalisation du CCR4 (Mariani, Lang et al. 2004)
Le récepteur une fois internalisé peut suivre deux voies : soit il est dirigé vers des
endosomes de recyclage, soit il est orienté vers le compartiment lysosomial. Le pH acide des
endosomes de recyclage peut favoriser la dissociation entre le ligand et le récepteur.
Resensibilisation
Une fois le récepteur « vidé » de son ligand, il peut reprendre sa conformation de repos,
être déphosphorylé par des phosphatases spécifiques et être recyclé à la membrane
plasmique : on parle de resensibilisation. Cette resensibilisation permet d’éviter une
désensibilisation prolongée des récepteurs qui aboutirait à l’incapacité pour la cellule de
répondre de manière appropriée à des signaux extracellulaires. En revanche, d’autres
récepteurs sont dirigés vers les lysosomes où ils sont dégradés par des protéases.
D’autres paramètres comme la durée de la stimulation ou la concentration de ligands

jouent un rôle dans la décision de recyclage ou de dégradation. Comme pour l’internalisation,
des chimiokines différentes, liant un même récepteur avec la même affinité, peuvent réguler
inégalement la dynamique du recyclage. Ainsi, la stimulation de CCR3 par CCL11 conduit à
l’augmentation de la dégradation et à une désensibilisation prolongée du récepteur, en
comparaison à la stimulation du même récepteur par CCL5 qui conduit à son recyclage
(Zimmermann, Conkright et al. 1999).
D] Rôles physiologiques des chimiokines et des RCK

Les chimiokines sont des acteurs chimiotactiques indispensables au recrutement des
cellules circulantes au site de l’inflammation. Néanmoins leur spectre d’action ne se limite pas à
cette fonction mais s’étend à des rôles de modulation de la prolifération, de la survie, de la
différenciation et de l’activation cellulaire. Ainsi les chimiokines et leurs récepteurs se retrouvent
impliqués dans de nombreux processus biologiques. En plus de leur implication dans les
mécanismes de défense de l’hôte (Sallusto and Lanzavecchia 2000; Rot and von Andrian 2004),
les chimiokines jouent un rôle important dans l’embryogénèse (Raman, Sobolik-Delmaire et al.
68
2011), l’hématopoïèse (Broxmeyer 2008), la cicatrisation cutanée (Zaja-Milatovic and Richmond

2008) ou encore l’angiogenèse (Kiefer and Siekmann 2011). Par soucis de clarté, nous ne
détaillerons au cours de ce chapitre que les rôles les plus généraux des chimiokines en
physiologie et physiopathologie humaine (Figure II-8).
Figure II-8 : Illustration du rôle des chimiokines au cours de différents processus

physiologiques
Migration leucocytaire en réponse à un gradient de chimiokine (A). Activation des intégrines suite à
l’interaction des leucocytes exprimant les RCK avec les cellules endothéliales sécrétrices de chimiokines
(B). Dégranulation des leucocytes et libération des médiateurs de l’inflammation suite à l’activation de
leurs RCK (C). Illustration des propriétés angiogéniques et angiostatiques des chimiokines et de leurs RCK
(D).
D.1 – Chimiotactisme et Migration cellulaire

Leur rôle chimio-attractant fait des chimiokines des molécules clés du système
immunitaire qui orchestrent finement le trafic leucocytaire et leur recrutement vers le site de
l’inflammation.
D.1.1. – Transmigration endothéliale
Lors d’une réaction inflammatoire, on assiste à un recrutement des leucocytes circulants

vers le tissu en proie à l’inflammation. Ce recrutement des leucocytes à partir du sang vers le
tissu inflammé nécessite le passage à travers la barrière endothéliale, on parle de
transmigration endothéliale. Cette transmigration se produit selon une chronologie précise et est
guidée par un gradient interstitiel de molécules chimiotactiques, dont les chimiokines.
69
On distingue 4 étapes successives (Granger and Kubes 1994; Springer 1994) (Figure II-
8). Lors d’une première étape, on assiste à un ralentissement de certains leucocytes dont les
microvillosités s’enchevêtrent dans celles des cellules endothéliales. Au cours de cette première
étape, les liaisons engagées sont transitoires et réversibles, se traduisant surtout par un
ralentissement des leucocytes puis un roulement dû aux forces hémodynamique de cisaillement
du flux sanguin. Ces liaisons mobilisent essentiellement des sélectines comme principales
molécules d’adhésion. Au niveau du site de l’inflammation, des chimiokines inflammatoires vont
être secrétées par les cellules endothéliales. En interagissant avec leurs récepteurs présent à la
surface des leucocytes, elles induisent, pour certaine comme le CCL2, une augmentation de la
concentration d’intégrines à la surface des leucocytes, ce qui aura pour effet une adhérence
ferme et stable du leucocyte à la surface de l’endothélium et une immobilisation totale. C’est
l’étape d’arrêt. Enfin, on assiste à la traversée de l’endothélium ou diapédèse. Cette dernière
étape semble être contrôlée par les ligands des intégrines PECAM (Platelet Endothelial Cell
Adhesion Molecule), ICAM (InterCellular Adhesion Molecule) et VCAM (Vascular Cell Adhesion
Molecule) exprimés à la surface des cellules leucocytaires.
D.1.2 – Migration interstitielle
Après avoir franchi la barrière endothéliale, les leucocytes poursuivent leur migration à
travers le tissu vers le site de l’inflammation. Un gradient de concentration de chimiokines
permet leur guidage. Ces chimiokines sont secrétées par des cellules immunes activées,
présentes sur le site de l’inflammation. Ces molécules diffusent tout en se fixant à la matrice
extracellulaire par l’intermédiaire des GAG, créant ainsi un gradient de concentration.
D.2 – Hématopoïèse
Les chimiokines interviennent déjà dans le processus de maturation des leucocytes alors
qu’ils ne sont encore que des précurseurs hématopoïétiques contenus dans la moelle osseuse
ou le thymus. En effet, les chimiokines sont de plus en plus reconnues comme régulateur de la
différentiation, de la mobilisation et de la prolifération des cellules souches de la moelle
osseuse. On observe entre autre des profils d’expression des chimiokines et de leurs récepteurs
variables en fonction du stade de maturation du leucocyte. Ces modulations sophistiquées
permettent notamment une relocalisation des précurseurs au sein des différents compartiments
tissulaires pendant les multiples phases de maturation.
70
D.3 – Angiogenèse
L’angiogenèse est, par définition, la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir

de micro-vaisseaux préexistants. Il s’agit d’un processus biologique essentiel au développement
physiologique (organogenèse, embryogenèse,…) mais aussi aux désordres pathologiques
(développement tumoral). Ce processus se déroule en deux étapes : Premièrement, on assiste
à une dégradation de la membrane basale et de la matrice extracellulaire suivie deuxièmement
d’une migration et prolifération de cellules endothéliales. La régulation de l’angiogenèse dépend
d’un équilibre entre molécules angiogéniques et angiostatiques qui, respectivement, favorisent
ou inhibent la néovascularisation.
La famille des chimiokines CXC- est la principale famille dont les membres régulent
l’angiogenèse aussi bien dans le sens d’une stimulation que d’une inhibition. Les chimiokines
agissent sur les deux étapes clés du processus d’angiogenèse (Belperio, Keane et al. 2000). En
modulant la production de metalloprotéases, elles régulent l’étape de dégradation de la matrice
extracellulaire (Park and Wells 2004) alors que leur propriété chimio-attractante leur permet
d’intervenir au cours de la seconde étape, i.e. la migration des cellules endothéliales vers le site
de néovascularisation.
L’activité angiogénique de cette famille de chimiokine CXC- semble être contrôlée par la
présence, chez certains membres de la famille CXC-, du motif ELR (Karagiannis and Popel
2008). Ainsi les chimiokines CXC- contenant le motif ELR (ELR+), tel que le CXCL8 sont
angiogéniques alors que les chimiokines CXC-ELR- sont plutôt angiostatiques (Angiolillo,
Sgadari et al. 1995; Strieter, Polverini et al. 1995; Sgadari, Farber et al. 1997). Toutefois cette
classification n’est pas absolue. En effet, la chimiokine CXCL12 (ELR-) est chimio-attractante
vis-à-vis des cellules endothéliales in vitro et présente des propriétés angiogéniques in vivo
(Salcedo and Oppenheim 2003).
Quelques chimiokines autres que les CXC-chimiokines semblent être impliquées dans ce
processus, c’est notamment le cas de CCL2, qui induit la migration des cellules endothéliales
CCR2+ tout en stimulant la néovascularisation dans différents modèles (Salcedo, Ponce et al.
2000).
D.4 – Initiation de la réponse immunitaire…

Au vu de leur rôle capital dans l’orchestration des mouvements cellulaires, les
chimiokines sont largement impliquées dans la mise en place d’une réponse immunitaire.
71
D.3.1 – …innée
La capacité de l’organisme à répondre rapidement à un agent pathogène, externe ou

interne, par la mise en place d’un mécanisme de défense non-spécifique constitue la première
étape du processus de défense immunitaire qualifié d’innée. Elle repose sur la reconnaissance
par les cellules immunitaires résidantes des tissus (DC, macrophages ou mastocytes) de
signaux de danger ou de motifs pathogéniques (PAMP - Pathogen Associated Molecular
Patterns). La reconnaissance de ces motifs PAMP est possible grâce à la présence de « Toll
Like Receptor » (TLR) ou encore de « Nucleotide-Binding Site Leucine Rich Repeat protein »
(NBS LRR) à la surface de ces cellules, qui s’en trouvent activées. En réponse à cette
activation, elles libèrent dans le milieu extracellulaire de l’histamine et des cytokines
pro-inflammatoires (interleukines, TNF-α ou l’IFN-γ) responsables d’une augmentation de la
sécrétion des chimiokines. L’effet combiné de ces différentes molécules va permettre le
recrutement de cellules circulantes, l’élimination du pathogène et la réparation de la lésion.
D.3.2 – …adaptative
L'immunité adaptative s'ajoute à l'immunité innée et assure une action plus spécifique
contre les agressions de l’organisme. Les principales cellules impliquées dans cette réponse
sont les cellules présentatrices d’antigènes (CPA) et les lymphocytes qui sont activés par la
reconnaissance de l’antigène. Trois types de cellules ont constitutivement des propriétés de
capture et de présentation de l’antigène : les DC, les macrophages et les lymphocytes B.
Néanmoins, les DC sont les plus efficaces et constituent les principaux effecteurs de cette
réponse immunitaire spécifique.
Les DC sentinelles sont dispersées dans la majorité des tissus et se trouvent dans un
état immature. Elles expriment différents RCK tel que le CCR1/2/3/5/6 et CXCR1/2, ce qui les
rend sensibles aux chimiokines et module leur recrutement sur le lieu de lésion où sont
produites les chimiokines. Lors de la capture d’un antigène, ces cellules se différencient en DC
matures. Cette différenciation s’accompagne d’une modulation de l’expression des RCK
présents à la surface. On a ainsi une perte de l’expression des RCK inflammatoires au profit
d’une augmentation de l’expression de CCR7, provoquant la migration des DC vers les
vaisseaux lymphatiques afférents, où elles assurent leurs fonctions de présentatrice d’antigènes
aux lymphocytes T naïfs (Tang and Cyster 1999).
Les chimiokines régulent le trafic lymphocytaire et la localisation des lymphocytes au

sein de ces organes pendant la lymphopoïèse mais également lors des processus
d’immunosurveillance ; CXCL12, CXCL13, CCL19 et CCL21 en sont des exemples. Certaines
72
de ces chimiokines semblent également être indispensables pour la formation de ces organes
(Cyster 1999). L’entrée des lymphocytes naïfs dans les organes lymphoïdes secondaires (rate,
ganglions, plaques de Peyer) a lieu via leur migration à travers les HEVs (High Endothelial
Venules). Les expériences in vitro montrent que les chimiokines exprimées à la surface des
HEV sont requises pour l’adhérence des lymphocytes T à la surface de l’endothélium et
participent activement à l’entrée ou extravasation des lymphocytes du compartiment sanguin
vers les organes lymphoïdes secondaires. Une fois à l’intérieur des organes lymphoïdes, les
lymphocytes T migrent vers les zones T par un processus qui requiert, d’une part, l’expression
de CCR7 à la surface des lymphocytes T et, d’autre part, l’expression de CCL19 et CCL21 à
l’intérieur des zones T par les cellules dendritiques et les macrophages (Cyster 2000).
Les chimiokines et leurs récepteurs permettent ainsi la régulation de la réponse immune

innée comme adaptative (Campbell, Kim et al. 2003; Esche, Stellato et al. 2005) en intervenant
non seulement sur le contrôle du recrutement des leucocytes (Friedl and Weigelin 2008) mais
également sur leur activation et leurs fonctions effectrices (Rossi and Zlotnik 2000; Sallusto and
Lanzavecchia 2000).
E] Physiopathologie des chimiokines et de leurs

récepteurs
Du fait de leurs propriétés multiples et de leur importance dans de nombreux processus
biologiques vitaux, un dérèglement ou un détournement du système chimiokine/RCK est
souvent associé à différents états pathologiques. Ainsi différents couples chimiokine/RCK ont
été impliqués dans diverses pathologies telles que l’asthme et l’allergie (Pease 2006), les
maladies auto-immunes (Godessart and Kunkel 2001), l’athérosclérose (Poupel, Boissonnas et
al. 2013; Wan and Murphy 2013), l’infection par le VIH (Virus de l’Immunodéficience
Humaine)(Evans, Khoury et al. 2012), la douleur (Gao and Ji 2010) ou encore dans le
développement tumoral (Jacquelin, Licata et al. 2013). Nous détaillerons ici l’implication des
chimiokines et de leurs récepteurs dans trois types de pathologies inflammatoires, virales et
tumorales, à l’aide d’un exemple représentatif de chacune.
E.1 – Chimiokines et maladies inflammatoires

Au vu des capacités des chimiokines à orchestrer la réponse immunitaire, il est
relativement aisé de faire le lien entre ces pathologies « inflammatoires » et un
dysfonctionnement du système des chimiokines. En effet, une sécrétion non-contrôlée de
chimiokines peut être à l’origine de la perturbation du recrutement cellulaire. Une perte
d’expression des RCK ou une diminution de la sécrétion des chimiokines ont également pour
73
conséquence la perte des capacités de recrutement des cellules immunitaires sur le site de
lésion et donc perturbe la mise en place d’une réponse immunitaire efficace et appropriée.
Dans certains cas, on assiste à une infiltration leucocytaire au sein d’un tissu sain, suivie
d’une production anormale de chimiokines : la réponse immunitaire est activée de manière
non-appropriée au sein d’un tissu parfaitement sain. C’est le cas dans de nombreuses
pathologies inflammatoires, tel que les rhumatismes, les réactions allergiques (asthme,
dermatite, rhinite allergique), les pathologies auto-immunes comme la sclérose en plaque ou
encore dans certaines pathologies cardiaques, la plus représentative étant l’athérosclérose.
Exemple de l’athérosclérose
L’athérosclérose est une maladie chronique inflammatoire des gros vaisseaux.

L’évolution de cette maladie repose en partie sur une infiltration de leucocytes, principalement
de type monocytaire et lymphocytaire, au sein de la paroi inflammée. Ce recrutement cellulaire
est étroitement associé à l’activité de plusieurs chimiokine et de leurs récepteurs. De
nombreuses études rapportent le rôle central des chimiokines dès les premiers stades de
formation de la plaque d’athérome et qui s’accentue dans la progression de la maladie.
Les toutes premières étapes de l’athérosclérose dépendent pour l’essentiel d’un

phénomène de dysfonctionnement endothélial. Ce phénomène peut avoir plusieurs origines :
l’élévation du taux plasmatique de lipoprotéines de basse densité (LDL), la présence de
radicaux libres générés par la consommation de tabac, l’hypertension artérielle, le diabète, la
présence de microorganismes infectieux ou encore la perturbation du flux sanguin. L’ensemble
de ces facteurs contribue à modifier l’activité des cellules endothéliales qui, d’un état
physiologique non activé, acquièrent un phénotype activé inflammatoire. En réponse à cette
activation, les cellules endothéliales augmentent l’expression de certaines protéines (de surface
ou secrétées) dont les chimiokines, favorisant ainsi le recrutement anormal des leucocytes sur la
paroi vasculaire, étape initiant le développement des plaques d’athérosclérose. Ces chimiokines
sont également impliquées dans l’étape suivante, à savoir la diapédèse des leucocytes, car
l’utilisation d’anticorps neutralisant des chimiokines CCL2 ou CCL5 (Navab, Imes et al. 1991;
Randolph and Furie 1995) réduit de façon considérable la transmigration des leucocytes.
En plus de leur rôle déterminant au cours des stades initiaux de la maladie, les
chimiokines influencent également la progression de l’athérosclérose. C’est notamment le cas
de CCL2. Afin d’illustrer l’effet de cette chimiokine, deux modèles murins
hypercholestérolémiques ont été utilisés :
 les souris ccl2 -/- ldlr -/-, déficientes pour le récepteur au LDL (Gu, Okada et al. 1998)
74
 les souris ccl2 -/- ApoE -/- déficientes en apolipoprotéine E, un transporteur de

cholestérol sanguin (Gosling, Slaymaker et al. 1999) .
Dans ces deux modèles, on observe une diminution de 60-80% de la taille des plaques
d’athérome ainsi qu’une diminution de 55% du contenu de ces plaques en macrophages, par
comparaison avec les souris contrôles, non déficiente en CCL2. L’invalidation du récepteur
CCR2 génère le même type de résultats. A l’image du CCL2, de nombreuses autres
chimiokines, dont le CX3CL1, favorisent le développement de l’athérosclérose. Néanmoins il a
également pu être montré un rôle protecteur du couple CCL5/CCR5. En effet, l’équipe de Ziad
Mallat, montrent que des souris CCR5 -/-, soumise à 12 semaines de régime pro-athérogène
présentent une stabilisation du développement de leur plaque d’athérome, qui contiennent
moins de macrophages que celles des souris contrôles (Zernecke, Liehn et al. 2006).
L’ensemble de ces données confèrent aux chimiokines un intérêt majeur dans la

recherche de nouvelles voies thérapeutiques visant à ralentir, voire à prévenir le développement
de l’athérosclérose.
E.2 – Chimiokines et Infections virales

Il a également été montré que certains agents pathogènes utilisent les RCK exprimés à
la surface des leucocytes pour pénétrer dans la cellule hôte. C’est le cas notamment pour le
Virus de l'immunodéficience humaine (VIH). Il est connu et admis que le virus pénètre dans la
cellule hôte en utilisant les protéines de surface de celle-ci. Dans le cas du VIH, il se lie
principalement à la protéine cellulaire CD4 par l’intermédiaire de la gp120. Mais la présence de
cette protéine n’est pas suffisante à la pénétration du virus dans la cellule hôte. Des
corécepteurs sont nécessaires à la fusion des membranes virales et cellulaires. Parmi ces
corécepteurs, deux RCK sont utilisés de manière alternative par les différentes souches du VIH :
CCR5 et CXCR4. Le premier est nécessaire à l’entrée des souches de VIH infectant les
macrophages alors que le second permet l’infection des lymphocytes T (Alkhatib, Combadiere et
al. 1996; Deng, Liu et al. 1996).
E.3 – Chimiokines et Cancers

Dans nombre de tumeurs solides, le microenvironnement tumoral est riche en
chimiokines. Celles-ci sont sécrétées par les cellules tumorales elles-mêmes ou par les cellules
du stroma tumoral telles que les leucocytes infiltrants, les cellules endothéliales et les
fibroblastes (Lazennec and Richmond 2010). Il a par ailleurs été montré que ces chimiokines
peuvent réguler le développement tumoral (positivement ou négativement) et cela aux différents
stades du développement tumoral (Tableau 2.3).
75
Chimiokine Modèle tumoral Résultats Références
CCL2 Cancer de la prostate  de la croissance et de Zhang et al. 2010

(inhibition) l’angiogenèse tumorale in
vivo
Métastases de cancer du  des métastases et  de la Qian et al. 2011
sein survie des animaux
Cancer des poumons  de la taille des tumeurs et Arenberg et al. 1998 et

de la densité 1996
CXCL5/CXCL8 Mélanome inhibition de la croissance, de Huang et al. 2002 ;
(inhibition) l’invasion et de l’angiogenèse Malnikova et Bar-Eli.
tumorale 2006 ; Zigler et al. 2008
Cancer de la vessie  de la croissance tumorale Mian et al. 2003

CXCL8
Cancer du pancréas  de la croissance et de Shi et al. 1999
(inhibition)
l’angiogenèse tumorale in
vivo
CCL16 Cancer du sein  de la taille des tumeurs et Guiducci et al. 2004

(surexpression) de la formation de métastases
CCL17 Cancer du côlon Régression tumorale Kanagawa et al.2007

(surexpression)
CCL20 Cancer des poumons,  de la taille des tumeurs et  Fushimi et al. 2000
(surexpression) colorectal et mélanome de la survie des animaux
CCL22 Cancer des poumons Régression tumorale Guo et al.2002

(surexpression)
CXCL9/CXCL10 Cancer du sein et Régression tumorale et  de Palmer et al. 2001

(surexpression) fibrosarcome la survie des animaux
CXCL10 Hémangiosarcome inhibition de la progression Giese et al. 2002

(surexpression) métastatique tumorale
Cancer colorectal éradication de 100% des Narvaiza et al. 2000

tumeurs
Myélome Régression de tumeurs Liu et al. 2002

préétablies
CX3CL1 Métastases pulmonaires de inhibition des métastases Richard-Fiardo et al. 2011

(surexpression) cancer colorectal et pulmonaires
d’ostéosarcome
XCL1 Cancer du sein Régression tumorale Emtage et al.1999

(surexpression)
Tableau 2.2 : Exemples d’études précliniques – Cancer et Chimiokine

Ces études réalisées par des équipes différentes illustrent l’implication du système chimiokine
dans desmodèles de cancer. La surexpression de certaines chimiokines au sein de la tumeur à
travers l’utilisation d’adénovirus corrèle avec un effet anti-tumorale. A l’inverse l’inhibition
d’autres chimiokines semblent présenter un effet pro-tumorale, leur inhibition (souris KO)
permet d’inhiber la croissance tumorale.
76
E.3.1 – Rôle des chimiokines sur la croissance et/ou la survie tumorale
Il est clairement admis que les chimiokines et leurs récepteurs agissent sur le
développement tumoral. Leur action peut être directe, par activation de la croissance ou
indirecte, en agissant sur la survie des cellules tumorales. La présence de chimiokines dans le
microenvironnement tumoral peut donc permettre aux cellules tumorales, exprimant leurs RCK
d’engager un processus de croissance de ces cellules (Mukaida and Baba 2012; Verbeke,
Geboes et al. 2012).
Dans ce contexte, les chimiokines les mieux caractérisées sont le CXCL1, CXCL2,
CXCL3 et CXCL8 qui fonctionnent comme des facteurs autocrines de croissance dans divers
cancers (Brew, Erikson et al. 2000; Dhawan and Richmond 2002; Kollmar, Rupertus et al. 2007;
Aldinucci and Colombatti 2014; Muralidhar and Barbolina 2014)
Le rôle pro-tumoral de CXCL12 dans divers cancers a également été démontré par le
blocage de ses récepteurs dans des études précliniques. Cette chimiokine, incriminée dans de
nombreux cancers dont le cancer du sein, des ovaires ou de la prostate, semble être impliquée
à la fois dans la stimulation de la croissance mais également dans la survie.
A l’inverse, il existe des chimiokines anti-tumorales qui exercent leur effet en mobilisant
des cellules immunocompétentes qui participent à la mise en place d’une réponse adaptée de
l’hôte contre le développement tumoral. Ainsi, en 1993, Luster et al. furent les premiers à mettre
en évidence l’impact de l’expression de CXCL10 par les cellules tumorales dans des modèles
de tumeurs mammaires sous-cutanées (Luster and Leder 1993). Par la suite, il a été mis en
évidence que le recrutement des lymphocytes T CXCR3+, par CXCL10, est à l’origine de la
régression spontanée des mélanomes (Wenzel, Henze et al. 2005). De la même manière
CXCL11 augmente la présence des lymphocytes infiltrant la tumeur et inhibe la croissance
tumorale dans les cancers du sein (Hensbergen, Wijnands et al. 2005; Chu, Yang et al. 2007).
E.3.2 – Rôle des chimiokines sur l’angiogenèse tumorale
Afin d’assurer ses besoins en oxygène et en nutriment, le développement tumoral

s’accompagne d’une angiogenèse. Ainsi il n’est pas rare que dans les tumeurs solides, l’action
angiogénique des chimiokine soit détournée par les cellules cancéreuses au profit de la
croissance tumorale (Keeley, Mehrad et al. 2011; Kiefer and Siekmann 2011). Comme décrit
plus haut, dans le paragraphe consacré à l’angiogenèse physiologique, les membres de la sous-
famille CXC- semblent également jouer un rôle crucial dans l’angiogenèse tumorale. Mais ces
chimiokines ne sont pas les seules à être identifiées comme promoteur de l’angiogenèse. La
77
chimiokine CCL2 est particulièrement impliquée dans l’angiogenèse tumorale (Keeley, Mehrad
et al. 2011) où elle induit la migration des cellules endothéliales et la formation des tubes de
migration, suite à l’activation de son récepteur CCR2 (exprimé par les cellules endothéliales)
(Salcedo, Ponce et al. 2000). Deux études distinctes ont montré que les cellules cancéreuses
peuvent produire CCL2 et que l’activation de CCR2 par CCL2 peut impacter directement
l’angiogenèse et la croissance tumorales (Salcedo, Ponce et al. 2000; Stamatovic, Keep et al.
2006). La chimiokine CX3CL1 peut également réguler l’angiogenèse (Imaizumi, Yoshida et al.
2004; Zheng, Yang et al. 2013).
Parallèlement à cet effet direct des chimiokines sur l’angiogenèse, un effet indirect des
chimiokine a été décrit. En effet, une angiogenèse peut également être induite par l’action de
facteurs pro-angiogéniques non chimiokiniques (tels que le VEGF- Vascular endothelial growth
factor) sécrétés par les leucocytes, qui eux ont été recrutés par les chimiokines sécrétées par
les tumeurs (Kiefer and Siekmann 2011). CX3CL1 fait parti de ces chimiokines modulant
l’angiogenèse tumorale de manière indirecte par le biais d’un recrutement macrophagique (Lee,
Choi et al. 2013).
E.3.3 – Rôle des chimiokines dans la dissémination tumorale
La dissémination des cellules tumorales au sein de l’organisme n’est pas un processus

aléatoire mais plutôt un processus contrôlé par des mécanismes spécifiques de la tumeur
d’origine et de l’organe secondaire dans lequel se développent les métastases. En 2001, Müller
et al. ont mis en évidence pour la première fois l’implication des chimiokines dans la
domiciliation organe-spécifique des cellules métastatiques mammaires. Ils ont ainsi montré que
les RCK, CXCR4 et CCR7, sont surexprimés par les cellules tumorales de cancer du sein
(Muller, Homey et al. 2001). Les ligands correspondant à ces récepteurs (respectivement
CXCL12 et CCL21) sont exprimés de manière constitutive dans les organes cibles des
métastases de ces cancers (les ganglions lymphatiques, les poumons, le cerveau, le foie et la
moelle osseuse). Les auteurs ont démontré que ces deux récepteurs jouent un rôle déterminant
dans la domiciliation des cellules tumorales mammaires dans les poumons et dans les ganglions
lymphatiques. Il est maintenant bien établi que le profil d’expression RCK par les cellules
tumorales, associé à la production des ligands correspondants dans les organes, oriente la
progression métastatique. Le nombre et la nature des RCK impliqués dans ce processus
dépendent à la fois de la tumeur d’origine et de l’organe secondaire concerné. Le CXCR4 est le
RCK le plus étudié dans la dissémination des cellules cancéreuses. Il est surexprimé dans plus
de 20 cancers différents (Raman, Sobolik-Delmaire et al. 2011; Zlotnik, Burkhardt et al. 2011)
dont le cancer colorectal (Ottaiano, di Palma et al. 2005). Dans ce dernier, il a été rapporté
78
qu’une forte expression de CXCR4 est associée à la présence de métastases au niveau des
ganglions lymphatiques (Schimanski, Schwald et al. 2005) et au niveau du foie (Kim, Mori et al.
2006), ainsi qu’à une augmentation de la récidive tumorale. Par ailleurs, une expression élevée
de CXCR4 est inversement corrélée à la survie des patients (Yopp, Shia et al. 2012). Le
récepteur CXCR3 semble également impliqué dans la dissémination métastatique de différents
cancers. Ce récepteur exprimé à la surface des cellules tumorales mammaires participe
activement à la mise en place des métastases de ces cancers dans les poumons (Walser, Rifat
et al. 2006).C’est également le cas du CX3CR1 dans le cadre du cancer pulmonaire ou
colorectal (Tableau 2.3).
79
80
81
Introduction – le couple CX3CR1/CX3CL1
III. La chimiokine CX3CL1 et son récepteur le

CX3CR1
L’histoire de ce couple récepteur – ligands commence en 1995, avec la découverte

d’un récepteur CMKBRL1 (CheMoKine β Receptor Like 1), renommé ensuite CX3CR1
(Combadiere, Ahuja et al. 1995). Quelques années plus tard, son ligand est à son tour
identifié, il s’agit d’une chimiokine à la signature cystéique insolite. En effet ses deux cystéines
N-terminales sont espacées de 3 aa d’où son nom : CX3CL1. Encore à l’heure actuelle, elle
demeure l’unique chimiokine de ce type mais également l’unique ligand physiologique connu
de CX3CR1.
Cette chimiokine se révèle être aussi surprenante par sa structure que par ses
fonctions.
A] La chimiokine CX3CL1, une chimiokine un peu

particulière…
A.1 – Structure
CX3CL1, appelée initialement fractalkine, est une chimiokine particulière à plus d’un
titre. La première particularité de CX3CL1 réside dans sa taille et sa localisation cellulaire.
Alors que la séquence peptidique de la plupart des chimiokines dépasse rarement les 100 aa,
celle du CX3CL1 en compte 373, formant une glycoprotéine transmembranaire de 90 kDa,
composée de 4 domaines distincts (Figure III-1):
 Un domaine chimiokine, situé dans la partie N-terminale et constitué de 76 aa, il
contient le motif CX3C. Il s’agit du support de l’activité biologique. La structure
tertiaire de cette région est comparable à celle des chimiokines de type CC- et
CXC-, sa seule particularité étant un noyau central plus compact, lié à
l’espacement des cystéines N-terminales par 3 aa.
 Un tronc mucine de 241 aa constitué de la répétition de 17 motifs de type mucine,
riche en résidus sérine et thréonine hautement glycosylés (glycosylation de type
O). Ce tronc de 26 nm ne semble pas présenter de fonction spécifique en dehors
de la présentation du CX3CL1 à la surface cellulaire (Fong, Erickson et al. 2000;
Haskell, Cleary et al. 2000; Ostuni, Guellec et al. 2014)
 Un segment transmembranaire de 18 aa hydrophobes
 Un court domaine intracellulaire de 37 aa.
82
Figure III-1 : Structures schématiques des deux formes physiologiques du

CX3CL1. Le CX3CL1 est une molécule membranaire composée de 4 régions distinctes, un domaine chimiokine,
un tronc mucine, un domaine transmembranaire et une région cytosolique. Son clivage par des metalloprotéases
induit la libération de la forme soluble contenant le domaine chimiokine et le tronc mucine. Ce tonc mucine est
hautement glycosylé. (Encadré : structure tertiaire du domaine chimiokine).
La seconde particularité du CX3CL1 vient au fait qu’il existe - comme CXCL16 - sous
deux formes physiologiquement actives : une forme native membranaire et une forme soluble.
La forme soluble, chimio-attractante, résulte d’un clivage enzymatique de la forme
membranaire par des metalloprotéases, ADAM-10 et -17 (Garton, Gough et al. 2001; Tsou,
Haskell et al. 2001) au niveau d’un motif dibasique situé en C-terminal. La troisième
particularité de CX3CL1, la plus originale pour une chimiokine réside dans sa capacité, sous
sa forme membranaire, à provoquer une adhésion des cellules circulantes CX3CR1+ et cela
indépendamment des molécules d’adhésion classiques telles que les intégrines ou les
sélectines (Fong, Robinson et al. 1998; Haskell, Cleary et al. 1999).
A.2 – Relation structure – fonctions
A.2.1 – Domaine chimiokine
Il s’agit du domaine responsable de l’activité biologique du CX3CL1. La suppression

totale ou partielle (délétion des 7 premiers aa) de ce domaine chimiokine abolit la liaison au
CX3CR1 et l’ensemble des réponses cellulaires associées (chimiotactisme, adhésion…). Des
expériences de mutations dirigées ont permis de mettre en évidence les aa importants d’un
83
point de vue fonctionnel. Les lysines en position 7, 15, 19, 37 et 47 ainsi que les arginines en
position 38 et 45 apparaissent comme essentielles, leurs mutations en alanine affectent
lourdement, voire supprime, la liaison au récepteur affectant autant les fonctions
chimiotactiques qu’adhésives (Mizoue, Bazan et al. 1999).
A.2.2 – Tronc mucine
L’affinité du CX3CL1 pour son récepteur n’est pas différente selon que le ligand soit
sous forme du domaine chimiokine seul ou sous une forme complète (domaine chimiokine +
tronc mucine). Cette affinité n’est pas modifiée si le tronc mucine est substitué par un tronc
différent, type sélectine. Ainsi le tronc mucine ne semble pas modifier la qualité de la liaison
avec le récepteur et n’affecte pas les propriétés chimiotactiques du ligand. Ce qui n’est pas le
cas des propriétés adhésives. En effet, il a été montré, au travers d’expériences d’adhésion
sous flux, que l’adhésion de cellules CX3CR1+ se faisait plus efficacement lorsque le domaine
chimiokine de CX3CL1 est présenté à l’aide du tronc mucine comparé au domaine chimiokine
seul. De même, il semble que la glycosylation est essentielle pour « rigidifier » le tronc mucine
et permettre au domaine chimiokine de sortir du glycocalyx pour une adhérence plus efficace
(Ostuni, Guellec et al. 2014). Cependant, la seule existence d’un tronc mucine présentant une
chimiokine à la surface d’une cellule ne suffit pas à générer une adhésion. En effet, des
molécules chimères réalisées avec les domaines chimiokines de CCL2, CCL5, CCL4 ou
CXCL8 fusionnés avec le tronc mucine de CX3CL1 ne donne pas lieu à des couples adhésifs
comme observé avec le couple CX3CL1/CX3CR1 (Haskell, Cleary et al. 2000).
A.2.3 – Domaine transmembranaire
En plus de son rôle évident dans l’ancrage membranaire du CX3CL1, il a été démontré
au sein de notre équipe que ce domaine avait un rôle prépondérant dans l’oligomérisation du
CX3CL1 membranaire. En effet, le CX3CL1 sous cette forme membranaire n’est pas
monomérique mais oligomérique. Cette conformation semble indispensable à sa fonction
adhésive. Cependant aucun motif d’oligomérisation classique n’a pu être mis en évidence au
sein du domaine transmembranaire : seule la mutation d’au moins 12 aa de ce domaine en 12
alanine permet l’obtention d’un mutant non adhésif (Hermand, Pincet et al. 2008)
A.2.4 – Domaine intracellulaire
Des études sur le CX3CL1 murin, présentant les mêmes caractéristiques que le
CX3CL1 humain, suggèrent que le domaine intracellulaire n’est pas indispensable aux
fonctions cellulaires associés au CX3CL1 (adhésion, chimiotactisme, diapédèse). Par contre
84
son existence et sa composition sont essentielles au recyclage permanent de la chimiokine

(Kumar, Kremer et al. 2011), ainsi qu’à sa maturation, à son adressage à la membrane, au
son clivage constitutif et à son endocytose (Andrzejewski, Koelsch et al. 2010).
A.3 – Expression du CX3CL1
A.3.1 – Sites de production
Le CX3CL1 est exprimé au niveau de nombreux organes tels que le cœur, le rein, les
poumons, les testicules/ovaires, le cerveau, l’œil, les amygdales, les organes lymphoïdes
secondaires ou encore au sein de l’épithélium cutané. Dans le système nerveux central, cette
chimiokine est produite par les neurones (Clark, Yip et al. 2009). Dans la peau, outre les
cellules endothéliales, les mélanocytes comme les cellules de Langerhans ou les
kératinocytes peuvent être à l’origine de la production de CX3CL1. On rapporte également
une production de CX3CL1 par différents types de tumeurs dont le neuroblastome, le
carcinome hépatocellulaire, le mélanome, les tumeurs colorectales (Marchesi, Locatelli et al.
2010) ou encore les carcinomes épithéliaux ovariens (Gaudin, Nasreddine et al. 2011).
Le CX3CL1 a été initialement découvert sous sa forme membranaire à la surface de

cellules endothéliales humaines de la veine ombilicale (HUVEC) activées par les cytokines
pro-inflammatoires comme le TNF-α ou l’Interleukine-1 (IL-1) (Bazan, Bacon et al. 1997). De
ce fait, le CX3CL1 est d’abord considéré comme chimiokine inductible. Par la suite, son
expression constitutive sera mise en évidence grâce à la détection de l’ARNm et de la
protéine sans pré-activation des cellules. Ainsi le CX3CL1 fait partie de ces chimiokines dont
l’expression est aussi bien inductible que constitutive. Le profil d’expression constitutive ou
inductible du CX3CL1 est résumé dans le tableau (Tableau 3.1).
A.3.2 – Régulation de l’expression
La régulation de l’expression du CX3CL1 se fait à plusieurs niveaux. Comme pour

toutes les autres chimiokines, il existe une régulation de la synthèse au niveau des étapes de
transcription et de traduction de la protéine. Sa structure transmembranaire offre un second
niveau de régulation par le biais d’un contrôle du clivage de la forme membranaire et donc de
la libération de la forme soluble. L’expression du CX3CL1 et son clivage sont généralement
induits par des stimuli pro-inflammatoires qui conduisent à une augmentation simultanée de la
forme membranaire et de la forme soluble. Parmi ces stimuli, on rapporte le LPS, l’IL-1β, le
TNF-α ou encore l’IFN-γ. La néosynthèse du CX3CL1 est induite par ces stimuli pro-
85
inflammatoires via différentes voies de signalisation tels que la signalisation NF-κB (Nuclear
Factor –Kappa B), JAK/STAT ou encore P38/MAPK/ MAPK Kinase (Yang, Mattagajasingh et
al. 2007; Matsumiya, Ota et al. 2010).
Type d’expression
Système Organes Cellules
Inductible/Constitutive
Immunitaire Moelle Osseuse Cellules myéloïdes
Sang Monocytes
Nodule Cellules dendritiques
Lymphoïde Natural Killer
C
Thymus Lymphocytes T
Amygdale (CD4+/CD8+)
Peau Lymphocyte B
Cellules Endothéliales
Cardio-Vasculaire Artères Cellules Musculaires I

lisses
Vaisseaux (par TNF-α / IFN-γ / IL-1,
veineux Cellules endothéliales thrombine)
Artères
coronaires
Cœur ? C
Urinaire Rein Cellules endothéliales I
Cellules Epithéliales (par TNF-α / IFN-γ / IL-1,

thrombine)
Fibroblastes
Digestif Colon ? C
Reproductif Ovaires
? C
Testicules
Cérébral Cerveau Neurones C
Œil Astrocytes I
(Rétine et Iris) Cellules stromales (par par TNF-α / IFN-γ /
IL-1β)
et endothéliales
Tableau 3.1 : Expression du CX3CL1 selon le tissu et le type de cellule.
86
L’augmentation du clivage de CX3CL1 résulte directement d’une stimulation de la

production des metalloprotéases, notamment ADAM-10 (Hundhausen, Schulte et al. 2007).
L’expression membranaire du CX3CL1 est également régulée par son endocytose

constitutive. En effet, comme beaucoup de protéines membranaires, le CX3CL1 est sujet à un
recyclage permanent (Kumar, Kremer et al. 2011). Actuellement, le CX3CL1 est la seule
chimiokine pour laquelle est décrit un mécanisme d’internalisation. Le CX3CL1 internalisé est
alors protégé du clivage par les metalloprotéases et pourra être redirigé vers la membrane
lors d’une inflammation et ainsi augmenter rapidement le nombre de molécules de CX3CL1
présentes à la surface sans passer par une néosynthèse (Huang, Su et al. 2009).
B] CX3CR1
En 1994, Harrison et al. caractérisent chez le rat une molécule transmembranaire de
355 aa : RBS11 qui est couplée aux protéines G et possédant les caractéristiques des RCK
(Harrison, Barber et al. 1994). Un an plus tard, deux groupes distincts identifient, chez
l’Homme, une protéine présentant 80% d’homologie avec RBS11 et plus de 40% d’homologie
avec les récepteurs aux chimiokines de type CCR, ils nomment cette molécule
V28/CMKBRL1 (CheMoKine Beta Receptor Like-1) (Combadiere, Ahuja et al. 1995; Raport,
Schweickart et al. 1995). Ce récepteur reste orphelin jusqu’à ce que l’équipe de Bazan
découvre le CX3CL1 (Bazan, Bacon et al. 1997) qui encore aujourd’hui est le seul ligand
connu de CX3CR1.
B.1 – Structure
Le CX3CR1 humain possède la structure classique des RCK : il s’agit d’un RCPG de
classe IA de 355 aa (Figure III-2). Les études biochimiques de l’interaction récepteur-ligand
ont montré que le CX3CR1 lie le CX3CL1 par son domaine chimiokine, indépendamment de
la présence du tronc mucine. Cette interaction, spécifique et affine, présente une constante de
dissociation à l’équilibre (Kd) comprise entre 30pM et 1nM en fonction du type cellulaire.
Néanmoins, l’affinité du CX3CL1 pour le CX3CR1 est généralement décrite comme moins
bonne que celle des autres chimiokines pour leurs récepteurs exprimés au sein d’un même
type cellulaire. A titre de comparaison, alors que les constantes de dissociation de CCL2 et
CCL5 pour leurs récepteurs respectifs, CCR2 et CCR5, exprimés à la surface de cellules
HEK293 sont de l’ordre de 0.26nM et 0.14nM, celle du couple CX3CL1-CX3CR1 est de
0.74nM (Combadiere, Salzwedel et al. 1998).
87
Seuls les résidus tyrosine 14, aspartate 25 et glutamate 254 semblent être importants
dans la capacité du CX3CR1 à lier le CX3CL1. En effet, toute autre mutation en alanine des
aa du domaine N-terminal ou de la boucle ECL3 n’entraîne aucune perte de liaison du
CX3CL1 au CX3CR1. Cependant, des mutations en alanine des résidus glutamate 13,
aspartate 16 et 266 génèrent des récepteurs variants qui conservent leur capacité de liaison
au CX3CL1, avec une affinité identique à celle du récepteur sauvage, mais qui ne peuvent
plus activer certaines voies de signalisation comme la voie ERK, voire qui n’engendrent plus
de réponse chimiotactique (Chen, Green et al. 2006). Ces résultats sont compatibles avec un
modèle d’interaction récepteur-ligands à deux étapes, classiquement décrit lors de la liaison
d’une chimiokine à son récepteur (cf. Chapitre II -§ C.2)
En dehors des modifications post-traductionnelles communes aux RCPG de famille I

(ponts disulfures, palmitylation, … cf. Chapitre I-§ A.2.1), le domaine N-terminal du CX3CR1
comporte deux sites de sulfatations sur les tyrosines 14 et 22. La désulfatation du récepteur
entraîne une diminution d’un facteur 100 de son affinité pour le CX3CL1 (Fong, Alam et al.
2002).
L’homodimérisation du CX3CR1 a été mise en évidence et étudiée au sein de notre

laboratoire par les techniques de FRET (Darbandi-Tehrani, Hermand et al. 2010). A ce jour
aucune hétérodimérisation n’a été mise en évidence pour ce récepteur.
B.2 – Polymorphisme génétique du CX3CR1

Cinq variants du CX3CR1 humain ont été mis en évidence par la technique de
détection systématique de mutations SSCP (Single Strand Conformational Polymorphism).
Ces variants résultent d’une modification de la région codant les segments
transmembranaires du CX3CR1 (Faure, Meyer et al. 2000). Parmi ces variants, deux sont
particulièrement fréquents dans la population humaine. Ils résultent d’une double substitution,
la première transforme la valine en position 249 en une isoleucine (V249I), alors que la
seconde correspond à la substitution de la thréonine 280 en une méthionine (T280M). Ces
deux mutations sont présentes dans la population caucasienne à une fréquence allélique
respective de 25.5% et de 14%. Elles sont en complet déséquilibre de liaison : la seconde
mutation n’apparaissant que si la première est présente. Ainsi seul 3 haplotypes sur 5 sont
représentés dans la population humaine: V249-T280 (70% de fréquence), I249-T280 (15% de
fréquence) et I249-M280 (13% de fréquence) et 6 génotypes possibles (VV-TT, VI-TT, VI-TM,
II-TT, II-TM et II-MM). Ces deux aa variants (en position 249 et 280) sont situés du côté
extracellulaire du 6ème et 7ème segment transmembranaire ne semblent pas participer pas au
site de liaison du ligand à son récepteur. En effet, leur mutation ne présente aucune
88
conséquence sur ce paramètre. L’existence de ces variants du CX3CR1 a été associée à des
modifications des propriétés fonctionnelles de ce récepteur et particulièrement de la fonction
adhésive du couple CX3CR1/CX3CL1 qui sera détaillée plus loin dans la partie « Fonctions
associées au CX3CR1/CX3CL1 ». Jusqu’ici, les études portant sur une transduction de signal
en aval des différents variants activés par la forme soluble, (étude des signaux calciques et
des voies MAPK) n’ont montré aucune différence (Daoudi, Lavergne et al. 2004); (Lavergne,
Combadiere et al. 2004; Davis and Harrison 2006). Par contre, l’existence de ces variants
impacte l’épidémiologie associée à ce couple CX3CL1/CX3CR1. Les conséquences de ce
polymorphisme seront développées dans la partie consacrée aux rôles physiopathologiques
de ce couple, avec notamment l’implication différentielle des variants au cours de l’évolution
du VIH, de la DMLA ou encore des pathologies cardiovasculaires (Tableau 3.2).
Figure III-2 : Représentation schématique des variants génétiques du CX3CR1

A- Positions des deux substitutions (V 249 I et T 280 M) à l’origine du polymorphisme génétique du CX3CR1
B- Combinaisons haplotypiques possibles et fréquences des génotypes dans la population caucasienne
(d’après Faure et al. 2000)
B.3 – Expression du CX3CR1
Chez l’Homme, le CX3CR1 est principalement exprimé à la surface de cellules issus

des cellules souches hématopoïétiques parmi lesquelles les monocytes, les cellules
microgliales, les NK CD56dimCD16+ ainsi que sur certaines sous populations de lymphocytes.
Au sein même de ces différentes populations, son niveau d’expression est variable, générant
des sous-populations selon ce nouveau critère.
B.3.1 – Les monocytes

Plusieurs études indiquent que les monocytes du sang sont constitués de plusieurs
sous-populations cellulaires, qui diffèrent par leur taille, leur morphologie nucléaire, leur
89
granularité, leur fonction, leurs antigènes de surface (plus particulièrement CD16 et CD14) ou
encore leur profil d’expression des RCK (CCR2 et CX3CR1). Chez l’Homme comme chez la
souris, deux sous-populations principales ont été décrites : les monocytes « classiques » et
les monocytes « non-classiques » (Figure III-3) (Geissmann, Jung et al. 2003; Anbazhagan,
Duroux-Richard et al. 2014). Une troisième sous population qualifiée d’intermédiaire est
également évoquée dans la bibliographie, mais reste controversée. Aussi par soucis de
simplicité, nous nous limitons ici à la description des deux sous-populations majeures.
Les monocytes « classiques », également connus sous le nom de monocytes

inflammatoires, représentent 85-90% des monocytes circulants chez un individu sain. Cette
catégorie de monocyte, CD14+CD16-, expriment un fort niveau de CCR2 et un faible niveau
de CX3CR1. Chez la souris, ces monocytes sont caractérisés par l'expression d’un fort niveau
de Ly6C, de CCR2 et de L-sélectine (CD62L). Le CX3CR1 est faiblement exprimé à la surface
de cette sous-population. Ces monocytes présentent une forte activité phagocytaire.
Effet Protecteur du variant IM Effet néfaste du variant IM
Pathologie Références Pathologie Références
Lavergne,E. 2005 Infarctus cérébral Lavergne,E. 2005

Infarctus du myocarde
Maladie coronariennes Moatti,D.2001/ DMLA Chan,C.C. 2005 /
Apostolakis,S. 2007 Comabdière,C. 2007
Maladie occlusive de Ghilardi,G. 2004 Vasculite rétinienne Wallace,G.R. 2006
l’artère coronaire
interne
Athérosclérose McDermott,D.H. 2011/
Maladie de Crohn Brand,S. 2006 /
Nassar,B.A. 2008
Athérosclérose après Binion,D.G. 2006 /
VIH Coll,B. 2007 Sabate,J.M. 2008
Sclérose systémique Marasini,B. 2005

Douleurs Combadière,C. 2008
Asthme Tremblay,K. 2006
neuropathiques
Pneumoconiose Nadif,R. 2006
VIH Faure,S. 2000 et 2003/
McDermott, D.H. 2000/
Hendel,H. 2001
Rejet de transplantation Simeoni,E. 2005
Fibrose hépatique Wasmuth, H.E. 2008
cardiaque
Atopie allergique Depner,M. 2007
Virus respiratoire Amantidou,V. 2006
syncytial
Tableau 3.2 : Impact du polymorphisme de CX3CR1 dans différentes pathologies
La sous population de monocytes dite « non-classique » ne représente que 10-15% de

la population monocytaire totale chez l’Homme. Ils ont une fonction de « patrouilleurs »
90
(Kumar, Tripathi et al. 2012). Selon certains auteurs, cette sous population dériverait de la
première. Chez la souris, ces cellules sont caractérisées par une expression faible de Ly6C et
CCR2 mais un haut niveau d'expression de CX3CR1. Chez les humains, les monocytes non
classiques sont CD14low CD16+ CCR2low CX3CR1hi.
Figure III-3 : Représentation schématique des deux principales sous-populations de

monocytes chez l'humain et la souris (d’après Shen and al.2004).
Deux sous-populations monocytaires majeures sont décrites aussi bien chez l’Homme que chez la souris : les
+ - + -
monocytes « classiques » (CX3CR1 /CCR2 /CD14 chez l’Homme ou Ly6C chez la souris) et les monocytes
- + + +
« non classiques » (CX3CR1 /CCR2 /CD16 ou Ly6C ).
B.3.2 – Les lymphocytes
Le CX3CR1 est exprimé à la surface de plus de 14% de lymphocytes T mais rarement

exprimé par les lymphocytes B. Parmi la population des T, les T CD8+ décrits comme des
cellules mémoires activées, l’expriment à hauteur de 30-40% contre 5-10% pour les T CD4+.
Plus généralement, la majorité des lymphocytes CX3CR1+ possèdent des granules
cytoplasmiques contenant la perforine ou le granzyme B, ce qui suggère que le CX3CR1
91
pourrait être considéré comme un marqueur de surface supplémentaire des lymphocytes

cytotoxiques.
B.3.3 – Les autres cellules CX3CR1+
Le CX3CR1 et son ligand CX3CL1 sont exprimés à la surface des DC, matures
comme immatures. Les formes matures présentent un niveau d’expression plus important que
les formes immatures (Liu, Lu et al. 2011), laissant penser à un mécanisme d’activation et/ou
de régulation autocrine.
Parmi les cellules myéloïdes exprimant le CX3CR1, autres que celles citées plus haut,
on retrouve les plaquettes, les neutrophiles ou encore les mastocytes.
Néanmoins, d’autres types cellulaires, non myéloïdes expriment ce récepteur. En effet

des souris déficientes pour ce récepteur, en plus de troubles liés à un défaut de migration et
de recrutement leucocytaire, présentent une malformation des connexions neuro-gliales
(Jung, Aliberti et al. 2000). Ces observations suggèrent une expression cérébrale du
CX3CR1. Parmi les cellules du système nerveux central exprimant le CX3CR1, on trouve les
cellules microgliales et les astrocytes mais également certains types neuronaux dont les
dopaminergiques.
Le CX3CR1 est également présent à la surface des cellules musculaires lisses (Lucas,
Bursill et al. 2003).
B.3.4 – Régulation de l’expression du CX3CR1
A l’image de celle du CX3CL1, l’expression du CX3CR1 est sujette à une régulation

complexe spécifique à chaque type cellulaire. Globalement une augmentation du niveau de
l’expression du CX3CR1 est synonyme d’inflammation et est associée à l’augmentation dans
le milieu de facteurs cytotoxiques tel que les interleukines ou les cytokines. A titre d’exemple,
dans le système nerveux central, certains stimuli pro-inflammatoires, tel que TGF-β,
augmentent le niveau d’expression du CX3CR1 en activant la production d’ARNm et la
production protéique du CX3CR1. Cependant, alors que cette observation est vraie dans les
cellules microgliales, il a été démontré que le TNF-β n’a aucun effet sur l’expression du
CX3CR1 dans les astrocytes (Chen, Luo et al. 2002; Daoudi, Lavergne et al. 2004).
La modulation de l’expression du CX3CR1 n’implique pas forcement une modulation

du niveau de transcription et de traduction de la protéine. En effet, dans les monocytes, il
semble que le CCL2 stimule le niveau d’expression du CX3CR1, sans moduler la transcription
92
ni la traduction mais en libérant du CX3CR1 pré-synthétisé et contenu dans le cytoplasme

cellulaire (Green, Han et al. 2006).
B.4– Transduction du signal en aval du CX3CR1
Comme pour tous les RCK, la liaison du CX3CL1 au CX3CR1 est à l’origine de
l’activation de plusieurs cascades de signalisation parallèles (Figure III-4). Le CX3CR1 est,
comme tous les RCK, un RCPG couplé à une protéine Gαi. Certaines des voies de
signalisation en aval de CX3CR1 impliquent l’activation de la protéine Gαi alors que d’autres
voies en sont indépendantes. Plusieurs signaux ont été étudiés en aval du CX3CR1 activé par
la forme soluble de son ligand, d’autres sont admis sans avoir été caractérisés, faute d’outils
performants, c’est le cas notamment du signal AMPc qui fait l’objet de ma thèse. Dans cette
partie seront présentés les signaux cellulaires et voies de signalisation décrites en aval du
CX3CR1 avant ce travail de thèse.
B.4.1 – Signal Calcique
Comme en aval de tous les RCK, l’activation du CX3CR1 par addition de son ligand
soluble la chimiokine CX3CL1 déclenche une augmentation, rapide et transitoire (durée
<1min), de calcium par activation de la voie IP3 (Imai et al. 1997). L’existence et l’amplitude
de cette réponse dépendent toutefois du type cellulaire. En effet dans l’étude réalisée par
l’équipe d’Imai en 1997, cette réponse présente dans les K-562 (cellules pré-érythrocytaires)
n’est pas retrouvée dans la lignée Raji (lymphoblast-like cells) transfectées avec du CX3CR1.
Dans les K-562, le signal calcique peut être supprimé soit à la suite de la mutation du motif
DRY, réputé comme participant à la liaison protéine G-récepteurs (Haskell, Cleary et al. 1999;
Haskell, Cleary et al. 2000; Schwarz, Pruessmeyer et al. 2010) soit après un traitement à la
PTX, ce qui suggère l’implication de la protéine Gi. De manière intéressante, Harrison et al.
Mettent en évidence une signalisation calcique différentielle en fonction d’une activation du
récepteur par la forme soluble ou par la forme membranaire du ligand semble pas induire une
signalisation calcique différente (Harrison, Jiang et al. 1998). Selon leur étude, réalisée sur
des cellules microgliales de rat exprimant le CX3CR1, seule la forme membranaire de
CX3CL1 induit une réponse calcique en aval de CX3CR1. Ce résultat contraste nettement
avec les données de la littérature citée plus haut et n’a pas été confirmée par les expériences
réalisées au laboratoire. L’étude du signal calcique en aval des RCK sur cellule unique, par
les techniques classiques telles que le Fura-2, n’ont pas permis l’étude de la réponse en aval
de CX3CR1, qui contrairement au autres couples récepteur/chimiokine présente une réponse
d’amplitude très faible et donc difficilement étudiable quand elle est présente. C’est
93
principalement pour cette raison que nous avons cherché une autre voie de signalisation qui
nous permette d’étudier les différences potentielles de signalisation en fonction de la forme de
CX3CL1 activant le récepteur.
Figure III-4 : Représentation des principales voies de signalisation connues induites en

aval du CX3CR1.
Une multitude de voies de signalisation sont activées en aval du CX3CR1. Loin d’être exclusives, elles peuvent
être activées simultanément. On distingue deux grandes familles, les voies de signalisation impliquant l’activation
préalable de la protéine G ou indépendantes de cette dernière.
B.4.2 – La voie AMP cyclique
La fonction primaire d’une protéine G et plus particulièrement de type Gi, est de

moduler l’activité de l’AC, responsable de la production d’AMPc intracellulaire. Bien que cette
voie est admise d’un point de vue théorique en aval du CX3CR1 car observée en aval
d’autres RCK (Nardelli, Tiffany et al. 1999) dont le CCR1, elle n’a pas été explicitée en aval de
94
CX3CR1. L’étude et la caractérisation de ce signal, représentant le principal objectif de ce

travail de thèse, seront présentées dans la seconde partie du manuscrit.
B.4.3 – Interaction entre les voies de transduction calcique et AMPc
De nombreux ligands des cellules immunes influencent aussi bien le calcium

intracellulaire que le niveau d’AMPc. Il est clair par ailleurs que de nombreux effecteurs de la
voie AMPc sont sensibles à la concentration de calcium intracellulaire, à commencer par les
AC (Tableau1.2). L’interaction entre les deux voies de transduction est bien documentée dans
le système nerveux central, où, par exemple, leur coordination par calmoduline interposée
permet la sécrétion d’insuline ou la génération de « potentiation à long terme » (Willoughby,
Halls et al. 2012; Averaimo and Nicol 2014). Par contre, cette coordination est beaucoup
moins étudiée dans les cellules immunes, à l’exception du travail de C.Randriamampita
(Conche, Boulla et al. 2009) montrant qu’une augmentation transitoire d’AMPc induit la
potentiation de l’activation des lymphocytes T et en particulier de la réponse calcique. Pour ce
qui est de la signalisation chimiokinergique, les quelques études qui se sont intéressées à la
question des interactions entre les deux voies concluent plutôt à un découplage. En effet, une
étude moléculaire détaillée sur le CCR2 a montré qu’il était possible de trouver des mutants
du récepteur et/ou de la chimiokine qui activent la voie calcique sans activer la voie AMPc,
d’autres qui activent la voie AMPc sans activer la voie calcique et que ces deux voies peuvent
être activées alors que la fonction chimiotactique est inhibée (Jarnagin, Grunberger et al.
1999). La question de la coordination éventuelle dans les cellules immunes entre
l’immunomodulateur qu’est l’AMPc et l’activateur des fonctions secrétoires qu’est le calcium
intracellulaire reste donc entière.
B.4.4 – Voie des MAP-Kinases
Parallèlement à la voie calcique, qui représente la voie de signalisation la plus étudiée

en aval du CX3CR1 et plus globalement des RCK, il existe une multitude d’autre voies. Ces
voies passent par l’activation des tyrosines kinases de la famille Src/Syk et des MAPK. Elles
sont responsables de la modulation de nombreux facteurs de transcription tel que le NF-κB.
Ces voies aboutissent à la stimulation de la prolifération des cellules et à leur différentiation
(Garcia, Xia et al. 2000; Cambien, Pomeranz et al. 2001; Cotter, Williams et al. 2002). Cinq de
ces voies ont bien été caractérisées en aval du CX3CR1:
 Syk/ERK1/2  Dans la lignée monocytaire MonoMAC6 stimulée avec CX3CL1, on
observe une phosphorylation rapide (<1min) et transitoire (>5min) de la protéine
95
p72-Syk ainsi qu’une phosphorylation de ERK plus tardive (10min) mais

persistante (>1h) (Cambien, Pomeranz et al. 2001)
 Src/P-38/MAPK  Dans les même cellules (MonoMAC6), une seconde série de
phosphorylation est rapportée, portant sur la protéine kinase Src ainsi que sur la p-
38 avec des cinétiques là encore différentielles (Cambien, Pomeranz et al. 2001).
 JNK  Toujours dans les MonoMac6, une phosphorylation à long term (6h) de
JNK1 est observée (Cambien, Pomeranz et al. 2001).
 PI3K et sa cible PKB Dans des CHO-CX3CR1, l’addition de CX3CL1 induit une
phosphorylation rapide et transitoire de la protéine PKB (pic à 5min) (Kansra,
Groves et al. 2001)
 PKB/NF-κB (Meucci, Fatatis et al. 2000)
Les cinétiques de ces phosphorylations sont toutefois très dépendantes du type

cellulaire utilisé. A titre d’exemple, la phosphorylation de PKB est transitoire dans les CHO
(5min) alors qu’elle persiste dans les neurones ou les HEK-CX3CR1, pendant respectivement
15 et 45min (Harrison, Jiang et al. 1998).
Certaines de ces voies sont inhibées après traitement des cellules par la PTX et/ou la
CTX, alors que d’autres sont insensibles à ces traitements. Cela suggère l’existence de voies
de signalisation indépendantes des protéines Gi et Gs, passant par d’autres protéines G
comme les G12 ou G13 ou des voies indépendantes de toutes protéines G (cf. Chapitre I -
§ D.2).
C] Fonctions associées aux couples CX3CR1/CX3CL1

Comme toutes les chimiokines, le CX3CL1 soluble présente des propriétés
chimio-attractantes essentielles au routage des cellules immunes. Il est donc capable de
recruter sur son lieu de production les cellules exprimant le CX3CR1, parmi lesquelles les
monocytes, les macrophages, la microglie, les cellules dendritiques ou encore certains
lymphocytes. Une fois recrutées, ces cellules traversent la barrière endothéliale et pénètrent
le tissu inflammé. Cette étape de transmigration est également orchestrée par le CX3CL1,
mais sous sa forme membranaire cette fois. En effet, sous cette forme, le ligand agit comme
une véritable molécule d’adhésion, capable d’arrêter les cellules CX3CR1+ circulantes et
d’amorcer leur transmigration (Figure III-5).
96
C.1– Chimiotactisme
Dès la découverte de la chimiokine CX3CL1, plusieurs équipes indépendantes

montrent que le surnageant de cellules HEK293 (Human Embryonic Kidney) transfectées par
le CX3CL1 est capable d’induire le chimiotactisme de monocytes et de lymphocytes T (Bazan,
Bacon et al. 1997; Imai, Hieshima et al. 1997). Plus généralement, le CX3CL1 soluble induit la
migration transendothéliale de leucocytes ou encore de cellules non-hématopoïétiques
exprimant le CX3CR1, avec un effet maximal à une concentration de 1nM (Imai, Hieshima et
al. 1997; Chapman, Moores et al. 2000). Dans le système nerveux central, il est intéressant
de remarquer que les propriétés chimio-attractantes du CX3CL1 ne s’exercent pas sur
l’ensemble des cellules CX3CR1+. En effet, alors que les cellules gliales répondent à
l’attraction chimiotactique de CX3CL1, les astrocytes, malgré l’expression de CX3CR1 à leur
surface, ne sont pas « attirés » par le CX3CL1. Pourtant dans les deux types cellulaires, une
réponse calcique à CX3CL1 a été observée. Cette donnée confirme l’existence d’une
multitude de voie de signalisation en aval du récepteur activé par son ligand et que le
chimiotactisme ne semble pas être lié à la signalisation calcique mais plutôt à la voie de
signalisation ERK1/2 et Syk (Gevrey, Isaac et al. 2005).
Il a également été décrit une synergie entre les différents couples chimiokine/récepteur
en vue d’améliorer le chimiotactisme global. Par exemple, le CX3CL1 semble augmenter
l’expression de CCL2 sur les monocytes, ce qui tend à améliorer le recrutement des
monocytes sur le site de l’inflammation (Popovic, Laumonnier et al. 2008).
C.2- Adhésion cellulaire
C’est à l’occasion de l’identification du ligand de CX3CR1 que la fonction adhésive au

couple CX3CL1/CX3CR1 a été mise en évidence. En effet une adhésion spécifique de
différentes populations cellulaires CX3CR1+ (monocyte, lymphocytes T et neutrophiles) sur
des cellules HEK293 exprimant de manière stable le CX3CL1 a été observée (Bazan, Bacon
et al. 1997). Cette adhésion CX3CL1/CX3CR1 observée en adhésion statique (Imai, Hieshima
et al. 1997) a ensuite été validée dans des conditions dynamiques, c'est-à-dire avec des
cellules soumises à un flux (Fong, Robinson et al. 1998).
97
Figure III-5 : Coordination de l’action de la chimiokine soluble et membranaire lors du

processus de recrutement leucocytaire.
+
Suite à un recrutement des cellules leucocytaires CX3CR1 contrôlé par un gradient de CX3CL1 soluble, la forme
membranaire de la chimiokine permet un arrêt du leucocyte sur les cellules endothéliales. La liaison entre le
récepteur et la chimiokine induit une activation des systèmes intégrines à l’origine d’une adhésion ferme du
leucocyte, nécessaire avant l’étape de transmigration.
Il est essentiel de noter que, du fait de la spécificité structurale du ligand, deux types
d’adhésion cellulaires peuvent être associées à ce couple. La première est commune à
l’ensemble des RCK et met en jeu les molécules d’adhésion classiques comme les intégrines
(Figure III-6). Elle est conséquente à l’activation des intégrines en réponse à presque tous les
RCK activés par leurs ligands. Le second type d’adhésion, qualifié d’intrinsèque ou de
spécifique, est lié à l’existence de la forme membranaire qui agit comme une véritable
molécule d’adhésion suffisante pour immobiliser les cellules exprimant le récepteur (Figure III-
6). Cette seconde adhésion n’est possible que pour deux couples : CX3CL1/CX3CR1 et
CXCL16/CXCR6. Les chimiokines solubles sont donc associées à une adhésion cellulaire par
activation du système intégrine alors que les chimiokines présentant une forme membranaire
activent les deux types d’adhésion.
98
C.2.1 – induite par la forme soluble
L’activation du CX3CR1 par son ligand soluble s’accompagne d’une augmentation de

l’avidité des intégrines pour leurs ligands, ce qui conduit à une potentialisation de l’adhésion
cellulaire comparé à un système pris individuellement (Figure III-6) (Umehara, Bloom et al.
2001). Parmi les systèmes intégrines couramment modulés par le CX3CL1, plusieurs études
rapportent une augmentation de l’adhérence passant par les intégrine α4β2 (ou MAC-1) ou
α4β7 (ou LPAM-1) (Haskell, Cleary et al. 1999; Goda, Imai et al. 2000; Kerfoot, Lord et al.
2003). Le détail de la signalisation conduisant à cette « suradhérence » par modulation du
système intégrine est encore mal connu. Toutefois certaines études suggèrent l’implication de
plusieurs voies de signalisation dont les voies syk/ERK, Src/p-38/MAPK et PI3K.
C.2.2 – induite par la forme membranaire
L’adhésion induite par la forme membranaire du ligand semble quant à elle

indépendante de toute signalisation et ne semble n’être qu’un processus mécanique reposant
sur l’affinité du ligand pour son récepteur. En effet, la mutation du motif DRY au niveau du
récepteur, supposé impliqué dans la liaison du récepteur avec la protéine G, n’altère pas cette
adhésion CX3CR1/CX3CL1 membranaire (Haskell, Cleary et al. 1999). De même que le
signal calcique ne semble pas moduler cette réponse (Imai, Hieshima et al. 1997). Seule
l’utilisation d’anticorps bloquants anti-CX3CR1 (Imaizumi, Matsumiya et al. 2000) ou la pré-
incubation des cellules CX3CR1+ avec la forme soluble du CX3CL1 (Goda, Imai et al. 2000)
permettent d’abolir cette adhésion. Sous flux, l’adhésion de monocytes sur des cellules
CX3CL1+, est observable sous des forces de cisaillement égales à 1.85 dyne/cm2,
comparable aux valeurs rencontrées dans la circulation veineuse (Fong, Robinson et al. 1998;
Haskell, Cleary et al. 1999; Daoudi, Lavergne et al. 2004). Cette adhésion décroît à des forces
de cisaillement égale à 10 dynes/cm², correspondant à des débits artériels (Kerfoot, Lord et al.
2003). La capture est rapide, les cellules CX3CR1+ s’immobilisent en 60 ms sur les cellules
CX3CL1+ alors qu’il leur faut en moyenne 190 ms pour adhérer via les systèmes intégrines
(Haskell, Cleary et al. 1999). Cette adhésion est également très solide, puisque une fois
adhérée, même soumise à un flux plus important (>15 dynes/cm²), les cellules CX3CR1+ ne
se détachent pas ou peu.
99
Figure III-6 : Trois configurations d’adhérence cellulaire induite par le système intégrine
et ou le couple CX3CR1/CX3CL1 sur des cellules endothéliales.
A- Adhésion cellulaire impliquant uniquement le système intégrine activé à la suite d’une libération
dans le milieu extracellulaire de chimiokine soluble (CX3CL1, CCL2, …) et dont les récepteurs
respectifs se trouvent à la surface de la cellule « à adhérer»
B- Adhésion cellulaire induite par la liaison du CX3CL1 membranaire situé à la surface de la
cellule endothéliale et de son récepteur le CX3CR1 exprimé sur la cellule cible.
C- Adhésion cellulaire synergique entre les deux systèmes précédents ; la liaison du CX3CL1
membranaire à son récepteur induit une activation du système d’adhésion intégrine dépendant.
C.2.3 – Corrélations fonctionnelles du polymorphisme génétique du CX3CR1
Il a été démontré au sein de notre équipe que la propriété adhésive du couple

CX3CL1/CX3CR1 est différente selon le variant du récepteur. Des expériences d’adhésion
sous flux ont permis de mettre en évidence une adhésion des cellules exprimant le variant
CX3CR1-IM, sur le CX3CL1 membranaire, supérieure à celle observée sur les mêmes
cellules exprimant le variant VT. Cette « sur-adhérence » est PTX sensible et corrèle avec
une augmentation de la force d’adhérence entre les cellules CX3CR1-IM et le CX3CL1
membranaire (expériences de micromanipulations à deux pipettes) (Daoudi, Lavergne et al.
2004). Ces résultats contrastent avec ceux obtenus par une équipe américaine (McDermott,
Fong et al. 2003). Pour cette équipe, le variant IM serait un récepteur déficient qui lierait
moins bien le CX3CL1 et serait corrélé avec une réponse calcique, un chimiotactisme et une
100
adhérence sur CX3CL1 membranaire moins efficaces comparé au variant VT. La raison de
ces résultats contradictoires reste encore à ce jour inconnue.
D] Physiologie du couple CX3CR1/CX3CL1

Le couple CX3CR1/CX3CL1 joue un rôle dans de nombreux processus biologiques
dont la plupart sont aussi dépendants d’autres chimiokines et que nous avons décrits au cours
du chapitre II (§ D). Nous expliciterons ici uniquement ceux dans lesquels le couple
CX3CR1/CX3CL1 a un rôle central (Figure III-7).
D.1- Prolifération, différentiation et survie des cellules

Exemple des cellules musculaires lisses
Les cellules musculaires lisses (CML) humaines présentes au niveau des artères
expriment le CX3CR1 et semblent être soumises au chimiotactisme CX3CL1 dépendant
(Lucas, Bursill et al. 2003). Il a également été montré que le CX3CL1 exerçait un effet anti-
apoptotique au sein de ces cellules tout en favorisant leur prolifération. Cette action du
CX3CL1 passe par l’activation de la voie ERK1/2 en aval du CX3CR1 (White, Tan et al.
2010). Parallèlement, il a été démontré que le CX3CR1 était présent à la surface des
progéniteurs de CML, des cellules mononuclées myéloïdes, qui peuvent être mobilisées et
différentiées en CML à l’occasion d’une réparation post lésionnelle (Kumar, Metharom et al.
2010). Enfin, les CML sont capables aussi d’exprimer le CX3CL1 (Ollivier, Faure et al. 2003):
l’action de cette chimiokine peut donc être autocrine.
D.2- Ostéoclastogenèse
Le tissu osseux est composé de cellules et d’une matrice extracellulaire qui, dans ce
cas précis, est minéralisée. Il se renouvelle grâce à ses deux composantes cellulaires, à
savoir les ostéoclastes qui dégradent la matrice osseuse et les ostéoblastes qui la
reconstruisent. Ces deux types cellulaires ne se trouvent pas au même endroit. Alors que les
ostéoblastes sont à la surface du tissu osseux, les ostéoblastes eux se trouvent dans les
cavités creusées dans l’os, le long des travées osseuses (appelées lacunes de Howship). Des
études récentes mettent en évidence un rôle central du couple CX3CR1/CX3CL1 dans le
processus d’ostéoclastogenèse. En effet, il avait été montré en 2009, que les ostéoclastes
expriment le CX3CR1 à leur surface et peuvent être recrutés en réponse à une sécrétion de
101
Figure III-7 : Principaux rôles physiologiques de l’axe CX3CL1/CX3CR1
102
CX3CL1 par les ostéoblastes (Koizumi, Saitoh et al. 2009). La forme membranaire du ligand
contribue à leur adhésion. Une étude récente confirme cette observation et montre que la
modulation du niveau d’expression du CX3CL1 permet de réguler l’ostéoclastogenèse (Han,
Ryu et al. 2014). Dans cette étude, l’utilisation d’une souris déficiente pour le CX3CR1 ou
traitée avec un anticorps bloquant anti-CX3CR1 favorise la reconstruction osseuse et prévient
la résorption osseuse associée à l’irradiation des souris.
D.3- Réponses inflammatoire et immunitaire
L’augmentation de l’expression du CX3CL1 sur l’endothélium vasculaire constitue un

signal d’alarme qui se traduit par le recrutement massif et spécifique des sous-populations
leucocytaires exprimant le CX3CR1 (lymphocytes T cytotoxiques, Natural Killer,
monocytes,…). Une fois recrutées, ces cellules sont vouées à envahir le tissu inflammé et
doivent pour cela franchir la barrière endothéliale. Cette transmigration cellulaire est
orchestrée par la seconde forme du CX3CL1, la forme membranaire. Cette forme permet
dans un premier temps l’arrêt des cellules, puis leur diapédèse (Figure III-8) (Ancuta, Rao et
al. 2003). Toutefois le rôle de cette forme membranaire ne semble pas se limiter à une
fonction adhésive. En effet, elle est également capable d’induire une réponse cytotoxique
dans les cellules recrutées. Les travaux de Nishimura et collaborateurs mettent bien en
évidence cette action du CX3CL1 sur les NK (Nishimura, Umehara et al. 2002). Ils montrent
que le CX3CL1 membranaire en plus d’être capable d’arrêter les NK au niveau du site de
l’inflammation, d’activer ces cellules en provoquant leur dégranulation, ce qui à son tour est
responsable d’un endommagement de l’endothélium. Parallèlement, on assiste à la sécrétion
d’IFN-γ par les cellules infiltrées et donc a une activation des cellules endothéliales qui vont
alors sécréter des chimiokines inflammatoires et surexprimer le CX3CL1 (Figure III-8). Cette
surproduction de chimiokines à partir du compartiment sous-endothéliale contrôle le
chimiotactisme et l’infiltration d’un surcroît de cellules immunes. Cette boucle paracrine
permet de cette façon un maintien de la réponse immune et inflammatoire (Umehara, Bloom
et al. 2004). La persistance excessive de cette réponse inflammatoire est souvent mise en
cause dans de nombreuses pathologies chroniques telles que l’athérosclérose.
103
Figure III-8 : Boucle paracrine

Suite à son recrutement sous-endothélial (chimiotactisme et adhérence) hautement contrôlé par la chimiokine
CX3CL1, le leucocyte sécrète des médiateurs de l’inflammation, tels que l’IFN-γ et le TNF-α. Ces cytokines
inflammatoires stimulent l’expression de CX3CL1 par les cellules endothéliales et contribuent au renforcement du
recrutement leucocytaire.
D.4- Rôle physiologique dans le système nerveux central

CX3CL1, « signal off » de l’activation microgliale
CX3CL1 est une des chimiokines constitutivement exprimée à des niveaux élevés
dans le système nerveux central. C’est d’ailleurs à partir de cellules endothéliales activées et
de neurones qu’elle a été clonée (Bazan, Bacon et al. 1997). CX3CL1 et son récepteur jouent
un rôle important dans la communication neurone-microglie. Alors que le CX3CL1 est présent
à la surface des neurones, le CX3CR1 est exprimé par les cellules de la lignée myéloide dont
les cellules microgliales (Harrison, Jiang et al. 1998); (Hughes, Botham et al. 2002) ;(Lindia,
McGowan et al. 2005). Cependant, CX3CL1 est également exprimé à la surface des
astrocytes (Mizuno, Kawanokuchi et al. 2003), tandis que quelques études montrent
l’expression neuronale de CX3CR1 (Meucci, Fatatis et al. 2000).
La voie de signalisation CX3CL1/CX3CR1 est impliqué dans la communication

neurone-microglie et dans la neuroprotection en conditions inflammatoires ou lésionnelles
(Harrison, Jiang et al. 1998; Boehme, Lio et al. 2000); (Zujovic, Benavides et al. 2000;
Hughes, Botham et al. 2002);(Mizuno, Kawanokuchi et al. 2003);(Cardona, Pioro et al. 2006).
En effet, des expériences in vitro et in vivo ont montré que l’interaction de CX3CL1 et de son
104
récepteur contribue à l’atténuation de l’activation microgliale et de la neurotoxicité en

conditions inflammatoires. In vitro, le CX3CL1 soluble agit comme un facteur anti-
inflammatoire via l’inhibition de la production induite par du LPS, de l’IL-1β, l’IL-6, du TNFα, du
NO (monoxyde d’azote) et de l’enzyme iNOS (NO synthase inductible) dans des cultures de
cellules microgliales (Zujovic, Benavides et al. 2000; Mizuno, Kawanokuchi et al. 2003). En
2009, Lyons montre que les deux formes de CX3CL1 diminuent l’augmentation de
l’expression d’IL-1β et du complexe majeur d’histocompatibilité II (CMHII) dans des cultures
primaires neurones-microglie (Lyons, Lynch et al. 2009). In vivo, le blocage par un anticorps
anti-CX3CL1 de l’action de la chimiokine endogène, potentialise la production induite par le
LPS, de l’expression hippocampique de TNFα et de l’isoprostane-8 (marqueur de stress
oxydatif), suggérant que l’expression de CX3CL1 est nécessaire au contrôle de l’activation
microgliale (Zujovic, Schussler et al. 2001).
E] Physiopathologie du couple CX3CR1/CX3CL1

Il a été démontré que ce couple CX3CR1/CX3CL1 est impliqué dans la pathogénécité
de plusieurs maladies, dont la pancréatite chronique (Yasuda, Ito et al. 2008; Ceyhan,
Deucker et al. 2009), l'athérosclérose, l'arthrite rhumatoïde, la glomérulonéphrite, le SIDA
(Syndrome d’ImmunoDeficience Acquise), le rejet d'allogreffe (Haskell, Hancock et al. 2001),
la dégénérescence maculaire liée à l'âge (Combadiere, Feumi et al. 2007), l'uvéite (Chu, Li et
al. 2009), la douleur neuropathique (Zhuang, Kawasaki et al. 2007), la septicémie, et divers
types de cancer, comme le cancer du pancréas (Vitale, Cambien et al. 2007; Marchesi,
Piemonti et al. 2008). Nous décrirons ici, de manière succincte, le rôle de CX3CL1/CX3CR1 et
les conséquences du polymorphisme de CX3CR1 dans l’inflammation, l’athérosclérose, dans
certaines pathologies cérébrales, dans certains cancers et dans l’infection VIH (Figure III-9).
E.1- Inflammation
Il est clairement démontré que l’axe CX3CL1/CX3CR1 est directement impliqué dans
le recrutement, la migration et l’activation de cellules cytotoxiques du sang vers le tissu
inflammé (Nishimura, Umehara et al. 2002) (Cf. chapitre II §.D.2). Plusieurs catégories de
pathologies inflammatoires confirment cette hypothèse, notamment les maladies
inflammatoires chroniques de l’intestin, les réactions allergiques ou encore certaines
pathologies auto-immunes.
Chez les patients atteints de la maladie de Crohn, il a été observé une augmentation
significative de l'expression de l'ARNm de CX3CL1 au niveau des muqueuses inflammées par
comparaison avec la muqueuse du côlon sain. Cette surexpression de CX3CL1 semble être
105
induite par des cytokines pro-inflammatoires, en particulier par l'IL-8, ce qui suggère un impact
important de cet axe CX3CL1/CX3CR1 dans l'inflammation intestinale (Brand, Hofbauer et al.
2006).
Le CX3CL1 a une influence déterminante sur l'issue de l'asthme allergique en

augmentant le recrutement des éosinophiles dans les poumons (Bisset and Schmid-
Grendelmeier 2005). Chez les patients atteints d'asthme ou de rhinite allergique, le niveau de
CX3CL1 soluble est augmenté et la fonction cytotoxique dans les lymphocytes T naïfs
(CD45RO-/CX3CR1+) et mémoires (CD45RO+ CD4+/CX3CR1+) circulants est augmentée
(Rimaniol, Till et al. 2003). Après exposition à l'allergène, la concentration de CX3CL1 est
augmentée dans le liquide broncho-alvéolaire de façon corrélée avec le nombre de cellules
inflammatoires recrutées (Rimaniol, Till et al. 2003).
Le couple CX3CR1/CX3CL1 a été mis en cause dans un certain nombre de maladies

auto-immunes dont la sclérose en plaque où le CX3CR1 est un marqueur de diagnostic : il
existe une corrélation entre un pourcentage faible de cellules NK CX3CR1 + et la sévérité de
la maladie.
E.2- Pathologie cardio-vasculaire sur fond d’inflammation

Exemple de l’athérosclérose
L’athérosclérose est une maladie cardio-vasculaire au cours de laquelle les
chimiokines jouent un rôle crucial (cf. II.E-1). Plusieurs études ont montré que le CX3CL1 est
un médiateur important de l'accumulation des leucocytes et de la migration des CML à
l'intérieur de lésions athérosclérotiques (Lucas, Bursill et al. 2003; Apostolakis, Krambovitis et
al. 2007; Galkina and Ley 2007; Saederup, Chan et al. 2008).
Les Lipoprotéines de petites densité (LDL) et l’acide linoléique oxydés stimulent

l’expression du CX3CL1 au niveau des CML, ce qui induit une augmentation de l’adhésion
des macrophages CX3CR1+, qui eux même stimulent l’expression de CX3CL1 par les CML,
générant ainsi une boucle de régulation autocrine et une amplification du recrutement et de
l’adhésion des macrophages et de leur infiltration au niveau de la plaque d’athérome (Barlic
and Murphy 2007; Barlic, Zhang et al. 2007)
106
Figure III-9 : Implication de l’axe CX3CL1/CX3CR1dans différentes pathologies
107
Une diminution de la formation de lésions d'athérosclérose a été signalée chez des

souris double knock-out CX3CR1/apolipoprotein E (Combadiere, Potteaux et al. 2003). Mais il
semble que ce couple CX3CR1/CX3CL1 intervient à plusieurs niveaux du développement de
la maladie. La chimiokine CX3CL1 peut également contribuer au dysfonctionnement
vasculaire par un autre mécanisme, en stimulant la génération d’anions superoxydes produit
par les cellules endothéliales et les CML. Enfin, le CX3CL1 sous sa forme soluble induit une
dégranulation des plaquettes et l’expression à leur surface de P-Selectine, ce qui stimule
l’adhésion et l’accumulation des leucocytes.
Le polymorphisme CX3CR1 a été identifié comme un des facteurs de risque des

maladies coronariennes chez les patients, indépendamment d’autres facteurs de risque, plus
classiques (surpoids, tabac,…). Ce polymorphisme du récepteur CX3CR1 semble impliqué
dans une adhésion différentielle des leucocytes, conférant à ce variant IM des propriétés de
protection contre les maladies cardio-vasculaires (Combadiere, Potteaux et al. 2003). Il a ainsi
été démontré que l’allèle I249 est associé à une meilleure vasodilatation (McDermott, Halcox
et al. 2001) et est décrite comme un facteur de stabilité des plaques d’athérome, alors que
l’allèle M280 semble être un facteur génétique protecteur de l’obstruction de l’artère
carotide(Ghilardi, Biondi et al. 2004). Cependant les mécanismes de cette protection ne sont
pas totalement élucidés. Umehara et collaborateurs proposent un modèle où l’expression de
la forme membranaire du CX3CL1 à la surface des cellules endothéliales est à l’origine d’une
augmentation de l’adhésion des monocytes CX3CR1-IM qui empêche leur transmigration et
donc limite l’enrichissement de la plaque d’athérome (Umehara, Bloom et al. 2004).
L’axe CX3CL1-CX3CR1 représente une cible thérapeutique très intéressante dans la

maladie de l’athérosclérose et son exploration est susceptible d'ouvrir la voie à des essais
cliniques dans la recherche cardiovasculaire dans un proche avenir (Poupel, Boissonnas et al.
2013).
E.3- pathologies cérébrales
E.3.1 – Douleur
Le couple CX3CL1/CX3CR1 occupe une place importante dans le processus de

communication microglie-neurone (Nishiyori, Minami et al. 1998). Suite à une stimulation, les
neurones sensoriels afférents sont capables de cliver le CX3CL1 membranaire et ainsi de
libérer de la chimiokine soluble (Milligan, Zapata et al. 2004). Dans plusieurs modèles
expérimentaux de douleurs neuropathiques, il a été observé une augmentation de la libération
de CX3CL1 par les neurones de la corne dorsale (Milligan, Sloane et al. 2008). Cette
108
libération massive de CX3CL1 active la voie p-38-MAPK en aval du CX3CR1 et engendre une
libération de cytokines neuropathiques. Ce mécanisme contribuerait au maintien et à
l’amplification de la douleur chronique (Clark, Yip et al. 2009). L’utilisation d’anticorps
bloquants dans un modèle de douleur lié au cancer du tibia chez le rat, permet de retarder et
d’atténuer la douleur, sans avoir d’effets sur le développement tumoral (Yin, Cheng et al.
2010).
E.3.2 –Maladies neurodégénératives
Un nouvel axe de recherche tend à expliciter l’implication du couple CX3CL1/CX3CR1

dans les maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson ou la maladie
d'Alzheimer. Dans ces deux neuropathologies, le CX3CL1 tient un rôle central du fait qu’il
constitue une des molécules clé de la communication neurone-microglie. Ainsi il a été observé
une diminution des dépôts β-amyloïde et une diminution significative de la perte neuronale
dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer déficient en CX3CR1. Cet effet est
certainement lié à une diminution de l’activité cytotoxique des cellules microgliales (Fuhrmann,
Bittner et al. 2010; Lee, Varvel et al. 2010). Ces données sont également observées sur un
modèle de la maladie de Parkinson, où l’activation de la microglie est là encore responsable
de la dégénérescence neuronale (Shan, Hong-Min et al. 2011).
Enfin l’axe CX3CR1/CX3CL1 s’illustre dans l’évolution de la dégénérescence

maculaire liée à l’âge (DMLA). Au sein du laboratoire, l’équipe a pu démontrer une implication
des cellules microgliales CX3CR1+. Chez des patients atteints de DMLA, ces cellules
s’accumulent au niveau de l’espace sous-rétinien à proximité des photorécepteurs alors que
chez le sujet sain, ces cellules sont localisées dans la rétine interne. Après une phagocytose
excessive des photorécepteurs, les cellules microgliales s’agrègent, obstruant la vision des
patients. Ces cellules microgliales ont également des propriétés angiogéniques, VEGF
dépendantes, responsables d’une destruction de la rétine et d’une dégénérescence maculaire
par sécrétion de facteurs neurotoxiques (Combadiere, Feumi et al. 2007). Dans 20% des cas,
on observe une augmentation significative du développement de nouveaux vaisseaux
sanguins, on parle alors de DMLA exsudative ou DMLA sèche (Figure III-10). Au vu de ces
observations, il semble que le CX3CR1 soit impliqué, dans le SNC, dans l’évacuation des
cellules microgliales alors que dans les autres organes, il participe à un recrutement.
Une inactivation du CX3CR1 permet de simuler ce dysfonctionnement chez l’animal avec
notamment une accumulation de cellules microgliales dans l’espace sous-rétinien.
109
De manière cohérente avec le modèle murin, il a été montré que le risque de DMLA
chez l’Homme est environ 2 à 2.5 fois supérieur chez les individus homozygotes porteurs de
l’allèle M280 (Combadiere, Feumi et al. 2007).
Figure III-10 : Représentation schématique de la configuration rétinienne chez un

individu sain et un patient atteint de DMLA
E.4- CX3CL1 et Cancer

La mise en place d’une réponse immunitaire efficace est un paramètre critique dans le
processus d’apparition des tumeurs et d’inhibition de la dissémination métastatique. On sait
que CX3CL1 et CX3CR1 sont des acteurs importants de l’immunité en particulier pour leurs
effets sur les cellules NK, les monocytes ou encore les lymphocytes T cytotoxiques. Ainsi leur
dysfonctionnement est souvent associé dans des pathologies où la réponse immunitaire fait
défaut, c’est notamment le cas du cancer. Il s’agit également de la pathologie où l’utilisation
de CX3CL1 en tant qu’agent thérapeutique est la plus prometteuse. En effet, l’administration
de CX3CL1 à des souris présentant des carcinomes pulmonaires induit un effet anti-tumoral
grâce principalement à un recrutement massif de cellules cytotoxiques, telles que les NK
(Guo, Chen et al. 2003; Guo, Zhang et al. 2003) et les lymphocytes T (Lavergne, Combadiere
et al. 2003; Xin, Kikuchi et al. 2005).
110
Certaines études mettent en évidence un recrutement supplémentaire des DC,

impliquées dans l’inhibition de la croissance de certain mélanome et de tumeurs colorectales
chez la souris (Nukiwa, Andarini et al. 2006). Dans ce cas, le couple CX3CR1/CX3CL1 est
décrit comme anti-tumoral. Selon le modèle étudié, cet effet anti-tumoral ne dépends pas
toujours des mêmes cellules immunes mais aboutit aux mêmes conséquences, à savoir une
inhibition partielle mais efficace de la croissance des cellules tumorales mais également une
diminution de leur survie. Ces résultats ont été observés dans différents modèles et par des
équipes indépendantes.
En revanche, dans d’autres exemples de cancer, le CX3CL1 a été associé à un effet

pro-tumoral, responsable d’une augmentation du potentiel métastatique et un risque de
récidive locale (Andre, Cabioglu et al. 2006; Marchesi, Piemonti et al. 2008). Les mécanismes
de ces effets contradictoires du CX3CL1 ne sont pas encore pleinement compris. Bien que
l'effet anti-tumoral soit probablement causé par des mécanismes immunologiques, les effets
pro-tumoraux peuvent être expliqués par les propriétés adhésives et de facilitation de la
transmigration des cellules cancéreuses (Jamieson, Shimizu et al. 2008; Nevo, Sagi-Assif et
al. 2009). Le CX3CL1 peut également provoquer un effet pro-tumoral en induisant
l'angiogenèse. Chez des patients présentant un cancer colorectal, l’expression de CX3CL1
corrèle avec une augmentation de la densité de cellules tumorales infiltrantes (Ohta, Tanaka
et al. 2005). Le CX3CL1 est d’ailleurs utilisé comme biomarqueur du pronostique, utile pour
identifier les patients qui pourraient bénéficier d’une thérapie immunomodulatrice
complémentaire.
Ce couple CX3CR1/CX3CL1 est également responsable de la dissémination

métastatique selon un mécanisme simple qui repose sur le recrutement des cellules
cancéreuses CX3CR1+ à partir du foyer tumoral primaire, sous l’influence de la forme soluble
du ligand, suivi de l’infiltration dans un foyer tumoral secondaire. Cette étape est notamment
contrôlée par la forme membranaire du CX3CL1. Cependant les deux formes du CX3CL1
n’ont pas toujours des effets comparables. En effet, dans certains cancers, dont celui du
colon, une étude montre qu’à l’inverse de la forme soluble qui présente un effet anti-tumoral
par action sur la dissémination métastatique, la forme membranaire a une action pro-tumorale
(Vitale, Cambien et al. 2007). Cette étude souligne l’importance de la régulation de l’équilibre
entre les formes solubles et transmembranaires du CX3CL1.
111
E.5- CX3CL1 et VIH

Initialement identifié comme un des corécepteurs du VIH avec le CXCR4 et le CCR5,
les études in vivo ont toutefois écarté l’implication directe du CX3CR1 dans le processus
d’infection des cellules, montrant que sa présence n’était pas indispensable (Garin, Tarantino
et al. 2003). Cependant, en dehors d’un rôle de corécepteur, le CX3CR1est bien impliqué au
cours de l’infection virale (Becker 2007). Il a ainsi été montré que les niveaux d’expression de
CX3CL1 et CX3CR1 sont modifiés au cours de l’infection, ce qui se traduit par une modulation
de l’interaction des lymphocytes T et des DC (Faure, Meyer et al. 2000; Foussat, Bouchet-
Delbos et al. 2001). De même, l’expression de CX3CL1 augmente au niveau des DC matures
dans les zones T des ganglions lymphatiques (Foussat, Bouchet-Delbos et al. 2001). Cette
forte expression de CX3CL1 aurait pour but de consolider l’interaction adhésive des DC avec
les lymphocytes pour une présentation antigénique meilleure et plus efficace. On observe
également une augmentation de l’expression de CX3CL1 lors du contact cellules microgliales-
macrophages infectés par le VIH, ce qui pourrait entraîner le recrutement massif de
monocytes dans le parenchyme cérébral (Pereira, Middel et al. 2001). Il a été montré qu’il y
avait une corrélation entre la progression de la pathologie et le fait que le CX3CR1 devienne
le principal RCK exprimé par les T CD4+ et T CD8+ effecteurs cytotoxiques mémoires
(Combadiere, Faure et al. 2003). Le CX3CR1 contrôle également la migration et les propriétés
antivirales des lymphocytes T8 en inhibant par exemple la production d’IFN-γ (Combadiere,
Faure et al. 2003). Le CX3CR1 serait donc un bon marqueur de l’évolution de l’évolution de la
pathologie VIH.
Une étude menée au sein du laboratoire, montre que la présence des variants V249I
et T280M du CX3CR1 chez des patients infectés par le VIH est corrélée avec une évolution
plus rapide de la pathologie vers le stade SIDA (Faure, Meyer et al. 2000). Cette étude
épidémiologique révèle que le CX3CR1 semble ne pas avoir la même fonctionnalité suivant
qu’il est muté ou non. De plus, l’haplotype I249-M280 exprimé à l’état homozygote est associé
à une diminution du taux de fixation de CX3CL1 à son récepteur présent sur les lymphocytes
périphériques de ces mêmes patients. Cette diminution peut être expliquée soit par la
diminution de l’affinité du variant CX3CR1-M280 vis-à-vis du CX3CL1 soluble (mais les études
biochimiques ne vont pas dans ce sens) soit par une diminution de l’expression du récepteur
à la membrane lors de l’infection (Faure, Meyer et al. 2000). La perte fonctionnelle du
CX3CR1 muté pourrait être responsable de la diminution de la survie. Toutefois, ces résultats
divergent en fonction des cohortes utilisées. A l’inverse, une étude américaine a associé la
variation T280M, même à l’état hétérozygote, avec une progression retardée de la maladie.
Cette régression est expliquée par la diminution de l’activité de corécepteur du CX3CR1-IM
112
(McDermott, Halcox et al. 2001), diminution qui est une nouvelle fois en contradiction avec les
résultats de notre laboratoire. Une étude sur une cohorte espagnole a associé l’haplotype
I249 – T280 aux LTNP (Long Term Non-Progressors) [Vidal et al. 2005]. D’un autre côté, les
résultats de la toute première étude effectuée au sein du laboratoire ont été confirmés depuis
(Faure, Meyer et al. 2003; Singh, Hughes et al. 2005). Il n’y a par ailleurs pas d’association
entre le polymorphisme de la région non traduite 3’UTR du CX3CR1 et la progression de la
maladie (Peraire, Vidal et al. 2007)
La présence de la mutation I249 de CX3CR1 a été corrélée à un échec plus précoce

de la trithérapie anti-VIH suggérant, là encore, un rôle du couple CX3CR1/CX3CL1 au cours
de la réponse immune antivirale spécifique du VIH (Brumme, Dong et al. 2003). Par contre,
plus récemment, les allèles I249 et M280 ont été associés à une meilleure réponse
immunologique au traitement HAART (Highly Active Antiretroviral Therapy) (Passam,
Sourvinos et al. 2007).
113
114
Introduction – AMPc & immunité : ami ou ennemi ?
IV. AMP cyclique & Immunité : ami ou ennemi ?
La survie d’une cellule dépend de sa capacité à intégrer les différents signaux de son
environnement et à s’y conformer en mettant en place une réponse cellulaire adaptée (cf. chapitre
I - § A). La réponse cellulaire résulte de l’activation en aval de ces récepteurs d’une multitude de
voies de signalisation mettant en jeu des molécules intracellulaires qualifiées de messagers
secondaires. Ces molécules sont de véritables carrefours entre les différentes voies de
signalisations activées. La nature de ces messagers secondaires est multiple. Il peut s’agir d’ions
comme le calcium, de phospholipides comme le PIP2 ou le DAG, ainsi que de nucléotides
cycliques: GMPc ou AMPc. C’est à ce dernier que nous nous sommes intéressé puisqu’il
constitue un messager classiquement modulé en aval des RCK.
Plusieurs études mettent en évidence le rôle immunosuppresseur de l’AMPc. Cette

immunosuppression passe par une modulation de plusieurs processus dont le recrutement et
l’adhésion des leucocytes, la production de médiateurs inflammatoires, la phagocytose produite
par les cellules immunes spécialisées (monocyte, macrophage et lymphocyte T et B) ou encore
par l’inhibition du récepteur à l’antigène présent à la surface des lymphocytes. Par ailleurs,
plusieurs situations cliniques qui prédisposent à l'infection ont été associées à une augmentation
de la concentration d’AMPc : ainsi de nombreuses stratégies thérapeutiques ont pour but de
diminuer cette production d'AMPc afin de restaurer une réponse immunitaire efficace.
Après une rapide description du système AMPc, nous expliciterons l’aspect

immunorégulateur de ce messager secondaire.
A] Anatomie du système AMPc

A.1- Effecteurs et voies de signalisation
La voie de signalisation AMPc est induite en aval de nombreux récepteurs et

particulièrement en aval des RCPG dont font partie les RCK. Le niveau d’AMPc intracellulaire est
principalement commandé par deux types d’enzymes, celles impliquées dans la synthèse : les AC
et celles responsables de sa dégradation : les phosphodiestérases (PDE).
Il existe dix isoformes différentes de l’AC (AC1-AC10) et onze isoformes de PDE (PDE1-PDE11).
Neuf des AC sont des protéines membranaires, attachées à la face interne de la membrane alors
que la dixième (AC10) est décrite comme soluble (cf. chapitre I - § B.5.1). Pour rappel, ces
115
enzymes transforment l’ATP en AMPc et sont contrôlées en amont par les sous unités α de la
protéine Gs et Gi : αi inhibe l’activité AC alors que αs l’active. En revanche les PDE sont le plus
souvent des protéines cytoplasmiques, responsables de l’hydrolyse de l’AMPc en adénosine
5’ monophosphate (AMP) et pyrophosphate (PPi). Ayant déjà décrit les AC au cours du chapitre I,
nous consacrerons ici un paragraphe aux PDE ainsi qu’aux principaux effecteurs de l’AMPc.
A.1.1 – Les Phosphodiestérases (PDE)
Les PDE sont les enzymes responsables de l’hydrolyse des nucléotides cycliques (AMPc
et GMPc). Bien que dans certaines cellules comme les cardiomyocytes, l’AMPc peut être
transporté hors de la cellule par des canaux de la famille des MRP (Multidrug Resistance Protein),
l’activité catalytique des PDE constitue la seule voie d’élimination de l’AMPc dans la plupart des
types cellulaires. C’est principalement l’activité des PDE qui va apporter une dimension
spatio-temporelle du signal AMPc.
Décrite pour la première fois en 1962 par Butcher et Sutherland (Butcher and Sutherland
1962), la superfamille des PDE contient actuellement plus de 90 membres regroupés en 11
familles selon leurs propriétés structurales, enzymatiques, pharmacologiques ainsi que leur mode
de régulation (Tableau IV.1). Chaque famille est codée par 1 à 4 gènes qui peuvent subir des
épissages alternatifs, ce qui explique les 96 PDE recensées. Une nomenclature a été proposée
afin de classer les différents isoformes, on peut ainsi identifier la famille de PDE, le gène codant
pour l’isoforme ainsi que l’épissage alternatif. A titre d’exemple la PDE4D3 correspond à la PDE
de la famille 4, codée par le gène D et produite par le 3ème épissage alternatif de l’ARN issu de ce
même gène.
Les PDE des familles 4,7 et 8 sont capables de dégrader sélectivement l’AMPc, alors que
les isoformes de la famille 5, 6 et 9 sont spécifique du GMPc. Les familles 1, 2, 3,10 et 1 peuvent
hydrolyser les deux nucléotides cycliques indifféremment (Figure IV-1).
D’un point de vue structure, les PDE partagent une organisation structurale commune
contenant : un domaine catalytique conservé d’une famille à l’autre et situé à l’extrémité
C-terminale et des domaines de régulation et d’adressage situés essentiellement dans la partie
N-terminale. La plupart des PDE fonctionnent en dimère ou oligomère (Conti and Beavo 2007).
116
PDE Gènes / Localité Site de liaison /

Tissulaire phosphorylation
Substrat
1 PDE1A – GMPc Cœur, cerveau, Ca2+/CaM

PDE1B – GMPc muscle lisse,
PDE1C– AMPc et poumons, PKA
GMPc lymphocytes T
2 PDE2A – AMPc et Glandes surrénales, GMPc

(1-3) GMPc cœur, foie, poumons,
plaquettes
3 PDE3A – AMPc > Cœur, poumons, PKA et PKB

(1-3) GMPc foie,reins,adipocytes
,lymphocytes T,
PDE3B – AMPc > cellules
GMPc inflammatoires,
plaquettes
4 PDE4A Reins,cerveau, foie, PKA
PDE4B AMPc poumons, muscle
PDE4C lisses,
PDE4D cardiomyocytes,
cellules
inflammatoires,
5 PDE5A – GMPc Poumons, plaquettes,
vaisseaux, muscle
lisses
6 PDE6A – GMPc Photorecepteurs transducine

PDE6B – GMPc
7 PDE7A – AMPc Muscles, cœur, reins,

pancréas,
PDE7B – AMPc lymphocytes T,
éosinophiles,
neutrophiles
8 PDE8A – AMPc Testicules,œil, foie,

muscles,rein,
PDE8B – AMPc ovaires,cerveau,
lymphocytes T
9 PDE9A – GMPc Rein, foie, poumons,

cerveau,rate, intestins
10 PDE10A – AMPc Testicules, cerveau

< GMPc
11 PDE11A – AMPc Muscles, prostate,

rein, foie, testicules,
et GMPc
Tableau IV.1 : Classification des PDE (D’après Ishiwata et al.2007, Smith et al. 2004 ; van der staay et al.
2008)
117
Légendes tableau IV.1 :
A.1.2 – Effecteurs de l’AMPc
Parallèlement à la voie canonique impliquant la PKA comme principal effecteur, deux

autres effecteurs de cette voie ont été décrits. Il s’agit de la protéine EPAC ainsi que des canaux
ioniques CNG et HCN. Ensemble ou séparément, ces différentes branches de la signalisation
AMPc, tendent à moduler différentes fonctions cellulaires.
La Protéine Kinase A (PKA)
A l’état inactif, la PKA est un hétérotétramère formé de 4 sous-unités : 2 sous-unités

catalytiques (C) et 2 sous unités régulatrices (R). L’AMPc en se liant aux sous-unités R, dissocie
et libère les sous-unités C qui deviennent actives (Figure IV-1). Les sous-unités C de la PKA ont
pour fonction de phosphoryler les protéines cibles au niveau d’un motif dont la séquence est
formée de deux aa basiques, suivi d’un aa neutre puis d’une sérine ou d’une thréonine
phosphorylable : RRXS/T. L’ATP est ici le donneur de phosphate et d’énergie.
Figure IV-1 : Représentation schématique de la Protéine Kinase A

La PKA est l’une des protéines cible de l’AMPc. Elle se compose de 4 sous unités : 2 sous unités catalytiques et 2 sous
unités régulatrices. A l’état basal, ces 4 sous unités sont cohésives. Lorsque l’AMPc se fixe sur les sous unités
régulatrices, on assiste à la libération des sous unités catalytiques qui vont aller phosphoryler tout un tas de protéines
cibles.
118
Initialement, deux isoformes de la PKA (I et II) avaient été décrites en fonction de leur
profil d’élution sur colonne DEAE (DiEthylAminoEthyl). Ces deux isoformes différent par leur
domaines régulateurs annotés respectivement RI et RII, présentant une affinité différente pour
l’AMPc. Il a récemment été démontré qu’il existe bien plus de deux PKA. Cette hétérogénéité
résulte de l’existence de différents variants et sous variants, issus d’épissages alternatifs, des
régions régulatrices (RI α et β / RII α et β) comme catalytiques (C α, β et γ).
L’activité catalytique de la PKA est régulée par un inhibiteur endogène, PKI (Protéine
Kinase Inhibitor). Ce dernier présente une forte affinité pour les sous unités catalytiques de la
PKA, qu’il lie au niveau du site catalytique. Certaines études tendent à démontrer que ce facteur,
en plus de son rôle d’inhibiteur de la PKA, contribue à la translocation de la PKA active du
compartiment nucléaire (où se trouvent certaines protéines cibles) vers le cytoplasme où elle
redevient inactive après liaison avec les sous unités régulatrices.
Il y a plus de 100 protéines substrats de la PKA, parmi lesquelles NFAT, Raf-1, Ras ou
encore d’autres effecteurs de la voie MAPK. Certaines de ces protéines sont activées, d’autres
sont au contraire inhibées par la phosphorylation.
Une interconnexion de la voie AMPc/PKA avec la signalisation calcique a également été

rapportée (Rogue, Humbert et al. 1998) ainsi qu’avec la voie PKB (Du and Montminy 1998). Dans
les cellules immunes, il semble également possible que la PKA inhibe la voie JaK/STAT (David,
Petricoin et al. 1996).
Le facteur d’échange EPAC
En 1998, deux groupes indépendants mettent en évidence une nouvelle famille de

protéines liant l’AMPc : EPAC (Exchange Protein directly Activated by cAMP) (de Rooij,
Zwartkruis et al. 1998; Kawasaki, Springett et al. 1998). Ces protéines contiennent un domaine de
liaison pour l’AMPc (CBD : cAMP Binding Domain) qui est homologue à celui des sous-unités
régulatrices de la PKA. L’AMPc se lie à la protéine EPAC avec une haute affinité, ce qui active la
famille des petites GTPases Ras : Rap1 et Rap2. EPAC est en effet un facteur d’échange (GEF)
qui entraîne l’échange du GDP en GTP sur ces petites protéines G ou ras (Bos 2003), permettant
ainsi leur activation et leur interaction avec leurs effecteurs (Figure IV-2.B).
Il existe deux isoformes d’EPAC : Epac1 et Epac2, produits de gènes indépendants chez
les mammifères. Alors qu’Epac1 est exprimé de manière ubiquitaire, Epac2 présente une
expression confinée à certains tissus (de Rooij, Zwartkruis et al. 1998; Kawasaki, Springett et al.
1998). Ces deux isoformes présentent une importante homologie de séquence et contiennent
119
toutes les deux une région N-terminale régulatrice comprenant un domaine d’adressage (DEP :
Dishevelled Egl-10 Pleckstrin); des domaines de liaison de l’AMPc (CBD) et une région
C-terminale catalytique. La région catalytique d’Epac1 se compose d'un motif d’échange RAS
(REM), un domaine d’association RAS (RA) et du domaine classique d’homologie CDC25
(CDC25HD) responsable de l'activité d'échange des nucléotides (Figure IV-2.A).
Figure IV-2 : Représentation schématique de la structure et de l’activation des protéines

EPAC.
A- Structure des protéines EPAC (D’après Gloerich et Bos, 2010) DEP : Dishevelled, Eg10 and Pleckstrin ; CNB :
cAMP Binding Domain, REM : Ras Exchange Motif ; RA : Ras Association Domain, CDC25HD : CDC25 Homology
Domain.
B- Mécanisme d’activation de la protéine EPAC.
La découverte de la protéine EPAC comme nouvelle cible intracellulaire de l’AMPc

suggère que le mécanisme de signalisation de l'AMPc est beaucoup plus complexe que ce que
l'on croyait auparavant. Ainsi, une grande partie des effets induit par l'AMPc, qui étaient attribués
à la seule action de la PKA, sont en partie imputables à EPAC et n’implique pas la branche PKA
de la voie AMPc. A ce jour, il a été démontré que la protéine EPAC est impliquée dans une
multitude de fonctions cellulaires telles que l’adhésion cellulaire (Rangarajan, Enserink et al.
2003; Enserink, Price et al. 2004), les jonctions cellule-cellule (Cullere, Shaw et al. 2005),
l'exocytose et la sécrétion (Ozaki, Shibasaki et al. 2000), la différenciation (Geissmann, Jung et
al. 2003) et la prolifération cellulaire (Métrich, Lucas et al. 2008).
Les canaux régulés par les nucléotides cycliques : CNG et HCN
Les canaux régulés par les nucléotides cycliques sont les seuls effecteurs de l’AMPc dont
l’activation produit des variations de la concentration ionique et du potentiel membranaire. Il existe
120
deux grandes familles de canaux régulés par les nucléotides cycliques : les canaux CNG (Cyclic
Nucleotide Gated channel) et les canaux HCN (Hyperpolarization-activated Cyclic Nucleotide
gated). Ces deux familles partagent la même organisation structurelle (Figure IV-3.A). Ils sont
formés par l’assemblage de :
- 4 sous unités, constituées chacune de 6 segments transmembranaires (S1-S6),
- une boucle P située entre S5 et S6 formant le pore du canal
- un domaine de liaison aux nucléotides cycliques situé dans la région C-terminale.
Ces deux familles de canaux diffèrent par leur mode d’activation, leur perméabilité ionique
et la liaison de l’AMPc et du GMPc.
Les canaux CNG sont exprimés principalement dans les photorécepteurs de la rétine et
les neurones olfactifs. Les formes fonctionnelles sont des hétérotétramères composés de deux
sous unité α et deux sous unité β (Kaupp and Seifert 2002). L’ouverture de ces canaux est
contrôlée aussi bien par la liaison d’une molécule d’AMPc comme d’un GMPc. Lors de la fixation
de l’un de ces deux nucléotides cyclique, le pore du canal devient perméant au calcium et aux
cations monovalents. Ainsi l’ouverture de ce canal induit une dépolarisation de la membrane
plasmique de la cellule conduisant à une entrée massive d’ions calcium (Figure IV-3.B). Ce
dernier en liant la calmoduline module de nombreuses cibles intracellulaires dont les canaux CNG
eux même. Ce rétrocontrôle négatif, constitue avec les PDE le principal mécanisme de régulation
négative des canaux CNG.
Parallèlement à cette première famille de canaux activés directement par les nucléotides
cycliques, il existe dans les cellules excitables et notamment dans les neurones, une seconde
famille de canaux activés par l’AMPc : les HCN. Chez les mammifères, il existe 4 sous familles de
HCN. Leur ouverture nécessite une hyperpolarisation préalable de la membrane plasmique en
plus de la fixation de l’AMPc et induit une dépolarisation lente par entrée de sodium.
A.2- Compartimentation du signal cAMP…
Il est de plus en plus admis que les différents protagonistes de la voie de signalisation
AMPc ne sont pas répartis de façon diffuse au sein de la membrane plasmique ou dans le cytosol
mais sont regroupés en signalosome grâce aux AKAP (A-Kinase Anchoring Protein) (Wong and
Scott 2004). Un signalosome peut ainsi regrouper tous les partenaires de la signalisation: une
PDE, une AKAP, une AC, la PKA ou les EPAC (Houslay 2010). Ce complexe fournit ainsi un
contrôle spatial des effecteurs de l’AMPc en plus du contrôle temporel de la signalisation via une
distribution cytosolique spécifique des PDE (Houslay, Baillie et al. 2007; Baillie 2009).
121
Figure IV-3 : Modèle structural et

mode de fonctionnement des canaux
régulés par les nucléotides
cycliques.
A- Représentation schématique de la structure

commune des canaux activés directement par
les nucléotides cycliques.
B- Mode d’activation du canal CNG. L’ouverture

du CNG est induite par la fixation d’une molécule
de nucléotide cyclique (AMPc ou GMPc) au
niveau intracellulaire. Dans cette configuration, le
pore du canal s’ouvre et laisse entrée dans la
cellule du calcium et du sodium. Cette entrée
d’anions induit une dépolarisation de la
membrane plasmique.
Cette compartimentation du signal semble être cruciale pour la survie de la cellule car cela
lui permet de confiner sa dépense d’ATP.
A.2.1 – Importance des AKAP
La famille des AKAP compte aujourd’hui une cinquantaine de membre. Les membres de
cette famille partagent d’avantage une fonction commune qu’une structure commune. Malgré
cette diversité structurale, pour être considérée comme une AKAP, une protéine doit répondre à 3
critères. Toutes les AKAP présentent un domaine de liaison à la sous unité régulatrice de la PKA.
Ensuite, une AKAP présente un domaine d’adressage spécifique qui lui impose un
« cloisonnement » à un compartiment cellulaire donné. A titre d’exemple, l’AKAP 79/150 présente
une séquence peptidique qui lui permet d’interagir avec les phospholipides de la membrane
plasmique, alors que l’AKAP-WAVE1 (WisKott-Aldrich VErprolin-homology protein 1) interagit
avec le cytosquelette d’actine ou les membranes mitochondriales (Figure IV-4). Enfin, une AKAP
doit être capable d’interagir avec plusieurs protéines de la signalisation AMPc (protéines
phosphatases, GSK, protéine Kinase,…) et ainsi de co-localiser l’effecteur de la voie (PKA ou
EPAC) avec ces différents partenaires au sein d’un « signalosome ». Les AKAP semblent donc
agir comme des plateformes d’ancrage des différents protagonistes de la signalisation, à la fois
ceux impliqués dans la transduction et ceux qui induisent l’arrêt, qu’elles maintiennent à proximité
les uns des autres (Cooper 2005).
122
A.2.2 – Implication des PDE
Les PDE étant l’unique moyen de dégrader l’AMPc. Leur positionnement au sein de la
cellule est crucial pour la régulation temporelle du signal AMPc. Il a ainsi été démontré que
chaque PDE a un territoire d’expression spécifique, par exemple la PDE4B est sub-membranaire
alors que la PDE4D est cytosolique (Terrin, Di Benedetto et al. 2006).
Ainsi le modèle de compartimentation actuel peut être résumé en 4 grandes idées :
1- Tout l’AMPc produit par les AC n’a pas accès à tous ses effecteurs mais seulement à
quelques-uns en fonction du « signalosome » proximal
2- Tout l’AMPc n’a pas accès à toutes les PDE
3- Toutes les PKA réparties dans les différents compartiments cellulaires n’ont pas accès
à tous les substrats
4- Il existe une relation spatiale stricte entre les RCPG, les AC et certains effecteurs en
aval de l’AMPc
Figure IV-4 : Localisation subcellulaire de quelques complexes AKAP- effecteurs au sein

d’une cellule. (d’après Wei Wong and John D. Scott, 2004)
Les AKAP (en violet) permettent de maintenir les effecteurs de l’AMPc (PKA et EPAC) à proximité de leurs effecteurs
redans des régions subcellulaires spécifique (membrane plasmique, mitochondries, cytosquelette ou encore
centrosome). Cet assemblage est à l’origine d’un véritable signalosome. L’application locale d’un agoniste de RCPG
produit une variation localisée de la concentration d’AMPc. Cette modulation locale de l’AMPc n’activera que les
effecteurs proximaux (PKA, EPAC ou CNG), qui à leur tour n’activerons que les cibles proches.
123
B] AMPc et fonctions immunitaires

De nombreux RCPG induisant la modulation de la concentration d’AMPc intracellulaire
sont exprimés sur les cellules immunitaires (neutrophiles, cellules dendritiques, lymphocytes T et
B) (Shirshev 2010). Globalement, il apparait qu’une augmentation de la concentration cellulaire
d’AMPc est immunosuppresseur, c'est-à-dire qu’elle affecte de façon négative les défenses
immunitaires. Elle induit notamment une diminution de la production de cytokines
pro-inflammatoires (TNF-α, IL-12, IFN-γ) (Eigler, Siegmund et al. 1998), ainsi que de nombreuses
chimiokines dont CCL2 et CXCL8 (van der Pouw Kraan, Boeije et al. 1995; Schnurr, Toy et al.
2005), une suppression de la prolifération des lymphocytes T (Kuklina and Shirshev 2000; Vang,
Torgersen et al. 2001), une diminution du recrutement des éosinophiles par une diminution du
chimiotactisme (Kaneko, Alvarez et al. 1995) ainsi qu’une diminution de la phagocytose par les
macrophages (Aronoff, Canetti et al. 2004). Nous détaillons ici quelques-unes des actions
immunomodulatrices de l’AMPc.
B.1 - AMPc, adhésion et migration des cellules du système

immunitaire.
Le rôle de la voie AMPc dans ce processus d’adhésion a été rapporté pour la première fois
au cours d’une étude sur le carcinome ovarien. Les auteurs montrent que l’activation de la voie de
signalisation AMPc induit une augmentation de l’adhésion intégrine dépendante (α5β1 et αvβ3)
des cellules endothéliales (Rangarajan, Enserink et al. 2003). D’autres études confirment cette
observation (Bos, de Bruyn et al. 2003; Enserink, Price et al. 2004) et montrent que cette
augmentation d’adhésion concerne aussi les monocytes (Li, Liu et al. 1995; Figueiredo, Mui et al.
2006) et les lymphocytes T (Reedquist, Ross et al. 2000) selon un même mécanisme impliquant
les intégrines. Ces observation sont remises en cause par les travaux de Fine et collaborateurs,
qui montrent qu’une augmentation de la concentration d’AMPc intracellulaire, par la forskoline et
l’IBMX, induit au contraire une diminution de l’adhésion et de la migration chimiokine dépendante
des monocytes (Fine, Byrnes et al. 2001). Nous observons nous même suite à la stimulation des
cellules par de la FSK, une diminution de ces deux fonctions (chimiotactisme et adhésion)
déclenchées par l’axe CX3CL1/CX3CR1 (cf. partie Résultats Complémentaires).
Certains auteurs expliquent ces effets contradictoires de l’AMPc sur l’adhésion par une
compartimentation différentielle du signal cAMP (Baillie and Houslay 2005) liée en particulier à la
distribution des PDE qui limite la diffusion du signal (Lorenowicz, van Gils et al. 2006). D’autres
montrent clairement que ces effets opposés de l’AMPc passent par des branches différentes de la
signalisation AMPc, (PKA régulation négative ; EPAC régulation positive) (de Bruyn,
124
Rangarajan et al. 2002; Rangarajan, Enserink et al. 2003; Enserink, Price et al. 2004; Aronoff,
Canetti et al. 2005)
B.2 - AMPc et fonctions immunes associées au monocyte/macrophage
Les monocytes et les macrophages représentent la première ligne de défense d’un

organisme. Ce sont les premiers acteurs de l’immunité, responsable de l’initiation d’une réponse
immunitaire non spécifique grâce à leur propriété de phagocytose des agents infectieux (micro-
organisme, parasites ou cellules).
La phagocytose est un processus cellulaire pouvant être décrit en trois étapes : adhésion,
ingestion et digestion de l’agent infectieux. La réalisation de ces différentes étapes nécessite
notamment une modulation du cytosquelette et de la membrane plasmique ainsi qu’une
opsonisation des anticorps présents à la surface des cellules phagocytaires en favorisant
l’expression de différents récepteurs dont les ligands sont fortement exprimés à la surface de la
cellule cible. Parmi les différentes molécules surexprimées à la surface des cellules
phagocytaires, on trouve le récepteur Fcγ, les récepteurs du complément ainsi que des
récepteurs du mannose. Plusieurs études montrent que l’augmentation de l’AMPc dans les
macrophages diminue significativement leur capacité phagocytaire en diminuant le nombre de
récepteurs du complément et de Fcγ, diminuant ainsi l’étape d’adhésion de ces cellules aux
agents pathogènes (Nambu, Morita et al. 1989; Makranz, Cohen et al. 2006). Néanmoins les
mécanismes de médiation de cet effet restent encore mal connus, notamment en ce qui concerne
la branche de la voie impliquée : PKA vs EPAC. Afin de déterminer l’effecteur impliqué, les
auteurs utilisent des analogues de l’AMPc spécifique de chacun de ces deux médiateurs tel que
le 6-Bnz-cAMP qui active la voie PKA dépendante ou le 8-cPT-2’-O-Me-cAMP, un activateur
spécifique de la protéine EPAC. L’utilisation de ces molécules dans la lignée macrophagique PL8
met en évidence un effet de l’AMPc sur la phagocytose passant par la voie de signalisation
PKA/CREB (Hazan-Eitan, Weinstein et al. 2006). La même étude réalisée sur des macrophages
alvéolaires humains implique la composante EPAC (Aronoff, Canetti et al. 2005; Canetti, Serezani
et al. 2007). De même dans les monocytes, l’ensemble des effets de l’AMPc sur les différentes
fonctions cellulaires sont modulées majoritairement par la PKA et non par EPAC (Bryn, Mahic et
al. 2006).
En plus de son implication dans l’étape d’adhésion, l’AMPc contrôle également l’activation
du métabolisme de l’oxygène des cellules phagocytaire (ou « explosion oxydative ») qui entraîne
une production massive de dérivés de l’oxygène. Cela passe, en particulier par une inhibition de
la NADPH oxydase par l’AMPc, ce qui conduit à une diminution de la production des espèces
125
réactives de l’oxygène (ROS) et donc contribue à diminuer la phagocytose (Bengis-Garber and

Gruener 1996). Il a ainsi pu être démontré dans les deux modèles macrophagiques (hépathique
(Usynin, Klotz et al. 2007) et alvéolaire (Aronoff, Carstens et al. 2006) que la stimulation de la voie
AMPc/EPAC (par l’utilisation de l’analogue : 8-cPT-2’-O-Me-cAMP) induit une diminution de la
production de ROS corrélant avec une diminution des défenses microbiennes.
B.3 – AMPc et fonctions lymphocytaires
B.3.1 – Lymphocytes T
Le rôle de l’AMPc comme inhibiteur des lymphocytes T a très bien été démontré (Kammer
1988; Vang, Torgersen et al. 2001; Hermann-Kleiter, Thuille et al. 2006). Plus précisément,
l’augmentation d’AMPc intracellulaire dans ces cellules induit une inhibition de leur activation
(Vang, Torgersen et al. 2001) et de leur prolifération (Skalhegg, Landmark et al. 1992). Les
résultats ont montré que, dans les T matures, l’augmentation d’AMPc intracellulaire induit par une
cascade impliquant la kinase Csk (COOH-terminal Src kinase) conduisent à une inactivation de la
cascade de signalisation en aval du TCR (Tasken and Ruppelt 2006).
L’AMPc diminue aussi l’activité cytotoxique des T. grâce à une réduction significative de la
production de nombreuses cytokines, tel que l’IL2, le TNF-α et l’IFN-γ par les lymphocytes Th1
(Th Lymphocyte T helper ; Th1 et Th2 : sous populations 1 et 2 différenciées sur la base des
cytokines sécrétées) (Henney and Lichtenstein 1971).
Parallèlement à ces effets immunosuppresseurs, certaines études rapportent des effets

plutôt inverse contribuant à une immunoactivation supporté par exemple par une augmentation de
la sécrétion des cytokines par les Th2 sous l’action de l’AMPc (Betz and Fox 1991; Snijdewint,
Kalinski et al. 1993; Haraguchi, Good et al. 1995; Hilkens, Snijders et al. 1996; Aandahl, Aukrust
et al. 1998). Il a également été mis en évidence une augmentation transitoire de l’AMPc au sein
des lymphocytes T, suite à leur adhésion aux DC. Cette augmentation de l’AMPc (Conche, Boulla
et al. 2009) contribue à augmenter la sensibilité de la cellule T aux antigènes suite au contact
Lymphocyte –DC décrit par la même équipe (Randriamampita, Boulla et al. 2003).
B.3.2 - Signal AMPc, Lymphocyte et VIH

Exemple de l’implication de l’AMPc dans la physiopathologie
Certaines études réalisées in vitro montrent qu’une infection de lignées lymphocytaires par
le VIH conduit à une augmentation de la concentration d’AMPc cellulaire (Nokta and Pollard 1991;
Hofmann, Nishanian et al. 1993; Aandahl, Aukrust et al. 1998). En outre, des études ex vivo
126
montrent que des cellules T de patients séropositifs contiennent deux fois plus d’AMPc que celles
issues de personnes séronégatives (Hofmann, Nishanian et al. 1993; Aandahl, Aukrust et al.
1998).
Cette augmentation de l’AMPc intracellulaire semble passer par l’activation de la PKA

sous influence de la glycoprotéine gp120 contenue dans l’enveloppe virale (Hofmann, Nishanian
et al. 1993; Masci, Galgani et al. 2003; Becker, Taube et al. 2009). Le mécanisme par lequel cette
protéine augmente la concentration d’AMPc est encore inconnu. Une étude tend à associer cet
effet à des récepteurs chimiokinergiques et plus particulièrement au CXCR4 (Masci, Galgani et al.
2003).
Plusieurs études ont montré que l’activation de la voie AMPc dans les cellules T infectées
contribue à inhiber la réponse immunitaire et ainsi à favoriser l’infection. L’adhésion du virus par le
biais de la gp120 sur le CXCR4 diminue significativement la prolifération des lymphocytes T CD4+
et T CD8+. Cet effet est en rapport avec une activation de la PKA et de CREB (Hofmann,
Nishanian et al. 1993; Masci, Galgani et al. 2003). A l’inverse, la diminution de l’AMPc restaure la
prolifération et la cytotoxicité de ces cellules (Hofmann, Nishanian et al. 1993; Hofmann,
Nishanian et al. 1993). L’AMPc agit également sur les T régulateurs : lors de l’infection VIH, on
assiste à une suppression de la potentiation de ces cellules par une augmentation du niveau de
CTLA-4 (Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4) (Becker, Taube et al. 2009). Cette protéine est
connue pour être un régulateur négatif de l’immunité.
L’ensemble de ces études décrivent la signalisation AMPc comme étant un élément clé du
processus d’infection des lymphocytes T par le VIH particulièrement en supprimant la réponse
immunitaire. Néanmoins, il semble que son rôle soit encore plus complexe. Plusieurs études
rapportent un effet inhibiteur de l’AMPc sur la capacité du virus à se répliquer. Une augmentation
de l’AMPc, soit par le biais d’une activation de l’AC par de la FSK, soit après un blocage de la
dégradation par un traitement avec du rolipram, un inhibiteur spécifique de la PDE4, est corrélée
avec une diminution de la transcription virale ainsi qu’une diminution du niveau de la protéine HIV-
p24Gag dans les lymphocytes T (Navarro, Punzon et al. 1998; Sun, Li et al. 2000). Dans la même
logique, une étude montre que dans les cellules T naïves, l'AMPc diminue significativement
l’import nucléaire, la translocation et la réplication de l'ADN viral, par comparaison avec des
cellules T mémoires. On rapporte également un effet sur l’expression des corécepteurs du VIH,
CCR5 et CXCR4 (Thivierge, Le Gouill et al. 1998; By, Durand-Gorde et al. 2010).
L’ensemble de ces données suggèrent que la voie de l'AMPc/PKA affecte l'infection par le
VIH à la fois sur les étapes de pré- et de post-intégration. Ainsi le rôle de l’AMPc au cours de
l’infection par le VIH et plus globalement dans la réponse immunitaire semble dépasser la simple
127
fonction d’immunosuppresseur. Ces connaissances peuvent permettre d'établir de nouvelles

cibles thérapeutiques dans la thérapie antirétrovirale ou identifier des molécules cibles avec un
potentiel immunorégulateur, ce qui pourrait aider à restaurer la dysfonction immunitaire dans le
cadre de cette pathologie.
B.3.3 – Lymphocytes B
L’AMPc et ses effecteurs, PKA et EPAC, jouent un rôle important dans la régulation de
l’activité des lymphocytes B. Les données actuelles ne permettent pas de formuler distinctement
la contribution respective de ces effecteurs mais montrent une action préférentielle de la PKA sur
les fonctions cellulaires des lymphocytes B matures et par le biais de la protéine EPAC dans les
formes cellulaires immatures. L’utilisation de l’analogue de l’AMPc, PKA sensible (6-Bnz-cAMP),
sur des lymphocytes B matures de la rate de souris, inhibe la voie ERK1/2, cela indépendamment
de l’activation des récepteurs de lymphocyte B (BCR), ce qui se répercute sur les fonctions de
ces cellules et conduit à une diminution de la réponse immunitaire humorale (Yue, Dodge et al.
1998; Kaibuchi, Kuroda et al. 1999).
A la différence des lymphocytes B matures, l’effet de l’AMPc dans les formes immatures
est plutôt EPAC dépendant. Dans ces cellules, l’augmentation de l’AMPc intracellulaire se traduit
par une inhibition de la voie PKB et cela indépendamment de l’activation de la PKA. En outre, il a
été démontré que l’AMPc, par la bais de la protéine EPAC, module le processus de sélection
négative des lymphocytes B immatures, avec un effet majoritairement pro-apoptotique. Nous
savons que la réponse des cellules B immatures à l’activation des BCR par un antigène dépend
de la balance entre signaux pro-apoptotiques, passant principalement par ERK1/2 (Marchildon,
Casnellie et al. 1984; Okada, Nada et al. 1991) et anti-apoptotiques passant par la voie PI3K/PKB
(Brdicka, Pavlistova et al. 2000; Kawabuchi, Satomi et al. 2000).
C] Outils technologiques permettant l’étude du signal

AMPc
De nombreuses techniques existent pour analyser le niveau d’AMPc cellulaire, depuis les
dosages classiques par anticorps jusqu’aux technologies récentes de suivi en temps réel. Nous
détaillerons ici quelques-uns de ces outils en décrivant leur principe (Tableau 4.2).
128
Technique Principe Suivi en Sur cellule Références

temps réel ou Unique ou
Accumulation Population
Dosage Quantification post Accumulation Population

lyse cellulaire
RIA ou
HitHUNTER
(DiscovrX®)
Sonde FICRhRR Sonde FRET Dynamique Cellule Unique Adams et al. 1991
PKA-like (imagerie) Goaillard et al. 2001
Zaccolo & Pozzan
2002
Canaux CNG Cellule Unique Rich et al. 2000

Electrophysiologie Dynamique (imagerie) Rochais et al. 2004
et HCN Nikolaev et al. 2006
Sonde EPAC Sonde FRET Dynamique Cellule Unique Ponsioen et al. 2004
(imagerie) ou Klarenbeek et
Population al.2011
(lecteur de Gorshkov and Zhang
plaque) 2014
Sonde AKAR Sonde FRET Dynamique Cellule Unique Zhang et al. 2001
PKA-like (imagerie) ou Zhou et al. 2012
Population Agarwal et al. 2014
(lecteur de
plaque)
Sonde Sonde Dynamique Population Binkowski et al. 2011

GloSENSOR Bioluminescente (lecteur de
plaque)
Tableau IV.2 : Classification des outils permettant l’étude de l’AMPc intracellulaire
C.1 – Technique de Dosage de l’AMPc intracellulaire
La plus ancienne technique de dosage de l’AMPc est basée sur l’utilisation d’anticorps
radio-marqués (RIA). La RIA est un procédé sensible qui permet la détection de l’ensemble de
l’AMPc intracellulaire à partir d’un lysat cellulaire. Il existe aujourd’hui des variantes non
radioactives de cette technique (HitHunter ® by Discoverx).
Ces techniques ont globalement deux inconvénients : elles nécessitent une lyse cellulaire
et ne permettent pas de suivre les modulations d’AMPc dans les cellules avec une résolution
spatiale. Or comme nous l’avons exposé plus haut, il existe une compartimentation du signal
AMPc. Par conséquent, d’autres méthodes sont nécessaires pour étudier les cinétiques et la
distribution spatiale du signal AMPc.
129
C.2 – Techniques résolutives utilisant le FRET ou la luminescence
Les premières techniques résolutives utilisaient la PKA et le processus de FRET

(Fluorescence Resonance Energy Transfert) (Adams, Harootunian et al. 1991; Zaccolo, De Giorgi
et al. 2000; Castro, Guiot et al. 2014; Gorshkov and Zhang 2014). Pour rappel, le FRET est un
phénomène quantique consistant en une transmission d’énergie non radiative (non lumineuse en
l’occurrence) d’une molécule fluorescente qualifiée de donneur à une molécule « acceptrice »,
elle aussi fluorescente, qui va donc émettre. Cette transmission d’énergie n’est possible qu’à
certaines conditions : (i) la distance entre les deux molécules doit être inférieure à 100Å ; (ii)
même proches, l’orientation de ces des molécules doit être adéquate à un travers d’énergie entre
les deux molécules fluorescentes, (iii) le spectre d’émission du donneur doit recouvrir le spectre
d’excitation de l’accepteur (Figure IV-5). Sur ce principe des biocapteurs de plus en plus sensibles
et résolutifs de l’AMPc ont été développés (Nikolaev and Lohse 2006). En plus de pouvoir étudier
la cinétique du signal AMPc, ces outils en permettent une visualisation par imagerie en temps
réel.
Figure IV-5 : Principe du FRET.

Le transfert d’énergie a lieu entre deux fluorophores lorsque
le spectre d’émission du donneur recouvre le spectre
d’absorption du receveur et lorsque ces fluorophores
présentent une orientation et une distance (<100 Å)
favorables.
CFP: Cyan Fluorescent Protein, YFP: Yellow Fluorescent
Protein.
C.2.1 - Techniques basées sur la PKA ou ses cibles
La première technique de visualisation de l’AMPc par imagerie de fluorescence a été

développée par l’équipe de Roger Tsien aux Etats-Unis. Cette sonde, baptisée FICRhR est une
PKA génétiquement modifiée : ses sous-unités catalytiques sont marquées par la fluorescéine et
130
ses sous-unités régulatrices par la rhodamine(Adams, Harootunian et al. 1991). En absence

d’AMPc, l’excitation de la fluorescéine est transmise par FRET à la rhodamine car les deux
fluorophores sont suffisamment proches. Lors d’une élévation d’AMPc, la dissociation des sous-
unités catalytiques et régulatrices conduit à un effondrement du signal FRET.
FICRhR a été utilisé avec succès dans plusieurs applications différentes. Il a notamment
permis d’étudier la cinétique de réponse AMPc dans les neurones (Bacskai, Hochner et al. 1993;
Hempel, Noll et al. 1996; Goaillard and Vincent 2002). Les premières preuves de la
compartimentation du signal AMPc ont d’ailleurs été observées grâce à cette sonde. Cependant
l’utilisation de cette sonde était très limitée car elle nécessitait la micro-injection de protéines
recombinantes marquées. Une amélioration de cette sonde a consisté au remplacement des
fluorophores chimiques par des variants de la GFP, permettant de la coder génétiquement et de
la faire exprimer par les cellules (Zaccolo, De Giorgi et al. 2000). Malgré cela, cette sonde
présente quelques défauts majeurs, liés à la complexité de son mécanisme d’activation, à son
adressage par le biais des AKAPs et surtout parce que l’activité kinase est préservée dans la
sonde. De plus il semble que le signal FRET donné par les capteurs PKA traduit la dissociation du
complexe PKA plutôt que les changements de concentrations d'AMPc (Goaillard, Vincent et al.
2001).
Les sondes AKAR (A-Kinase Activity Reporter) permettent également une mesure de
l’activité PKA en temps réel en recourant au principe du FRET. Il s’agit d’une protéine
recombinante constituée d’une chaîne polypeptidique portant un site consensus de
phosphorylation de la PKA et d’un domaine de reconnaissance des aa phosphorylés, insérés
entre des variants de la CFP (donneur) et la YFP (accepteur). Lorsque la PKA est activée, elle
phosphoryle AKAR sur son site consensus, entraînant son repliement et sa fixation au domaine
de reconnaissance, ce qui rapproche les deux fluorophores. Ce changement de conformation
permet le transfert d’énergie de la fluorescence de la CFP vers la YFP (Figure IV-6.A) La
première version d’AKAR a été mise au point en 2001 par Jin Zhang dans le laboratoire de Roger
Tsien (Zhang, Ma et al. 2001) Plusieurs versions de la sonde AKAR ont été développées,
modifiées et améliorées afin d’analyser la dynamique spatiotemporelle de l’activité PKA dans des
cellules vivantes (Allen and Zhang 2006; Zhou, Herbst-Robinson et al. 2012).
Une sonde luminescente, appelée GloSensorTM a été développée et commercialisée par

Promega®. Cette sonde est composée d’une forme mutante de la luciférase issue de Photinus
Pyralis dans laquelle la sous unité catalytique de la PKA, comportant le site de liaison de l’AMPc,
a été inséré (Figure IV-6.B). Lors de la liaison de l’AMPc, un changement conformationnel est
131
induit ce qui se traduit par un rapprochement des deux parties de la luciférase (principe de la
complémentation enzymatique) et à une émission de lumière proportionnelle à la quantité de
sonde « activée ». Il s’agit d’une technique proposée initialement pour le criblage haut débit
d’agoniste ou d’antagoniste des RCPG. Nous avons choisi cette technique pour étudier la
signalisation AMPc en aval des RCK car elle fournit un moyen simple et rapide pour l’investigation
d’une réponse AMPc. Elle présente l’avantage de pouvoir être travaillée en lecteur de plaque,
ainsi plusieurs concentrations ou chimiokines différentes peuvent être comparées simultanément.
Toutefois, elle ne permet que la visualisation d’une réponse globale et non d’une réponse issu
d’un compartiment subcellulaire donné. Il s’agit d’un excellent outil pour commencer à investiguer
les réponses AMPc en aval d’un RCPG. Cette première étude peut être complétée par une étude
en imagerie réalisée avec une sonde EPAC adressée spécifiquement dans un domaine cellulaire
donné.
C.2.2 – Techniques résolutives basées sur les cibles de l’AMPc
Une autre technique de mesure de l'AMPc en temps réel sur des cellules vivantes a été
développée sur la base des CNG. Ce sont des canaux cationiques non sélectifs constitués de
quatre sous-unités avec un site intracellulaire pour l'AMPc / GMPc (cf.§A.1.2). L'augmentation de
l'AMPc conduit à un déclenchement rapide de ces canaux. Cette activation qui peut être
enregistrée par des méthodes électro physiologiques ou d'imagerie calcique. Néanmoins, les
CNG natifs ont une affinité à l’AMPc beaucoup plus faible que la PKA. Par conséquent, plusieurs
mutants ont été créés pour augmenter l'affinité et la sélectivité de ces canaux pour l'AMPc (Rich,
Fagan et al. 2000). Du fait de leur nature de canal, les CNG sont localisés à la membrane, ce qui
est à l’origine de leur principal inconvénient : ils ne peuvent mesurer que les fluctuations d’AMPc
à la membrane plasmique.
C.2.3 – Sondes basées sur EPAC
Rappelons que la molécule EPAC se compose d’un domaine régulateur comportant un

site de liaison à l'AMPc et un domaine catalytique, qui a pour fonction de charger un GTP sur la
petite protéine G, Rap1, et ainsi de la maintenir dans un état actif (Figure IV-5.C). Deux groupes
indépendents ont créés des sondes FRET sur le modèle EPAC. Pour cela ils ont encadré la
molécule EPAC de deux fluorophores : CFP et YFP (DiPilato, Cheng et al. 2004; Ponsioen, Zhao
et al. 2004). Les auteurs suppriment le domaine DEP de la protéine endogène ce qui aura pour
effet une distribution cytosolique de la sonde et surtout une abolition de l’activité EPAC par
dimintuion de l’interaction avec sa cible : la protéine Rap1. Une seconde mutation (T781A,
F782A) vient compléter cette abolition de l’activité EPAC-like.
132
La liaison de l'AMPc de capteurs induit un changement de conformation qui conduit à une

diminution de FRET entre les fluorophores. Les affinités de ces capteurs pour l'AMPc sont
cependant nettement inférieures à celle de la PKA. Ceci permet de visualiser des concentrations
d'AMPc élevés mais peut conduire à une incapacité à détecter des concentrations plus faibles
d'AMPc, qui sont rapportées par les sondes PKA. D’un autre côté, cette plus faible affinité est
associée à une dissociation plus rapide de l’AMPc ; ainsi les sondes EPAC mettent en évidence
des cinétiques plus rapides que celle mesurées par les sondes PKA (Ponsioen, Zhao et al. 2004).
Le développement de biosenseurs FRET pour l’AMPc basés sur EPAC est en perpétuelle
évolution. Ainsi, Klarenbeek et ses collaborateurs ont récemment mis en évidence un nouveau
senseur qui semble encore plus performant, « T Epac-vv » (Klarenbeek, Goedhart et al. 2011).
C’est cette dernière version d’EPAC que nous avons utilisé pour l’étude du signal AMPc en aval
des RCK en imagerie.
Les nouvelles générations possèdent un signal d’adressage spécifique aux différents

compartiments subcellulaires, elles permettent ainsi d’enregistrer des signaux AMPc en tenant
compte de la compartimentation du signal AMPc (Agarwal and Agarwal 2014) .
133
Figure IV-6 : Outils dynamiques de mesure de l’AMPc cellulaire.

A- Sonde FRET AKAR : la sonde est dans une configuration où un transfert d’énergie entre le fluorophore
donneur et accepteur suite à une phosphorylation de son peptide substrat (région centrale en bleu) par la
PKA.
B- Sonde Bioluminescente GloSensor®- Représentation en 3D de la sonde (a) et Principe de fonctionnement de
la sonde (b): la fixation d’une molécule d’AMPc sur le domaine PKA de la sonde (marron) induit un
changement conformationnel et à l’activation de la luciférase. Cette dernière en hydrolysant son substrat émet
de la lumière.
C- Sonde FRET EPAC : la sonde est dans une configuration où le FRET est possible en absence d’AMPc
cellulaire. La fixation d’une molécule d’AMPc induit une diminution du transfert d’énergie du donneur vers
l’accepteur.
CFP: Cyan Fluorescent Protein, YFP: Yellow Fluorescent Protein.
134
135
V. Objectif de la thèse
L’objectif général de l’équipe est de mieux connaître les fonctions des chimiokines et de
leurs récepteurs, en particulier en situation inflammatoire et/ou pathologique. L’équipe s’est
concentrée en particulier sur l’étude moléculaire et structurale du couple CX3CL1/CX3CR1 afin
de définir des moyens d’intervention pharmacologiques dans différentes pathologies. Mon projet
de thèse consistait donc à étudier certains signaux déclenchés en aval du CX3CR1, et leurs
éventuelles différences selon leur activation par la forme soluble ou membranaire du CX3CL1.
Comme exposé dans l’introduction bibliographique, ces signaux sont pléiotropes et mettent en
œuvre plusieurs voies parallèles. Nous choisissons d’autres signaux que la phosphorylation des
MAPK ou que la voie calcique traditionnellement étudiées et qui n’ont révélé aucune variation
notable entre les variants du CX3CR1 (Daoudi, Lavergne et al. 2004). Comme il est admis que
les RCK sont couplés à une protéine G de la famille Gi/o, et sont donc capables, après activation
par leurs ligands, d’inhiber l’activité de l’adénylate cyclase, conduisant à une diminution de la
concentration d’AMPc intracellulaire, nous nous sommes principalement intéressés à cette voie
de signalisation, jusqu’ici admise mais méconnue en aval des RCK.
Mon travail de thèse s’est articulé autour de deux grands axes. Le premier consiste à la
caractérisation de la réponse AMPc en aval des RCK et plus particulièrement en aval du
récepteur CX3CR1. Dans cette première partie nous étudions la différence de signalisation
AMPc en aval du CX3CR1 stimulé par les deux formes du CX3CL1 et explicitons les
mécanismes impliqués. Le rôle de cette signalisation AMPc en aval du CX3CR1 sur les
fonctions associées à ce couple récepteur ligands à fait l’objet de la seconde partie de ma thèse,
Nous avons ainsi étudié l’effet de l’AMPc sur les fonctions adhésives et chimiotactiques du
couple CX3CL1/CX3CR1.
136
Objectif de la thèse
137
138
ARTICLE I
139
140
Monitoring the cAMP-inhibitory responses to chemokines
Evidence of kinetically different responses to the two forms of CX3CL1
De nombreux processus physiologiques et physiopathologiques font intervenir le

système des chimiokines. De ce fait, la connaissance et la compréhension des réponses
cellulaires en aval de leurs récepteurs (RCK) sont donc cruciales, notamment dans le
cadre du développement de molécules « médicaments » basées sur les chimiokines,
leurs analogues ou des antagonistes des RCK. Parmi les signaux déclenchés en aval
des RCK, l’existence d’une voie de signalisation AMPc en aval des RCK est connue
depuis leur découverte mais sa cinétique n’a jamais été explicitée. Parallèlement,
l’AMPc est décrit comme une molécule immunomodulatrice dont le rôle en aval des
RCK reste controversé. La commercialisation d’une nouvelle génération de biocapteurs
permettant le suivi en temps réel de la concentration cellulaire d’AMPc est à l’origine de
ce travail de thèse. L’existence de deux formes physiologiques du ligand CX3CL1, une
forme soluble et une forme membranaire, justifie son utilisation comme principal modèle
d’étude.
Les résultats obtenus être séparés en deux parties :
1- Optimisation d’une technique de mesure en lecteur de plaque de l’AMPc en

réponse aux chimiokines solubles – Exemple des chimiokines CX3CL1 et
CXCL12.
L’utilisation de la sonde GloSensor dans le but d’étudier les cinétiques des

réponses chimiokinergiques a nécessité une phase d’optimisation. Nous avons établi un
clone HEK293 exprimant de manière stable le récepteur d’intérêt, CX3CR1 et la sonde
(HEKgloCX3CR1). L’utilisation majoritaire de ce modèle cellulaire s’explique par les
difficultés techniques rencontrées pour faire exprimer la sonde dans un modèle cellulaire
plus physiologique. En effet, nous avons testé différents protocoles de transfection,
électroporation et nucléoporation sur différents modèles cellulaire : lignées murines ou
humaines (THP-1, U937, Monomac 6, BV-2, HBP-ALL, Jurkat, NK) ou des cellules
natives (PBMC totaux, monocytes CD14+). Un lentivirus a également été généré en
collaboration avec une équipe du centre de recherche mais sa transduction dans les
différents types cellulaires, lignée ou cellules primaires est restée sans succès, sauf
dans les HEK293. Aussi malgré ses limites, le clone HEKgloCX3CR1, nous a permis
141
d’expliciter la cinétique de la réponse AMPc induite par les chimiokines. L’étude de la

réponse à la chimiokine CXCL12 a pu être réalisée grâce à l’expression endogène du
récepteur CXCR4 à la surface des ces cellules.
Contrairement aux études du même type réalisées avec d’autres techniques de

mesure de l’AMPc par accumulation, nous n’utilisons pas la FSK combiné à l’IBMX, un
inhibiteur des PDE, mais la FSK seule et à faible dose (< 1µM). De ce fait, malgré un
modèle cellulaire basique, les HEK293, nous travaillons dans un contexte cellulaire
proche de la physiologie, car nous ne supprimons pas l’activité de dégradation induite
par les PDE.
Nous avons donc, mis en évidence une réponse AMPc inhibitrice induite par les
chimiokines solubles, CX3CL1 et CXCL12 (Article - Figure 1). Ces réponses présentent
une cinétique et une amplitude indépendantes des différentes conditions de mesure. En
effet la nature de la molécule utilisée pour préstimuler le niveau d’AMPc intracellulaire,
forskoline (FSK) ou prostaglandine (PGE2) n’influence ni l’amplitude, ni l’allure de la
réponse aux chimiokines. De même, les réponses chimiokinergiques sont inchangées
indépendamment de plusieurs paramètres dont:
- la concentration de FSK utilisée (à condition d’être dans la phase linéaire de

la sonde) (Article – Figure 3 & Figure S3)
- le moment d’addition de la chimiokine par rapport à l’addition de la FSK
(Article – Figure 2)
- la sous famille de chimiokine considérée (Article – Figure 5)
L’activation d’un RCK ne semble pas induire de désensibilisation croisée des

autres RCK exprimés à la surface de la même cellule (Article – Figure 6)
Nous avons ainsi standardisé la mesure des réponses chimiokinergiques

associées à une diminution d’AMPc et ainsi utilisé cette méthode pour identifier ou
confirmer le caractère antagoniste des différentes molécules développées au sein du
laboratoire. C’est le cas de la molécule F1 (Article – Figure 8A & Figure S9) un
antagoniste compétitif de CX3CL1, utilisé pour étudier indirectement la cinétique
d’internalisation du récepteur CX3CR1. En effet, l’addition de F1 à différents temps
142
après le CX3CL1, induit l’arrêt de la réponse AMPc et son retour rapide à zéro.
Toutefois ce phénomène n’est observable qu’au cours des 16 premières minutes après
l’addition de la chimiokine (Article – Figure 8A). L’étude par cytométrie en flux de
l’expression du CX3CR1 à la surface révèle que le nombre de récepteur est réduit de
moitié 30 minutes après addition de la chimiokine soluble (Article – Figure 8B).
L’inhibition de l’internalisation par le dynasore abolit la diminution du nombre de
récepteurs consécutive à l’addition de la chimiokine et modifie la cinétique de retour de
la réponse AMPc inhibitrice (Article – Figure 8C).
Il semble donc que l’internalisation du récepteur soit l’un des paramètres à l’origine du
retour à zéro de la réponse.
L’effet des phosphodiestérases (PDE) a été étudié à l’aide de l’IBMX, un

inhibiteur de ces dernières. Nous observons une modification de la cinétique des
réponses chimiokinergiques, aussi bien sur leur cinétique d’apparition (maximum
obtenu en 8 minutes sous FSK contre 20 minutes sous IBMX) avec un ralentissement
du temps d’obtention de la réponse maximale que sur la cinétique de retour (Article –
Figure 4 & Figure S4). Par contre, son amplitude n’est que peu affectée.
2- Mise en évidence d’une réponse AMPc différentielle en aval du CX3CR1 activé

par les formes soluble ou membranaire de son ligand, la chimiokine CX3CL1.
Une adaptation du protocole de mesure a été nécessaire afin d’étudier la réponse

à la chimiokine membranaire. En effet, lors de la mesure de la réponse induite par les
chimiokines solubles, les cellules HEKgloCX3CR1 sont adhérentes au fond du puits de
la plaque de mesure et les solutions de FSK et chimiokines sont additionnées
par-dessus. Dans le cas de la mesure de la réponse à la forme membranaire, les
cellules HEKgloCX3CR1 sont mises en suspension et déposées sur un tapis de cellules
L929 exprimant ou non CX3CL1 à leur surface. Ce sont ces dernières qui sont adhérées
au fond de la plaque. Nous avons donc vérifié que la mise en suspension des
HEKgloCX3CR1 n’affecte pas la réponse AMPc (Article – Figure S6).
Une réponse AMPc inhibitrice a été mesurée en aval du CX3CR1 activé par la
forme membranaire du ligand (Article – Figure 7). Il s’agit du premier signal mesuré
143
induit par cette forme du CX3CL1. En effet, le CX3CL1 membranaire se « cantonné » à

un rôle mécanique de molécule d’adhérence.
Comparée à la réponse observée en aval du récepteur activé par la forme soluble
(Article – Figure 7B), cette réponse à la forme membranaire est nettement plus lente
aussi bien dans sa phase de descente que dans sa remontée. De plus elle apparait
comme quantitativement différente. Contrairement à la forme soluble, elle ne mobilise
pas l’ensemble des récepteurs de la cellule, malgré une amplitude de réponse similaire
à la réponse observée avec une dose de CX3CL1 soluble saturante. En effet, des
HEKgloCX3CR1 mises en contact sur des LCX3CL1 et secondairement stimulées par
une addition de CX3CL1 soluble, présentent une réponse avec deux vagues: une
première réponse à la forme membranaire suivie de la réponse à la forme soluble
(Article – Figure 7A). Par comparaison deux additions séquentielles de CX3CL1 soluble
n’engendrent qu’une seule vague de réponse (Article – Figure 6).
Une internalisation différentielle du récepteur semble être en partie à l’origine de

cette différence de cinétique des réponses AMPc induites par les formes solubles ou
membranaires (Article – Figure 8B vs Figure 9). L’hypothèse d’une libération
progressive de CX3CL1 soluble dans le milieu cellulaire à partir de la forme
membranaire a été écartée grâce à l’expérience qui a consistée à additionner sur des
HEKgloSensor les surnageants issus de culture de L929 ou LCX3CL1 (Article – Figure
S8).
Ce travail a permis d’optimiser la mesure d’une réponse AMPc inhibitrice en

lecteur de plaque, facilitant ainsi l’étude des cinétiques des réponses chimiokinergiques
et par extension le criblage des peptides ou protéines antagonistes développées pour
agir sur la signalisation en aval des RCK. Cette technique nous a permis d’expliciter
pour la première fois une signalisation en aval du récepteur activé par la forme
membranaire du CX3CL1 en plus de celle induite par la forme soluble. Les mécanismes
à l’origine de la différence de cinétique observée sous CX3CL1 soluble ou
membranaires restent à découvrir, mais il semble que l’internalisation et les
phosphodiestèrases ne soient pas indifférentes à cette thématique.
144
Virginia Felouzis*†‡, Patricia Hermand*†‡, Christophe

Combadière*†‡ and Philippe Deterre*†‡
*INSERM, U 1135, Centre d'Immunologie et des Maladies Infectieuses, 91 boulevard de
l’Hôpital F-75013, Paris, France
†Sorbonne Universités, UPMC Université Paris 06, UMRS CR7, Centre d'Immunologie et des
Maladies Infectieuses, 91 boulevard de l’Hôpital F-75013, Paris, France
‡CNRS, ERL 8255, Centre d'Immunologie et des Maladies Infectieuses, F-75013, 91 boulevard
de l’Hôpital Paris, France
Corresponding author: Philippe Deterre, [email protected]
Background: Kinetics of the Gi-mediated cAMP-inhibitory chemokine responses is

unknown
Results: Using cAMP-related biosensor, the responses to both soluble and membrane
forms of CX3CL1 are monitored in real time. Membrane form evokes a prolonged
response Conclusion: the cAMP-inhibitory response is mainly driven by the
internalization of the cognate receptor
Significance: Biosensor could help to precise the role of cAMP-inhibitory responses
Keywords: chemokine, cAMP, biosensor, adenylyl-cyclase, Gi, phosphodiesterase,
internalization, CXCR4, CXCL12, CX3CR1, CX3CL1, forskolin
145
Abstract
Receptors of the chemokines are all G-protein Coupled Receptors (GPCR) coupled to members
of the Gi family, whose primary function is to inhibit the cellular adenylyl cyclases. We use here
a cAMP-related luminescent biosensor (GlosensorTM F-22) to monitor in real time the response
downstream the chemokine receptors, and especially CX3CR1 and CXCR4 after activation by
CX3CL1 and CXCL12. We found that the amplitude and kinetic profile of chemokine responses
were conserved in different cell types and was independent of the nature and of the concentration
of molecules used for the previous cAMP stimulation, as the adenylate cyclase activator forskolin
or ligand of Gs-coupled GPCR. This response outline was also independent of the time elapsed
between the additions of the cAMP-stimulatory ligand and of the chemokine. Moreover the
response amplitude was only slightly changed in the presence of inhibitors of cAMP-related
phosphodiesterases. We show that this conserved chemokinergic response could be accounted by
a simple model combining Gi action on adenylate cyclase and an associated phosphodiesterase
activity whom activity is a linear function of the cellular cAMP concentration. Finally, using
competitive inhibitors of CX3CR1 and inhibitors of internalization, we found that the outline of
the CX3CL1 response is mainly governed by the surface receptors and that receptor
internalization had a major role in the decline of the response.Consistently, we found that the
native membrane form of CX3CL1, which did not induce the receptor internalization, evoked a
significantly prolonged cAMP-inhibitory response as compared to the one induced by the
soluble form. We conclude that cAMP-related biosensors are valuable tools to analyze in
details the chemokines cellular response and could help to decipher their precise role in
modulating the cellular action of cAMP. We conclude that cAMP-related biosensors are valuable
tools to analyze in details the chemokines cellular response and could help to decipher their
precise role in modulating the cellular action of cAMP.
146
Introduction
Cyclic AMP (cAMP) is a ubiquitous second messenger known to regulate diverse functions
(Sutherland, 1972). The cAMP signal is mediated by G-protein coupled receptors and
transmits information to downstream effectors like PKA use and EPAC. Recent use of
FRET and BRET biosensors (Rich and Karpen, 2002; Willoughby and Cooper, 2008;
Vilardaga et al., 2009; Lohse et al., 2012; Castro et al., 2014) allowed to unravel subtle
kinetic information of this cellular signal and unexpected compartmentation and diffusional
restrictions of the cAMP signal and partners (Rich et al., 2001; DiPilato et al., 2004; Mongillo et
al., 2004). Most of these studies were done with cAMP-stimulatory ligands like adrenergic ones
in cardiomyocytes (Mongillo et al., 2004) or dopaminergic neuronal responses (Castro et al.,
2013) and rarely addressed the Gi-mediated inhibitory signals, like those evoked by
chemotactic cytokines or chemokines.
Chemokines are secreted soluble molecules expressed by numerous immune cell types, either
constitutively or upon induction by inflammatory conditions. They play a central role in cell
chemotaxis and positioning in the immune system and development. Their signaling is central to
the inflammatory process and is dysregulated in autoimmune disorders, rheumatologic diseases
and atherosclerosis (Baggiolini, 1998; Viola and Luster, 2008). Chemokine receptors are
essentially G- protein Coupled Receptors (GPCR), members of the Rhodopsin class, coupled to
Gi classes of G-proteins. However, some chemokine receptors were recently found coupled to
Gq (Shi et al., 2007). The chemotactic activity of chemokines involves both activation of cell
movement as well as adherence on various support via integrins. While evidenced as early as
calcium responses downward chemokine receptors (Myers et al., 1995), the role of cAMP in
such functional roles of chemokine remains controversial. Some studies indicate a regulatory
role of the messenger in monocyte chemotaxis towards CCL2 (O'Boyle et al., 2007), while
others indicate a positive role (Lorenowicz et al., 2006) or no role at all (Jarnagin et al., 1999).
Considering the monocytic adhesion, the same dispute exists (Cambien et al., 2001;
Lorenowicz et al., 2006; Mori et al., 2007), probably due to lacking detailed analysis of the
cAMP variation. So the study of the cAMP signal evoked by chemokines in real time is
urgently awaited.
While chemokines generally operate through cell adherence by inducing or activating classical
adhesive molecules like integrins (Moser and Loetscher, 2001; Rot and Von Andrian, 2004),
CX3CL1 is an exception since it is natively expressed as a transmembrane protein that is
endowed with an adhesive function unique among chemokines. When interacting with its
unique receptor, CX3CR1, CX3CL1 induce cell-cell adhesion (Ludwig and Weber, 2007). It
can be cleaved by metalloproteinases, such as ADAM10 and ADAM17 (Garton et al., 2001;
Hundhausen et al., 2003; Ludwig et al., 2005), to yield a soluble form that is chemotactic.
Until now, the cAMP-inhibitory signal has not been involved in any CX3CL1/CX3CR1
functional responses. Moreover, it seems that the cellular responses downward CX3CR1 when
147
bound to one or another form of CX3CL1 are qualitatively different. Indeed, Kim et al (Kim et
al., 2011) showed that only the membrane anchored full-length CX3CL1 was able to rescue
the CX3CR1hi blood monocytes from cell death. So we investigated the potential differences
between the cellular cAMP responses evoked by both forms of CX3CL1 by measuring
cellular cAMP in real time using the Glosensor biosensor. We found that the cAMP-
inhibitory signal is lasting more than two-fold longer when evoked by membrane CX3CL1
than by the soluble form. This was shown to be due to the fact that the CX3CR1 receptors
bound to membrane CX3CL1 are hardly internalized.
148
Materials and Methods
Materials and Reagents

Cell culture media were from Gibco – Life technologie. FBS are from Dutscher (Les
Ulis,France). Forskolin (FSK), 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) and prostaglandin E2
(PGE2), hygromycine, geneticine (G418), are from Sigma-Aldrich. Pertussis toxin (PTX) was
from Enzo life sciences. Dynasor was from Calbiochem (Merck Millipore-Guyancourt,
France). 96-well clear-bottomed white microplates were from Greiner-Bio-One (Dutscher-Les
Ulis, France). JetPei was from Ozyme (Montigny-le Bretonneux, France). The Dual-
Luciferase® reporter assay system, pGloSensorTM-22F-cAMP plasmid and GloSensorTM
cAMP reagent were purchased from Promega (Charbonnière, France). CX3CL1 chemokine
domain and CX3CL1 full length were from R&D systems (Lille, France) while CXCL12,
CXCL26 and CCL2 were from Peprotech (Neuilly sur Seine, France). Human CX3CR1-
Phycoerythrin antibody, Human CXCR4- Allophycocyanin-conjugated antibody and the
IgG2A-APC conjugated isotype were from R&D systems (Lille, France).
Cell Culture
HEK293 and L929 cells were cultured in Dulbecco’s modified Eagle’s Medium plus
GlutaMax I (DMEM) supplemented with 10% FBS and 1mM sodium pyruvate. We generate
a stable cell line HEK293 expressing human CX3CR1 gene and the bioluminescent sensor
Glosensor F-22 (HEK- CX3CR1-Glo). We generate a stable cell line HEK293 expressing
human CX3CR1 gene and the bioluminescent sensor GloSensor F-22 resistant to 0.5mg/ml
G418 and to 100ng/ml Hygromycin B. We use a stable cell line L929 expressing on their
surface the human CX3CL1. This expression is maintained thanks to 0.5mg/ml G418.
HBP-ALL and Jurkat cell line are maintained in Roswell Park Memorial Institute Medium
(RPMI- 1640) supplemented with 10% FBS. The HBP-all cell line used is a stable clone
expressing human CX3CR1 gene.
Creation of the HEK-CX3CR1-GloSENSOR cell line

Human HEK293 cells expressing human CX3CR1 gene were transfected with a plasmid
encoding an engineered cAMP sensitive luciferase (pGloSensorTM-22F-cAMP plasmid,
Promega) by JepPei method (Ozyme). These cells (HEK-CX3CR1-Glo) were grown in 88%
DMEM, 10% FBS, 1% sodium pyruvate, 1% penicillin and streptomycin, geneticin (0.5mg/ml)
and hygromycin (100µg/ml). Resistant clones were isolated, expanded and selected for their
ability to respond to FSK.
149
Electroporation of Jurkat cell line and HBP-ALL CX3CR1 cell line

Prior to electroporation, the cells were washed with PBS, counted, and resuspended in RPMI-
1640 FBS free to a cell density of 5×106 cells/400µl in gene pulser® cuvette 4mm (Bio-Rad,
Hercules, CA) and mixed with 10µg of pGloSensorTM-22F-cAMP plasmid. After 10 minutes at
room temperature, prior to the delivery of a single electrical pulse at 270V and a capacitance of
950 µF. The cell suspension was transferred to prewarmed culture medium and incubated for 24h
at 37°C in a humidified atmosphere of 5% CO2.
Flow cytometry
Flow cytometry was performed using FACSCalibur (BD Bioscience, Le Pont de Claix, France)
for acquisition and analysis was performed using Flowjo software (Tree Star,Ashland,OR).
HEK- CX3CR1-Glo cells suspension was distributed in 96-round-bootom well plates
(5x105/well) in DMEM in the presence of XnM human CX3CR1-PE or CXCR4-APC for
30minutes at room temperature. Isotype control are used for detect the negative population. We
used an IgG2B-PE and an IgG2A-APC. Cells were washed twice in PBS-BSA 0.5% and
directly analyzed by flow cytometry. Results are expressed in mean fluorescence intensity
(MFI) of PE.
GloSensor assay
The day before the experiment cells expressed the biosensor seeded in 96-well clear-bottomed
white microplate in 100µl of culture medium were incubated at 37°C, 5% CO2 overnight.
Culture medium was replaced by CO2 independent medium containing a 2%v/v GloSensor
cAMP reagent stock solution and 10% FBS. After 90 minutes of incubation at 37°C, the
luminescence was measured using a TRISTAR plate reader (Berthold technologies- Thoiry,
France) (100ms integration). The luminescence was recorded before and after injection of the
drugs (FSK, chemokine and vehicle). This protocol is valid for the measurement of
responses induced by the soluble form of the chemokine. For membrane form of chemokine,
we adapted the protocol as following. The day before the experiment, L929 and L-CX3CL1
seeded in 96-well clear-bottomed white microplate in 100µl of culture medium and incubated
at 37°C, 5% CO2 overnight. In parallel, the cells expressed the biosensor were seeded in 6-well
plate in 2ml of culture medium. The day of the experiment, cells expressed the biosensor
were equilibrate in CO2 independent medium containing a 2%v/v GloSensor cAMP reagent
stock solution and 10% FBS. After this step, if the cells expressed CX3CR1 and the
biosensor were dispensed in 96-well clear-bottomed white microplate containing L929 cells
and FSK.
150
Results
The cAMP-inhibitory response to chemokines is independent of the cAMP

prestimulation way
To explore the cAMP-inhibitory chemokine response, we employed the HEK293 cell
line often used to monitor Gs-related cAMP responses (Violin et al., 2008; Leduc et al., 2009;
Rosethorne et al., 2010; Nobles et al., 2011) and to analyze the chemokine responses
(Combadiere et al., 1995; Myers et al., 1995). From a HEK293 cell clone that constitutively
expressed CXCR4 (Figure 1A) and that ectopically expressed CX3CR1 (Daoudi et al., 2004)
(Figure 1B), we obtained a sub-clone stably expressing the luminescent biosensor called
GlosensorTM-22F (Promega, Charbonnières, France). This biosensor consists in a recombinant
firely luciferase coupled to the PKA cAMP-binding domain, where cAMP binding promotes a
conformational shift within the biosensor inducing luciferase activity. The HEK subclone
expressing the biosensor - hereafter called HEKgloCX3CR1 - exhibited a stimulatory
response to Forskolin, a classically used adenylyl cyclase activator (Seamon et al., 1981)
(quoted here FSK) (Figures 1C black trace). As expected, this FSK response was absent
when using the parental HEK293 clone that does not express the biosensor (Figure 1C
b l a c k dotted trace). We also tested a more physiological way to obtain prior cAMP
stimulation, i.e. agonists of GPCR coupled to Gs like prostaglandin receptors that are
present in HEK293 (Morath et al., 1999; Desai and Ashby, 2001). Addition of PGE2 to
HEKgloCX3CR1 gave rise to a signal similar to that evoked by FSK (Figure 1E, black trace).
To evidence cAMP-inhibitory responses, the chemokine was added at the time of peak
of the FSK or PGE2 response. Using 100 nM of either CX3CL1 (Figures 1C and 1E, red
traces) or CXCL12 (Figures 1C and 1E, green traces), we observed a significant
inhibition while the addition of the control chemokine CCL2 left the signals unchanged
(Figures 1C and 1E, blue traces). So the net responses obtained after addition of CX3CL1
or CXCL12 – i.e. difference between signals obtained in the presence (Figures 1C and 1E,
red and green traces) or in the absence of chemokines (Figures 1C and 1E, black traces) –
have similar profiles, the cAMP prestimulatory ligand being FSK (Figure 1D) or PGE2
(Figure 1F): the chemokine responses reached a peak 8-10 minutes after the chemokine
addition and displayed a slow decay that achieved 50% of the peak amplitude after 40- 50
minutes. When expressed as percent of the maximum of the control signals (Figures 1D and
1F, right side ordinate), the amplitude of the response to both CX3CL1 and CXCL12 were
found around 35-40%. Moreover, we found similar dose-response curves, the prestimulation
would be done with either PGE2 or FSK. Finally, we found that responses to both
chemokines were suppressed after a Pertussis toxin treatment (Figures 1D, black and grey
traces) bearing out the chemokine responses are through the Gi-pathway.
Natively, the soluble form of the CX3CL1 chemokine is not the chemokine domain
alone as for the other chemokines like CXCL12, but includes a mucin stalk (Bazan et al., 1997).
So we checked that the full length soluble CX3CL1 evoked a response similar to that of the
151
CX3CL1 chemokine domain (Figure S1).

We next examined whether the response is conserved when the chemokine is added
at different times after the Gs-related ligand (Figure 2A) or the FSK (Figure 2B). In this
case, each response was expressed at percent of the amplitude of the control signal gained at
the moment of chemokine addition. We observed that the chemokine responses had similar
amplitude and outline (Figures 2C and 2D) to that the described above (Figure 1), whether
chemokine was added simultaneously with FSK or PGE2 (Figures 2C and 2D, black traces),
3 minutes (blue traces), 20 minutes (green traces) or 60 minutes (red traces) after FSK or
PGE2.
The chemokine response was further analyzed according to the amplitude of the
cAMP-prestimulatory signal. This was done by using different concentrations of FSK added
before the chemokine. The addition of 0.5 µM, 1 µM, 5 µM and 20 µM FSK gave signals
with amplitude levels staggering between 300 and 4000 luminescence units (Figure 3A, thin
traces). In each case, CX3CL1 induced a net inhibitory response (Figure 3A, bold traces).
When expressed in percent of the control signal, the responses to CX3CL1 were very similar
when using FSK concentrations of 0.5 µM or 1 µM (Figure 3B, black and red traces), with
an amplitude peaking at 25-30%. In the presence of higher FSK concentration, i.e. 5 µM and
20 µM (Figure 3B, blue and green traces), the FSK signal was greater than 2000
luminescence units and the amplitude of the subsequent chemokine response was found
smaller (5-15%). This was more evident in Figure 3C (circles) where the amplitude of the
CX3CL1 response was reported versus the FSK concentration used for the prestimulation.
This distortion at highest FSK concentration was probably due to the saturation of the
biosensor, as indicated by the Glosensor Manufacturer when luminescence exceeds 2000
units. This nonlinear behavior was confirmed here when using a permeant non-hydrolysable
cAMP analog (Figure S2): at concentration below 0.5 µM, the amplitude of the signal was
lower than 2000 and linear versus the cAMP analog concentration. Using concentration of the
cAMP analog above 0.5µM, the amplitude of the observed signal began to saturate.
In the other hand, using FSK concentration lower than 50nM gave chemokine
responses with a signal-to-noise ratio lower than 10 (Figure 3C, right side ordinate) rending
the analysis less easy. So we decide to work hereafter with FSK concentration in the 0.05-
1µM range. Taken together, our data indicate that the chemokine response was robust and
did not depend on the nature of the prestimulatory compounds, nor of the time of addition of
the chemokine, when keeping the signal in the linear range of the biosensor activity.
According to the study of Gs-mediated cAMP-stimulatory responses, the cellular
phosphodiesterases are involved in both limiting the amplitude of the responses and allowing
their rapid decline. As expected, the addition along with FSK of IBMX, a non-selective
phosphodiesterase inhibitor, gave a considerably increased signal (Figure 4A, black trace).
However, the amplitude of responses to both CX3CL1 and CXCL12 expressed as percent of
control (Figures 4B and 4C, black traces) remained similar to that observed in absence of
IBMX (Figures 4B and 4C, grey traces), the response kinetics being slightly slowed
down: the maximum of the response appears only after 25 minutes instead of 8-10 minutes
and the response decay achieved 50% of the peak amplitude after more than 90 minutes. The
152
same picture was obtained when using alone IBMX at a concentration giving a signal
equivalent to the FSK signal (Figure S3).
Similar responses are obtained with other chemokines and in other cell lines
Using HEK293 clones transitory transfected with CXCR6 or CCR2 along with the
Glosensor, we obtained responses to CXCL16 and CCL2 (Figure 5, grey traces) which were
akin to that of CX3CL1 and CXCL12 (Figure 1) and were both suppressed after Pertussis
Toxin treatment (Figure 5 black traces). Moreover, similar response to both chemokine was
also found in lymphocytic cell lines like the Jurkat (Figure S4A) and HPB-ALL (Figure
S4B). However, the FSK signals in these cell lines were very small as compared to the ones
obtained in HEK293, giving chemokine responses with larger noise. This was probably due to
the hard biosensor transfection in such cell lines.
Absence of cross desensitization between responses to different chemokines
Since chemokines seem to share the same signaling machinery, we wonder whether the
addition of one chemokine might suppress the subsequent response to another. While after a
full response to CX3CL1, a second addition of CX3CL1 gave not signal at all (Figure 6A,
trace a, bold arrows), a second addition of CXCL12 gave a clear response (Figure 6A, trace b,
empty arrow). A similar picture was observed in the reverse case, i.e. when the CX3CL1 addition
followed the CXCL12 addition (Figure 6A, trace c). Moreover, the individual CX3CL1 responses
expressed as percent of the control at the time of the chemokine addition were similar, whether the
CX3CL1 was added first (Figure 6B, red trace corresponding to trace a), after CXCL12 (Figure
6B, green trace corresponding to trace c) or after the control chemokine CCL2 (Figure 6B, blue
trace corresponding to trace d). The same picture was also found for CXCL12 responses (Figure
6C). This indicates (i) that there was no crossed desensitization between responses to two
different chemokines and (ii) that the intracellular machinery was not the limiting factor to the
amplitude of the response to individual chemokine. To confirm this latter deduction, we
performed simultaneous addition of CX3CL1 and CXCL12 (Figure 6A, trace f). As expected,
this gave a signal greater than those obtain to single chemokine (more than 50%); however its
amplitude did not clearly correspond to the mere addition of both single responses.
Soluble and membrane forms of CX3CL1 evoke responses with different kinetics
To monitor cellular responses to the membrane form of CX3CL1, we needed to work
with CX3CR1-positive cells in suspension. So we first checked that suspended
HEKgloCX3CR1 cells display the same response than when adherent. We indeed found that
both amplitude and outline of the response were similar (Figure S5A), as well as the dose-
153
response curve (Figure S5B). Then we monitored the signal produced by suspended HEK293
deposited on a cell layer of L929 cells expressing or not CX3CL1 (Figure 7A insert) in the
presence of FSK. We did observe a net inhibitory response in the presence of membrane
CX3CL1 (Figure 7A, compare bold and thin traces). This response was reported as
percent of control in Figure 7B (black trace). Its amplitude was comparable to that obtained
with the soluble CX3CL1 on the same cells (Figure 7B, grey trace), but with a very
slower kinetics: it peaked only 25-35 minutes after the chemokine addition, and more than 90
minutes were needed to observe a signal back to 50% of the maximum.
One could argue that this signal slowness could be due to the limiting time of
HEKgloCX3CR1 cells landing to the L929 cells at the bottom of each well. So we doubled
the volume in which HEKgloCX3CR1 cells were suspended, expecting a slower response:
this was not the case; we observed that the kinetics of the response remained unchanged
(Figure S6). Another alternative explanation could be the cleavage of the membranous
CX3CL1 on the L929 cells giving a continuous source of soluble CX3CL1. We therefore
analyzed the supernatant of these L929 cells expressing or not CX3CL1: we found the first
did not contain any detectable CX3CL1 while the CX3CL1-positive L929 secrete less than
0.1pM of CX3CL1 after 2 h of incubation. This was confirmed by adding supernatant of
CX3CL1-positive L929 to HEKgloCX3CR1 (Figure S7): we did not observe any
significantly differential signal using supernatants after 15 min or 60 minutes of incubation. The
120 min-supernatant gave a very slight signal, which amplitude was less than 7% of the control.
So the response we observed in the presence of CX3CL1-expressing L929 came actually from
the membrane CX3CL1. Finally, the difference between responses to both forms of CX3CL1
were clearly illustrated by successive action of both ligands (Figure 7A, bold and grey
trace): adding soluble CX3CL1 after 45 minutes gave a response that was faster than the
response to the membrane CX3CL1; the first is finished when the second is still under course.
Role of receptor internalization in the dynamics of the chemokine response

The possible role of the internalization of the chemokine receptor in shaping the
cAMP-inhibitory response was first investigated using the CX3CR1 antagonist F1 we recently
identified (Dorgham et al., 2009). We first showed that the F1 was a competitive antagonist
regarding the CX3CL1-evoked cAMP-inhibitory response (Figure S8A) as found using the
intracellular calcium signaling (Dorgham et al., 2009): as hallmark of the competitive
inhibition, the double-reciprocal plot gave the same intercept in the presence of in the absence
of inhibitor ( Figure S8B).
Adding a saturating concentration of F1 along with the chemokine effectively suppressed
the response (Figure 8A, compare traces a and b). When added 8 minutes or 16 minutes after
CX3CL1, the antagonist elicited a rapid return to zero of the signal and shortened the
response (Figure 8A, traces c and d). By contrast, F1 addition after the response peak, i.e.
at 30 or 90 minutes, had no effect (Figure 8A, traces e and f), indicating that the receptors
possibly involved in the continuing response are no more accessible to the external antagonist.
Consistently, we found that the surface CX3CR1 decreased during 30 minutes after CX3CL1
154
addition and remain stable until 90 minutes (Figure 8B, black dots).
Then we used Dynasore, an inhibitor of the dynamin-mediated receptor internalization
(Kirchhausen et al., 2008; Huang, 2009 #12902}). After treatment with such compound, the
CX3CR1 internalization was indeed completely abolished (Figure 8B grey dots). Such a
treatment remained the cAMP-inhibitory response unchanged regarding its onset, while its
decay was significantly slowed down (Figure 8C). The same picture was obtained with the
CXCL12 response (Figure S9).
In contrast to the soluble form of CX3CL1, the membrane form is not expected to
induce the CX3CR1 internalization (Figure 9).
Discussion
The present work shows that the use of cAMP biosensor is a valuable tool to delineate the
cAMP- inhibiting responses downward chemokine receptors and especially here downward
CX3CR1, stimulated by either soluble or membrane forms of its natural ligand, CX3CL1.
Such biosensors based on luminescence {Nobles, 2011 #15693} or FRET techniques
(Nikolaev et al., 2004; Ponsioen et al., 2004; Nikolaev et al., 2006; van der Krogt et al.,
2008; Depry et al., 2011) were largely used to decipher the temporal dynamics of the Gs-
mediated (Allen and Zhang, 2006; Klarenbeek et al., 2011) or Gq-mediated (Shen et al., 2012;
Shen and Cooper, 2013) cAMP- related stimulatory signal. However, the Gi-mediated cAMP-
inhibitory signals are rarely monitored in such a way (see (DiRaddo et al., 2014). Some studies
used the 22F-GloSensorTM cAMP- luminescent biosensor to quantify the Gi-mediated responses
in HEK293 cells but only in an end- point manner (Nobles et al., 2011; Gilliland et al.,
2013); we used it to monitor its kinetics. We primarily found that the responses evoked by
155
chemokines expressed as percent of inhibition were remarkably conserved regarding either its
amplitude than its kinetics. The chemokine response seems limited to 30-40% inhibition
regardless the prestimulation way (Figures 1, 3-4, S3), the time of chemokine addition (Figure
2), the cellular configuration (suspended or adherent) (Figure S5) and the cell type (Figure
S4). This amplitude is of the same order of the amplitude of chemokine Gi-mediated response
already found by conventional assays of cellular cAMP (Myers et al., 1995;O'Boyle et al.,
2007 ;Shyamala et al., 1998 )
As expected, the main limiting factor to observe such cAMP-inhibitory responses is the
sensitivity and the linear dynamic range of the biosensor: the prestimulation signal should be
enough great to allow the observation of the cAMP-inhibiting response (50 nM FSK in our
case, Figure 3C) and not too high to remain in the linear range of the biosensor and avoid its
saturation (1 µM FSK, Figure 3C). This globally matches with the dynamic range of the 22F-
GloSensorTM recently described (Binkowski et al., 2011) and illustrated in Figure S2, i.e. in
the cAMP concentration of 10-9-5.10-7 M.
The activity level of a biosensor such the cAMP-related GloSensor in a cellular context is
controlled by several parameters, the first being the apparent affinity of the biosensor binding
domain for its metabolite. It is relatively easy to know the on-rate of such cAMP biosensor by
using permeant and non-hydrolysable cAMP analogues (Figure S2). However, the limiting
step to monitor a cAMP-inhibitory response with such biosensor is the off-rate of cAMP
from the biosensor site, and this reaction is less easy to test. We found here that the Gi-
mediated chemokine response peaked after 8-10 minutes of chemokine stimulation. This is
relatively slower than the onset of the Gs-mediated responses like those evoked by PGE2
(Figure 1E) or by beta-adrenergic ligands (Binkowski et al., 2011) that peaked 4-6 minutes
after ligand addition. So it is not impossible that the cAMP desorption from GloSensor could
limit in some extent the onset of cAMP-inhibitory responses. Anyway, the fact that
chemokines, and especially CX3CL1, triggered intracellular transducing events lasting more
than 30 minutes was classically found regarding for instance ERK phosphorylation
(Cambien et al., 2001).
The second parameter involved in the dynamic response of the Glosensor is the turnover of
the cellular cAMP produced by cyclase and degraded by phosphodiesterases. More rapid is
this turnover, greater is the time of response of the Glosensor to a drop of cellular cAMP
concentration. This could explain why the chemokine response appeared here slower in both
onset and decline in the presence of IBMX (Figures 4 and S3).
The compartmentation of cellular cAMP was also a major parameter that governs the shape of
the responses monitored using biosensors, as clearly shown for cAMP-stimulating responses
(Agarwal et al., 2014). Indeed diverse responses kinetics could be observed according the cell
localization of the biosensor, whether it is soluble or membrane-tethered (Willoughby and
Cooper, 2008) or associated in raft or non-raft microdomains (Agarwal et al., 2014). The 22F-
GloSensorTM here used is derived from the PKA-cAMP binding site (Binkowski et al., 2011)
and is presumably soluble and hence responds to changes in cAMP occurring throughout the
cytosolic compartment of cell. If chemokine-elicited cAMP-inhibitory responses are confined
to some subcellular compartment confined by the co-localization of receptors, Gi-proteins,
156
adenylyl cyclases and phosphodiesterases in a “receptosome” as shown for cAMP-stimulatory

responses, the signals we observed is only the integration of many local responses, with
delayed kinetics and average amplitudes. Using a membrane-associated biosensor might give
access to such subcellular responses as recently shown for cAMP-stimulatory responses
(Agarwal et al., 2014).
Regardless the actual localization of the biosensor we used here, it remains that the
phosphodiesterases appeared to have a great role to shape the observed signal. In the
presence of their inhibitor IBMX, the cAMP-associated signal increased ten-fold in the
presence of FSK (Figure 4A). More significantly, the resting signal increased more than 100-
fold (Figure S3), indicating that the cellular cAMP concentration is a result of a basal adenylyl
cyclase activity counterbalanced by a high phosphodiesterase activity. So in the conditions
where phosphodiesterase are inhibited (in the presence of IBMX), one could expect that the
cellular cAMP is continuously growing, and that the partial Gi-mediated inhibition of the
cAMP production by adenylyl cyclase could not give a net decrease in the cellular cAMP
concentration. Nevertheless, such responses are yet observed (Figures 4A and S3). This
could mean that phosphodiesterases insensitive to IBMX could exist in HEK293, or that cells
could reduce its cellular cAMP by other way still to be described.
The main results we obtained here is the conserved amplitude of the chemokine response to 35-
40% no matter the way used for the prestimulatory phase. By comparison, a recent study
found that responses downward metabotropic glutamate receptors assayed with the same
biosensor in CHO reached 80% (DiRaddo et al., 2014). In our case, we show that the
intracellular signaling machinery is not limiting since adding two different chemokines at the
same time give greater responses than individual ones (Figure 6, trace f). Moreover, adding
sequentially two different chemokines give two individual responses (Figure 6, traces b and
c), while adding sequentially the same chemokine gives only one response: the receptors
saturated by the first addition are not available to transduce signal by the second addition
(Figure 6, trace a). So the limiting step explaining why the chemokine response never exceeds
the 40% level is most probably the number of available surface chemokine receptors. This is
further evidenced by the use of the competitive CX3CL1 antagonist: the amplitude of the
response obviously follows the rate of the receptor occupancy by the agonist CX3CL1
(Figure S8). Moreover the addition of an antagonist concentration sufficient to displace
CX3CL1 during the onset of the response results in a rapid return to basal line of the signal
(Figure 8A), indicating that the number of liganded receptors directly governs the response
profile.
The use of biosensors allows to demonstrate an important paradigm shift in GPCR signaling
, in that some receptor-evoked Gs-mediated cAMP production persists even after receptor
internalization by signaling from endosomes (Calebiro et al., 2009; Ferrandon et al.,
2009);(Kuna et al., 2013);(Wehbi et al., 2013; Irannejad and von Zastrow, 2014);(Vilardaga et
al., 2014). This was also shown for a Gi-dependent signal downward the S1P1 receptor
(Mullershausen et al., 2009). It was therefore important to evaluate the potential existence of
such signaling from internalized chemokine receptors in our model, especially as it is
controversial whether this unclassical persistent signaling exists in HEK293 (Werthmann et
157
al., 2012);(Geras-Raaka et al., 2013). However, it seems that the onset of the chemokine
response follows the kinetics of internalization (Figures 8A and 8B). Moreover this
hypothetical of persistent endosomal signaling would be suppressed in conditions where the
receptor internalization is inhibited (Vilardaga et al., 2014): this is clearly not the case here
(Figure 8C). So we conclude that the chemokine responses we observed in HEK293 are
mainly driven by the available surface cognate chemokine receptors.
The biosensor technique was shown here useful to investigate a response in one cell type in
the presence of another cell type interacting with the former. This assay clearly revealed that
the membranous form of the CX3CL1 chemokine exhibited significantly longer cAMP-
inhibitory response than its soluble form (Figure 7). It would be interesting to investigate
whether such qualitative difference between responses to both forms of CX3CL1 also exist for
activation of others transduction pathways involving ERK, PI3K or Akt activation. It was
indeed interesting to note that some functional responses were found to be original to the
CX3CL1 membrane form, e.g IFN secretion (Yoneda et al., 2003) or rescue from cell death
(Kim et al., 2011).
Anyway, in the case of the cAMP-inhibitory response, our data strongly indicated that the
difference between responses to both forms of CX3CL1 was due to a net difference in
receptor internalization. Indeed we showed that the CX3CR1 liganded by the membrane
CX3CL1 was hardly internalized, if any (Figure 9A). So the inability to internalize of the
CX3CR1 receptors bound to membrane CX3CL1 maintains their ability to transmit signal
leading to cAMP-inhibitory responses. The final and slow decline beyond 60 minutes of the
response elicited by the membranous chemokine could come from two processes: the hard
CX3CR1 internalization following a slow cleavage of membrane CX3CL1 and the progressive
inactivation of the receptors by the classical way involving phosphorylation and binding of
arrestin.
As mentioned in the Introduction part, the contribution of the cAMP second messenger in the
functional role of chemokines remains controversial. It seems not involved in the signal
leading to chemotaxis (Jarnagin et al., 1999). Reciprocally, cellular cAMP production could
either decrease the chemokine-induced chemotactic activity of monocytes through PKA (Fine
et al., 2001; O'Boyle et al., 2007) or increase it through EPAC (Lorenowicz et al., 2006).
Moreover, the same cAMP- EPAC way seems to contribute to the synthesis of chemokines
(Hertz et al., 2009). Similarly, the adhesion of monocytes to HUVEC is largely decreased in
the presence of cAMP (Mori et al., 2007; Chigaev et al., 2008), via a way involving PKA
and the phosphorylated RhoA (Laudanna et al., 1997). In contrast, the cAMP-EPAC pathway
simulates the monocytes adhesion to activated HUVEC (Lorenowicz et al., 2006). Finally,
cAMP has been shown to be an important mediator of growth arrest and apoptosis of B and T
cells, while it delays apoptosis in neutrophils, most probably via the EPAC activation
(Grandoch et al., 2009). In each of these situations, the precise knowledge of the kinetic
profile of the chemokine-induced cAMP-inhibitory response could help to decipher the exact
role of cAMP and its cellular partners in the chemokine-associated functions.
158
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Figure legends
Figure 1. The cAMP-inhibitory responses triggered by chemokines.
(A)Expression of CXCR4 on the HEKgloCX3CR1 clone cells visualized by flow cytometry after
staining of cells with anti-CXCR4 (grey trace) or control isotype antibodies (black traces).
(B)Flux cytometry to visualize CX3CR1 expression on the HEKgloCX3CR1 clone cells after
staining with CX3CR1 antibodies (grey trace) or antibodies against control isotype (black trace).
165
(C) Luminescence signal obtained either in the HEK293 parental cell line (black dotted trace) or
in the HEKgloCX3CR1 clone after addition of 0.5 µM FSK 3 min after reading (black arrow). 30
minutes after (grey arrow), was added either vehicle (black trace), 100 nM CCL2 (blue trace),
100 nM CX3CL1 (red trace) or 100nM CXCL12 (green trace). (D) The signals observed in A
with CX3CL1 (red trace) or CXCL12 (green trace) were subtracted from the signal obtained with
vehicle (black trace in A) and were expressed either as luminescence unit (left ordinate) or as
percent of the maximum of the control signal. The responses to CX3CL1 and CXCL12 observed
after pretreatment with Pertussis toxin (100 ng/ml, 4h) were reported (gray and black traces,
respectively). (E) Luminescence signal obtained in the HEKgloCX3CR1 clone after addition of
0.4µM PGE2 3 min after reading (black arrow). 30 minutes after (grey arrow), was added either
vehicle (black trace), 100 nM CCL2 (blue trace), 100 nM CX3CL1 (red trace) or 100nM
CXCL12 (green trace). (F) Representation of the response observed with CX3CL1 (red trace) or
CXCL12 (green trace) subtracted from the signal obtained with vehicle (black trace in A) and
were expressed either as luminescence unit (left ordinate) or as percent of the maximum of the
control signal.
Figure 2. .The profile of the CX3CL1-triggered cAMP-inhibitory response is independent of
the time of chemokine addition after the pre-stimulating compound.
(A and B). Luminescence signal obtained in the HEKgloCX3CR1 clone cells after addition of
0.12 µM PGE2 (A) or 0.5µM de FSK (B). The arrows indicate the different times of addition of
the chemokine whose responses are shown in C and D.
(C and D). The signal obtained with 50nM CX3CL1 added simultaneous (black traces), 3 (blue
traces), 20 (green traces) or 60 minutes (red traces) after 0.12µM PGE2 (C) or 0.5µM de FSK (D)
Figure 3. .The profile of the CX3CL1-triggered cAMP-inhibitory response is independent of

the concentration of the pre-stimulating compound.
(A) Luminescence signal obtained in the HEKgloCX3CR1 clone cells after addition of 20µM
(green traces), 5µM (blues traces), 1µM (black traces) or 0.5µM (red traces) of FSK. The arrows
indicate the time of addition of the chemokine, 50nM CX3CL1 (bold traces) or 50nM CCL2, a
control chemokine (thin traces). (B) Responses obtained with 50nM CX3CL1 after 50µM (green
trace), 20µM (blue trace), 1µM (black trace) or 0.5µM (red trace) of FSK. (C) Expression of the
maximal AMPc inhibitory response to 50nM of CX3CL1 dependently to the FSK concentration
used to pre-stimulate the cells HEKgloCX3CR1 (). The ratio Signal to noise are reported to
ordinate axis ().
Figure 4. Influence of the PDE inhibition on the FSK and chemokine responses
(A) Luminescence signal obtained in the HEKgloCX3CR1 clone cells after addition of 0.5µM
FSK (grey traces) or 0.05µM FSK supplemented by 0.5mM IBMX (black traces). The arrows
indicate the addition of 50nM of CX3CL1 (bold traces) or 50nM of CCL2 (thin traces). B and C.
The signal obtained with 50nM of CX3CL1 (B) or 50nM of CXCL12 (C) after 0.5µM FSK (grey
traces) or 0.05µM of FSK supplemented by 0.5mM of IBMX (black trace)
Figure 5. Chemokine responses downstream different chemokine Receptors
(A) Responses to 50 nM CXCL16 (grey trace) or (B) CCL2 (grey trace) in HEK clones stably
166
expressing CXCR6 (A) or CCR2 (B) and transfected transiently by GloSensor F-22. The black
traces are the same responses observed after PTX treatment (100ng/µl, 2h).
Figure 6. Luminescent signals obtained after sequential or simultaneous addition of
CX3CL1 and CXCL12
(A) Luminescence signals obtained in the HEKgloCX3CR1 clone after addition (grey arrow) of
0.5µM FSK. 30 minutes later was added 50 nM of either CX3CL1 (bold black arrows), CXCL12
(empty arrows) or CCL2 (thin arrows). Still 30 minutes later was added one of the CHK at the
same concentration (traces a to e). Alternatively, both 50 nM CX3CL1 and 50 nM CXCL12 was
added 30 min after FSK (trace f). (B) The CX3CL1 responses observed in A were analyzed as in
Figure 1B and reported as percent of the signal gained just before the time of CX3CL1 addition.
(C) The CXCL12 responses observed in A were analyzed as in Figure 1B and reported as percent
of the signal gained just before the time of CXCL12 addition.
Figure 7. cAMP-inhibitory responses observed using the membrane form of CX3CL1
(A) Luminescence signal obtained in the HEKgloCX3CR1 clone cells filed on 50 000 L929 cells
(black thin trace) or L-CX3CL1 (black bold trace). 0.5µM of FSK are diled in the well contained
the L929 cells or L-CX3CL1. Grey trace represents the signal obtained by HEKgloCX3CR1
stimulated by 50nM of CX3CL1 45minutes after their deposit on L-CX3CL1 cells. Insert.
Expression of CX3CL1 analyzed by FACS. (B) Comparison of CX3CL1 responses on
HEKgloCX3CR1 deposit on 50nM of CX3CL1 soluble form (red trace) or on L-CX3CL1 (black
trace). Grey trace represent the combined response induced by the deposit of HEKgloCX3CR1
cells on LCX3CL1 followed by an addition of 50nM CX3CL1 soluble (grey in A).
Figure 8. Impact of the addition of the CX3CR1 antagonist on the CX3CL1 response and
kinetic of CX3CR1 internalization.
(A) Responses to 5nM CX3CL1 in the presence of 0.5µM FSK (trace a). Simultaneously to
CX3CL1 (trace b), 8min (trace c), 15 min (trace d), 30 min (trace e) or 60 min (trace f) after
CX3CL1 addition, was added 300 nM F1 (red arrows). (B) CX3CR1 expression at the surface of
the HEKgloCX3CR1 clone cells analyzed using flow cytometry at various time (10, 15, 30, 60
and 90 min) after addition of 50nM CX3CL1 without (black circles) or after a 30 minutes
treatment with 120µM dynasore (green circles). At each time, the data represent the ratio of mean
fluorescence intensity obtained in the presence of CX3CL1 to the mean fluorescence intensity
obtained in the absence of CX3CL1. The data was analyzed using PRISM 5 (GraphPad Software)
giving a characteristic time of 14 min and 59 min, in the absence and in the presence of dynasore
respectively. (C) The responses to 50 nM CX3CL1 obtained on HEKgloCX3CR1 cells pretreated
(grey trace) or not (black trace) with dynasore (30 minutes, 120µM) in the presence of 0.5µM
FSK.
Figure 9. Kinetic of CX3CR1 internalization in response to the membrane form of CX3CL1
CX3CR1 Expression at the surface of HEKgloCX3CR1 cells deposit during different time on
L929 or LCX3CL1
167
Supplementary figure legends
Figure S1. cAMP response induced by the CX3CL1 chemokine domain or CX3CL1 with its
mucin stalk
Response induced by 50 nM of the CX3CL1 chemokine domain alone (black trace) or to full
length CX3CL1 (chemokine domain plus mucin stalk) (grey trace) obtained in HEKgloCX3CR1
cells expressed as percent of the maximum of the control signal.
Figure S2. Amplitude of luminescent signal obtained with the cAMP analog Sp-8-br-cAMP
Various concentrations of a membrane-permeant cAMP analog, Sp-8-br-cAMP were added to the
wells containing HEK-CX3CR1-GloSENSOR. The maximum of the luminescent signal is
reported according to the concentration of analog added in medium. The linearity of the sensor is
only true for a concentration less than 0.5µM (insert).
Figure S3. Impact of the inhibition of PDE on the chemokine response
(A) Luminescence signal obtained in the HEKgloCX3CR1 clone cells after addition of 0.05µM
FSK (gray traces) or 0.5mM IBMX (black traces). (B) Responses evoked by 50nM of CX3CL1
in the presence of 0.05µM FSK (grey trace) or 0.5mM of IBMX (black trace)
Figure S4.CX3CL1 and CXCL12 cAMP-inhibitory responses observed in different cell lines
(A) Luminescence signal obtained in Jurkat-Tag cells electroporated with GloSensor F-22 and
stimulated by 50µM of FSK (black trace) 30 minutes after was added either vehicle (black trace)
or 100nM CXCL12 (grey trace). Representation of the response induced by CXCL12 (grey trace)
subtracted from the signal obtained with vehicle (black trace in A) and were expressed as percent
of the maximum of the control signal. (B) Luminescence signal obtained in HBP-CX3CR1 cells
electroporated with GloSensor F-22 and stimulated by 50µM of FSK (black trace) 30 minutes
after was added either vehicle (black trace) or 100nM CX3CL1 (grey trace). Representation of
the response induced by CX3CL1 (grey trace) subtracted from the signal obtained with vehicle
(black trace in A) and were expressed as percent of the maximum of the control signal.
Figure S5. cAMP response induced by CX3CL1 in the HEKgloCX3CR1 in the adherent
state and in the suspended state
(A) AMPc inhibitory response to 50nM of CX3CL1 chemokine domain measured on
HEKgloCX3CR1 cells in adherent (black trace) or suspended (grey trace).(B) Dose response
curve of CX3CL1 in function of the stat of cells adherent versus suspended.
Figure S6. Effect of dilution on the response observed with membrane CX3CL1
(A) Luminescence signal obtained either in 30 000 HEKgloCX3CR1 resuspended in 60
(continuous traces) or 120µl (dotted traces) filed on L929 (grey trace) or LCX3CL1 (black trace)
cells. FSK 0.3µM filed in the well containing L cells. (B) CX3CL1 response in function of
dilution factor.
Figure S7. Responses observed in the HEKgloCX3CR1 cells after addition of the
supernatant of L929 (grey trace) or L-CX3CL1 cells incubated 15 min (A), 60 min (B) or
168
120 min (C) (black traces)

50 000 cells L929 (grey trace) or LCX3CL1 (black trace) are incubated in CO2 independent
medium supplement by 10% of FBS and 1.5% of cAMP GloSensor reactif ® during 15, 60 or
120minutes. Supernatants of these cells are addition on HEKgloCX3CR1 (arrow) after FSK
0.5µM pre-stimulation.
Figure S8. Competitive antagonism of the CX3CR1 antagonist F1 observed on the CX3CL1
cAMP-inhibitory responses
(A) The areas under curves (AUC) of the responses to various CX3CL1 concentrations obtained
after 0.5µM FSK stimulation in the presence of various concentration of the F1 compound were
reported. The dose-responses curves were analyzed using PRISM 5 (GraphPad Software) giving
an EC50 of 0.9 nM, 2.3 nM, 5.6 nM and 11.6 nM using respectively F1 at 0, 10, 50 and 200 nM.
(B) The same data are displayed in the double-inverse configuration, i.e. inverse of AUC versus
inverse of CX3CL1 concentration.
Figure S9. Effect of the treatment with dynasore on the cAMP-inhibitroy responses
observed with CXCL12 in the HEKgloCX3CR1 clone cells.
The responses to 50 nM CXCL12 obtained on HEKgloCX3CR1 cells pretreated (grey trace) or
not (black trace) with dynasore (30 minutes, 120µM) in the presence of 0.5µM FSK.
169
170
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183
184
Résultats Complémentaires
185
186
I. Caractérisation de la voie de signalisation AMPc

en aval du CX3CR1 (Compléments)
Des expériences complémentaires à celles publiées dans l’article précédent ont été
réalisées dans l’objectif d’expliciter les différents acteurs de la signalisation AMPc activée par
CX3CL1.
A] Etude de l’implication de différents partenaires de la voie

AMPc dans la réponse inhibitrice induite par les chimiokines
Les résultats des expériences exposées au cours de cette partie ont été obtenus grâce à
la technologie GloSENSOR, décrite dans l’article et dont le protocole détaillé est repris sur la
fiche technique 1 (Annexe). Les réponses chimiokinergiques présentées dans cette partie sont
obtenues avec 50nM de chimiokine (sauf exception dans ce cas, la dose utilisée sera clairement
indiquée). Cette concentration correspond à la quantité de chimiokine saturante, induisant une
réponse AMPc inhibitrice dont l’amplitude est maximale.
A.1 – Réponse AMPc inhibitrice induite par le LPA
Parallèlement aux réponses chimiokinergiques, nous avons étudié la réponse AMPc

inhibitrice induite par l’acide lysophosphatidique (LPA) dont le récepteur est exprimé de manière
endogène à la surface des HEK293 (Ponsioen, Zhao et al. 2004). Ce récepteur est décrit
comme un RCPG capable d’induire une multitude de signaux en fonction de son couplage avec
différentes protéines G, dont une activation du signal calcique, une activation des Rho (Harvath,
Robbins et al. 1991) ainsi qu’une modulation de l’activité AC.
La réponse LPA, enregistrée sur nos cellules HEKgloCX3CR1, se distingue des

réponses chimiokinergiques, tant par son amplitude que par sa cinétique. En effet, l’addition de
5µM ou 50µM de LPA (Sigma Aldrich®), doses classiquement utilisées dans la littérature,
génère une réponse dont l’amplitude maximale (10% d’inhibition) est nettement inférieure à la
réponse AMPc inhibitrice engendrée en aval des RCK, (30-40% d’inhibition). De plus nous
notons une différence de cinétique ; la réponse au LPA atteint son amplitude maximale vers 5
minutes après l’addition du ligand et se réalise en 30 minutes, c’est-à-dire beaucoup plus
rapidement que les réponses chimiokinergiques qui se maintiennent au-delà d’une heure
(Figure V.1). Cette différence de cinétique est encore valable même pour des réponses
chimiokinergiques d’amplitude plus faible (obtenue avec 1nM de CX3CL1- Figure V-1 courbe
187
jaune). En effet, les faibles doses de chimiokine bien que générant des réponses dont
l’amplitude maximale est comparable à celle obtenues avec le LPA, présentent des cinétiques
plus lentes, particulièrement en ce qui concerne le retour à zéro.
Figure V-1 : Comparaison de

la réponse AMPc inhibitrice
induite par une chimiokine, le
CX3CL1 et une protéine non
chimiokinergique, l’acide
lysophosphatidique (LPA).
Réponses AMPc inhibitrices induite par
le CX3CL1 (1nM – courbe jaune ou
50nM – courbe rouge) ou le LPA (5µM
– courbe noire ou 50µM – courbe
grise) mesurée sur des cellules
HEKgloCX3CR1 stimulée avec 1µM de
FSK
A.2 – Effet du nombre de protéines G disponibles sur l’amplitude de

la réponse AMPc inhibitrice
Les différentes expériences réalisées mettent en évidence une réponse AMPc inhibitrice
dont l’amplitude correspond invariablement à environ 30-40% du signal mesuré en absence de
CX3CL1. Cette valeur est indépendante de plusieurs paramètres de mesure, comme démontré
dans l’article 1. La figure 6 de l’article compare l’amplitude de la réponse obtenue lorsque nous
additionnons deux chimiokines (CX3CL1 et CXCL12) consécutivement ou simultanément. Nous
observons que l’addition simultanée des deux chimiokines génère une réponse AMPc inhibitrice
d’amplitude plus importante que celle obtenue par l’addition d’une seule chimiokine. Cependant
l’amplitude de la réponse à cette double addition (~45% d’inhibition) n’est pas égale à la somme
des réponses aux deux chimiokines additionnées individuellement (30% d’inhibition pour chaque
chimiokine). Afin de déterminer si nous avons alors atteint le maximum d’inhibition possible,
nous avons tenté une triple addition : les deux chimiokines, CX3CL1 et CXCL12, et le LPA, dont
nous avons montré la capacité à induire une réponse AMPc inhibitrice (Figure V.1). Cette triple
addition ne génère pas une réponse d’amplitude supérieure à la double addition (Figure V-2A et
V-2B). Cette amplitude ne serait donc plus limitée par le nombre de récepteurs membranaires
disponibles, mais plutôt un des éléments de la machinerie cellulaire, par exemple le nombre de
protéines G disponibles. Pour tester cette hypothèse, nous avons cherché à augmenter le
188
nombre de protéines G par transfection des différentes sous unités fonctionnelles: αi1-GFP, β et
γ.
Figure V-2 : Effet de la transfection des

différentes sous-unités de la protéine G sur
l’amplitude de la double ou triple
stimulation CXCL12 + CX3CL1 +/- LPA de
cellules HEK-CX3CR1-GloSENSOR.
Mesure de la luminescence au cours du temps sur des
cellules HEK-CX3CR1-GloSENSOR non transfectées
(A), transfectées 24h au préalable avec un plasmide vide
pcDNA3 (B) ou avec les différentes sous unités
constituants la protéine Gi (C).Une addition de 0.5µM de
FSK précède l’addition des cocktails d’agonistes :
CX3CL1 50nM + CXCL12 50nM +/- LPA 3µM
(respectivement courbes bleues et rouges). La
chimiokine CCL2 est utilisée comme contrôle négatif
(courbes noires)
La réponse induite par une triple addition (CX3CL1, CXCL12 et LPA à des
concentrations saturantes) mesurée dans des cellules transfectées par les différentes sous
unités de la protéine G n’est pas différente de celle observée dans les cellules contrôles (non
transfectées ou transfectées avec le plasmide contrôle pcDNA3) (Figure V-2.C versus V-2.A &
B). Toutefois ce résultat reste difficile à interpréter car seul le niveau de Gαi est vérifiable, du fait
de la présence de l’étiquette YFP. Or nous ne pouvons affirmer que les cellules transfectées
disposent d’un nombre de protéines G fonctionnelles supérieur aux cellules contrôles.
189
A.3 – Effet du complexe βγ
On sait que l’activation d’une protéine G libère non seulement une sous unité αi active,
mais également deux autres sous unités, formant une seule entité, à savoir le complexe βγ. Ce
complexe peut réguler l’activité de certaines AC et contrôler la localisation de certaines PDE
comme décrit dans les chapitres introductifs (cf. chapitre I §B.5.2).
Afin d’étudier l’éventualité d’une action de ce complexe, nous utilisons la gallein (Sigma
Aldrich®), une protéine qui se fixe avec une forte affinité au complexe βγ et l’empêche ainsi
d’exercer ses différentes fonctions (Bonacci, Mathews et al. 2006). Une préincubation des
cellules 30 minutes avec 30 µM de gallein induit une diminution des signaux FSK et IBMX
(Figure V-3A) comparés au niveau de luminescence atteint sur des cellules non traitées. Cette
diminution est probablement due à une toxicité du traitement. Les réponses inhibitrices de
l’AMPc induites par les chimiokines (CX3CL1 et CXCL12) (Figure V-3BE) sont comparables à
celles observées sur des cellules non traitées. Il semble donc que la réponse AMPc inhibitrice
soit totalement liée à l’activation de la sous unité αi de la protéine G et n’implique pas le
complexe βγ.
A.4– Effet de la PKA
La PKA étant l’une des principales cibles de l’AMPc, son implication dans la forme de la
réponse AMPc inhibitrice en aval du CX3CR1 n’est pas à exclure. En effet, il est probable que
les PDE cellulaires participent au retour à zéro des réponses Gi comme cela est établi pour les
réponses activatrices passant par Gs (Rich, Fagan et al. 2000). Il a par ailleurs été démontré
que certaines de ces PDE, notamment la PDE4, présentes dans les HEK293 sont directement
activées par la PKA (MacKenzie, Baillie et al. 2002).
Afin de tester l’effet de la PKA sur la cinétique de la réponse chimiokinergique, les

cellules HEKgloCX3CR1 sont traitées avec le H-89 (Sigma Aldrich®) ou le KT5720 (Tocris®),
deux inhibiteurs commerciaux de la PKA. Le KT5720 est décrit comme plus spécifique que le
H-89 (Murray 2008). Les cellules sont prétraitées durant 90 minutes avec 10µM de H-89 ou 1µM
de KT5720.
190
Figure V-3 : Effet du complexe βγ sur les réponses Gi mesurées dans des HEK-
CX3CR1-GloSENSOR.
A- Effet de la pré-incubation des cellules en présence de gallein (30µM – courbe bleue et orange) sur la cinétique
FSK (0.1µM) ou l’IBMX (0.5mM), comparé à celle observée sur cellules non traitées (respectivement courbe noire et
courbe rouge).
B / C – Réponses cAMP inhibitrices, exprimées en pourcentage d’inhibition du contrôle (addition de CCL2) induite par
le CXCL12 (50nM) (B) ou le CX3CL1 soluble (50nM) (C) après stimulation des cellules par 0.1µM de FSK (courbes
noires) en fonction du prétraitement des cellules avec 30µM de gallein (courbes bleues)
D / E - Réponses cAMP inhibitrices, exprimées en pourcentage d’inhibition du contrôle (addition de CCL2) induite par
le CXCL12 (50nM) (B) ou le CX3CL1 soluble (50nM) (C) après stimulation des cellules par 0.1µM de FSK (courbes
rouges) en fonction du prétraitement des cellules avec 30µM de gallein (courbes oranges)
191
L’amplitude de la réponse FSK est nettement augmentée (+60%) par H-89 (Figure V-4A-
courbe rouge) alors que le traitement au KT5720 (Figure V-4.A – courbe grise) ne semble pas
affecter ce paramètre (Figure V-4A).
Les réponses chimiokinergiques, CX3CL1 et CXCL12, exprimées en pourcentage du

signal FSK contrôle, restent inchangées en présence des inhibiteurs de PKA, alors que la
réponse au LPA est modifiée : sa durée est nettement augmentée. Cette modification de la
cinétique de la réponse au LPA sous H-89, comme sous KT5720, impacte la cinétique de retour
à zéro de la réponse. Le traitement n’affecte ni l’amplitude de la réponse ni le délai d’atteinte de
cette réponse maximale après addition du LPA.
Ce résultat semble indiquer que les voies de signalisation induisant la diminution de

l’AMPc intracellulaire en aval de deux familles de récepteurs – chimiokinergiques et celui du
LPA - sont différentes. La PKA semble induire un rétrocontrôle négatif sur la signalisation AMPc
induite par le LPA. L’une des hypothèses envisageable, serait une phosphorylation à l’origine de
la désensibilisation du récepteur au LPA. Cette boucle de régulation semble absente en aval
des récepteurs de chimiokine pour ce qui est des réponses AMPc. Il n’est pas exclu qu’il d’une
activation différentielles des effecteurs PKA et EPAC.
A.5 – Effet du MRP-4
Outre sa synthèse par les AC et sa dégradation par les PDE, le niveau d’AMPc
intracellulaire est contrôlé par son extrusion cellulaire via les protéines d’efflux appelées
« Multidrug-Resistance Protein » (MRP). Les MRP constituent une grande famille de protéines
transmembranaires (faisant partie de la famille des transporteurs à cassette ATP) impliquées
dans l’efflux de divers substrats hors des cellules. Certaines études avaient rapporté que l'AMPc
pouvait sortir du cytosol vers le milieu extracellulaire via les MRP (Sampath, Adachi et al. 2002).
Afin d’étudier le rôle de cette famille de protéines sur la réponse AMPc induite par les
chimiokines (100nM), nous procédons à leur inhibition cette famille de transporteurs par le
probénécide (Sigma Aldrich ®). La préincubation des cellules durant 90 minutes avec cet agent
inhibiteur (100 ou 500µM) laisse le signal FSK (Figure V-5A) et les réponses chimiokinergiques
inchangés (Figure V-5B/C). Cette extrusion de l’AMPc ne semble donc pas impliquée dans le
profil des signaux associés à l’AMPc cellulaire dans les HEK293.
192
Figure V-4 : Effet de l’inhibition de la PKA sur la cinétique FSK et sur les réponses Gi
mesurées dans des HEKgloCX3CR1.
A.Effet des inhibiteurs H-89 (10µM courbe rouge) et KT5720 (1µM - courbe verte) sur la cinétique FSK (1µM –
courbe grise) comparé à des cellules non traitées (courbe noire)
B/C/D - Réponses AMPc inhibitrice induite par l’addition de CX3CL1 (50nM) (B), CXCL12 (50nM) (C) ou de LPA
(50µM) (D) en fonction du traitement H-89 (courbe rouge), KT5720 (courbe grise) ou non traitées (courbe noire).
Figure V-5 : Effet de l’inhibition de MRP-4 par le probénécide sur la cinétique FSK et sur
les réponses chimiokinergiques mesurées dans des HEKgloCX3CR1.
A- Effet de la pré-incubation des cellules en présence de probénécide (100µM – courbe jaune ou 500µM –
courbe rouge) sur la cinétique FSK (1µM), comparé à celle observée sur cellules non traitées (courbe noire).
B / C – Réponses cAMP inhibitrices induite par le CXCL12 (100nM) (B) ou le CX3CL1 soluble (100nM) (C) après
stimulation des cellules par 1µM de FSK (courbes noires) en fonction de l’incubation avec le probénécide.
193
A.6 – Effet du calcium
Un traitement des cellules HEKgloCX3CR1avec du BAPTA, un chélateur de calcium, à

hauteur de 10µM durant 30 minutes augmente l’amplitude des réponses AMPc inhibitrices
étudiées. Cette observation est vraie aussi bien pour les réponses chimiokinergiques (Figure V-
6B) que pour la réponse au LPA (Figure V-6C). Cette différence ne semble pas imputable à une
modification de l’activité AC car le traitement n’affecte pas le niveau de la réponse FSK (Figure
V-6A). La signification de ce résultat sera discutée dans de la dernière partie du mansucrit :
Discussion et perspectives.
Figure V-6 : Effet du calcium sur la cinétique et l’amplitude de la réponse FSK et

chimiokinergique.
A- Effet de la pré-incubation des cellules en présence de BAPTA-AM (10µM – courbe rouge) sur la
cinétique FSK (1µM), comparé à celle observée sur cellules non traitées (courbe noire).
B / C – Réponses cAMP inhibitrices induites par 50nM de CX3CL1 soluble (B) ou 50µM de LPA (C)
sur des cellules traitées au BAPTA (courbes rouges) ou contrôles (courbes noires) après
stimulation des cellules par 0.5µM de FSK
A.7– Mesure d’une réponse AMPc induite par CX3CL1-immobilisé
Nous avons cherché à confirmer le résultat obtenu avec CX3CL1 membranaire (Article
Figure 8) en utilisant un CX3CL1 « immobilisé », contenant le domaine chimiokine et le tronc
mucine du CX3CL1 auquel est ajouté un « tag » 6xHistidine (CXC3L1-His). Cette forme du
CX3CL1 peut être immobilisée au fond d’un puits grâce à un anticorps anti-Histidine (Fiche
Technique 4), mimant ainsi la forme membranaire du CX3CL1. Mais à la différence de la forme
membranaire, exprimée à la surface des cellules, la forme immobilisée présente l’avantage
d’être plus « malléable ». On peut en effet contrôler et déterminer la quantité immobilisée au
fond du puits, ce qui n’est pas aisé avec le CX3CL1 membranaire. Les tentatives d’obtention de
194
clones cellulaires exprimant des quantités de CX3CL1 différentes mais homogènes (clonale)
sont restées infructueuses.
De manière comparable au CX3CL1 soluble, la forme immobilisée du ligand induit une

réponse AMPc inhibitrice (Figure V-7A et 7B), qui est dose dépendante comme les réponses au
CX3CL1 soluble, à cette différence près que nous n’atteignons pas la réponse maximale (Figure
V-7C). Cette observation semble indiquer qu’avec plus de CX3CL1-His (quantité matériellement
et « financièrement » irréalisable), il serait possible d’atteindre une réponse dont l’amplitude
serait plus grande. Cela signifierait que la réponse à CX3CL1 immobilisé serait qualitativement
plus efficace que la réponse à CX3CL1 soluble, comme cela sera détaillé dans la « Discussion »
de ce manuscrit.
Figure V-7 : Réponse induite par le CX3CL1 « immobilisé ».

A- Suivi de la luminescence au cours du temps émise par des HEKgloCX3CR1 déposées dans des puits
contenant 0.3µM de FSK et dans lesquels différentes chimiokine ont été immobilisée : 50nM de CX3CL1
(courbe rouge) ou CXCL16 (courbe noire). Le CXCL16 est utilisé comme chimiokine contrôle
B- Réponses cAMP inhibitrices induite par le CX3CL1 immobilisé (50nM) (B) après stimulation des cellules par
0.3µM de FSK
C- Courbe Dose réponse en fonction de la quantité de CX3CL1 immobilisé au fond du puits. .
B] Recrutement différentiel des β-arrestines en fonction de

l’activation du récepteur par la forme soluble ou la forme
membranaire du CX3CL1
Un des résultats importants de ce travail est l’observation d’une différence nette de
cinétique entre les réponses inhibitrices obtenues avec les deux formes, soluble ou
membranaire de CX3CL1. L’internalisation différentielle du récepteur (Article Figure 8 & 9)
semble directement impliquée dans cette différence de réponse, selon les expériences utilisant
le dynasore (Article Figure 8C). Nous avons cherché à étendre ce résultat en mesurant le
recrutement des β-arrestines sur les récepteurs. Selon le schéma classique de transduction du
signal par les RCPG (cf. Chapitre I), les β-arrestines sont impliquées dans l’arrêt du signal
195
transmis aux protéines-G et dans l’internalisation des RCPG ; elles devraient donc être
recrutées par le CX3CL1 membranaire plus lentement que par le CX3CL1 soluble.
Le recrutement des β-arrestines au niveau du récepteur est visualisé grâce à la
technique de BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfert) CX3CR1-LUC / β-arrestine
YFP, technique que j’ai eu à développer à mon arrivée au laboratoire. Cette technique dont le
principe se rapproche de celui du FRET, à l’exception que le donneur est ici luminescent et non
fluorescent, permet d’étudier les interactions protéine – protéine. Dans la technique de BRET, la
première protéine ou donneur, ici le récepteur CX3CR1-VT, est fusionnée à la luciférase de
Renilla d’où l’abréviation CX3CR1-LUC utilisée plus haut. La protéine fluorescente YFP est
fusionnée à l’autre protéine d’intérêt ou accepteur : la β-arrestine en l’occurrence, susceptible
d’interagir avec la première. A la suite d’une excitation de la luciférase à l’aide de son substrat,
la Coelenterazine h (Interchim©), si les deux protéines sont suffisamment proches et
correctement orientées, il y a un transfert d’énergie entre la luciférase et la YFP. Concrètement
cela se traduit par une apparition d’un second signal émis à 530nm (longueur d’onde d’émission
de la YFP) en plus du signal d’émission de la luciférase à 480nm (Figure V-8). S’il n’y a pas
d’interaction, seule le signal d’émission de la luciférase est enregistré.
Figure V-8 : Principe de la technique de BRET.

A- Spectre d’excitation et d’émission de la luciférase et du YFP. Le BRET n’est possible que parce qu’il existe
une zone de recouvrement spectrale entre les deux longueurs d’onde d’excitation.
B- Représentation schématique du BRET entre le récepteur CX3CR1-LUC et la β-arrestine YFP.
Le plasmide codant CX3CR1-LUC était déjà disponible au laboratoire alors que les plasmides
codant les formes YFP des β-arrestine 1 et 2 ont été obtenues grâce à une collaboration avec
l’équipe du Dr. Daniel FOURMY (Toulouse – INSERM U531). Ces plasmides ont été transfectés
dans les cellules HEK293. Le lendemain de la transfection, nous procédons à la mesure de
BRET au lecteur de plaque Berthold ® selon les détails techniques énoncés dans le fiche
technique 2 fournie en annexe. Nous mesurons la luminescence en appliquant deux filtres
196
successifs à deux longueurs d’onde différentes, le premier à 485nm et le second à 530nm. Afin
de générer une cinétique, ces mesures sont répétées toutes les 30 secondes environ sur un
créneau d’une à deux heures. Des cellules transfectées uniquement avec le plasmide codant le
récepteur sont utilisées pour déterminer le bruit de fond lors des calculs des ratios BRET. Afin
de comparer le recrutement différentiel des β-arrestines au niveau du récepteur CX3CR1-LUC,
en fonction de la forme du CX3CL1, les cellules transfectées sont déposées soit dans des puits
contenant 25nM de CX3CL1 soluble, soit dans lesquels du 100nM de CX3CL1-HIS ont été
immobilisés.
Les expériences de BRET, présentées sur la figure V-9, mettent en évidence une différence
de la cinétique de recrutement des β-arrestines, ici β-arrestine 2, selon que les cellules sont
déposées sur du CX3CL1 soluble ou sur du CX3CL1 immobilisé: la seconde est plus lente
(maximum à atteint entre 20 et 25 minutes contre moins d’une minutes sous CX3CL1 soluble).
Cette donnée, qui reste à confirmer, semble montrer que la réponse au CX3CL1 immobilisé (et
probablement au CX3CL1 membranaire) est qualitativement différente de celle à CX3CL1
soluble. Toutefois, il y a un décalage net entre la cinétique du signal BRET et celle du signal
AMPc étudié par la technique GloSENSOR© (réponse au CX3CL1 maximale atteinte au bout de
8 minutes). Ce qui signifierait que la réponse AMPc se réalise malgré le recrutement des
β arrestines au niveau de la région C-terminale du récepteur. Cette donnée contraste avec le
modèle classique de la signalisation des RCPG, dans lequel le recrutement des β-arrestines
« stoppe » le signal Gi.
Nous avons tenté d’étudier l’effet des β-arrestines sur la réponse AMPc en diminuant leur
concentration cellulaire par la technique de siRNA (Hunton, Barnes et al. 2005; Shenoy, Drake
et al. 2006). Mais aucun des deux couples différents de siRNA proposés pour les arrestines ne
s’est avéré efficace sur l’expression de celles-ci dans notre clone HEKgloCX3CR1.
C] Visualisation de la réponse AMPc inhibitrice en imagerie

avec la sonde FRET : T-EPAC-vv
Afin d’étudier une réponse AMPc au sein d’une cellule unique, nous avons eu recours à la
sonde FRET, T-EPAC-vv (Klarenbeek, Goedhart et al. 2011) que nous avons transfectée dans
un clone HEK293 exprimant de manière stable le récepteur CX3CR1 (Daoudi, Lavergne et al.
2004). Les cellules sont stimulées avec 10µM de FSK avant l’addition de 50nM de CX3CL1. Le
signal CFP et YFP sont enregistrés au cours du temps (Microscope Zeiss-Observer Z1 /
Caméra Hamamatsu C11440). Le signal FRET représente le ratio du signal du donneur (CFP)
sur celui de l’accepteur (YFP). La réponse FSK (flèche noire) induit une montée du signal dans
197
toutes les cellules du champ comme le présente la moyenne des mesures par champ (courbe
en gras) (Figure V-10 A). Cependant la réponse à CX3CL1 (flèche rouge) n’est appréciable que
sur certaines cellules (Figure V-10 B). On peut distinguer deux groupes de cellule, ici en fonction
de l’amplitude de la réponse AMPc inhibitrice ; supérieure à 10% du contrôle de ou inférieure à
10%. Les premières seront considérées comme des « répondeuses ». La moyenne des
réponses de ces cellules est rapportée en noir. La moyenne des cellules « non répondeuses »
est rapportée en bleu (Figure V-10 B). La cinétique de la réponse observée dans des cellules
uniques par cette technique est comparable à celle observée sur une population cellulaire avec
la technique GloSensor.
Figure V-9 : Etude du recrutement des β-arrestines par BRET.

Expression du ratio BRET (Emission accepteur / Emission donneur) au cours du temps en fonction que les cellules
transfectées avec les plasmides CX3CR1LUC et β-arrestine2 soient déposées dans des puits contenant soit le
CX3CL1 soluble (barres grises) ou du CX3CL1- HIS, forme artificiellement immobilisée (barres noires).
II. Implication de l’AMPc dans les fonctions

associées au couple CX3CL1/CX3CR1
L’AMPc est le premier messager à avoir été étudié en aval des protéines Gi, puisque
c’est de leur fonction inhibitrice sur l’AC qu’elles tirent leur nom. Cependant son rôle dans les
fonctions chimiokinergiques reste controversé. Il nous a semblé intéressant d’étudier l’influence
de l’AMPc sur les deux fonctions principales du couple CX3CL1/CX3CR1 - le chimiotactisme et
l’adhésion - afin de la corréler avec les réponses inhibitrices d’AMPc observées en aval du
CX3CR1. En effet ces deux fonctions sont généralement étudiées in vitro avec des cellules
198
(lignées cellulaires ou cellules primaires) à un état basal : nous les étudions ici après un
traitement qui augmente l’AMPc cellulaire, condition souvent rencontrée dans l’environnement
inflammatoire où sont les cellules immunes en situation de réponse chimiokinergique.
A B
Figure V-10 : Etude de la réponse AMPc induite par le CX3CL1 par FRET
A - FRET brut mesuré sur HEK-CX3CR1 transfectées avec la sonde T-EPAC-vv. Les cellules sont activées avec
10µM de FSK (flèche noire) avant l’addition de 50nM de CX3CL1 (flèche rouge). Les mesures des cellules
individuelles sont en gris, la moyenne des mesures faites est en noir gras
B - Réponses AMPc moyenne induite par le CX3CL1 (50nM) rapportée en % du signal contrôle avant addition de
CX3CL1. Deux classes de cellules sont distinguées en fonction de l’amplitude de leurs réponses, les « répondeuses »
(moyenne en noir) dont la réponse est supérieure à 10% d’inhibition du signal FSK initial et les « non répondeuses »
dont la réponse est inférieure à 10% (moyenne en bleu). Il y a 20 cellules « répondeuses » et 6 « non répondeuses.
A] Chimiotactisme et AMPc
Afin de tester l’effet de l’augmentation d’AMPc intracellulaire sur la migration des cellules
CX3CR1+ en réponse au chimiotactisme induit par CX3CL1, nous avons utilisé une chambre de
migration commercialisée par Transwell ®. Il s’agit d’un système de plaque 24 puits sur lesquels
sont placés des supports amovibles dont le fond est une fine membrane en Polycarbone (Fiche
Technique 6). Cette membrane peut être traversée par les cellules qui sont déposées par-
dessus en réponse à l’agent chimio-attractant, ici 5nM de CX3CL1 ou 5nM de CCL2, déposé lui
au fond du puits.
Nous observons que l’augmentation d’AMPc intracellulaire au sein des cellules CX3CR1+
induite par de la FSK (30, 15ou 5µM) ou de l’IBMX (0.5mM) provoque une diminution
significative du chimiotactisme dépendant de CX3CL1 (Figure VI-1).
199
Figure VI-1 : Effet de la FSK et de l’IBMX

sur le chimiotactisme CX3CL1 dépendant.
150 000 CHO-CX3CR1 VT sont incubées 20 minutes
avec différentes concentration de FSK (30, 15 ou 5µM)
ou d’IBMX (0.5mM). Le groupe témoin ne subit aucun
traitement. La réponse migratoire en réponse à 5nM de
CX3CL1 est analysée grâce à la technologie Transwell ®. Test
statistique Dunnett's Multiple comparison ; p<0.05
B] Effet de l’augmentation d’AMPc intracellulaire sur la

fonction adhésive du couple CX3CR1/CX3CL1
Nous avons utilisé ici la technique d’adhésion sous flux ou adhésion dynamique,
optimisée au laboratoire (Fiche Technique 5), qui consiste à quantifier l’adhésion sur CX3CL1
immobilisé de cellules CX3CR1+ (CHO-CX3CR1 ou U-937, lignée monocytaire CX3CR1+)
soumise à un flux (20ml/hr - 0.55 dynes) mimant ainsi la circulation sanguine. L’immobilisation
du CX3CL1 sur le fond de la cellule d’adhérence est réalisée comme précédemment grâce à la
pré-immobilisation d’un anticorps anti-His (Fiche Technique 4).Nous comparons l’adhésion sur
CX3CL1-His de cellules CX3CR1+ prétraitées ou non à la FSK, 5 ou 25 minutes avant injection
dans le circuit. Nous observons que les CHO-CX3CR1 (Figure VI-2A) comme les U-937 (Figure
VI-2B) adhérent moins sur CX3CL1 après un traitement à la FSK. Cette diminution de
l’adhérence est fonction de la dose de FSK utilisée. L’utilisation d’autres agents augmentant
l’AMPc intracellulaire, comme l’IBMX, le dibutyryl-AMPc ou encore des agonistes de RCPG
couplés à Gs tel que l’isoproterenol ou la prostaglandine E2, induit aussi une diminution
semblable (Figure VI-2C).
Parallèlement, nous avons étudié l’impact de l’AMPc sur l’adhésion cellulaire passant par
les intégrines et la fibronectine. Dans la littérature, plusieurs données contradictoires existent.
L’adhésion sur fibronectine est affectée tantôt positivement, tantôt négativement. Nous
n’observons ici aucun effet significatif de la FSK sur cette adhérence (Figure VI-2D).
Nous avons ensuite entrepris une série d’expériences visant à déterminer les différents
intermédiaires moléculaires de cet effet. Nous avons ainsi traité nos cellules avec un inhibiteur
de la PKA, le H-89 (10µM – 1H) avant de les soumettre à la FSK. Aucune différence significative
n’est observée que les cellules soient traitées ou non avec le H-89 (Figure VII-2E). Nous avons
aussi cherché un éventuel lien entre cette adhérence sensible à l’AMPc et la réponse passant
par Gi qui diminue l’AMPc cellulaire. Aussi avons-nous prétraité les cellules CX3CR1+ avec la
200
PTX. Les résultats ne montrent aucun effet de la PTX sur la diminution de l’adhésion FSK
dépendante (Figure VI-2F).
Nous concluons que l’AMPc induit bien un effet sur l’adhésion CX3CR1-CX3CL1 des
cellules utilisées sans pour autant modifier leur adhérence cellulaire globale passant par les
intégrines. Mais nous n’avons pas réussi à expliciter le mécanisme à l’origine de cet effet.
C] AMPc et Survie
La mort cellulaire est un des paramètres pouvant expliquer la décroissance du signal

FSK et IBMX au cours du temps (Article Figure 4). Afin de tester cette hypothèse nous réalisons
un test d’apoptose après addition de FSK ou d’IBMX, puis de chimiokine. Le CCL2 est utilisé
comme molécule contrôle. Les cellules sont récupérées au bout de 3h d’incubation et marquées
avec un agent intercalant de l’ADN, l’iodure de propidium (PI) et analysées par cytométrie en
flux pour déterminer la proportion de cellules en apoptose ayant intégré le PI.
Nous observons une mort cellulaire proportionnelle à la concentration de FSK et d’IBMX :

l’augmentation de l’AMPc induit la mort cellulaire. Cette mort cellulaire est largement inhibée
dans les puits où le CX3CL1 a été additionné.
Figure VI-3 : Effet du CX3CL1 sur la

mort cellulaire
Quantification de la proportion de cellules
+
PI par rapport au nombre total de cellule en
fonction d’un traitement FSK (0.5, 10 ou
100µM) ou IBMX (0.5 ou2mM) suivie d’une
addition 15 minutes plus tard de 50nM de
CCL2 (barres blanches) ou CX3CL1 (barres
grises).
201
Figure VI-2 : Etude de l’effet d’une augmentation de l’AMPc intracellulaire sur la

fonction adhésive du couple CX3CL1-CX3CR1
A / B- Effet de l’augmentation d’AMPc intracellulaire induite par l’incubation (5 ou 25min) de CHO-CX3CR1 (A) ou
de U-937 (B) en présence de différentes concentrations de FSK (5 ou 50µM) sur l’adhésion de ces cellules
sur 100nM de CX3CL1-HIS. Test statistique Dunnett's Multiple Comparison ; p<0.05
C- Effet de l’augmentation d’AMPc intracellulaire induite par diverses molécules (isoproterenol - ISO,
prostaglandine – PGE E2,dibutyryl, IBMX ou forskoline – FSK) sur l’adhésion de CHO-CX3CR1sur 100nM de
CX3CL1-HIS. Test statistique Dunnett's Multiple Comparison ; p<0.05
D- - Effet de l’augmentation d’AMPc intracellulaire induite par l’incubation (5 ou 25min) de CHO-CX3CR1 avec
50µM de FSK sur l’adhérence sur fibronectine (2µg/ml) ou CX3CL1-HIS (100nM) Test statistique : t test ;
p<0.0001
E- Effet d’un traitement préalable des cellules (CHO-CX3CR1) avec un inhibiteur de la PKA, le H-89 (100µM –
1h) sur l’adhésion de ces cellules sur CX3CL1-His après traitement FSK. Test statistique : t test ; p<0.0001
F- Effet d’un
traitement préalable des cellules (CHO-CX3CR1) avec la PTX (100ng/ml – 12h) sur l’adhésion de ces cellules sur
CX3CL1-His après traitement FSK Test statistique : t test ; p<0.0001
202
Discussion & Perspectives
203
204
Discussion et perspectives.
Les chimiokines et leurs récepteurs sont impliqués dans une multitude de processus
physiologiques et physiopathologiques. L’étude des signaux cellulaires induits par les
chimiokines est entreprise depuis longtemps, en particulier pour tester de possibles molécules
« médicaments». Cependant la quantification en temps réel et dans des cellules vivantes des
signaux chimiokinergiques reste confinée à la seule mesure de calcium. L’existence d’une voie
de signalisation AMPc en aval des RCK est admise mais sa cinétique n’a jamais été explicitée.
Aussi nous avons entrepris de mesurer en temps réel les réponses AMPc inhibitrice en aval des
RCK à l’aide des nouveaux outils technologiques, déjà utilisé en routine pour la mesure de
réponse AMPc stimulatrice (§ 1.1). Nous avons ainsi mis en évidence une conservation
remarquable de la cinétique des réponses aux chimiokines solubles et à CX3CL1 en particulier
(§ 1.2) et observé pour la première fois une réponse qualitativement différente en aval du
récepteur activé par le CX3CL1 membranaire comparé à celle obtenue avec la forme soluble
(§ 1.3). De façon surprenante, dans ces réponses, les PDE ne semblent jouer qu’un rôle
secondaire (§ 1.4). Enfin, nous avons tenté d’expliciter le rôle de cette réponse AMPc inhibitrice
dans les fonctions chimiotactiques et adhésives du couple CX3CL1/CX3CR1 (§ 1.5) ainsi que
sur son action sur la mort cellulaire (§ 1.6).
1.1. Optimisation d’une méthode de mesure en temps réel de l'AMPc
Comparaison des résultats obtenus avec les deux sondes
Le premier objectif de ce travail de thèse a consisté à optimiser l’utilisation d’une sonde

luminescente sensible à l’AMPc, le biocapteur Glosensor commercialisé par Promega®, pour la
mesure d’une réponse inhibitrice. Parallèlement, nous avons utilisé la sonde FRET, à savoir T-
Epac-vv (Klarenbeek, Goedhart et al. 2011), qui permet une étude par imagerie et une mesure
unicellulaire contrairement à la technique Glosensor qui permet la mesure d’une réponse
globale, moyennant la réponse sur des centaines de cellules, mesurée en lecteur de plaque.
Malgré quelques succès avec la sonde FRET, les difficultés rencontrées (efficacité aléatoire des
transfections transitoires, étroitesse des concentrations FSK sous lesquelles la réponse Gi est
observable) n’ont pas permis son utilisation extensivement.
La comparaison des signaux mesurés par les deux techniques révèle un point de
divergence majeur portant sur la cinétique de la réponse FSK. En effet, alors que la réponse
FSK maximale est atteinte en 5 minutes avec la sonde FRET (Article - Figure 1), il faut attendre
205
au moins 20 minutes avec le sonde luminescente. Toutefois, des réponses chimiokinergiques

d’amplitude et de cinétique très semblables ont pu être observées avec les deux types de
sonde.
La différence de cinétique de la réponse FSK amène une première question sur la
manière avec laquelle la sonde luminescente reflète les changements de niveau d’AMPc
cellulaire et surtout avec quel délai
Domaine de linéarité de la sonde luminescente
L’utilisation d’un analogue perméant et non hydrolysable de l’AMPc, le 8-br-cAMP,

apporte quelques éléments de réponse à la première question (Article - Figure S3) : le signal
donné par la sonde luminescente est proportionnel à la concentration d’AMPc quand celle-ci
n’excède pas 1µM.
Réactivité de la sonde luminescente
L’existence d’un délai entre la variation de l’AMPc cellulaire donnée et celle du signal
luminescent émis, dépend des constantes d’association et de dissociation entre l’AMPc et la
sonde. Il est possible, en principe, de déterminer la constante d’association d’un biocapteur en
mesurant le signal conséquent à une libération instantanée d’AMPc, par exemple avec un AMPc
« cagé ». Par contre, il est plus difficile de connaître la constante de dissociation de la sonde. Or
c’est ce dernier paramètre qui est crucial dans la mesure d’une réponse inhibitrice. Nous
disposons toutefois d’un indice, fournit par l’utilisation de F1, l’antagoniste compétitif de la
chimiokine CX3CL1 (Article - Figure S9). En effet, nous avons observé que le temps de retour
de la réponse AMPc induite par CX3CL1, sous l’effet de F1, est comparable au temps que met
la réponse CX3CL1 elle-même à atteindre son maximum (Article - Figure 8A). Cette observation
indique qu’il existe bien un temps de latence (ou temps de réactivité de la sonde) important
entre le changement effectif de la concentration cellulaire d’AMPc et le signal émis par la sonde
GloSensor.
Un second paramètre important pour la réactivité de la sonde aux variations- en

particulier négatives – de l’AMPc cellulaire est le « turnover » de l’AMPc, c’est-à-dire sa vitesse
de synthèse et de dégradation au sein de la cellule ; plus ce « turnover » sera rapide et plus la
réactivité du biocapteur aux changements (augmentation ou diminution) de la concentration de
l’AMPc sera rapide. Ce paramètre est ralenti par exemple par l’utilisation d’inhibiteurs de PDE.
C’est d’ailleurs ainsi que nous expliquons le fait que la réponse chimiokinergique présente une
cinétique plus lente en présence d’IBMX (Article - Figure 4).
206
Insensibilité des sondes utilisées aux compartimentations subcellulaires
Les deux sondes utilisées au cours de cette étude sont cytosoliques, de ce fait elles ne
reflètent que la moyenne des changements de la concentration d’AMPc au sein de la cellule.
Autrement dit, elles sont insensibles à la compartimentation du signal AMPc. Or il semble
aujourd’hui impossible de considérer les signaux AMPc en négligeant ce paramètre. Aussi l’une
des perspectives de ce travail serait l’utilisation en imagerie d’une sonde FRET de nouvelle
génération, qui permet un adressage de la sonde au niveau sous-membranaire ou à tout autre
compartiment cellulaire en fonction du peptide d’ancrage fusionné (Agarwal, Yang et al. 2014).
Cela permettrait d’étudier la compartimentation des réponses AMPc inhibitrices induite par les
chimiokines.
Malgré cette limitation, la technique de sonde luminescente lue par lecteur de plaque
présente des avantages considérables pour cribler rapidement les différents agents
pharmacologiques développés au sein de notre laboratoire et ainsi sélectionner les meilleurs
candidats à tester in vivo dans nos modèles souris, comme j’ai pu le faire au cours de ma thèse
(travaux couverts par la confidentialité de brevets en cours).
1.2. Invariance de la cinétique de la réponse chimiokinergique. Rôle

de l’internalisation du RCK
L’utilisation de la sonde luminescente nous a permis de visualiser une réponse AMPc

inhibitrice en aval des RCK (CX3CR1, CXCR4, CCR2 et CXCR6) qui, exprimée en pourcentage
du niveau contrôle avant addition du ligand, apparait remarquablement stable. Sa cinétique ne
montre aucune variation notable selon :
- la nature de la molécule utilisée pour augmenter le niveau d’AMPc (forskoline,

prostaglandine E2, isoprotérenol) (Article – Figure 1)
- la concentration de FSK (tant qu’elle reste inférieure à 1µM]) (Article – Figure 3)
- le temps écoulé entre l’addition de la FSK et celle de la chimiokine (simultanée, 5, 10,
20, 60 minutes après la FSK, 5 minutes avant la FSK) (Article – Figure 2)
- le RCK étudié (qu’il soit exprimé de manière endogène comme le CXCR4, ou de
manière exogène comme le CX3CR1, CCR2 ou le CXCR6) (Article – Figure 5)
- l’activation ou non au préalable d’un autre RCK (Article – Figure 6)
- le type cellulaire (HEK293, K562, Jurkat, U937, HBP-all) (Article – Figure S5)
- la sonde utilisée (Résultats complémentaires– Figure V.10)
207
Rôle du calcium intracellulaire
Les seules variations d’amplitude et de cinétique de la réponse chimiokinergique ont été

observées lors de la mesure de la réponse induite par la forme membranaire du ligand (§ 1.3),
d’inhibiteurs de PDE (§ 1.4) ou en présence du chélateur calcique BAPTA (Figure V-6). En effet,
suite à un traitement des cellules avec le BAPTA, les amplitudes des réponses LPA et
chimiokinergiques sont largement augmentées (respectivement +35% et +10% comparé aux
mêmes signaux en absence de BAPTA) sans modification de la cinétique. Une modification de
l’activité AC par le calcium est à exclure car la réponse FSK demeure inchangée. Pour la même
raison, il ne semble pas non plus que cela résulte d’une modification de l’activité des PDE, à
moins d’imaginer un effet exactement compensatoire entre deux actions du calcium : activatrice
des AC et inhibitrice des PDE. Cet effet du calcium sur les réponses AMPc inhibitrices serait
donc plutôt lié à une modulation d’un élément de la machinerie cellulaire mis en œuvre en aval
du récepteur (RCK ou LPA-R) qui, en présence de calcium, limite l’amplitude de la réponse,
comme cela a été montré dans la phototransduction rétinienne (Subbaraya, Ruiz et al. 1994;
Gorczyca, Polans et al. 1995). On peut penser ici aux interactions RCK-GRK ou RCK-arrestine.
L’utilisation de siRNA serait probablement une solution pour identifier le partenaire, sensible au
calcium, impliqué dans la limitation de la réponse AMPc.
Rôle des récepteurs de surface
Nos données indiquent clairement que la première partie de la réponse chimiokinergique

est contrôlée par les récepteurs présents en surface (cf. expérience utilisant F1, Article - Figure
8A) et qu’elle décroît quand les récepteurs commencent à internaliser (Article - Figure 8B) pour
preuve l’inhibition de cette internalisation ralentie nettement le retour à zéro de la réponse
(Article - Figure 8B et 8C). Pourtant, selon le modèle classique de l’activité des RCPG, ce n’est
pas l’internalisation qui déclenche leur inactivation mais la liaison des -arrestines. Et nos
expériences de BRET montrent un recrutement très rapide (de l’ordre de la minute) des
-arrestines au niveau du CX3CR1 (Résultats complémentaires– Figure V.9). Or une addition de
F1, 16 minutes après la chimiokine, reverse encore la réponse AMPc initiée par CX3CL1, ce qui
signifie que les récepteurs sont en surface au moins durant les 16 premières minutes de la
réponse chimiokinergique (Article - Figure 8A). Il y a donc ici contradiction.
Peut-on envisager qu’un CX3CR1 lié à une -arrestine soit encore efficace pour
transmettre un signal à Gi ?
Une explication possible est que le système BRET mesure un signal dans un système où
les partenaires (ici β-arrestine et CX3CR1) sont surexprimés, ce qui modifie peut être la vitesse
208
du recrutement des -arrestines comparé à celle des -arrestines endogènes. Lors de la mesure
de la réponse Gi, le recrutement des -arrestines est peut-être plus lent que dans les
expériences de BRET car l’interaction des protéines Gi présentes entrent en compétition, à force
égales, avec les -arrestines pour la liaison au récepteur.
Il est à noter que cette cinétique invariante des réponses chimiokinergiques se

différencie des réponses plus rapides observées après activation des récepteurs du LPA
(Résultats complémentaires– Figure V.1) et des réponses de plus grande amplitude observées
en aval des récepteurs métabotropiques au glutamate (DiRaddo, Miller et al. 2014). Ceci
explicite ce qui était déjà plus ou moins connu, à savoir que le système chimiokinergique est
robuste et « répond » dans une grande variété d’environnements y compris en conditions
inflammatoires où une élévation de l’AMPc est souvent rapportée. Or c’est dans ce cadre
inflammatoire qu’une réponse chimiokinergique inhibitrice du signal AMPc est pertinente.
1.3. Une réponse AMPc induite par la forme membranaire du

CX3CL1
La forme membranaire du CX3CL1 induit une réponse plus lente que la forme soluble
La forme membranaire du CX3CL1, inhabituelle pour une chimiokine, est souvent réduite à
un rôle d’adhésion mécanique, induisant l’arrêt des cellules CX3CR1+ circulantes. C’est
d’ailleurs de cette façon que le CX3CL1 a été découvert et associé au CX3CR1 (Bazan, Bacon
et al. 1997). Nos résultats semblent indiquer qu’une signalisation existe en aval du récepteur
activé par cette forme membranaire du CX3CL1 et que cette signalisation est cinétiquement
différente de celle observée en aval du même récepteur activé par la forme soluble de la
chimiokine. En effet, la réponse inhibitrice au CX3CL1 membranaire est maximale 30 minutes
après la mise en contact des deux types cellulaires (HEK-CX3CR1 et L-CX3CL1) et se maintient
plus d’une heure. Nous montrons en outre que cette cinétique, particulièrement lente, n’est pas
due à un effet de « sédimentation » lent ou d’une arrivée progressive des cellules
HEKgloCX3CR1 mise en suspension et déposées sur un tapis de L-CX3CL1 (Article - Figure
S7). Il y a donc un facteur intrinsèque et cellulaire qui explique le fait que la réponse au CX3CL1
membranaire est particulièrement lente. Les données obtenues nous amènent à penser que la
faible internalisation du CX3CR1 activé par le CX3CL1 membranaire serait à l’origine de la
cinétique observée, en particulier de son très lent retour à zéro.
209
La forme membranaire du CX3CL1 induit une réponse qualitativement différente de

celle à la forme soluble
Nos résultats indiquent une autre différence quantitative entre la réponse due à la forme
membranaire et celle obtenue avec la forme soluble. Bien que les deux formes de CX3CL1
induisent des réponses dont les amplitudes maximales sont comparables en pourcentage
d’inhibition, à savoir environ 30% d’inhibition (Article - Figure 7) il existe une différence majeure
entre ces deux réponses. La réponse au CX3CL1 soluble est saturante (Article - Figure S1) et
une addition supplémentaire de CX3CL1 soluble ne donne aucun signal (Article - Figure 6). Par
contre, l’addition de CX3CL1 soluble après la réponse obtenue avec du CX3CL1 membranaire
induit une seconde vague de réponse (Article - Figure 7). Ce résultat semble indiquer que la
forme membranaire induit une réponse de même amplitude que la forme soluble en mobilisant
moins de récepteurs. Les résultats obtenus avec le CX3CL1-His ou CX3CL1 immobilisé
soutiennent ce postulat d’une réponse au CX3CL1 membranaire qualitativement meilleure que
celle due au CX3CL1 soluble. En effet la réponse obtenue avec le maximum possible de ligand
immobilisé (150nM dans 30µl), présente une amplitude semblable à celle obtenue avec la dose
saturante de CX3CL1 soluble ainsi qu’à celle obtenue avec CX3CL1 membranaire ; à un détail
prêt que la courbe dose-réponse montre que cette réponse n’est pas saturante et que s’il était
possible d’immobiliser plus de ligand, la réponse serait d’amplitude supérieure à celle mesurée.
En quoi le signal en aval du CX3CR1 est-il dépendant de la nature de son ligand ?
Une diffusion latérale du récepteur au sein de la membrane plasmique peut être un des
paramètres expliquant une différence d’activation du récepteur en fonction de la forme de ligand.
En effet, lors d’une activation par la forme soluble du CX3CL1, la diffusion du récepteur ne
semble pas nécessaire : le ligand qui diffuse dans le milieu arrive au contact du récepteur. A
l’inverse, lors de l’activation par la forme soluble, le récepteur doit se déplacer au sein de la
membrane afin d’entrer en contact avec son ligand. Des résultats obtenus au laboratoire
montrent que le récepteur a une mobilité supérieure à celle du CX3CL1 membranaire, dont les
mouvements son restreint par sa forte glycosylation et son oligomérisation (Shenoy 2011). De
plus il n’est pas impossible, que cette diffusion du récepteur soit à l’origine de la formation de
dimères de CX3CR1 qui se rassemblent sous l’oligomère de CX3CL1 et se comportent ainsi en
un complexe « transducteur » ou « réceptosome » au sein duquel leur conformation protéique
est peut être différente que dans les récepteurs dispersés à la surface et activés par le ligand
soluble. On aurait donc ici un facteur (temps de diffusion du CX3CR1 pour trouver son ligand sur
la cellulaire partenaire) qui explique la lenteur d’apparition de la réponse. Quant à sa cinétique
de retour retardée : on peut en effet penser qu’au sein du « réceptosome » la transduction du
signal par le CX3CR1 est plus efficace et que son signal d’arrêt par recrutement des β-
210
arrestines et donc son internalisation est plus lente. C’est d’ailleurs ce que nous observons
grâce au signal de BRET indiquant le recrutement des β-arrestines sur le CX3CR1 (Résultats
complémentaires– Figure V.9).
Cette différence d’amplitude et de cinétique entre la réponse induite par la forme soluble et
celle induite par la forme membranaire constitue le résultat majeur de cette étude. En effet, c’est
la première fois qu’une différence de signalisation est observée. L’étude du signal calcique en
2001 par l’équipe d’Harrison n’avait révélé aucune différence entre les réponses aux deux
formes de ligand. Il serait intéressant d’étudier les autres voies de signalisation, pour lesquelles
des outils de mesure sont disponibles, comme par exemple la voie JNK, ERK ou des signaux
encore plus distaux comme une phosphorylation différentielle des protéines cible de la PKA…
1.4. Rôle des PDE sur la régulation de la cinétique de retour de la

réponse chimiokinergique
Il est largement admis que les PDE ont un rôle à jouer dans le contrôle des réponses de type
Gs , particulièrement au cours de la phase de retour à zéro. La comparaison d’une réponse FSK
seule versus FSK combinée avec de l’IBMX, révèle qu’il existe bien une forte activité PDE
basale au sein des cellules HEKgloCX3CR1, ce qui permet sans doute de limiter l’augmentation
de l’AMPc cellulaire induite par la FSK (Article - Figure 4). En présence d’IBMX, le signal
enregistré est jusqu’à 10 fois supérieur à celui enregistré sous FSK seule. La réponse
chimiokinergique étudiée après stimulation des cellules par de l’IBMX ou de la FSK combinée à
l’IBMX, présente une cinétique légèrement différente de celle mesurée sous FSK seul. Deux
différences sont à souligner : une réponse inhibitrice maximum atteinte au bout de 25 minutes
en présence d’IBMX au lieu de 8 minutes sous FSK seule et une réponse dont le retour à zéro
est retardé de plus d’une demi-heure. L’amplitude de cette réponse n’est toutefois pas modifiée.
Il est plutôt surprenant d’observer une réponse inhibitrice en présence d’IBMX. Si

effectivement toutes les PDE sont inhibées, la concentration d’AMPc cellulaire devrait monter
rapidement et atteindre un niveau saturant pour la sonde. Par ailleurs, à supposer que le niveau
d’AMPc se stabilise d’une autre manière, il devrait être difficile de visualiser un signal inhibiteur
car pour que le biocapteur soit sensible à une diminution de l’AMPc, il faut qu’il puisse se
dissocier de l’AMPc et cela nécessite une dégradation de ce dernier. Le maintien d’une réponse
AMPc inhibitrice visible sous IBMX peut être expliqué par différentes hypothèses non
exclusives :
211
- Il existerait dans les HEK293 une activité PDE insensible à l’IBMX ; cependant les
PDE7 et 8 identifiées comme insensibles à l’IBMX ne sont pas exprimées dans les
HEK293, selon la littérature
- Dans nos conditions expérimentales, l’IBMX n’inhiberait pas complètement l’activité
PDE et il reste une activité résiduelle suffisante pour visualiser la réponse
- Il existe un autre mécanisme d’élimination de l’AMPc cellulaire. Nous avons testé la
possibilité d’une extrusion par les MRP (Résultats complémentaires– Figure V.5) or
nos résultats n’indiquent aucune activité de ce type au sein des cellules
HEKgloCX3CR1.
Il faudrait pouvoir étudier directement l’activité PDE, mais il n’existe pas à notre
connaissance de sonde capable de détecter séparément les activités de synthèse et de
dégradation de l’AMPc. Il est peut être possible d’analyser cette dernière de manière indirecte
en utilisant des analogues perméants de l’AMPc, hydrolysables ou non hydrolysables par la
PDE. Cela permettrait de savoir qu’elle est exactement la variation d’activité PDE qui
accompagne la réponse chimiokinergique. On peut penser qu’elle est simplement secondaire à
la variation du niveau d’AMPc, régulée par un des effecteurs de la voie de transduction mise en
œuvre, comme c’est le cas pour la PDE4 qui est régulée par phosphorylation PKA dépendante.
Cette hypothèse a été testée avec l’utilisation d’inhibiteurs de la PKA (H-89 et KT5720). Or nous
n’observons aucun effet de ces composés sur la réponse AMPc inhibitrice induite par les
chimiokines (Résultats complémentaires– Figure V.4).
Une autre hypothèse serait l’existence d’un autre niveau de régulation au sein du
« réceptosome » contenant le RCK, la Gi, l’adénylate cyclase, l’arrestine et la PDE comme l’ont
montré Perry et al pour le récepteur β2-adrénergique (Perry, Baillie et al. 2002).
1.5. AMPc, inflammation et fonctions du couple CX3CL1/CX3CR1
Comme nous l’avons décrit dans le chapitre VI de ce manuscrit, l’AMPc est connu pour
avoir un rôle pléiotrope dans l’inflammation et plus particulièrement comme
immunosuppresseur. En effet, l’augmentation de l’AMPc lors des réponses inflammatoires fait
partie d’un mécanisme endogène de régulation de la réponse inflammatoire, préservant ainsi les
effets bénéfiques d’une réponse inflammatoire aigüe par rapport à une inflammation chronique
généralement associée à une destruction tissulaire (Weissmann, Zurier et al. 1971; Harvath,
Robbins et al. 1991).
Au cours d’expériences présentées dans la partie consacrées aux résultats

complémentaires, nous avons étudié l’effet d’une augmentation de l’AMPc sur la fonction
212
chimiotactique et adhésive du couple CX3CR1/CX3CL1. Une augmentation de ce messager

secondaire semble diminuer la capacité chimiotactique de nos cellules CX3CR1+, conformément
à ce qui a déjà été dans la littérature pour d’autres chimiokines. Une controverse existe toutefois
sur l’effecteur activé, PKA ou EPAC (Fine, Byrnes et al. 2001; O'Boyle, Brain et al. 2007).
Cette diminution du chimiotactisme s’accompagne d’une diminution de la capacité des

cellules à adhérer sur le CX3CL1 membranaire (Résultats complémentaires – Figure VI.2A et
B), qui comme on le sait est exprimé à la surface des cellules inflammées. Cet effet semble
spécifique à l’adhésion CX3CL1/CX3CR1, puisqu’il n’affecte pas ou peu la capacité de ces
mêmes cellules à adhérer sur la fibronectine (Résultats complémentaires – Figure VI.2D). Cette
modulation de l’adhésion cellulaire par l’AMPc est décrite dans la littérature, particulièrement en
ce qui concerne l’adhésion des monocytes sur des HUVEC (cellules endothéliales) (Laudanna,
Campbell et al. 1997)
Par quel mécanisme et intermédiaire cellulaire passe la variation d’adhésion que nous
observons ?
Dans notre modèle d’adhésion, il ne semble pas que la PKA soit impliquée puisque la
baisse d’adhésion observée, suite au traitement de nos cellules avec de la FSK, n’est pas
affectée par le traitement H-89. De plus cette diminution de l’adhésion n’est pas PTX sensible,
ce qui nous laisse penser que ce phénomène d’adhésion par CX3CR1 est indépendant de la
réponse AMPc inhibitrice observée en aval du même récepteur. Cette diminution de l’adhésion
peut résulter d’une modification du récepteur (phosphorylation changement conformationnel
désensibilisation partielle,…). L’hypothèse d’une diminution du nombre de récepteur en
surface est exclue par nos expériences de cytométrie en flux (Résultats complémentaires–
Figure VI.2E et 2F Quantification du nombre de récepteur à la surface après FSK). Il est
possible d’imaginer un modèle où la réponse chimiokinergique inhibitrice est enclenchée
secondairement après une adhésion purement mécanique entre CX3CR1 et CX3CL1. Cette
réponse induit par la suite des mécanismes de renforcement de l’adhérence de la cellule
adhérée via une activation du système intégrine.
A notre connaissance, c’est la première fois que l’on observe une régulation des
fonctions du couple CX3CR1-CX3CL1 par l’AMPc cellulaire. Même si nous n’en connaissons
pas les véritables causes mécanistiques, nous pouvons intégrer l’ensemble des données
obtenues dans un modèle « finaliste » : En condition inflammatoire, l’augmentation de l’AMPc
observée tendrait à diminuer la migration (chimiotactisme et adhésion) des cellules. Les cellules
213
qui réussissent à migrer et à adhérer, malgré cette augmentation de l’AMPc sont ainsi
sélectionnées par leur capacité à diminuer leur AMPc cellulaire. L’AMPc cellulaire augmenterait
ainsi le seuil fonctionnel à partir duquel les cellules immunes sont recrutées et activées au site
inflammatoire, ce qui permet de .contrôler la réponse immunitaire
1.6. AMPc, CX3CL1 et survie cellulaire

On sait que l’AMPc régule l’apoptose de façon positive ou négative selon les types
cellulaires : il l’augmente dans les lymphocytes T et B (Grandoch, Bujok et al. 2009) ; il la
diminue dans les neutrophiles ou les éosinophiles (Bureau, Seumois et al. 2002). Par ailleurs, la
chimiokine CX3CL1 a un rôle important dans la survie cellulaire, plus particulièrement dans le
système nerveux central (Boehme, Lio et al. 2000; Deiva, Geeraerts et al. 2004). Toutefois,
cette action du CX3CL1 ne semble pas associée à la voie de signalisation Gi-AMPC-PKA mais
à la voie PI3K-PKB (Deiva, Geeraerts et al. 2004).
Nos expériences préliminaires indiquent un rôle protecteur du CX3CL1 vis-à-vis de la

mort cellulaire induite par une augmentation de l’AMPc intracellulaire. Là encore, les
mécanismes causals restent à identifier. On peut penser que cela est dû à la réponse inhibitrice
d’AMPc. Si ce postulat est vrai, cette réponse chimiokinergique anti-apoptotique devrait être
supprimée après traitement à la PTX. Il serait intéressant d’identifier le type d’apoptose engagée
(extrinsèque, mitochondriale ou autophagique), les caspases impliquées mais surtout la branche
(PKA ou EPAC) participant à cette réponse. Il faudrait enfin savoir si cette action anti-
apoptotique est spécifique à CX3CL1. Quoiqu’il en soit, ce serait une avancée remarquable
dans le déchiffrage du rôle protecteur de la chimiokine CX3CL1.
1.7. Rôle fonctionnel des réponses chimiokinergiques

inhibitrices d’AMPc observées
L’intégration des différentes données obtenues au cours de ce travail nous permettent
d’esquisser le modèle fonctionnel ci-après.
Dans un contexte inflammatoire sont secrétés de nombreux ligands, comme les
prostaglandines, qui induisent une augmentation d’AMPc intracellulaire. Dans les cellules
immunes, cela se traduit par une augmentation de la mort cellulaire et une diminution du
recrutement des leucocytes en réponse à la sécrétion de chimiokine par les cellules inflammées.
C’est un premier niveau de contrôle de la réponse inflammatoire aigüe. Les cellules recrutées
malgré ce « frein » fonctionnel, le sont grâce à leurs réponses AMPc inhibitrices, qui favorise
leur adhésion d’une part et leur résistance à l’apoptose d’autre part. Pour ce qui est du couple
CX3CR1-CX3CL1, cette « sélection » concerne principalement les monocytes et les cellules NK,
qui sont les principales cellules immunes CX3CR1+. La diminution de l’adhésion de ces cellules
214
sur l’endothélium inflammé exprimant le CX3CL1 membranaire constitue un second niveau de

contrôle contribuant à diminuer le nombre de cellules participant à la réponse inflammatoire.
Nous avons montré que les réponses à plusieurs chimiokines ne présentaient pas de
désensibilisation croisée, de même qu’une réponse à CX3CL1 membranaire n’empêchait pas
une réponse au CX3CL1 soluble subséquente. Pour les monocytes, cela se traduit par une
capacité de recrutement par plusieurs gradients chimiotactiques différents aboutissant à un
maintien de la capacité d’adhésion sur l’endothélium inflammé grâce, entre autres, au CX3CL1
membranaire lui permettant de s’infiltrer jusqu’au centre du site inflammatoire. Un modèle
fonctionnel similaire peut être décrit pour les NK. Après son recrutement au site inflammatoire, le
NK adhère à sa cible (par exemple la cellule endothéliale) grâce au CX3CL1. Aussi, il est
possible d’imaginer que la réponse AMPc inhibitrice enclenchée en aval du CX3CR1 renforce
cette adhésion et protège la cellule de l’apoptose, tout en ne désensibilisant pas les réponses à
d’autres chimiokines ou à CX3CL1 soluble qui permet à la cellule NK d’être recrutée ailleurs
vers une autre cible et de maintenir sa fonction immune.
Notre équipe a montré que l’adhésion cellulaire passant par le couple CX3CL1-CX3CR1
était différent selon le variant du CX3CR1 humain engagé (Daoudi, Lavergne et al. 2004). C’est
pour étudier ce polymorphisme que nous avions lancé cette étude. Malheureusement, la mise
au point de la technique, et le travail de compréhension de la réponse à CX3CL1 membranaire
ne m’a pas laissé le temps de creuser ce point. Quoi qu’il en soi, il serait intéressant maintenant
d’étudier la signalisation AMPc en aval du variant minoritaire (CX3CR1-I289-M280) et ainsi
d’identifier d’éventuelles différences avec les signaux décrits ici mesurés en aval du variant
majoritaire (CX3CR1-V289-T280). Cette comparaison est intéressante car rappelons-le, la
présence de ce variant est corrélée avec un risque accru de maladies cérébrovasculaires
(Moatti, Faure et al. 2001; McDermott, Fong et al. 2003) et de DMLA (Combadiere, Feumi et al.
2007) ainsi qu’un risque moindre d’athérosclérose (McDermott, Halcox et al. 2001), de
glioblastome (Rodero, Marie et al. 2008) et de sepsis (Chousterman en cours de publication).
215
216
217
Fiches Techniques
218
219
Milieux
Milieu de culture des cellules HEK-293
Ajouter au DMEM-Glutamax (life-technologie ©) :
10% de SVF (Dutscher ©) décomplémenté par chauffage à 56°C pendant 30min

1mM Pyruvate de Sodium (life-technologie ©)
50U/ml Pénicilline
50U/ml Streptomycine
Milieu de culture des cellules THP-1 / U-937 / Jurkat-TAG
Ajouter au RPMI-Glutamax (life-technologie ©) :

10% de SVF (Dutscher ©) décomplémenté par chauffage à 56°C pendant 30min
1mM Pyruvate de Sodium (life-technologie ©)
50U/ml Pénicilline
50U/ml Streptomycine
220
Fiche Technique 1
Mesure de la cinétique AMPc

Technique GloSENSOR Promega ©
Jour 1 : Culture cellulaire – mise en plaque des cellules

 Ensemencer les cellules (HEK-CX3CR1-GloSENSOR) à une densité de 30 000
cellules / 100µl de milieu de culture DMEM complet (cf. Fiche technique 0) dans une
plaque blanche a fond transparent 96 puits (Greiner Bio-one ®)
 Incuber à 37°C – CO2 5% sous atmosphère humide
Jour 2 : Equilibration et Mesure en lecteur de plaque

 Eliminer le milieu de culture et remplacer par 100µl/puits milieu d’équilibration :
CO2independant medium (life-technologie ©) + 2% de reactif cAMP-GloSENSOR

(Promega ®) + 10% de SVF décomplémenté.
 Incuber la plaque à 37°C – CO2 5% sous atmosphère humide – 90 minutes
 Mesurer l’absorbance en lecteur de plaque (Berthold ®) : Placer la plaque dans le
support de l’appareil et lancer le programme « Kinetic Repeat » sur 3minutes. ce
premier enregistrement servira à la représentation de la ligne de base. Sortir la
plaque et additionner, à la multicanaux, 20µl de FSK à la concentration désirée,
lancer un second enregistrement sur un temps donné. Sortir de nouveau la plaque et
additionner 20µl des solutions de ligands. Enregistrer sur 1 à 2h.
NB : Les différentes drogues visant à moduler les différents acteurs de la

signalisation sont souvent ajoutées dans cette solution dite d’équilibration.
221
BRET CX3CR1-LUC / β-arrestine YFP
Bioluminescence Resonance Energy Transfer

 Ensemencer les cellules (HEK-293) à une densité de 350 000 cellules / 2ml de milieu
de culture DMEM complet (cf. Fiche technique 0) dans une plaque 6 puits traitées
pour la culture
Jour 2 : Transfection avec les plasmides codant CX3CR1-VT LUC et β-arrestine
YFP (selon protocole fournisseur de l’agent transfectant JetPEI (polyplus ©))
 Tube ADN : 0.3µg de plasmide codant CX3CR1-LUC (donneur) + 2.8µg de plasmide
codant la β-arrestine YFP (1 ou 2) (accepteur) ou pcDNA3 (contrôle négatif) –
Solvant : NaCl 0.9% (100µl / puits6)
 Tube JetPEI (agent transfectant) : 6µl dans 100µl de NaCl 0.9% (valeurs pour 1 puits
6 à transfecter – ajuster en fonction du nombre de puits total)
 Vortexer les tubes
 Ajouter le contenu du tube JetPEI dans le tube ADN
 Vortexer le tube
 Incuber entre 15 et 30minutes à RT
 Distribuer 200µl de mix ADN + JetPEI par puits (la présence de SVF ne perturbe pas
la transfection)
 Incuber à 37°C – CO2 5% sous atmosphère humide sur la nuit
Jour 3 : Mesure du BRET en lecteur de plaque

 Eliminer le milieu de culture
 Décoller les cellules au tampon de dissociation cellulaire (Life technologie ®)
 Pooler les duplicats et centrifuger à 1300rpm – 5min
 Eliminer le surnageant et reprendre les cellules en tampon BRET1 à hauteur de
100 000 cellules / 180µl par point de mesure final
 Distribuer dans une plaque blanche totalement blanche, dite plaque de mesure (nunc
®) 5µM de coelentherazine h (interchim) diluée dans tampon BRET +/- chimiokine
100nM final pour un volume final de 20µl
 Distribuer 180µl de cellules par puits de la plaque de mesure
(1) Tampon BRET : HBSS complété par 10mM HEPES, 1mM de CaCl2, 1mM MgCl2
Programme :
 Mesure du BRET (programme BRET Luc &YFP) 100-300 répétitions
222
Fiche Technique 2
‐ Luciferase : λ emission F-485 Coelentherazine – slot A3

‐ YFP : λ emission F-530 eYFP – slot A4
 Mesure de la Fluorescencepost BRET :
‐ Basculer la tête du lecteur en position Fluorescence
‐ Lancer le programme FluoYFP post BRET_Luc &YFP pour 1 -2 répétitions
- lamp energy : 7000
-λ excitation : F485 (FITC Fluorescein) – slot A2
-λ emission : F 535 (FITC Fluorescein) – slot A2
Calcul :
 BRET BRUT
où :
 BRET NET
223
FRET T-EPAC-VV
Fluorescence Resonance Energy Transfer

 Ensemencer les cellules (HEK-CX3CR1 VT) à une densité de 20 000 cellules / 100µl
de milieu de culture DMEM complet sans rouge phenol (Gibco ®) dans une plaque
96 puits, noires à fond transparent traitées pour la culture
Jour 2 : Transfection avec le plasmide codant la sonde T-EPAC-vv (selon
protocole fournisseur de l’agent transfectant JetPEI (polyplus ©))
 Tube ADN : 250ng de plasmide codant T-EPAC-vv – Solvant : NaCl 0.9% (10µl /
puits 96)
 Tube JetPEI (agent transfectant) : 0.5µl dans 10µl de NaCl 0.9% (valeurs pour un
puits 96 à transfecter – ajuster en fonction du nombre de puits total)
 Vortexer les tubes
 Ajouter le contenu du tube JetPEI dans le tube ADN
 Vortexer le tube
 Incuber entre 15 et 30minutes à RT
 Distribuer 20µl de mix ADN + JetPEI par puits (la présence de SVF ne perturbe pas la
transfection)
 Incuber à 37°C – CO2 5% sous atmosphère humide sur la nuit
Jour 3 : Suivi du FRET par microscopie (microscope Zeiss ©)
Programme : programme constructeur Physiology ©

 Mesure du FRET (2 canaux de mesure)
‐ CFP & YFP sur des cycle de 1h30 avec une prise toutes les 10s
 Calcul d’un ratio FRET en direct
224
Fiche Technique 4
Préparation de lamelles(1) « coatées » avec CX3CL1-His

pour Adhésion sous flux
 Délimiter un cercle au feutre sur l’une des faces de la lamelle (attention la surface
de ce cercle doit être inférieure à celle de la chambre)
 Retourner la lamelle et la placer sur du sopalin humidifié
 Déposer une goutte (~ 10µl) d’anticorps anti-Histidine(2) au centre de la zone
précédemment délimitée
 Incuber la lamelle 1H à 37°C (ou 1 nuit à 4°C)
 Retirer la solution d’anticorps sans toucher la zone traitée, garder le cône très
superficiel
 Laver la zone traitée avec la solution de PBS, Ca, Mg (X3)
 Déposer une goutte (~10µl) de CX3CL1-His6 (3) au centre de la zone traitée avec
l’anticorps anti-Histidine
 Incuber la lamelle 1 nuit à 4°C (ou 1H à 37°C)
 Déposer une goutte de solution de saturation(4) au centre de la zone traitée
 Incuber la lamelle 1H à 37°C
 Laisser à 37°C en solution PBS, Ca, Mg jusqu’à utilisation
Variante
Préparation de puits « coatés » avec CX3CL1-His
pour mesure de la réponse AMPc via GloSENSOR technologie
 Déposer 40µl de solution d’anticorps anti-Histidine(2) dans chaque puits d’une

plaque blanche MAXISORP ® (Dutscher ©)
 Incuber la plaque 1H à 37°C
 Retirer la solution d’anticorps, garder le cône très superficiel
 Laver les puits avec la solution de PBS, Ca, Mg (X3)
 Déposer 30 à 35µl de solution CX3CL1-His (3) ou CXCL16-His dans les puits
préalablement traités par l’anticorps
 Incuber la lamelle 1 nuit à 4°C (ou 1H à 37°C)
 Retirer la solution de chK-HIS avant le dépôt des cellules CX3CR1+
(1) Lamelle Thermanox – nunc ®

(2) Solution d’anticorps anti-His : 1mM Ca++, 1mM Mg++, 25µg/ml Ac anti-His en PBS
(3) Solution de CX3CL1-His6 : 1mM Ca++, 1mM Mg++, 100nM CX3CL1-His6 en PBS
(4) Solution de saturation : 1% BSA dénaturée²² 2 min à 80°C, 5% Sucrose en PBS
225
Fiche Technique 5
Adhésion sous flux sur lamelles « coatées »
 Allumer le climatiseur afin de maintenir la chambre à 37°C

 Préparer le tampon d’adhésion(1), le filtrer (0.8µM) et le placer à 37°C
 Laver le circuit en faisant passer de l’eau stérile (X2)
‐ Plonger le tuyau de « remplissage » dans l’eau – robinet A fermé & « entrée circuit »
fermée à l’aide d’une pince à dessin (voir photo bas de page)
‐ Ouvrir le robinet A
‐ Se placer en mode REFILL (débit et volume préenregistrés)
‐ Démarrer le remplissage des seringues en appuyant sur RUN
‐ Fermer le robinet A
‐ Ouvrir l’« entrée circuit » et fermer le tuyau de « remplissage » avec le pince à dessin
‐ Se placer en mode INFUSE
‐ Régler le débit du flux : 2X 5000ml/hr (uniquement pour les lavages)
‐ Set/ Infuse RATE/ entrer le débit désiré/ RUN
‐ Chasser les bulles d’air formées dans les seringues en les plaçant verticalement.
‐ Laver la seringue « entrée des cellules »
‐ Vérifier l’écoulement dans la poubelle
 Remplir les seringues avec du tampon d’adhésion
‐ Plonger le tuyau de « remplissage » dans le tampon – robinet A fermé –
« entrée circuit » fermée à l’aide d’une pince à dessin
‐ Ouvrir le robinet A
‐ Se placer en mode REFILL (débit et volume préenregistrés)
‐ Démarrer le remplissage des seringues en appuyant sur RUN
‐ Fermer le robinet A
 Lancer le programme AXON Imaging
‐ Ouvrir la palette director (Acquisition/Ctrl/Palette)
‐ Lancer le live
‐ Modifier selon l’image visible le temps d’exposition (~5-20ms)
‐ Régler la netteté de l’image directement sur le microscope
 Monter la lamelle thermanox sur la chambre
‐ Placer la lamelle sur le support
‐ Recouvrir de tampon la lamelle
‐ Branchez la seringue remplie de tampon à l’entrée
‐ Evacuez les bulles du tuyau d’entrée en injectant du tampon
‐ Placer doucement la chambre sur le support + lamelle en injectant du tampon et en
évitant de créer des bulles.
‐ Viser légèrement en diagonale la chambre
‐ Finir de viser hermétiquement et vérifier l’étanchéité
‐ Evacuer les bulles potentielles
‐ Pincer le tuyau d’entrée à l’aide d’une pince à dessin
 Fixer la chambre montée sur la platine
 Commencer par brancher la sortie (l’aval = tuyau avec seringue – tuyau vers poubelle)
enlever rapidement les pinces pour éviter de mettre sous pression le système.
226
Fiche Technique 5
 Lancer un flux à 2X 100ml/hr (Mode Infuse)

 Branchez les tuyaux « entrée chambre »et « arrivée flux » en évitant un maximum la
création de bulles.
 Augmenter le flux 2X 500ml/hr pour chasser les bulles potentielles
 Revenir à un flux de 2X 10ml/hr
 Injecter les cellules (1million/ ml) dans la seringue « entrée des cellules »
 Eliminer la bulle au fond de la seringue à l’aide d’un cône 200µl
 Ouvrir le robinet et le refermer en laissant un volume mort dans la seringue
 Lancer un chrono – 10 minutes
 Prendre des photos de la zone traitée et de la zone non traitée (=adhésion non
spécifique)
‐ Arrêter le live
‐ Fichier /Export as/data/
‐ Renommer en format TIF
Si réutilisation de la même lamelle pour tester l’adhésion sous d’autres
conditions :
 Augmenter le flux (500ml/hr durant 2 min) afin d’éliminer les cellules ayant adhérées
 Laver la seringue d’entrée des cellules avec du tampon (5ml X3)
 A la fin de la manipulation, faire un lavage à l’eau, à la javel, à l’eau du cricuit, éliminer
l’ensemble des pinces et laisser en eau les tuyaux.
Flux
Remplissage
Entrée circuit
Chambre pour adhésion sous flux. Circuit
(1) Tampon d’adhésion : HBSS 1X, 0.2% BSA, 1mM Ca++, 1mM Mg++,10mM Hepes en
H2O pH=7.2
227
Fiche Technique 6
Chimiotactisme
Technique TRANSWELL® par Costar ©
Jour 1 : Culture cellulaire – mise en plaque des cellules et Perméabilisation de

la plaque Transwell
 Perméabilisation des membranes
- ajout de 600µl de milieu de culture neutre non complémenté dans les puits
de la rangée 1 et 4
- placer les supports de membrane dans ces puits et ajouter 150µl de milieu
de culture neutre dans les supports, par-dessus la membrane
- placer la plaque à 37°C sur la nuit
 Culture cellulaire
- Ensemencer les cellules dans une flasque de culture en fonction de la
quantité de cellules nécessaires le lendemain (150 000 cellules par points
testés), en prenant en compte qu’elles ne doivent pas excéder 80% de
confluence lors du test
Jour 2 : Test de migration
 Décoller les cellules avec du tampon de dissociation

cellulaire
 Centrifuger 5min à 1300rpm avant de les reprendre en
DMEM complet à hauteur de 1 000 000cell / ml
 Préparer la solution de chimiokine à 5µM finale –
solvant : DMEM complet – Vf : 600µl/puits
 Distribuer cette solution de chimiokine dans les puits
centraux (rang 2 et 3) de la plaque TRANSWELL
 Placer les supports de membranes perméabilisées sur
ces puits
 Distribuer 150µl de solution cellulaire dans chaque
support de membrane
 Incuber la plaque 5h à 37°C, 5% de CO2 en atmosphère
humide
228
Fiche Technique 6
 Préparer une plaque de culture 24 puits avec 600µl de

PBS 1X dans les puits de la rangée 1 et 4 et 600µl de méthanol froid dans les puits
centraux (rangée 2 et 3)
 Au bout de 5H, procéder au lavage des supports de
membrane :
- Eliminer le contenu de chaque support de membrane
- Plonger le support dans les puits contenant du PBS1X
- Lavage de l’intérieur des supports avec 150µl de PBS 1X
(x3)
- Eliminer l’excédent de PBS avec un coton tige
- Ajouter 100µl de PBS 1X propre pour éviter le
desséchement de la membrane
- Déplacer le support dans le puits contenant du méthanol
froid
- Placer la plaque 15 à 20 minutes à -20°C
- Déplacer les supports dans des puits secs et laisser
sécher à l’air libre 10 à 15 minutes
 Montage des membranes entre lame et lamelles à l’aide
de Vectashiel © contenant du DAPI
229
Fiche Technique 6
230
Fiche Technique 7
Quantification du_CX3CL1 soluble dans le surnageant cellulaire

Technique Quantikine ELISA® par R&DSystems ®
Jour 1 : Culture cellulaire
- Ensemencer dans une plaque de culture 96 puits avec les cellules dont le
surnageant est à tester dans 100µl de milieu de culture à tester
- Incuber à 37°C – CO2 5% sous atmosphère humide
Jour 2 : Récupération des surnageants
- Eliminer le milieu de culture et remplacer par 100µl de milieu d’équilibration

(cf. Fiche technique 1)
- Récupérer les surnageants dans des tubes falcons 0.5ml stérile – pooler les
réplicas
- Conserver à -20°C
Jour X : quantification du CX3CL1 dans les surnageants
 préparer les réactifs (placer les différentes solutions à RT avant utilisation)
- Wash Buffer (WB) : 480ml de H2O + 20ml de solution WB

- Solution Substrat (15 minutes avant utilisation ; 100µl / puits) :
1vol de A (100µl) + 1vol de B (100µl)
- Gamme CX3XL1 standard (15 minutes avant utilisation)
 préparer la plaque selon le plan de plaque désiré en retirant les barrettes excédentaires
 distribuer 100µl de RD1-88 dans chaque puits
231
Fiche Technique 7
 déposer 100µl de chaque échantillon, contrôles et de la gamme CX3CL1 standard

 couvrir avec la bande adhésive fournie dans le kit
 incuber 3h à 4°C
 aspirer chaque puits et faire un lavage avec 400µl de WB (X4) – éliminer un maximum
de liquide par aspiration et retournement de la plaque
 déposer 200µl de CX3CL1 « conjugated » froid (maintenu à 4°C) par puits
 incuber 1h à 4°C
 aspirer chaque puits et faire un lavage avec 400µl de WB (X4) – éliminer un maximum
de liquide par aspiration et retournement de la plaque
 déposer 200µl de solution substrat par puits
 incuber 30minutes à RT en protégeant la plaque de la lumière
 additionner 50µl de solution stop par puits (la couleur vire du bleu au jaune)
 Mesure de l’absorbance à 450nM
232
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Etude du signal AMP cyclique déclenché par la

chimiokine CX3CL1 en aval de son récepteur CX3CR1

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HAL Id: tel-01147476

HAL is a multi-disciplinary open access L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est

École doctorale Complexité du Vivant (ED515)

Spécialité Biologie Moléculaire et Cellulaire

Mlle VIRGINIA FELOUZIS

Etude du signal AMP cyclique déclenché par la

Devant le jury composé de :

Pr. Pierre VINCENT Président

I. LES RECEPTEURS COUPLES AUX PROTEINES G 21

A] LA CHIMIOKINE CX3CL1, UNE CHIMIOKINE UN PEU PARTICULIERE… 82

IV. AMP CYCLIQUE & IMMUNITE : AMI OU ENNEMI ? 115

A] ANATOMIE DU SYSTEME AMPC 115

V. OBJECTIF DE LA THESE 136

I. CARACTERISATION DE LA VOIE DE SIGNALISATION AMPC EN

A] ETUDE DE L’IMPLICATION DE DIFFERENTS PARTENAIRES DE LA VOIE AMPC DANS LA REPONSE

II. IMPLICATION DE L’AMPC DANS LES FONCTIONS ASSOCIEES AU

A] CHIMIOTACTISME ET AMPC 199

Annexes – Fiches Techniques 167

II-1 : Implication du système chimiokinergique dans différentes processus physiologiques et

III-1 : Structures schématiques des deux formes physiologiques du CX3CL1

IV-1 : Représentation schématique de la Protéine Kinase A

I.1 : Diversité et fonctions des différentes sous-unités des protéines G

II.1 : Classification des chimiokines et de leurs récepteurs

III.1 : Expression du CX3CL1 selon le tissu et le type de cellule

IV.1 : Classification des PDE

De nombreuses fonctions vitales aussi diverses que le développement embryonnaire, la

I. Les récepteurs couplés aux protéines G

La capacité des organismes multicellulaires, qu’ils soient animaux ou végétaux, à réagir

Les récepteurs membranaires représentent donc l’interface entre un stimulus extracellulaire

Aussi, au vu de la multitude de signaux qu’ils transmettent et, de ce fait, du grand

A.1 – Structures des RCPG

A.2 – Classification des RCPG

Dans ce chapitre nous ne détaillerons que la classification de Kolakowski, du fait de son

Figure I-2 : Représentation schématique 3D et 2D de la structure générale des

A.2.1 – La famille A : « Rhodopsin like »

- la sous-classe A2 comprend des récepteurs dont le site de liaison implique l’extrémité

- la sous-classe A3 comprend des récepteurs d’hormones glycoprotéiques

Ce groupe est caractérisé par 3 grandes signatures :

- un motif E/DRY (glutamate /aspartate-arginine-tyrosine) à l’extrémité cytoplasmique

On note également la présence d’un aa di-acide (aspartate ou glutamate) très conservé

Figure I-3 : Classification des RCPG. Représentation schématique de la structure

A.2.2 – La famille B: « Secretin like »

A.2.3 – La famille C : « Metabotrope-glutamate/pheromone»

La famille C des RCPG regroupe les récepteurs métabotropiques du glutamate, les

Ces RCPG ont la particularité de présenter une extrémité N-terminale particulièrement

A.2.4 – Autres familles : D / E / F

La famille D est constituée de récepteurs de phéromones principalement exprimés chez

La famille F de récepteurs rassemble des récepteurs homologues aux protéines

B] Transduction du signal par les protéines G

Parallèlement à cette transduction du signal protéine G dépendante ; d’autres signaux en

B.1 – RCPG, l’histoire d’une cascade de Nobel

Figure I-4 : Les RCPG, une histoire de Nobel

B.2 – Les différentes protéines G

Les protéines G sont des protéines hétérotrimériques composées de sous-unités α, β et

Un degré de diversité supplémentaire provient de l’assemblage croisé de ces trois sous-

B.3 – Le couplage des protéines G aux récepteurs

Les premières données conduisant à déterminer quelle protéine G est couplée à un